A gerincvelı caudalis végének szerkezete (conus medullaris, filum terminale)

Doktori értekezés

Dr. Boros Csaba

Semmelweis Egyetem Szentágothai János Idegtudományi Doktori Iskola

Témavezetı: Dr. Réthelyi Miklós, egyetemi tanár, az orvostudomány

doktora

Hivatalos bírálók: Dr. Matesz Klára, egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Mitsányi Attila, tudományos tanácsadó, az

orvostudomány kandidátusa

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Vígh Béla egyetemi tanár, az orvostudomány doktora

Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Kamondi Anita, egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Czéh Gábor, tudományos tanácsadó, az

orvostudomány doktora

Budapest 2009

1

Tartalomjegyzék

Rövidítések jegyzéke........................................................................................................ 3

1. Bevezetés (irodalmi háttér)........................................................................................... 4

2. Célkitőzések ................................................................................................................. 8

3. Módszerek .................................................................................................................... 9

3.1 Kísérleti állatok....................................................................................................... 9

3.2 Fixálás és metszetkészítés ...................................................................................... 9

3.3 Többes immunfluoreszcens jelölés - konfokális mikroszkópia............................ 10

3.4 Elektronmikroszkópos feldolgozás....................................................................... 12

3.5 BDA neuronális pályajelölés ................................................................................ 12

3.6 Golgi – Kopsch módszer ...................................................................................... 13

4. Eredmények ................................................................................................................ 14

4.1 A szürkeállomány morfológiai transzformációja a gerincvelı caudalis részén ... 14

4.2 A filum terminale szerkezete patkányban ............................................................ 19

4.2.1 Makro-mikroszkópos viszonyok ................................................................... 19

4.2.2 Neuronok, gliasejtek...................................................................................... 20

4.2.3. A filum terminale neuronjainak neurokémiai jellemzése............................. 25

4.2.4. Kolokalizációk, szoros kapcsolatok ............................................................. 31

4.2.5 Quantitatív mérések eredményei ................................................................... 32

4.2.6 Ultrastruktúra................................................................................................. 33

4.3 A filum terminale szerkezete macskában ............................................................. 42

4.4 A filum terminale szerkezete majomban .............................................................. 46

4.5 A filum terminale kapcsolatai (elızetes eredmények) ......................................... 48

5. Megbeszélés ............................................................................................................... 51

5.1 Neuronális átrendezıdés a gerincvelı caudalis szakaszán ................................... 51

5.2 A filum terminale definíciója ............................................................................... 53

5.3 A filum terminale rendezett idegszövet................................................................ 53

5.4 A filum terminale rendezettsége állatfajonként változó volt................................ 54

5.5 A filum terminale chemoarchitecturája ................................................................ 56

5.6 A filum terminale finomszerkezete ...................................................................... 59

5.7 A filum terminale kapcsolatai............................................................................... 60

2

5.8 Perspektíva............................................................................................................ 60

6. Következtetések.......................................................................................................... 62

7. Összefoglalás .............................................................................................................. 63

8. Summary..................................................................................................................... 64

9. Irodalomjegyzék ......................................................................................................... 65

10. Saját közlemények jegyzéke..................................................................................... 73

11. Köszönetnyilvánítás ................................................................................................. 75

3

Rövidítések jegyzéke

CGRP Calcitonin gene-related peptide (Kalcitonin gén-kapcsolt fehérje)

ChAT Choline acetyltransferase (Kolin acetyltranszferáz)

CM Conus medullaris

Cy 5 Cyanin 5

FT Filum terminale

GLYT2 Glycine transporter 2 (Glicin transzporter)

GFAP Glial fibrillary acidic protein (Savanyú gliális fibrilláris fehérje)

EM elektronmikroszkópos

IB 4 Griffonia simplicifolia lectin

NeuN Neuron-specific nuclear protein (Neuron-specifikus nukleáris fehérje)

NK-1r Neurokinin 1 receptor

NOS Nitric oxide synthase (Nitrogén-oxid szintetáz)

RIP Receptor integrated protein (Receptorhoz kapcsolódó fehérje)

PKCgamma Protein kinase C gamma (Protein kináz C gamma)

SP Substance P (P anyag)

VGLUT1 Vesicular glutamate transporter 1 (Vezikuláris glutamát transzporter 1)

VGLUT2 Vesicular glutamate transporter 2 (Vezikuláris glutamát transzporter 2)

VIP Vasointestinal Polypeptide (Vazointesztinális polipeptid)

4

1. Bevezetés (irodalmi háttér)

A gerincvelı és a gerinccsatorna közti térbeli kapcsolat három formában fordul elı

a gerincesek törzsében (Catala et al., 2000). Halakban, kétéltőekben a metamorphosis

elıtt, valamint hüllıkben a gerincvelı kitölti a gerinccsatorna teljes hosszát.

Madarakban a gerincvelı ugyan végig húzódik a gerinccsatorna teljes hosszában, de a

farok végsı szakaszára (pygostyl) esı gerincvelı részhez sem motoros, sem érzı

gyökerek nem kapcsolódnak. Az emlısökre jellemzı gerincvelı rövidebb, mint a

gerinccsatorna. A gerincvelınek a gerinccsatorna caudalis részében található folytatását

nevezik filum terminalénak.1 A madarakhoz hasonlóan, a filum terminaléhoz nem

kapcsolódik sem motoros, sem érzı gyökér, sem pedig gerincvelıi dúc.

A gerincvelı fejlıdését részletezı leírások nem egységesek. Általánosan

elfogadott, hogy a gerincvelı egy cranialis és egy caudalis telepbıl fejlıdik. A cranialis

telep maga a velıcsı, míg a caudalis telep a farokbimbó (tail bud) mesenchymája.

Eltérnek azonban a vélemények azon a ponton - ami részben a megfigyelt speciesek

közötti különbségekbıl is származik - hogy hol a határ, illetve az átmenet a két telepbıl

kialakuló gerincvelı szakasz között. Találunk olyan leírást, amely szerint már a lumbo-

sacralis gerincvelı szakasz is a farokbimbó származéka (Schoenwolf, 1984), mások a

határt a filum terminale (FT) cranialis végére teszik (Nievelstein és mtsai., 1993). A

leírások többsége szerint a farokbimbóval párhuzamosan a dúcléc vagy egyáltalán nem

differenciálódik, vagy megjelenik, de a dúcléc sejtjeibıl csak támasztósejtek és

melanocyták fejlıdnek ki (Catala et al., 2000).

Az általunk vizsgált mindhárom speciesben (patkány, macska, majom) a

gerincvelı caudalisan hirtelen elvékonyodva végzıdik. Ezen utolsó szakasz a conus

medullaris (CM), amelynek csúcsáról indul a kötegszerő, vékony filum terminale. A

CM területén találjuk a coccygealis gerincvelıi szelvényeket, amelyek a coccygealis

mellsı és hátsó gyökerekkel kapcsolódnak a perifériához. Szemben a conus

medullarisszal, a filum terminalét mind a klasszikus, mind a modern leírások

idegszövetmentes kötegnek tartják. Lenhossék (1922) szerint „ A végkúp (conus

terminalis) vékony fonalban, a végfonalban, filum terminale, folytatódik. Ez már csak

1 Az értekezés folyamatos olvasása érdekében a gyakran elıforduló filum terminale és conus medullaris anatómiai kifejezések csak akkor szerepelnek rövidítve – FT és CM – , ha rag vagy jel nem kapcsolódik a kifejezéshez.

5

kötıszövetbıl, nevezetesen a gerincvelı burkainak folytatásából áll, idegszövet nincs

benne.” A gerincvelı … a conus medullaris és az agyburkokból álló (meningealis)

filum terminaléval ér véget - írta Altmann és Bayer (2001). „A filum terminale a pia

materbıl és neuroglia komponensekbıl áll; a gerincvelınek az embryonalis farokban

megmaradt része, felnıttben semmi jelentısége nincs” – olvasható egy modern

tankönyvben (Barr és Kiernan, 1993). Ugyanezt az álláspontot képviselik klinikai

munkák szerzıi is (Yamada és mtsai., 2001; Selcuki és mtsai, 2003). Az idézett leírások

nem tárgyalják, de nyilvánvalónak veszik, hogy a filum terminaléból nem indulnak ki a

hátsó, illetve a mellsı gyökerekkel egyenértékő képletek.

Emberben a FT intraduralis és extraduralis szakaszból áll, ezen utóbbival rögzül a

farokcsont periosteumához (Pinto és mtsai, 2002). Adataik szerint a FT hossza 112,8 és

211,1 mm között változott (átlagos hossz: 156,4 mm). Leggyakrabban az L1

csigolyatest közepén kezdıdött FT intraduralisan, és az S2 csigolya felsı szélén indult

az extraduralis szakasz. Hasonló mérési adatok ugyanabból a laboratóriumból: átlagos

hosszúság: 155,4 mm; átlagos átmérı a FT kezdetén: 1,56 mm; a FT közepén az átlagos

átmérı: 1,03 mm (Fontes és mtsai., 2006). A dura zsákon belül a FT a lumbalis, sacralis

és coccygealis gyökerekkel együtt alkotja a cauda equinát.

A klasszikus elképzelések szerint, a FT a gerinccsatorna és a gerincvelı közötti

aránytalan hossznövekedés eredménye (Streeter, 1919; Pinto és mtsai, 2002). A 30 mm-

es emberi embryoban a gerincvelı kitölti a gerinccsatornát, caudalis végét a farki

csigolyák „mélységében” találjuk, a rövid S1 gyökerek végén a gerincvelıi ganglion a

S1 csigolya síkjában van. A 67 mm-es embryoban az aránytalan növekedés már

jelentkezik, a gerincvelı caudalis vége az alsó sacralis csigolyák mögött található, és

megjelenik a FT. Ezzel párhuzamosan a mutatóként használt S1 gyökér egyre hosszabb

lesz, mivel az S1 gerincvelıi ganglion nem változtatta meg eredeti helyzetét. A canalis

centralis kiszélesedve, ventriculus terminalisként végzıdik. Az aránytalan növekedés

folytatódik, a 220 mm-es embryoban a gerincvelı a conus terminalisszal az L3 és L4

csigolya között ér véget, innen indul lefelé a farokcsigolyákig a megnyúlt, vékony FT

(1. ábra).

Hozzánk idıben közelebb álló leírásokból az derül ki, hogy emberben a gerincvelı

a conus medullarisszal bezárólag a velıcsı caudalis részébıl differenciálódik. A

6

velıcsıvel együtt fejlıdı dúclécbıl származnak a gerincvelıi ganglionok. A FT viszont

már a farokbimbóból származik (Nievelstein és mtsai., 1993)

.

Patkányokon, a conus medullarison végzett kísérleteink során észrevettük, hogy a

CM-FT átmenetnél sem a canalis centralis, sem a fehérállomány nem szőnik meg,

hanem folytatódik a filum terminaléban. Ez után az sem volt meglepı, hogy a

szürkeállomány sem ér véget, hanem több lépésben átalakul, és egy része szintén

folytatódik a filum terminaléban. Ezen megfigyelés adta az ötletet, hogy a FT

neurohisztológiai szerkezetét módszeres vizsgálatokkal derítsük fel.

