Penentuan Kadar Tirosin Dalam Protein

  • View
    68

  • Download
    7

Embed Size (px)

Text of Penentuan Kadar Tirosin Dalam Protein

LAPORAN TETAPPRAKTIKUM BIOKIMIA

I. NOMOR PERCOBAAN: IX (SEMBILAN)II. NAMA PERCOBAAN : PENENTUAN KADAR TIROSIN DALAM KASEINIII. TUJUAN: Menentukan kadar tirosin dalam kasein serta dapat membuat kurva kalibrasinya.IV. DASAR TEORIKadar protein yang terkandung dalam setiap bahan berbeda-beda. Karena itu, pengukuran kadar protein suatu bahan sangat diperlukan. Untuk dapat menghitung kadar protein, maka diperlukan spektrofotometer dengan cara penembakan sampel. Untuk itulah maka pada praktikum ini dilakukan percobaan untuk menentukan kadar protein. Sifat protein jika dilarutkan dengan asam klorida dan enzim protease akan mengahasilkan asam amino karboksilat. Di sisi lain protein dapat mengalami denaturasi yaitu perubahan struktur protein yang menimbulkan perubahan sifat fisika, kimia dan biologi. Metode Spektrofotokopi dengan ultraviolet yang diserap bukan cahaya tampak ultra ungu (ultraviolet). Dalam spektrofotokopi ultra ungu energii cahaya tampak terserap digunakan untuk transfuse elektron. Karena energi cahaya ultraviolet dapat menyebabkan transfuse elektron (Hendayana, 1997).Protein juga memiliki molekul besar dengan bobot molekul bervariasi antara 5000 sampai jutaan. Dengan cara hidrolisis oleh asam atau oleh enzim, protein akan menghasilkan asam-asam amino. Protein mempunyai sifat yang sangat dipengaruhi oleh suhu tinggi, pH, dan pelarut organik.Jenis asam amino yang kita gunakan adalah Tirosin dengan rumus :

Tirosin adalah salah satu jenis asam amino dalam protein. Tirosin ini mempunyai gugus fenol dan bersifat asam lemah. Tirosin dapat diperoleh dari kasein, yaitu protein dalam keju atau susu.Pada percobaan ini kita akan melakukan pemurnian tirosin dari kaseinnya dengan melarutkan tirosin ke dalam berbagai larutan yang bersifat asam, alcohol, maupun senyawa yang mengandung logam berat. Dengan demikian, kita harus memperhatikan sifat-sifat protein antara lain :1. ionisasiseperti asam amino, protein juga larut dalam air akan membentuk ion yang mempunyai muatan positif dan negative. Dalam suasanan asam molekul protein akan membentuk ion positif, sedangkan dalam suasana basa akan membentuk ion negative. Pada titik isolistriknya protein mempunyai muatan positif dan negative yang sama, sehingga tidak bergerak kea rah elektroda positif maupun negative apabila ditempatkan diantara kedua electrode tersebut. Ionisasi protein dapat digambarkan sebagai berikut :protein+ H+ + +protein-kationion zwitterProtein memiliki titik isolistrik yang berbeda-beda sebagaimana yang tertera dalam table berikut : Tabel Titik Isolistrik Berbagai Protein :ProteinSumberpH isolistrik