I. táblázat: Az irodalmi adatok összefoglalása

Kísérleti állat Neuronok Idegrostok Szinapszisok Glia sejtek Hivatkozás Béka degenerált

neuronok + +

González-Robles és Glusman (1979)

Béka liquorkontakt neuronok; speciális, arcuate neuronok

+ +

Chesler és Nicholson (1985)

Béka neuronok elektrofiziológiai vizsgálatok)

+ Chvátal és mtsai 2001)

Macska + +(?) + Miller (1968) Macska liquorkontakt

neuronok + +

Rascher és mtsai 1988)

Humán fetus degenerált neuronok

degenerált idegrostok

+

Gamble (1971)

Humán degenerált neuronok

degenerált idegrostok

+

Choi és mtsai (1992)

1. ábra. A filum terminale kialakulásának sémás ábrája Streeter (1919) szerint.

7

A FT szerkezetével foglalkozó, régebbi, egy kivételével neurohisztológiai

kutatások eredményeinek összefoglalását az I. táblázatban találjuk meg. Nem meglepı,

hogy glia sejteket mind a két állat speciesben, és az emberi anyagban is találtak a

kutatók. Idegrostokat is ki lehetett mutatni a béka és macska filum terminaléban, az

emberi filum terminaléban mindkét szerzı degenerált idegrostokat talált. Neuronok

kimutathatók a béka filum terminaléban mind morfológiai, mind neurofiziológiai

módszerekkel. Az ependyma sejtek közé ékelıdı liquorkontakt neuronokat találtak

békában és macskában. A humán FT vizsgálatokat bemutató közleményekben

degenerált neuronokról lehetett olvasni.

Amennyire ritkán lehetett a FT mikroszkópos szerkezetét leíró, neurohisztológiai

módszereket alkalmazó közleményt találni, annál több publikáció jelent meg a klinikai

gyakorlatból. Vascularis malformatiok (Hurst és mtsai, 1999), velıcsı záródási zavarok

(dysraphismus; Phuong és mtsai, 2002; Wagner és mtsai, 2002) és különösen a rövid FT

által okozott komplex panaszok (rögzített gerincvelı = tethered spinal cord; Selcuki és

Coskun, 1998; Yamada és mtsai, 2000) eredetének magyarázatára a filum terminaléhoz

nyúlnak vissza a klinikusok. A „tethered spinal cord syndrome” klinikai tünetegyüttes,

amelynek az alapja a feszülés által kiváltott neuronális mőködészavar. Klinikailag az

alsó végtagon jelentkezı motoros és érzı zavarokból, inkontinenciából, és deformitások

(scoliosis, fokozott lordosis) kialakulásából áll (Yamada és mtsai., 2001). A neuronális

mőködészavar feltételezett okát a gerincvelı lumbo - sacralis szakaszában jelentkezı,

megzavart oxidatív folyamatokban keresik. Különbözı tényezık (tumor,

meningomyelocele), közöttük kitüntetett helyen a tethered cord syndrome „húzzák” a

gerincvelı caudalis részét a gerinccsatorna vége felé. Az így kialakuló feszítettség az a

mechanikai tényezı, amely a vérellátás megzavarásával a mitochondriumokban

kialakuló oxidatív folyamatok zavarához vezet.

8

2. Célkitőzések

A CM és a FT módszeres neurohisztológiai kutatásával az alábbi körülményeket

kívántuk felderíteni:

I. Hogyan alakul át a gerincvelı szürkeállományának szerkezete a CM-FT

átmenetnél? Ismert, hogy a szürkeállomány a központi területbıl (central core) és ehhez

kapcsolódó hátsó-, mellsı- és oldalsó szarvból áll (Réthelyi, 1976). A szürkeállomány

transzformációja kapcsolatba hozható-e a fenti szerkezet részenkénti megszőnésével

vagy átalakulásával?

II. A klasszikus neurohisztológiai módszerek alkalmazása mellett a neuronok és

glia sejtek neurokémiai jellemzésére használatos ellenanyagokkal kívántuk kideríteni

laboratóriumi fehér patkányban a FT chemoarchitecturáját.

III. A fénymikroszkópos vizsgálatok eredményei alapján vizsgáltuk a FT

ultrastruktúráját laboratóriumi fehér patkányban, macskában és majomban.

IV. A FT és caudalis gerincvelı között neuronális összeköttetések lehetıségét

nyomkövetı (tracer) anyagok befecskendezésével kívántuk megismerni (elızetes

eredmények).

V. A morfológiai vizsgálatok eredményeinek az értékelésével kerestük a

magyarázatot arra, hogy a neuronokban igen változatos FT hogyan kapcsolódik

szerkezetében és funkcionálisan a központi idegrendszer egyéb területeihez és a

perifériához.

9

3. Módszerek

3.1 Kísérleti állatok

Az állatkísérleteket az Állatvédelmi Törvény, a Semmelweis Egyetem

Állatkísérleti Bizottságának Állatvédelmi Szabályzata és az ÁNTSZ 1809/003/2004

számú engedélye alapján végeztük.

A vizsgálatokat Sprague-Dawley (Charles River, Magyarország) mindkét nembeli

felnıtt patkányokon (260-280 g) végeztük. A standard körülmények között tartott

állatok (ketrecenként négy) a szabványos tápot (CRLT AM, Charles River,

Magyarország) és a vizet szabadon fogyaszthatták. A helységek állandó hımérséklete

(21±1oC) és 12 órás sötét/fény periodicitása (a világítás kezdete reggel 6:00 óra)

biztosítva volt.

Kísérleteink során különbözı nemő házimacskák (3 állat) caudalis gerincvelıi

szakaszát is vizsgáltuk. Ezen állatok a patkányokhoz hasonló módon, az elıírt

körülmények között voltak tartva.

Morfológiai összehasonlítás céljából, munkánk során 1 hím, felnıtt Rhesus majom

(Macaca mulatta, Dr. Karmos György ajándéka) caudalis gerincvelıi szakaszát

vizsgáltuk elektronmikroszkópos módszerrel.

3.2 Fixálás és metszetkészítés

A kísérleti állatokat (fehér patkányokat és házimacskákat) mély narkózisban,

ketamine (Calypsol) és xylazine (Primazine) 1:2 arányú kombinációját alkalmazva

transzkardiális perfúzióval fixáltuk. A fixáló oldat összetétele a további vizsgálatok

követelményeitıl függött. A rögzített gerincvelıt kivettük a felnyitott gerinccsatornából,

a vizsgálandó szakaszokat (CM és/vagy FT) 5 mm hosszúsága szakaszokra vágtuk szét.

A 40-60 µm vastagságú transzverzális metszetek Vibratómmal készültek. A gerincvelı

hosszában történı szerkezeti változások megfigyelése érdekében a metszeteket ötös

csoportokban szedtük fel és tároltuk. Indokolt esetben hosszmetszetek is készültek a

filum terminaléról. A metszetek egy részét 1%-os toluidinkék oldattal festettük meg. A

metszetek másik csoportján egy vagy több immunszérum alkalmazásával a neuronok

10

kémiai tulajdonságait tanulmányoztuk. A metszetek harmadik csoportját elektron-

mikroszkópos vizsgálatok céljára dolgoztuk fel.

A hímnemő Rhesus majom gerincvelıjének feldolgozását (5 kg) elızetes 4%-os

formaldehyddel történı fixálás után kezdtük el. Elsıként laminectomiát végeztünk,

majd a caudalis gerincvelıt 4%-os formaldehyd és 1%-os glutáraldehyd keverékében

utófixáltuk. Az érintett gerincvelı szakaszt 5 kisebb részre vágtuk és a standard

elektronmikroszkópos víztelenítést és beágyazást végeztük el. A beágyazott anyagból

0,5 µm vastag félvékony metszetek készültek, melyeket 1%-os toluidinkék oldattal

festettünk meg. A kijelölt területekbıl ultravékony metszetek készültek.

3.3 Többes immunfluoreszcens jelölés - konfokális mikroszkópia

Immunhisztokémiai vizsgálatokhoz a patkányokat és macskákat 4%-os frissen

elkészített, pH 7, 4-re pufferolt formaldehyd oldattal perfundáltuk. A szövetmintákat

elıször 0,1 M foszfát pufferben mostuk, majd 10%-os agarba (Sigma) ágyaztuk. Az

agarba ágyazott szöveteket 50 µm vastag transzverzális és longitudinális Vibratóm

metszeteket készítettünk. Pufferes mosás után antigén feltárást végeztünk 50%-os

alkoholban. Az alkohol kimosása után a nem specifikus kötıhelyeket 3%-os normál ló

szérummal (Vector) blokkoltuk 30 percig. A metszeteket 2 napig inkubáltuk a

különbözı primer antitest koktélokban, +4oC-on. Az antitestek felsorolása a II.

táblázatban olvasható.

Az elsı inkubálást követıen többször váltott 0,1 M foszfát pufferben mostuk a

metszeteket. A második inkubálást a megfelelıen összeállított, fluorofórral jelölt

másodlagos antitest koktélban végeztük el, +4oC-on, 1 éjszakán keresztül. Alkalmazott

fluorofórral jelzett szekunder ellenanyagok: szamárban termelt nyúl-ellenes antitest (1:

500, Alexa 488), egér-ellenes antitest (1: 500, Alexa 594), kecske-ellenes antitest (1:

200, Cy5), mindegyik Molecular Probes termék. Alapos pufferes mosás után

zsírtalanított tárgylemezre húztuk fel, majd Vectashielddel (Vector) fedtük le a

metszeteket. A metszeteket fénytıl védve, -20oC-on tároltuk. Az immunhisztokémiai

reakciók elemzését Bio-Rad Radience 2100 Rainbow konfokális mikroszkóp se-

gítségével végeztük el. Az ábráknál feltüntettük, ha az ábra több, mint egy optikai

metszetbıl származó kép összessége.

11

II. táblázat: Primer antitestek hígítása és eredete

Antitest Állatfaj Felhasznált koncentráció

Gyártó

Calcitonin gene-related peptide (CGRP)

Kecske 1: 1000 Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg

Calretinin Nyúl 1: 2000 Millipore (Chemicon), Budapest

Cholin acetyltransferase (ChAT)

Kecske 1: 100 Millipore (Chemicon), Budapest

Enkephalin Egér 1: 1000 Millipore (Chemicon), Budapest

Glial fibrillary acidic protein (GFAP)

Nyúl 1: 5000 Sigma-Aldrich, St. Luise, Mo. USA

Glycin transporter 2 (GLYT2)

Bárány 1: 2000 Millipore (Chemicon), Budapest

Neurokinin 1 receptor (NK-1r)

Nyúl 1: 2000 Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg

Neuron-specific nuclear protein (NeuN)

Egér 1: 1000 Millipore (Chemicon), Budapest

Nitric oxide synthase (NOS) Kecske 1: 2000 Dr. Emson ajándéka

Oligodendrocita (NS-1 RIP) Egér 1: 30000 Millipore (Chemicon), Budapest

Protein kinase C (PKC) gamma

Nyúl 1: 1000 Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg

Serotonin Nyúl 1: 5000 DiaSorin, Stillwater, MN, USA

Substance P Patkány 1: 200 AbD Serotec (Oxford Biotechnology Ltd.)

Synaptophysin Egér 1: 20000 Novocastra (Biomarker Ltd), Budapest

Vesicular glutamate transporter 1 (VGLUT1)

Tengeri-malac

1: 1000 Millipore (Chemicon), Budapest

Vesicular glutamate transporter 2 (VGLUT2)

Tengeri-malac

1: 10000 Millipore (Chemicon), Budapest

A neuron-specific nuclear protein (NeuN) immunreakcióval jelzett neuronális

sejtmagokat ábrázoló metszeteken quantitatív becslést végeztünk. A 40-60 µm vastag

metszetekbıl egymástól 4 µm távolságra optikai metszeteket készítettünk. Az optikai

metszetekbıl készített felvételeken megszámoltuk, hogy a neuronok, amelyeket a

sejtmagjuk képviselt, hány optikai szinten voltak követhetık. Több sorozat átvizsgálása

után azt találtuk, hogy a neuronok 10%-a két optikai metszeten, 53%-a legalább három

optikai metszeten, 26%-uk legalább négy optikai metszeten, és 11%-uk legalább öt

optikai metszeten volt követhetı. A FT cranialis szakaszán 75-85 NeuN pozitív neuront

lehetett megszámolni, a fenti arányokat figyelembe véve 8 olyan neuron került

metszésre, amely csak két metszetben, 39 olyan, amely három metszetben, 20 neuron,

12

amely négy metszetben és 8 neuron, amely öt metszetben szerepel. Ha a neuronok

számát elosztjuk az elıfordulási gyakoriságukkal (vagyis a sejtmagok hosszméretével),

akkor elfogadható közelítéssel kapjuk meg a 4 µm vastag optikai metszetben lévı

neuronok számát, ami a fenti példában 8/2+39/3+20/4+8/5 = 4+13+5+2 =24.

3.4 Elektronmikroszkópos feldolgozás

Elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz az állatokat intrakardiális perfúzióval

fixáltuk, olyan aldehyd fixálóval, mely 2,5% formaldehydet és 1,5% glutáraldehydet

tartalmazott (pH 7,4). Pufferes (0,1 M foszfát puffer) mosás után 1%-os ozmium-

tetroxidban (Sigma) utófixáltuk a szövetblokkokat, 1 órán keresztül. Ezután felszálló

alkoholsorban, majd propilén-oxidban (Sigma) víztelenítettük és felszálló Durcupan

(Fluka) koncentrációban infiltráltuk a mintákat. A kis szövetdarabokat lapos beágyazó

formába helyeztük, majd tiszta Durcupanba ágyaztuk. A blokkokat úgy orientáltuk a

beágyazó formában, hogy azokból transzverzális metszeteket lehessen készíteni. A

caudalis gerincvelı rostrendszerének vizsgálata céljából longitudinális irányultságú

metszeteket is készítettünk. Ezután a beágyazott anyagot 56°C-os termosztátba

helyeztük, ahol 48 órán keresztül polimerizálódott. Az elektronmikroszkópos

analízishez Reichert ultramikrotómmal készítettünk metszeteket. Elıször 0,5 µm vastag

félvékony metszetek készültek, melyeket tárgylemezen szárítottunk és 1%-os

toluidinkék oldattal festettünk meg. A metszetekben kijelölt területekbıl ultravékony

metszetek készültek. A metszetek kontrasztozása 5%-os uranilacetáttal (Merck) és

Reynolds-féle ólomcitráttal történt. Az elektronmikroszkópos metszeteket JEOL

elektronmikroszkópban vizsgáltuk.

3.5 BDA neuronális pályajelölés

Mindkét nemhez tartozó, 5 felnıtt Sprague-Dawley patkány esetében biotinilált

dexránamin (BDA-10000, Sigma) neuronális jelölést végeztünk. A BDA-t fiziológiás

sóoldatban 10%-os koncentrációra hígítottuk. A pályajelölési procedúrát mély

narkózisban, aszeptikus körülmények között végeztük el. A caudalis gerinccsatorna

feltárása után a lumbosacralis gerincvelıi átmenetnél vékony kapilláris üveggel (átmérı:

0,3 µm) állatonként 5 µl BDA-t sikerült a gerincvelı állományába juttatni. A megfelelı

szöveti rétegek egyesítése után minden mőtött állat külön ketrecbe került. Egy hetes

túlélési idı után az állatokat mély altatásban, 4%-os formaldehyddel fixáltuk a fent

13

leírtak szerint. A vizsgált gerincvelı szakaszból 50 µm vastag Vibratóm metszetek

készültek, melyeket 0,1 M foszfát-pufferben győjtöttünk. A metszeteket 2 órán keresztül

inkubáltuk peroxidázzal jelölt avidin-biotin oldatban (Vectastain Elite, Vector). A

specifikus jelölést diaminobenzidin (DAB) reakcióval tettük láthatóvá. A metszeteket

tárgylemezre húztuk fel és felszálló alkoholsorban víztelenítettük majd DEPEX-xel

(Fluka) lefedtük. A metszeteket LUCIA (Nikon) képanalizáló rendszer segítségével

vizsgáltuk és fényképeztük.

3.6 Golgi – Kopsch módszer

Négy fiatal Sprague-Dawley patkányt (60–80g) transzkardiális perfúzióval

fixáltuk 4%-os formaldehyd és 1%-os glutáraldehyd kombinációját tartalmazó 0,1 M

foszfát pufferel (pH 7,4). A perfúzió körülményei megegyeztek a fent leírtakkal.

Laminectomiát végeztünk, majd a gondosan preparált caudalis gerincvelıt en block

(metszés nélkül) 3,6%-os káliumbikromát (Sigma) oldatba helyeztük, ahol a szövetet

négy napon keresztül tartottuk. Ezután a mintát többször desztillált vízben, majd 0,75%-

os ezüstnitrát (Sigma) oldatban öblítettük. Ugyanezen oldatban a szövetmintát 24 órán

keresztül pácoltuk, fénytıl óvott helyen. A CT és FT területeirıl 80-100 µm vastag

transzverzális metszetek készítettünk Vibratómmal, majd a metszeteket zselatinnal

bevont tárgylemezen rögzítettük. A preparátumok értékelését és fényképes analízisét

LUCIA (Nikon) képanalizáló rendszer segítségével végeztük el.

14

4. Eredmények

4.1 A szürkeállomány morfológiai transzformációja a gerincvelı caudalis részén

Ozmiumozott vastag és toluidinkékkel festett félvékony metszeteken végzett

vizsgálataink azt mutatták, hogy a CM cranialis részének keresztmetszetén a gerincvelı

szürkeállományának klasszikus elemei ismerhetık fel: a hátsó szarv, az intermedier

zóna és az elülsı szarv. Megkülönböztethetık az áttetszı substantia gelatinosa (lamina

II2) és az alatta lévı tömöttebb laminák (lamina III és IV), melyek a hátsó szarv részét

képezik. A canalis centralist az intermedier zóna szürkeállománya veszi körül. A

keresztmetszeti képeken myelinhüvellyel borított rostok jelölik a hátsó szarv és az

intermedier zóna határát. Az elülsı szarv nagy átmérıjő, alfa típusú motoneuronokat

tartalmaz, amelyek kisebb-nagyobb csoportokat alkotnak. A motoneuronok között

longitudinális irányban rendezett dendritek keresztmetszetei láthatók (2A ábra).

Caudalis irányban haladva, a szürkeállomány morfológiai transzformációjának

elsı lépése a motoneuronok perikaryonjainak eltőnésével jellemezhetı. Emellett a

szürkeállomány területének jelentıs csökkenése figyelhetı meg a metszetekben. A

motoneuronok keresztmetszetben látható dendritjei még felismerhetık az elülsı

szarvban, melynek mérete jelentısen csökken. A hátsó szarvak elkülönülnek a canalis

centralist körülvevı szürkeállománytól. A canalis centralis dorsalis végének

magasságában a szürkeállomány kezd lefőzıdni. A hátsó szarv általános megjelenése

nem változott (2B ábra).

A CM végsı szakaszán a szürkeállomány a majdnem önállóvá vált hátsó

szarvakból és a canalis centralist körülvevı intermedier zónából áll (2C ábra). A hátsó

szarvban a myelinhüvellyel borított rostok kötegeinek térfogata és a substantia gelatinosa

állománya is jelentısen csökken. Majd a mellsı szarvat követıen hátsó szarvak is

teljesen eltőnnek. A gerincvelı ezen caudalis területe a FT (3. ábra).3

2 A gerincvelı szürkeállományának a felosztásában, a konvencióknak megfelelıen, a Rexed (1954) által leírt réteges beosztást követtük. 3 Az értekezés 2. és 3. ábráit a Brain Research szerkesztısége a folyóirat 1028 (2) füzetének – amely az eredeti közleményt tartalmazta (Réthelyi és mtsai, 2004) - a címlapjára tette.

15

A conus medullarisban a hátsó szarv fokozatos átrendezıdését és eltőnését

immunhisztokémiai módszerrel vizsgáltuk tovább.

A mellsı szarvak eltőnését követıen a hátsó szarvak egyre inkább oldalfelé

dılnek, dorsalis felszínüket csak vékony fehérállomány borítja. Az ozmiumozott

félvékony metszeteken jól látszik az ozmiummal alig reagáló, felszínes áttetszı csík,

majd ettıl ventromedialisan az ozmiummal reagáló sötétebb terület (4. ábra). Mivel az

ozmium az idegrostokat körülvevı myelinhüvellyel lép reakcióba, az áttetszı felszínes

csík megfelel a myelinhüvely-mentes substantia gelatinosának, a mélyebb terület a

lamina III és IV réteg.