Albumin telurTelur4,55 4,90

InsulinPancreas5,3 5,35

Albumin serumDarah4,88

KaseinSusu sapi4,6

GelatineKulit sapi4,8 4,85

Globulin serumDarah5,4 5,5

FibroinSutera2,0 2,4

GliadinTerigu6,5

Titik isolistrik protein mempunyai arti penting karena pada umunya sifat fisika, dan kimia erat hubungannya dengan pH isolistrik. Pada pH diatas titik isolistrik protein bermuatan negative, sedangkan di bawah titik isolistrik protein bermuatan negative.Oleh karena itu untuk megendapkan protein dengan ion logam, diperlukan pH larutan diatas titik isolistrik, sedangkan pengendapan oleh ion negative memerlukan pH dibawah titik isolistrik. Ion-ion posisitf yang mengendapkan protein antara lain ialah Ag+, Ca++, Zn++, Hg++, Fe++, CU++, dan Pb++, sedangkan ion negative yang dapat mengendapkan protein adalah ion salisilat, triklorasetat, pikrat, tanat dan sulfosalisilat. Berdasarkan sifat tersebut putih teluratau susu dapat digunakan sebagai antidotum atau penawar racun apabila orang keracunan logam berat.2. DenaturasiProtein akan mengalami koalgulasi apabila dipanaskan pada suhu 50oC atau lebih. Koagulasi ini hanya terjadi apabila larutan protein berada pada titik isolistriknya. Protein yang terdenaturasi pada titik isolistriknya masih dapat alrut pada pH di luar titik isolistrik tersebut. Air ternyata diperlukan untuk proses denaturasi oleh panas. Disamping pH, sushu tinggi dan ion logam berat, denaturasi dapat pula terjadi oleh adanya gerakan mekanik, alcohol aseton, eter dan detergen.3. Viskositas.Viskositas adalah tahanan yang timbul karena adanya gesekan antara molekul-molekul di dalam zat cair yang mengalir. Suatu larutan protein dalam air mempunyai viskositas atau kekentalan yang relative besar daripada viskositas air sebagai pelarutnya.4. KristalisasiBanyak protein yang telah diperoleh dalam bentuk kristal. Meskipun demikian proses kristalisasi untuk berbagai jenis protein tidak selalu sama, artinya ada yang dengan mudah dapat terkristalisasi, tetapi ada pula ynag sukar.5. Sistem KoloidMolekul protein apabila dilarutkan dalam air mempunyai sifat koloid, yang tidak dapat menembus membrane atau kertas perkamen.Pemurnian Protein Langkah awal yang dalam pemurnian protein ini ialah menentukan bahan alam yang akan diproses. Penentuan ini didasarkan pada kadar protein yang terkandung didalamnya. Tentu saja dipilih bahan alam yang mempunyai kadar protein tinggi dan mudah diperoleh. Analisis terhadap kadar protein dalam bahan alam tersebut perlu dilakukan untuk memperoleh data tentang kadar protein yang akan dimurnikan. Setelah itu protein akan dilarutkan ke dalam air atau pelarut lainnya. Namun, disini juga harus diperhatikan sushu dan pH larutan agar tidak merusak protein.Dalam percobaan ini untuk menentukan kadar atau konsentrasi protein ini kita menggunakan spectrometer yang berfunsgi untuk menentukan transmittan maupun adsorbannya.Tyrosin dapat diubah menjadi asam P-hidroksi fenil piruvat dengan cara transaminasi. Reaksi ini berlangsung dengan bantuan enzim tyrosin ketoglutarat. Selanjutnya melalui beberapa tahap reaksi asam P- hidroksi fenil piruvat diubah menjadi asam fumarat dan asam astoasetat.Tyrosin dapat dibentuk dari fenil alanin hidroksilasi sebagai katalis.Dalam proses ini aada dua tahap, yaitu :1. Tahap 1Reduksi hidrobiopterin oleh NADPH menjadi tetra biobpterindan2. Tahap 2Reduksi O2 menjadi H2O dan pengubahan fenil alanin menjadi tyrosin kemudian menjadi hidrobiopterin kembali.

V. ALAT DAN BAHAN 1. ALATLaporan Praktikum Biokimia I

Riska Ria Lestari (06101410016) 8

1. beker gelas2. gelas ukur3. pipet tetes4. penangas air5. refluks kondensor6. pipet tetes7. corong pemisah8. pengaduk kaca9. porselen10. statif dan klem11. erlenmeyer12. spektometer13. kuvet14. neraca analitik15. kaca arloji16. labu bundar17. penjepit kayu

2. BAHAN: 1. 2. Kasein 3. Tirosin4. NaOH 6 N 20 ml5. H2SO4 7 N 30 ml6. Larutan Tirosina standard 1 ml7. HgSO4 (5%) 3 ml8. H2SO4 5 N9. H2SO4 7 N 2 ml10. NaNO2 (0,2%) 2 ml11. 12 ml air