A 4. ábrán látható keresztmetszetnek megfelelı szintben készített Vibratóm

metszeten az elsıdleges érzı rostok három csoportjának hátsó szarvi végzıdését

vizsgáltuk többes immunhisztokémiai reakcióval (Réthelyi és mtsai, 2008). A vékony

érzı rostok egy csoportjára jellemzı calcitonin gene-related peptide (CGRP) jelölés a

2. ábra. Ozmimummal kezelt Vibratóm metszetek a CM cranialis (A), középsı (B) és caudalis részébıl (C). A szürkeállomány részei: hátsó szarv (Hsz), zona intermedia (ZI) és mellsı szarv (Msz). A cranialis metszetben a mellsı szarvban motoneuronok (nyilak) találhatók. A középsı metszetben a mellsı szarv nagyrészt eltőnt, a motoneuronok hosszanti lefutású dendritjeinek csoportja (nyilak) követhetı. A caudalis metszetben a mellsı szarv teljesen eltőnt, a canalis centralis (CC) két oldalán a zona intermediát találjuk. A hátsó szarvakat a fehérállomány rostkötegei (nyilak) egyre teljesebben elválasztják a zona intermediatól. Mérték: 100 µm

3. ábra. A FT keresztmetszete, toluidinkék-kel festett félvékony metszeten. A résszerő canalis centralis (CC) mindkét oldalán kiter-jedt szürkeállomány (SZÁ), a metszet perifé-riáján idegrostokat tartalmazó fehérállomány (FÁ) található. Mérték: 100 µm

16

hátsó szarv perifériás csíkjában, az áttetszı területnek megfelelıen jelentkezett, míg a

vastag érzı rostok végzıdésére jellemzı vesicular glutamate transporter 1 (VGLUT1)

jelölés a hátsó szarvnak a ventromedialis részét fedte be. Izolált CGRP jelölést találtunk

a VGLUT1 által jelzett területen is (5A ábra). CGRP és IB4 jelölés együttes

alkalmazásával kiderült, hogy az IB4 pozitív idegrostok is, amelyek a vékony érzı

rostoknak egy másik csoportját jelentik, a hátsó szarv felszínes részében, annak inkább a

ventralis csíkjában, a CGRP pozitív idegrostokkal részlegesen átfedve találhatók (5B

ábra). Az érzı rostok három csoportjának - vékony rostok: CGRP és IB4, vastag rostok:

VGLUT1 - a conus medullarisban látható végzıdési mintázata mindenben megegyezik

a lumbalis szelvényekben látottakkal.

A CM caudalisabb területén, a hátsó szarv szerkezet az ozmiumozott félvékony

metszeten váratlan aszimmetriát mutatott. Az ábrán bal oldali hátsó szarvban eltőnt, míg

a másik oldalon a hátsó szarv lateralis területére zsugorodott a felszínes áttetszı csík

(substantia gelatinosa; 6. ábra). Hasonló keresztmetszeti szintben készített Vibratóm

metszeten, az immunhisztokémiai eredményekben hasonló eltérés mutatkozott. Az

egyik oldali hátsó szarvban nem kaptunk IB4 jelölıdést, míg az ellenoldalon az IB4

jelölıdés a hátsó szarv lateralis részére szorítkozott (7B ábra). Megváltozott a CGRP

4. ábra. Ozmiummal kezelt Vib-ratóm metszet a CM középsı ré-szébıl (az ábra azonos az 2B ábrával). A hátsó szarv felszínes csíkjaként az áttetszı substantia gelatinosát (SG) találjuk, mélyeb-ben a myelinhüvelyes rostokat tar-talmazó lamina III-IV helyezke-dik el. Mérték: 100 µm

5. ábra. A 4. ábra síkjának megfelelı Vibratóm metszetek, hár-mas immunhisztokémiai jelölés. A: CGRP tartalmú rostok (piros) mezıszerően kitöltik a hátsó szarv felületes csíkját, és egyenként megjelennek a hátsó szarv mélyebb rétegeiben is (nyilak), amelyet szintén mezıszerően, a myelinhüvelyes ros-tokat jelölı VGLUT1 pozitivitás (zöld) tölt ki. B: A CGRP (piros) és az IB4 (zöld) jelölés a hátsó szarv felszínes csíkjában jelentıs átfedést mutat (sárga). Mérték: 100 µm

17

jelölıdés elrendezıdése is. Ahol az IB4 jelölıdés kiesett, azon az oldalon a CGRP

pozitív idegrostok a hátsó szarv felszínén, vékony csíkban maradtak meg. Ugyanilyen

felszínes, vékony jelölıdést találtunk az ellenoldalon a hátsó szarv medialis felében,

míg lateralisan, az IB4 jelölıdéssel együtt kiterjedt, részben átfedı CGRP jelölıdést

találtunk (7A ábra). A VGLUT1 jelölıdés a baloldalon kiterjed az egész hátsó szarvra.

Ellenoldalon a hátsó szarv medialis felében az immunjelölés eléri a hátsó szarv

felszínét, lateralisan nem terjed ki arra a területre, ahol az IB4-CGRP jelölés található

(7A ábra).

A következı ábrasor ugyanezt a jelenséget ábrázolja a CM különbözı szintjeiben,

egy másik állatban. Az IB4-CGRP átfedı immunjelölés aszimmetrikus a hátsó

szarvban. Az IB4 jelölt elsıdleges érzı rostok teljesen, a CGRP jelölt elsıdleges érzı

rostok túlnyomó többségükben eltőntek még mielıtt a hátsó szarv eltőnne a CM

caudalis végén. A hátsó szarv mélyebb rétegeiben végzıdı vastag myelinhüvelyes

rostok, amelyeket a VGLUT1 immunszérum jelöl, fokozatosan kitöltik a teljes hátsó

szarvat. A CGRP jelölés megmarad a hátsó szarv felszínén, valamint izolált rostokként

a hátsó szarv mélyebb részeiben is (8A, B és C ábra).

6. ábra. Ozmimummal kezelt Vibratóm metszet a CM cau-dalis részébıl (az ábra azonos az 2C ábrával). A hátsó szarvban bal oldalon eltünt a substantia gelatinosa, az el-lenoldali hátsó szarvban is csak foltszerően, lateralisan található meg (*). Mérték: 100 µm

7. ábra. A 6. ábra síkjának megfelelı Vibratóm metszet, hármas immunhisztokémiai jelölés. A: CGRP tartalmú rostok (piros) me-zıszerően csak a jobb oldalon, a hátsó szarv lateralis felében ta-lálhatók (*). Ellenoldalon és jobb oldalon medialisan a rostok a hátsó szarv felszínén alkotnak hálózatot, 1-1- CGRP pozitív ideg-rost a hátsó szarv mélyebb részeiben is látható (nyilak). A VGLUT1 pozitív idegrostok (zöld) mezıszerően kitöltik a hátsó szarvat. B: A CGRP (piros) és az IB4 (zöld) jelölés közti átfedés (sárga) jelentıs a jobb oldali hátsó szarv lateralis részén (*). A *-gal jelölt területek hasonlósága a 6. és 7. ábrákon meggyızı. Mérték: 100 µm

18

8. ábra. Vibratóm metszetek a CM cranialis (A), középsı (B) és caudalis szakaszáról (C), hármas immunjelölés. Cranialisan a CGRP jelölés (piros) mezıszerően kitölti a hátsó szarv felszínes csíkját (A), a két oldal között jelentıs aszimmetria látható. A me-zıszerő CGRP jelölés az egyik oldali hátsó szarv lateralis oldalára zsugorodik a CM középsı szakaszán (B). Izolált CGRP pozi-tív idegrostokat (nyilak) találunk craniali-san a hátsó szarv mélyebb rétegében, a kö-zépsı és caudalis szakaszon a hátsó szarv felszínén, és mélyén (B és C). IB4 jelölés (zöld) mezıszerő és aszimmetrikus a crani-alis metszeten (A), egy oldalra szorítkozik a középsı metszeten (B), és csak kis folt-ban látható a caudalis metszeten (C). A VGLUT1-gyel jelölt myelinhüvelyes ros-tok (kék) a hátsó szarv mélyebb rétegében láthatók cranialisan (A), majd az IB4 jelö-lés eltőnésével párhuzamosan egyre na-gyobb területet foglalnak el a hátsó szarv-ból (B és C). Mérték: 100 µm

9. ábra. Vibratóm metszet a CM cranialis szakaszáról, kettıs immunjelölés (a 8A ábrán látható metszettel szomszédos metszet). NeuN immunreakció jelzi a neuronok peri-karyonjait (zöld). PKCgamma tartalmú neu-ronok a hátsó szarvban, aszimmetrikusan ta-lálhatók (piros). A két oldal közötti eltérés tükrözi a 8A ábrán az IB4 jelölésben látható eltérést.

19

A hátsó szarv területén NeuN jelöléssel a neuronok sejtmagjait, majd protein

kinase C (PKC) gamma jelöléssel a hátsó szarvi neuronoknak azt a csoportját tettük

láthatóvá, amelyek csíkszerően, nagyrészt a substantia gelatinosában helyezkednek el

(Polgár és mtsai, 1999). A PKCgamma jelölés, az érzı rostokhoz hasonlóan,

aszimmetrikus elrendezıdést mutat. A PKCgamma pozitív neuronok nagyrészt azon a

területen találhatók, ahol az IB4 pozitivitást mutató érzı idegrostok, illetve hiányzanak

azon a területen, ahol az IB4 immunjelölés már eltőnt (9. ábra).

4.2 A filum terminale szerkezete patkányban

4.2.1 Makro-mikroszkópos viszonyok

Patkányban a FT 2,4-2,8 cm hosszú. A CM-FT átmenetnél a FT szélessége 0,5-0,6

mm, amely distalis irányban, 5 mm-nyi távolságra 0,2-0,3 mm-re csökken. A FT

mellett, vele sokszor kötıszövettel és erekkel összekapcsolva találjuk a coccygealis

szelvényekbıl induló hátsó és mellsı gyökereket (10. ábra). Vizsgálataink a FT elsı,

1,0 cm hosszú szakaszára vonatkoznak.

Laboratóriumi fehér patkányban a CM-FT átmenet nem mutat éles szögeltérést, az

átmenet kívülrıl folyamatosnak tekinthetı. A két szakasz között, az 10. ábrán látható

intenzitásbeli különbség nem volt minden esetben látható. Ezért volt fontos, hogy a

CM-FT közötti határt a szürkeállomány szerkezetében is keressük. Az átmenet területén

azt a metszeti síkot tekintettük filum terminalénak, amelyben a hátsó szarv már nem

látszott.

A FT területén megfigyelhetı struktúrák: a canalis centralis, az ezt körülvevı kes-

keny szürkeállomány és a szintén keskeny fehérállomány. Caudalis irányban a FT to-

10. ábra. FT lupe nagyítású képe. A CM elkeskenyedik, és a filum terminaléban folytatódik. Az átmenetet nyilak jelzik. A cauda equniához tartozó gyökérre, amely a filum terminaléhoz rögzült, nyílhegy mutat. Mérték: 1 mm

20

vább vékonyodik. Fokozatosan eltőnik a szürkeállomány, de a myelinhüvelyes rostok

még hosszan követhetık (11. ábra).

A FT rostralis szakaszán a canalis centralis a gerincvelı más szakaszaihoz

hasonlóan sagittalis irányultságú. Lefelé haladva ebbıl a helyzetbıl haránt irányba

fordul, és a vizsgált FT metszeteken végig követhetı (11. ábra). A FT rostralis részébıl

készült félvékony metszetek közepén jól látható a keskeny lumenő canalis centralis,

amely dorso-ventralis irányban 100-120 µm hosszúságú.

4.2.2 Neuronok, gliasejtek

Vizsgálataink kezdetén azt kellett bizonyítanunk, hogy a filum terminaléban

neuronokból és gliasejtekbıl álló idegszövetet találtunk. A toluidinkékkel megfestett

félvékony metszeteken azonosítani tudtuk a kismérető neuronokat. Próbálkoztunk a

klasszikus Golgi módszerrel, de az elsı, másokat is meggyızı bizonyítékot az

immunhisztokémia módszerének és a neuronok sejtmagját kimutató antitest – NeuN –

alkalmazásával kaptuk. Az immunhisztokémia a neuronok azonosítása mellett lehetı-

séget adott a FT gliaszerkezetének a vizsgálatára is. Így együtt tudtuk vizsgálni az

11. ábra. Sorozat félvékony metszetek a filum terminaléból, toluidinkék festés. A FT cranialis részén (A és B) az ependyma sejtekkel bélelt canalis centralis (CC) függıleges helyzető, késıbb vízszintes-be fordul (C), majd lumene alig láthatóvá szőkül (D és E). A canalis centralis két oldalán lévı szürke-állomány a csatorna vízszintesbe fordulásával gyakorlatilag megszőnik (C), caudalisabban az epen-dyma sejtek, és néhány idegrost a periférián jelenti a filum terminalét. Az a. spinalis anterior átmet-szete (*) hosszan követhetı. A nyíl a cauda equinához tartozó gyökér metszetére mutat (D). Mérték: 50 µm

21

idegszövet három alapvetı komponensének – neuronok, astrocyták és oligodendrocyták

– kölcsönös elıfordulását a filum terminaléban. A neuronok kémiai sokféleségének a

kimutatása a vizsgálatok második szakaszában történt.

Toluidinkékkel megfestett félvékony metszeteken jól látszik a FT szerkezete (12.

ábra). A sagittalis állású canalis centralis két oldalán nagyobb (nucleus lateralis; NL), a

canalis centralistól dorsalisan kisebb szürkeállomány területet találunk (nucleus

dorsalis; ND). A magokat a különbözı vastagságú, myelinhüvelyes rostokat tartalmazó

fehérállomány veszi körül. A fehérállomány, mely 50-60 µm vastagságú, ventralisan és

két oldalról körülöleli a szürkeállományt, és FT legkülsı rétegét alkotja. A

fehérállományt fıként myelinhüvelyes rostok építik fel. A FT mellett gyakran láthatók

keskeny falú, de széles lumenő érképletek is.

A szürkeállományban a kismérető idegsejtek perikaryonjai már a toluidinkékkel

festett félvékony metszeten is egyértelmően felismerhetık. Keresztmetszeti képen a

perikaryonok kerek vagy enyhén ovális alakúak, a kerek sejtmag homogén szerkezető,

gyakran mutat behúzódást, a magvacska kerek, sötétre festıdik. Hosszmetszeten az

ugyancsak kerek perikaryonok mellett gyakran találtunk elnyújtott perikaryonokat is,

ugyancsak elnyújtott sejtmaggal (13. ábra). A perikaryonok mérete keresztmetszeti

képeken 8-15 µm, az ovális perikaryonok hosszmérete elérheti a 35-40 µm-t.

12. ábra. FT keresztmetszeti képe, félvékony metszet, toluidinkék festés. A canalis centralist az összefekvı ependyma sejtek (Ep) jelölik. A canalis centralis két oldalán lévı, összefüggı szürkeállományt neveztük nucleus lateralisnak (NL). A canalis centralis felett apró szürke-állomány szigetek láthatók, ezek összessége a nucleus dorsalis (ND). A fehérállomány U-alakban veszi körül a szürke-állományt. Dorsalisan, a nucleus dorsalis területén, hiányos. Mérték: 100 µm

22

A klasszikus Golgi módszer segítségével alig sikerült többet bemutatnunk,

minthogy a FT neuronjainak a perikaryonjai ovális alakúak és hogy nyúlványokkal

rendelkeznek (14. ábra).

14. ábra. FT, Golgi-Kopsch impregnáció. Neuronok kis csoport-ja impregnálódott a nucleus lateralisban (*). Betét jobbra lenn: A csillaggal jelölt neu-ronok nagyobb na-gyítással. A nyíl az orsó alakú perika-ryonból induló nyúl-ványra (valószínőleg dendrit) mutat. A két másik impregnálódott perikaryon eltérı fó-kúszsíkban helyezke-dik el. Mérték: 100 µm

13. ábra. FT nagy nagyítá-sú hosszmetszeti képe, fél-vékony metszet, toluidin-kék festés. A canalis cent-ralist az összefekvı epen-dyma sejtek (Ep) jelölik. A neuronok alakja helyenként kerek (nyíl), máshol a FT tengelyével megegyezı irány-ban elnyújtott (nyíl-hegy). A fehérállományban a myelin-hüvelyes idegrostok (az ábra alsó részében) hosszmetszetben találhatók. Tág lumenő eret * jelzi. Mérték: 100 µm

23

A NeuN segítségével egyértelmően tudtuk bizonyítani, hogy a filum terminaléban

apró neuronok gazdag hálózata található (15. ábra). A toluidinkékkel festett met-

szetekben találtakhoz hasonlóan a keresztmetszeti képeken a perikaryonok kerek vagy

enyhén ovális formájúak voltak, míg hosszmetszeten feltőntek a FT hosszában orientált

perikaryonok is (16. ábra). A neuronok gyakran kisebb csoportokban helyezkednek el.

Ezeket a csoportokat három, négy vagy öt sejt alkotja, gyakran a canalis centralis

közvetlen szomszédságában (15. ábra).

Ritkaságként tudunk bemutatni hosszmetszeti képen egy, a késıbbi vizsgálati

sorozatból származó, neurokinin 1 receptor (NK-1r) tartalmú neuront, amelyen nemcsak

az látszik, hogy a perikaryon hosszában orientált, hanem az is, hogy a perikaryon

mindkét végérıl hosszú, enyhén elágazódó dendritfa indul (17. ábra).

15. ábra. Kettıs immunjelölés a FT keresztmetszeti képén. A neuronok sejtmagját NeuN ellenanyaggal jelöltük (piros), a GFAP jelölés (zöld) az ast-rocyták nyúlványait tünteti fel. Az ependyma sejtek nem jelölıdtek. A neuronok peri-karyonjai kisebb csoportok-ban vagy elszórtan helyez-kednek el a szürkeállomány-ban. Gyakran találunk neu-ront az ependyma sejtek közvetlen közelében. CC = canalis centralis. Mérték: 100 µm

16. ábra. Kettıs immun-jelölés a FT hosszmet-szeti képén. A neuronok sejtmagját NeuN ellen-anyaggal jelöltük (piros), a GFAP jelölés (zöld) az astrocyta nyúlványokat tünteti fel. Az ovális ala-kú sejtmagok utalnak a neuronok elnyújtott a-lakjára. Mérték: 100 µm

24

Immunhisztokémia vizsgálataink során a sejtek azonosításával együtt gliasejtek

azonosítására alkalmas ellenanyagokat is használtunk. Nagyszámú glial fibrillary acidic

protein (GFAP) pozitivitást mutató sejtet is találtunk mind a szürke-, mind a

fehérállományban. A GFAP immunreaktív, tehát glia sejtek gazdagon elágazódó

nyúlványrendszerrel rendelkeznek. A gerincvelı más szakaszaitól eltérıen, a

glianyúlványok sugaras irányba rendezıdve haladnak a pia mater illetve a canalis

centralis felé (15. ábra). Az astrocyták átlagosan 4-6 µm átlagosan átmérıjőek, keskeny

cytoplazmájúak (18. ábra). Nyúlványaik radier irányban futnak keresztmetszeti képen,

míg hosszanti lefutású nyúlványokat találtunk a longitudinalisan metszett

preparátumokon, különösen az alsóbb FT szakaszokon (16. ábra).

A FT állományában GFAP pozitivitást mutató astrocyták mellett receptor

interacting protein (RIP) immunpozitivitást mutató oligodendrocytákat is tudtunk jelölni

(19. ábra). A FT szürke-, és fehérállománya nem különíthetı el a GFAP rajzolat alapján,

viszont a RIP pozitív oligodendrocyták jellemzı megoszlást mutatnak. A RIP

jelölıdések nagyobb nagyításban átmérıjükben változatos kis, győrőszerő

struktúrákként jelennek meg. A RIP jelölıdés gyenge a szürkeállományban és kifejezett

a fehérállományban, különösen az általunk váll-régiónak megnevezett dorsalis

fehérállomány csúcsoknál. Ezen területtıl dorsalisan a fehérállomány mintegy

félholdszerően - a gerincvelıi szelvényektıl eltérıen – nyitott.

17. ábra. NK-1r pozitív neuron a FT hossz-metszeti képén. A neu-ron dendritjei a FT hosszában húzódnak. Mérték: 100 µm

25

4.2.3. A filum terminale neuronjainak neurokémiai jellemzése

Mivel feltételeztük, hogy a filum terminaléban található nucleus lateralisok a

gerincvelıi szürkeállomány intermedier zónájának folytatásaként tekinthetık, ezért az

intermedier zóna neuronjainak azonosítására használt immunhisztokémiai markereket

alkalmaztuk vizsgálataink során (Boros és mtsai, 2008).

Hármas jelöléső fluoreszcens immunhisztokémiai reakciókban NeuN, nitric oxide

synthase (NOS) és calretinin antitesteket használtunk. NOS immunpozitivitású neuront

egyet, esetleg kettıt találtunk metszetenként. A NOS jelölés körbe vette a NeuN pozitív

sejtmagot, esetenként a dendritekben is megjelent (20A ábra). NOS jelölt neuronális

perikaryont gyakran figyeltünk meg canalis centralist bélelı ependyma sejtek

közelében. A jelölt neuronok többnyire a nucleus lateralis ventromedialis részében

helyezkedtek el, a nucleus dorsalisban nem találtunk NOS pozitív neuront.

Keresztmetszetben a NOS pozitív neuronok átmérıje átlagosan 7,96 µm (max: 11,96

µm, min: 5,2 µm, n=25). A citoplazmatikus jelölésen kívül NOS pozitív, finom

varikozitású axonok láthatók a FT szürkeállományában.

18. ábra. Kettıs immunjelölés a FT keresztmet-szeti képén. A neuronok sejtmagját NeuN el-lenanyaggal jelöltük (piros), a GFAP jelölés (zöld) az astrocyta nyúlványokat tünteti fel. A nyilak az astrocyták sejt testeire mutatnak. CC = canalis centralis. Részlet a 16. ábrából. Mérték: 10µm

19. ábra. RIP jelölt (zöld) oligodendrocyták a FT keresztmetszeti képén. Az immunrekció kirajzolja a fehérállományt. Különösen inten-zív immunreakciót látni a fehérállomány dor-solateralis részén (csillag). Mérték: 100 µm

26

Calretininnel jelölt neuronokat szintén azonosítottunk a filum terminaléban, egy-

egy metszetben akár több calretinin pozitív neuront is találtunk. Elıfordult, hogy a

jelölt neuronok dendritjeiben is látható volt az immunpozitivitás (20B ábra). Calretinin

pozitív neuronokat figyeltünk meg az ependyma sejtek mellett is, valamint a

fehérállományában vastag calretinin pozitív rostokat találtunk. Az immunpozitív rostok

gyakran futnak szimmetrikusan a fehérállomány dorsalis régiójával. A calretinin

pozitív neuronok átmérıje keresztmetszetben átlagosan 7,43 µm volt (max: 12,87 µm,

min: 3,50 µm, n=42). Mérési adataink alapján megállapítottuk, hogy a calretinin

pozitív neuronok száma a NOS pozititív neuronok számának kétszerese. A nucleus

lateralis ventralis részében csoportosan, nagyobb számban helyezkednek el a calretinin

pozitív neuronok, míg a dorsalis régióban az ependyma sejtek mellett láthatók. A

nucleus dorsalis ventralis határán csak igen ritkán figyelhetık meg calretinin pozitív

neuronok.