VI. PROSEDUR PERCOBAAN

Hidrolisa 1,0 gr Kaseina dengan 20, 0 ml NaOH 6 N pada refluks kondensor dalam penangas air selama 4 jam. Tambahkan hati-hati 30 ml H2SO4 7 N. campur. Tempatkan 1,0 ml hidrolisat ke dalam tabung yang bersih dan kering. Pada tabung-tabung lain pipet masing-masing 1,0 ml larutan tirosina standard dengan lima macam kadar yang berbeda. Tambahkan 3 ml HgSO4 5 % dalam H2SO4 5 N pada semua tabung. Panaskan dalam penangas air yang mendidih selama 10 menit. Dinginkan dan tambahkan ke dalam masing-masing tabung 2 ml H2SO4 7 N dan 2 ml NaNO2 0,2 %. Campur dan tambahkan 12 ml air ke dalam masing-masing tabung. Baca ekstingsinya pada spectrometer dengan maks = 470 nm.VII. HASIL PENGAMATANPengukuran % Transmittan larutan Tirosina Standar :Kadar tyrosin (%)absorban

10.007

20.013

30.017

40.021

50.055

VIII. Analisa DataPerhitungan regresi linier konsentrasi terhadap adsorbannya :X = konsentrasiY = AdsorbanXYXYX2

10.0070,0071

20.0130,0264

30.0170,0519

40.0210,08416

50.0550,27525

150,1130,44355

N . XY - X . Y Slope = N . X2 (X)2

5 . 0,443 15 . 0,113 = 5 . 55 (15)2 2,215 1,695 = 275 225 = 0,0104

Y . X2 - X . XY Intersep = N . X2 (X)2

0,113 . 55 15 . 0,443 = 5 . 55 (15)2 6,215 6,645 = = - 0,0086 275 225Maka diperoleh persamaan regresi linier :Y = AX + BY = 0,0104 X + (-0,0086)

X012345

Y-0,00860,00180,01220,02260,0330,0434

Tabel Hasil Persamaan Regresi

IX. REAKSI

X. PEMBAHASANPercobaan ini merupakan penentuan kadar tyrosein dalam kasein, dengan cara membandingkan hidrolisat kasein dengan larutan standar yang telah dibuat dan diukur mengunakan spektrometer UV/Vis. Hidrolisat yang dimaksud adalah larutan yang terdiri dari 1 mg kasein yang direfluks dengan 20 ml NaOH 6 N yang kemudian ditambah sedikit demi sedikit H2SO4 7 N. Setelah 4 jam di refluks, hidrolisat diambil sebanyak 1 ml dan dicampur dengan larutan Tyrosin standar yng berbeda konsentrasi. Larutan tyrosin staandar yang berbeda konsentrasi tersebut bertujuan untuk mendapatkan adsorbansi yang berbeda-beda sehingga dapat memprediksi absorbansi sampel kasein.Kasein yang digunakan dalam percobaan ini merupakan hasil yang didapatkan dari hasil percobaan sebelumnya yang kemudian diteruskan untuk dilakukan pengujian terhadap kadar tirosinnya.Proses refluks menggunakan suhu konstan yang berkisar 40 oC. Hal ini dikarenakan protein mengalami denaturasi pada suhu 40 oC, dimana protein atau asam nukleat kehilangan struktur tersier dan struktur sekunder dengan penerapan beberapa tekanan eksternal atau senyawa, jika protein dalam sel protein sel hidup didenaturasi menyebabkan gangguan terhadap aktivitas sel dan kemungkinan kematian sel. Pada proses ini diharapkan kandungan tirosin dalam kasein mengalami pemisahan sehingga dapat ditentukan kadarnya.Saat kasein dihidrolisa dengan NaOH, kasein akan tercampur dan terikat secara sempurna dalam suhu yang stabil sehingga larutan bersifat basa. Hal seperti ini dapat terjadi karena konsentrasi (HO-) yang tinggi mampu mengikat ion-ion H+ yang terdapat pada gugus NH3+ . Dan ketika l