A nucleus lateralisban azonosítottunk kerek, choline acetyltransferase (ChAT)

immunreaktív neuronokat (21. ábra). Méréseink azt mutatják, hogy ezen neuronok

átlagos átmérıje 7,0 - 9,0 µm. Kezdeti, rövid dendritek gyakran láthatók. ChAT im-

20. ábra Hármas immunjelölés a FT keresztmetszeti képén. LN = nucleus lateralis, DL = nucleus dorsalis, CC = canalis centralis. A: NeuN (piros) és NOS (zöld) immunpozitív neuronok, a nyilak a NOS-pozitív neuron proximalis dendritszakaszaira mutatnak. Három optikai metszet. B: NeuN (piros) és, calretinin (zöld) immunpozitív neuronok, a nyíl a calretinin-pozitív neuron dendritjére mutat. Csillag jelzi a calretinin pozitív rostnyalábot a fehérállomány dorsolateralis területén. Négy optikai metszet. Mérték: 50 µm

27

munreaktív, finom varikozitású arborizáció látható a szürkeállományban, mind a

nucleus dorsalisban, mind a nucleus lateralisban.

A filum terminaléban az NK-1r pozitív neuronok a legnagyobb neuronok közé

tartoznak, melyek átmérıje keresztmetszetben 12 - 18 µm. Az immunreakció típusosan

körbejelöli a citoplazma és a dendritek extracelluláris membránjait (22. ábra). A canalis

centralist körbevevı ependyma sejtek körül gazdag NK-1r pozitivitással rendelkezı

dendritrendszer látható. Hosszanti metszetekben cranialis - caudalis irányultságú NK-

1r pozitív dendriteket találtunk. A szürkeállományban NK-1r pozitív, finom

varikozitású axonok haladnak, melyek a fehérállomány váll-régiójában kötegeket

alkotnak.

A horizontális síkban készített metszeteken kicsi, kerek citoplazmával

rendelkezı substance P (SP)-pozitív neuronokat találtunk, melyek gazdag dendritikus

arborizációval rendelkeznek. A metszetekben SP-pozitív, finom varikozitású axonok

láthatók (23A és B ábra).

21.ábra. FT keresztmetszeti képén ChAT- immunjelölt (zöld) neuronok láthatók (nyi-lak). CC = canalis centralis. Öt optikai met-szet. Mérték: 50 µm

22. ábra. FT keresztmetszeti képén a neuronok átlagához képest feltőnıen nagy mérető NK-1r immunjelölt neuron (piros), a neuron dendrit-jére nyíl mutat. A canalis centralist (CC) NK-1r pozitív neuronok dendritjei veszik körül. Vari-kózus, NK-1r immunpozitív axon nyaláb a váll-régióban (nyilak között). Tizenhét optikai met-szet. Mérték: 50 µm

28

A filum terminaléban fellelt axonok arborizációjuk elhelyezkedése alapján négy

csoportba sorolhatók:

1) kizárólag a nucleus dorsalisban arborizáló axonok,

2) elsısorban a nucleus latrealisban arborizáló axonok,

3) az egész szürkeállományban arborizáló axonok,

4) azon axonok, melyek fıként a váll-régióban arborizálnak.

1. Kizárólag a nucleus dorsalisban arborizáló axonok. A nucleus dorsalisban

CGRP immunpozitív rostok haladnak longitudinális irányban. A gerincvelı hátsó

szarvának felszínes lamináiban és a conus medullarisban CGRP és IB 4 immunreaktív

primer afferens rostok dús arborizációját figyeltük meg (4A és B ábra). A filum

terminaléban IB 4 pozitív rostokat már nem találtunk (24. ábra).

23. ábra Hármas immunjelölés a FT hosszmetszeti képén. A: NeuN jelölés az idegsejtek perikary-onjait tünteti fel (piros). Két neuron SP tartalmú (zöld; nyilak). A FT hosszában rendezett, NK-1r tartalmú (kék) vastag dendrit és vékony, varikozus axon (apró nyilak) láthatók. Tizennégy optikai metszet. Mérték: 50 µm – B: Az A ábra felnagyított részlete. A SP-pozitív neuronok (zöld) perika-ryonjaira nyilak mutatnak. Vékony, varikózus SP-pozitív axonok fogják körül az NK-1r festıdéső dendritet (kék). A SP jelölt axonoknál vastagabb NK-1r tartalmú axonra (kék) apró nyilak mutat-nak. Tizennégy optikai metszet. Mérték: 50 µm

29

2. Elsısorban a nucleus lateralisban arborizáló axonok. Ahogyan már korábban

ismertetésre került, NOS-, SP-, és NK-1r immunpozitív axon arborizációt figyeltünk

meg a FT szürkeállományában, fıként a nucleus lateralisban. Sőrő, rendkívül finom

vesicular glutamate transporter 2 (VGLUT2) pozitív rosthálózat van jelen a nucleus

lateralisban, a szürkeállományban (25A ábra). A nucleus dorsalisban igen kis mértékő

VGLUT2 pozitív arborizáció látható. VGLUT2 pozitív neuronokat nem azo-

nosítottunk.

A szinaptizáló axonterminálisok detektálására szinaptofizin immunreakciót

használtunk. Sőrő, igen finom szinaptofizin pozitív varikozitás borítja a nucleus

lateralist (25B ábra), míg a nucleus dorsalisban csak kis mértékben látható. A nucleus

lateralisban finom glycin transporter 2 (GLYT2) axon arborizáció figyelhetı meg.

3. Az egész szürkeállományban arborizáló axonok. Cranio-caudalis irányban

orientált VGLUT1 pozitív rostok és alkalmanként igen nagy mérető varikozitások

vannak jelen mind a nucleus dorsalisban és lateralisban is (24. ábra). Ezenkívül az

egész szürkeállományra ChAT pozitív axon arborizáció jellemzı (21. ábra).

4. Fıként a váll-régióban elágazódó axonok. A váll-régióban szerotonin pozitív

rostok dús hálózata figyelhetı meg (26. és 28. ábra), míg a nucleus lateralisban

elszórtan találunk jelölt rostokat. Enkephalin pozitív rostok szintén hálózatot alkotnak a

váll-régióban (27. és 29. ábra), ezen rostok fıként a nucleus lateralisban ágazódnak el.

Ezenkívül calretinin pozitív rostok alkotnak sőrő köteget a váll-régióban (20B ábra),

24. ábra. Kettıs jelölés a FT ke-resztmetszeti képén. CGRP immun-pozitív (piros) rostok a nucleus dor-salisban, a VGLUT1 (zöld) immun-pozitív rostok a szürkeállomány tel-jes területén láthatók. A nyilak a fi-lum terminalével párhuzamosan el-helyezkedı hátsó gyökerekben lévı VGLUT1 pozitivitást adó idegros-tokra mutatnak. Nyolc optikai met-szet. Mérték: 50 µm

30

valamint a fehérállomány ezen régiójában hálózatot alkotó, varikózus, NK-1r pozitív

axonok is láthatók ott (22. ábra).

25. ábra. Kettıs immunjelölés a FT keresztmetszeti képén. A: VGLUT2 pozitív axonvégzıdé-sek (piros) kirajzolják a nucleus lateralist (NL). B: Szinaptofizin-pozitív axonvégzıdések (zöld) ugyancsak a nucleus lateralisban halmozódnak. Betét balra fenn: Az axonvégzıdések jelentıs hányada mindkét antitesttel jelölhetı volt (sárga). CC = canalis centralis. Mérték: A és B 50 µm; betét: 10 µm

26. ábra. Kettıs immunjelölés a FT ke-resztmetszeti képén. Szerotonin-pozitív axonvarikozitások (zöld) láthatók a váll- régióban (*). Dús szinaptofizin jelölt va-rikozitások (piros) figyelhetık meg a nuc-leus lateralisban (NL). CC = canalis cent-ralis. Mérték: 50 µm

27. ábra. Kettıs immunjelölés a FT kereszt-metszeti képén. Enkephalin-pozitív axonvari-kozitások (piros) haladnak a váll-régióban (*). ChAT immunreaktív rostok (zöld) figyelhetık meg a szürkeállomány területén. Nyilak mutat-nak a filum terminalét kísérı mellsı gyökerek-ben lévı ChAT-pozitív idegrostokra. CC = canalis centralis. Mérték: 50 µm

31

4.2.4. Kolokalizációk, szoros kapcsolatok

A nucleus lateralisban a szinaptofizin és a VGLUT2 immunpozitivitás szinte

teljes kolokalizációt mutatott (25B ábra, betét). A váll-régióban a szerotonin pozitív

varikozitás részben kolokalizált a ChAT pozitív jelöléssel (28. ábra). SP és enkephalin

kettısen jelölt varikózus képleteket gyakran azonosítottunk a váll-régióban (29. ábra),

és ritkábban a nucleus lateralisban.

SP-vel jelölt varikózus struktúrák gyakran közvetlenül kapcsolódtak a NK-1r

immunpozitív neuronok perikaryonjaihoz és dendritjeihez (30. ábra). Ezenkívül,

GLYT2 immunpozitív, pontszerő képletek is kapcsolódtak a NK-1r immunpozitív

neuronok perikaryonjaihoz (30. ábra, betét).

28. ábra. Kettıs immunjelölés a FT kereszt-metszeti képén. Szerotonin (piros) immun-pozitiv rosthálózat kijelöli a váll-régiót. ChAT-pozitív rostrendszer (zöld) látható a nucleus dorsalisban (ND) és lateralisban (NL). Kettısen jelölt varikozitásokra nyilak mutatnak. Mérték: 50 µm

29. ábra. Kettıs immunjelölés a FT kereszt-metszeti képén. Az enkephalin (piros), és SP (zöld) immunpozitivitást mutató axonvarikozi-tások sőrőn kitöltik a váll-régiót (*). Számos varikozitás mindkét peptidet tartalmazza (sár-ga) Mérték: 10 µm

32

4.2.5 Quantitatív mérések eredményei

A FT szürkeállományában a NeuN immunpozitivitással megjelölt neuronok

három csoportban helyezkednek el. Az általunk nucleus dorsalisnak elnevezett terület a

canalis centralis dorsalis peremén található, és fehérállomány hiányában ezen terület

neuronjai elérik a gerincvelı felszínét. A canalis centralis két oldalán a nucleus

lateralisok találhatók, melyekben a neuronok egy része a canalis centralist bélelı

ependymasejtekkel közvetlenül érintkeznek. A dorsalis és lateralis magok között egy

neuron-szegény, általunk váll-régiónak (shoulder region) nevezett terület található.

A NeuN pozitív jelölést adó idegsejtek száma cranialisan a FT 1 µm-es

vastagságú konfokális mikroszkópos keresztmetszeti képsorozatán 75 - 85 db volt.

Ugyanilyen szeletvastagságban a FT caudalis szakaszán már csak 20 - 25 neuront

számoltunk. A neuronalis perikaryonok mintegy 10%-a mindössze két, egymástól 4 µm

távolságban lévı, optikai metszetben volt követhetı. A perikaryonok 53 %-a legalább

három, 26%-uk legalább négy és 11%-uk legalább öt optikai metszetben volt

követhetı. A Módszerek fejezetben leírt módon cranialisan a FT 5 mm hosszú

szakaszában a neuronok számát közelítıleg 37000-nek becsültük. Distalisabb irányban

haladva, hasonló szakaszra számolva, a neuronok száma 15000-re csökken.

Az optikai analízis során azt találtuk, hogy a neuronoknak több mint a fele

hosszanti irányban orientálódik. A FT tengelyével párhuzamos síkban metszett

30. ábra. Kettıs immunjelölés a FT ke-resztmetszeti képén. NK-1r jelölt perika-ryonok és nyúlványrendszer láthatók (pi-ros), SP tartalmú rosthálózattal (zöld). A nyilak az NK-1r jelölt perikaryonokhoz (P) és dendritekhez szorosan hozzáfekvı SP tartalmú varikozitásokra mutatnak. Három optikai metszet. Mérték: 10 µm. Betét jobbra lenn: A P1 jelzéső perika-ryon felszínéhez GLYT2 immunjelölt axonvégzıdések kapcsolódnak (nyilak). Három optikai metszet. Mérték: 10 µm

33

preparátumokban látottak (13. 16. és 17. ábra) mindenben támogatták ezt a meg-

figyelést.

4.2.6 Ultrastruktúra

A FT nucleus lateralisa elektronmikroszkópos szerkezetének áttekintı képét látjuk

a 31. ábrán. Jobb oldalon az ependyma sejtek sorakoznak. Az ependyma rétegtıl

lateralisan találjuk az apró idegsejtek perikaryonjait, majd az ábra bal széle már a

myelinhüvelyes rostokból álló fehérállományt mutatja. (A további elektron-

mikroszkópos képek is a nucleus lateralisból valók.)

31. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. Ependyma sejtek (Ep), neuronok perikaryonjai (N) és myelin-hüvelyes idegrostok a fehérállományban. Gl = astrocyta. Mérték: 10 µm. Betét jobbra lenn: Epen-dyma sejtek (E) nagy nagyítású képe. Nyilak az ependyma sejteknek csillóira mutatnak, melyek ki- töltik a canalis centralis lumenét. Mérték: 1 µm

34

Az ependyma sejtek sora között a canalis centralis lumene szők (32. ábra), a

lument gyakran csak az ependyma sejtek szabad felszínérıl kiinduló csillók jelzik (31.

ábra, betét). A fénymikroszkópos megfigyeléseket megerısítve, egy-egy neuron

szorosan hozzáfekszik az ependyma sejtek basalis felszínéhez (32. ábra). Olyan neuront

is találtunk, amelynek egy közepesen vastag nyúlványa két ependyma sejt között beért a

canalis centralis lumenébe (liquorkontact neuron; 32. és 40. ábra).

A FT 8-15 µm átmérıjő neuronjai keresztmetszeti képen, a fénymikroszkópos

leírásoknak megfelelıen, kerek, vagy ahhoz közel álló átmetszeti képet mutattak (33A

ábra). A szintén kerek átmetszető sejtmagban megtaláltuk az elektrodenz magvacskát. A

maghártyán a neuronokra jellemzı befőzıdés látható. A sejtmagot keskeny cytoplazma

szegély vette körül, a cytoplazmában az idegsejtekre jellemzı sejtalkotórészeket

találtuk. Hosszmetszeti képen a neuronok nagy része ovális átmetszetet mutatott, az

esetek többségében a sejtmag követte a perikaryon alakját (33B ábra). A perikaryonok

közötti térben megtaláljuk a gliasejteket, a kapilláris átmetszeteket és a központi

idegrendszer szerkezetére jellemzı neuropilt, amely a filum terminaléban is különbözı

32. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. A canalis centralist szegélyezı ependyma (Ep) sejtek között a lumen csak kis foltban látható (*). Neuronok perikaryonjai (N) a szürkeállományban, az ependyma sejtekkel érintkezve vagy nyúlványával az ependyma sejtek között (Nl = liquorkontakt neuron). Érátmetszet (Cap) látható a kép bal szélén a fehérállomány myelinhüvelyes idegrostjaitól körülfogva. Mérték: 20 µm

35

mérető, alakú és szerkezető sejtnyúlványok halmazából áll (33A ábra). A neuropilban

elsısorban a szinapszisokat tanulmányoztuk.

33A. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. Keresztmetszeti képen a neuronok perikaryonjai (N) kör alakúak. Gl = astrocyták. Cap = kapillárisok. Mérték: 10 µm

33B ábra. Hosszmetszeti képen a neuronok perikaryonjainak nagy része elnyújtott, ovális képet mutat (N). Mindkét képen látható a sejtmag és magvacska neuronokra jellemzı elektronmikroszkópos képe. Mérték: 10 µm

36

Hagyományos módon csoportosítottuk a szinapszisokat egyrészt a poszt-

szinaptikus komponens jellege (axo-szomatikus és axo-dendritikus szinapszisok),

másrészt a preszinaptikus végzıdésben található szinaptikus vezikulák alakja alapján.

Axo-szomatikus szinapszist keresni kellett, ritkán fordultak elı. A

preszinaptikus végzıdésben az ovoid szinaptikus vezikulák a szinaptikus membrán-

megvastagodás közelében csoportosultak (34. ábra). Axo-dendritikus szinapszisokat

keresés nélkül lehetett találni a szürkeállományban.

Az 1-2 µm mérető preszinaptikus végzıdések egyaránt kapcsolódtak a hasonló

mérető és a sokkal kisebb mérető posztszinaptikus képletekhez (35. ábra). Mivel sem a

fénymikroszkóppal, sem az elektronmikroszkóppal készült metszeteinkben nem

találtunk dendritikus tüskékre utaló képet, így fel kell tételeznünk, hogy a 35. ábrán

látható mindkét posztszinaptikus képlet dendrittörzs. Elképzelhetı, hogy a dendriteken

gyöngyfüzérszerően vastagabb és vékonyabb szakaszok váltogatják egymást (erre

utalhat a 23B ábrán bemutatott SP tartalmú neuron ágrendszerének hosszmetszeti képe),

és a vékony szakaszokon is elıfordulnak szinapszisok.

34. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. Axo-szomatikus szinapszist (nyílhegy) ritkán lehetett ta-lálni. Az axonvégzıdések (Ax1, Ax2, Ax3) ultrastruktúrája különbözött a szinaptikus vezikulák formája és sőrősége alapján. Egy axo-denritikus szinapszisra nyíl mutat. D = dendrit. Mérték: 1 µm

37

Jellemzı

szinaptikus elrendezıdésként találtuk a több (2-4) preszinaptikus végzıdésbıl álló axo-

dendritikus szinaptikus együttest, amit koszorú szinapszisnak neveztünk (36. ábra). A

preszinaptikus végzıdésekben különbözı alakú szinaptikus vezikulák is

elıfordulhatnak, az axonvégzıdések között axo-axonális kapcsolatokat nem találtunk.

35. ábra. Patkány FT ultrastruk-túrája. Axo-dendritikus szinapszisok eltérı for-mái. Bal oldalon lenn a posztszinaptikus dendrit (D) nagy mérető, míg jobbra fenn (nyíl) a posztszinaptikus dendrit alig 0,2 µm átmérıjő. Ax = axon. Mérték: 0,5 µm

36.ábra. Patkány FT ult-rastruktúrája. Axo-dendritikus „koszorú” szi-napszisok. Egy-egy dendritet (D) több, külön-bözı szerkeze-tő, szinaptizáló axonvégzıdés (Ax) vesz kö-rül. Mérték: 1 µm

38

A FT hosszmetszetein az axo-dendritikus szinapszisok – a fénymikroszkópos

eredmények által diktált elvárásoknak megfelelıen – a hosszában orientált dendritekhez

szakaszosan érkezı preszinaptikus végzıdések formájában mutatkoztak (37. ábra).

Ritkán lehetett szinaptikus kapcsolatot találni a nucleus dorsalisban. Erre a

területre a myelinhüvely nélküli, rendkívül vékony rostok tömege jellemzı, amelyek a

FT hossztengelye mentén orientáltak (38. ábra).

A FT szélén elhelyezkedı fehérállomány különbözı mérető myelinhüvelyes

axonokból áll, amelyek a FT hossztengelyének irányába orientáltak. Az idegrostok

átmérıje 0,2 µm és 3,0 µm között változik. A FT felszínén gliasejtek nyúlványai

képezik a központi idegrendszerre jellemzı borítást (membrana superficialis gliae).

Ugyanitt gyakran találtunk kapilláris érátmetszeteket is (39. ábra).

37. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. Hosszmetszetben a posztszinaptikus dendrit (D) orsó alakú kiszélesedésével szinaptizál két, eltérı szinaptikus vezikula tartalmú axonvégzıdés (Ax). Mérték: 1 µm

39

38. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. A nucleus dorsalira jellemzı vékony, keresztbe metszett idegrostok (*) nagy tömege látható. Mérték: 0,5 µm

39. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. A fehérállományt különbözı vastagságú myelinhüvelyes ideg-rostok (*) töltik ki. A FT felszínét borító pia matert nyíl jelzi. Cap = kapilláris, Gl = astrocyta. Mérték: 1 µm

40

Az elektronmikroszkópos vizsgálatok különlegességei közé sorolhatjuk a

liquorkontakt neuronokat és a canalis centralis lumenében talált axonvégzıdés

csoportot. A liquorkontakt neuronnak a canalis centralisba furakodó dendrit

nyúlványának szabad felszínét az ependyma sejtek csillói veszik körül. A fejszerően

kiszélesedı nyúlványt a szomszédos ependyma sejtekhez zonula adherens jellegő

membránspecializációk kapcsolják (40. ábra).

Meglepetésszerően találtunk a canalis centralisban több, egymáshoz szorosan

kapcsolt, de az ependyma sejtekkel nem szükségszerően érintkezı axonvégzıdést (41.

ábra). Az axonvégzıdések szokatlan elhelyezkedése mellett a legfeltőnıbb a sőrőn

elhelyezkedı, 90-100 nm átmérıjő vezikulák jelenléte volt (42A ábra). A vezikulák

mérete és formája alapján arra következtetünk, hogy a vezikulák noradrenerg

transzmittert tartalmaznak.

40. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. Neuron bunkó alakú dendritje (D) az ependyma sejtek között – liquorkontakt neuron. A canalis centralis lumenét az ependyma sejtek csillói (nyilak) töltik ki. A 32. ábrán bemutatott neuron nyúlványának nagyított képe. Mérték: 1 µm

41

A 42B ábrán bemutatott elemi vezikulákat tartalmazó axonvégzıdéseket

találtunk a nucleus lateralisban és FT peremén, a fehérállomány myelinhüvelyes

41. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. Az ependyma sejtek (Ep) között, a canalis centralis lumenében ayonvégzıdések (Ax) csoportja látható. Mérték: 2 µm

42. ábra. Patkány FT ultrastruktúrája. A: a 41. ábrán bemutatott axonvégzıdések nagyított képe. A végzıdésekben 90-100 nm átmérıjő vezikulák találhatók a szabályos mérető szinaptikus vezikulák-kal együtt. Mérték: 0,5 µm. B: A bal oldali ábrán bemutatott axonvégzıdéssel megegyezı végzı-dést lehetett találni a szürkeállományban is. Mérték: 1 µm

42

idegrostjai között is. Valószínőleg nem valódi végzıdés, hanem varikozitás az axon

mentén, mert egy esetben sem találtunk a „végzıdéshez” kapcsolódó szinapszist.

4.3 A filum terminale szerkezete macskában

Kölyök macska gerincvelıjében a CM-FT átmenet hasonlít a patkányban

találtakhoz. Caudalis irányba haladva eltőnnek a motoneuronok, majd a motoros szarv

is (43A ábra). A canalis centralis felsı végénél az oldalköteg fehérállománya egyre

inkább elválasztja a hátsó szarvat a zona intermediától. A hátsó szarv egyre kisebb lesz,

majd aszimmetrikusan eltőnik, a szürkeállomány csak a canalis centralis két oldalán

marad meg, és folytatódik a filum terminaléban. (43B ábra).

Toluidinkékkel festett félvékony metszeteken jól látható az ependyma sejtek

rétege, a patkány filum terminaléban látott különbség a szürke- és fehérállomány között

azonban macskában csak jelzetten látszik, ugyanis macskában, a FT külsı rétegében

myelinhüvelyes rostok csak elvétve fordulnak elı (44A ábra).

Az ependyma sejtek szabad felszínérıl finom, szabálytalan nyúlványok indulnak

a canalis centralis lumene felé, patkány filum terminaléban ilyen nyúlványokat,

fénymikroszkópos metszeteken, nem láttunk. A filum terminaléban található neuronok

43. ábra. A CM-FT átmenet macskában. Félvékony, ozmiumozott metszetek. A: A canalis centralis mindkét oldalán elhelyezkedı szürkeállomány megfelel a zona intermediának (ZI). Bal oldalon nyilak mutatnak két motoneuronra. A hátsó szarv lefőzıdése az intermedier zónáról már megkezdıdött. B: A canalis centralis szabálytalan alakú, mindkét oldalról szürkeállomány veszi körül. A hátsó szarvak eltőnése aszimmetrikus, bal oldalon már csak nyomokban látható. Mérték: 500 µm

43

macskában is apró neuronok, de ritkábban fordulnak elı, mint patkányban (44B és C

ábra).

Immunhisztokémiai vizsgálataink során lényeges eltérés találtunk patkány és

macska filum terminaléban a GFAP pozitív glia sejtek és nyúlványaik elhelyez-

kedésében. Szemben a patkányban látott haránt és hosszanti hálózattal, macska filum

terminaléban a sőrő GFAP pozitív rosthálózat átszıtte a FT teljes szélességét. Vékony,

GFAP pozitív nyúlványokat találtunk az ependyma sejtek rétegében, feltehetıleg az

ependyma sejtek között (45A ábra).

44A ábra. Macska FT, félvékony metszet, toluidinkék festés. A canalis centralist (CC) ependyma sejtek szegélyezik. A szür-ke- és fehérállomány között csak jelzett a határ. Mérték: 100 µm

44B ábra. Macska FT, félvékony met-szet, tolouidinkék festés, részlet az A ábrából. A szürke- és a fehérál-lomány közti határt szaggatott vonal jelzi. Mérték: 10 µm. 44C ábra. Macska FT, félvékony met-szet, toluidinkék festés, részlet az A ábrából. A neuronokat nyilak jelzik. Mérték: 10 µm

44

Immunhisztokémiai módszerrel is (NeuN jelölés) láthatóvá tudtuk tenni a

neuronokat, amelyek elıszeretettel helyezkedtek el az ependyma sejtek közelében. SP

pozitív varikózus idegrostokat elsısorban a FT dorsalis területén csoportosultak (45B

ábra). Az immunhisztokémiai vizsgálatok megerısítették, hogy a macska filum

terminaléban lényegesen ritkábban fordulnak elı neuronok, mint a patkányéban.

A FT elektronmikroszkópos képén néhány myelinhüvelyes idegrost és számos,

nagyon vékony, myelinhüvely nélküli idegrost keresztmetszete látszik (46. ábra).

Hasonló idegrost szerkezetet patkányban csak a nucleus dorsalis területén lehetett látni

(38. ábra).

Megtaláltuk a kismérető, keresztmetszeti képen kör alakú perikaryonokat (47.

ábra). Axo-szomatikus szinapszist ritkán láttunk, axo-dendritikus szinapszisokat keresés

nélkül lehetett találni. A patkányhoz hasonlóan, macskában is elıfordult a nagy

axonvégzıdések és az aránytalanul kis dendritátmetszet közti szinaptikus kapcsolat (47.

45. ábra. Macska FT, hármas immunfluoreszcens jelölés. A: GFAP immunpoztív astrocy-ta nyúlványok átszövik a filum terminale teljes szélességét, és finom nyúlványokat külde-nek az ependyma sejtek közé. Az ependyma sejtek nem jelölıdtek. B: NeuN (piros) neu-ronális perikaryonok nagyrészt az ependyma sejtek közelében helyezkednek el. SP tartal-mú idegrostok (kék) a filum terminale dorsalis részében koncentrálódnak. CC = canalis centralis. Mérték: 100 µm

45

ábra). Feltőnı különbség volt a patkányban megfigyeltekkel szemben, hogy az astrocyta

nyúlványok sőrőn egymás mellé préselt fibrillumokat tartalmaztak (47. ábra).

47. ábra. Macska FT ultrastruktúrája. Szinaptizáló axonvégzıdések (Ax). A patkányban leírtakhoz hasonlóan, macskában is elıfordulnak apró dendritátmetszetek, mint posztszinaptikus képletek. Az astrocyták nyúlványai (Gl) - a patkányban találtakkal ellentétben - finom fibrillumokkal vannak kitöltve. Mérték: 1 µm. Betét: kerek, kismérető neuron perikaryonja. Mérték: 0.1 µm

46. ábra. Lupe na-gyítású elektron-mikroszkópos fel-vétel a macska FT területérıl. Né-hány myelin-hüvelyes idegrost körül számos, nagyon vékony myelinhvely nélküli idegrost (*) tölti ki a képet. Mérték: 1 µm

46

4.4 A filum terminale szerkezete majomban

A majom CM-FT átmenet fıbb jellemzıi megegyeztek a patkányban és a

macskában találtakkal. A motoros szarv eltőnése után a hátsó szarvak eltőnése ebben az

állatban is aszimmetrikus (48A, B és C ábra). A filum terminaléban folytatódik a canalis

centralis és annak két oldalán a szürkeállománynak az intermedier zóna része.

A FT felépítése cranialis szakaszán jól látszanak a perifériás elhelyezkedéső

myelinhüvelyes idegrostok keresztmetszetei. Caudalisabban az idegszövet 50-80 µm

átmérıjő gömbökbe rendezett (49. ábra), amelyek látszólag lazán kapcsolódnak az

ependyma sejtek basalis felszínéhez. A canalis centralist ependyma sejtek bélelik (49.

ábra). Az ependyma sejtek szabad felszínén csillókat és finom nyúlványokat találtunk, a

sejteket egymáshoz zonula adherens jellegő membránspecializációk rögzítik (50. ábra).

48. ábra. Ozmimummal kezelt Vibratóm metszetek a majom CM cranialis (A), középsı (B) és caudalis részébıl (C). A szürkeállomány részei: hátsó szarv (HSz), zona intermedia (ZI) és mellsı szarv (MSz). A középsı metszetben a mellsı szarv nagyrészt eltőnt. A caudalis metszeten a hátsó szarv elvált a zona intermediától. Mérték: 1 mm

49. ábra. Majom FT keresztmetszeti képe, toluidinkék festés. A kép jobb felsı részében (*) idegszövet látható, ami megfelel a filum terminale cranialis részének. Az idegszövet 100-150 µm széles csíkban veszi körül a canalis centralist (CC). Caudalisabban az idegszövet 50-80 µm átmérıjő gömbökbe rendezett. Mérték: 100 µm

47

A szövetgömbökben találunk idegsejt perikaryonokat, gliasejteket, és számos

myelinhüvelyes idegrostot (51. ábra).

A perikaryonok mérete és szerkezete (52. ábra) megegyezik a patkányban leírtakkal.

Gyakran találtunk koszorú alakú szinapszist, ahol egy vastagabb dendritet számos

szinaptizáló axonvégzıdés vett körül (53. ábra).

50. ábra. Ependyma sejtek kamrai fel-színe majom filum terminaléban. A sejtekbıl csillók indulnak a canalis centralis lumene felé (CC). A sejtek között membránspecializáció. Mérték: 0,5 µm

51. ábra. Majom FT ultra-struktúrája. Az ependyma sejtekhez (Ep) kapcsolódó-an az idegszövet gömb ala-kú területen található. A gömbben találunk neuron perikaryonokat (N), astro-cytákat (Gl) és különbözı átmérıjő myelinhüvelyes idegrostokat. Mérték: 10 µm 52. ábra. Majom filum ter-minale ultrastruktúrája. Egymás közelében két neu-ront találunk (N) Mérték: 10 µm

48

4.5 A filum terminale kapcsolatai (elızetes eredmények)

A FT rostösszeköttetéseit a gerincvelı caudalis területére beadott BDA injekciók

segítségével kívántuk vizsgálni. Mivel semmiféle támpont nem állt rendelkezésünkre

sem a FT felé induló idegrostok eredetére, sem a filum terminaléból érkezı idegrostok

végzıdésére, ezért minél nagyobb injekciókat igyekeztünk elhelyezni a caudalis

gerincvelı szürkeállományának különbözı területein.

A BDA injekciók beadási helyérıl készített felvételen (54. ábra) látszik, hogy a

beadás centruma a zona intermediában volt. A beadás környezetében megtaláltuk a

jelzett sejteket hosszú dendritszakaszokkal, valamint intenzív idegrost festıdést

elsısorban a funiculus anteriorban (55. ábra).

Retrográd jelzett perikaryont az eddigi vizsgálatok során csak elvétve, a conus

medullarisban találtunk (56. ábra). A FT keresztmetszeti képen apró pontokként láttuk a

BDA immunjelzett képleteket. Mivel 15-20, egymástól 1 µm távolságra lévı optikai

metszeten (maximum 27) is követni tudtuk a megfigyelt képletet, abból arra

következtettünk, hogy egy jelzett, vékony idegrostot követünk. Az ilyen módon

azonosított, vékony, cranio-caudalisan húzódó BDA jelzett idegrostokat találtunk mind

a canalis centralis mentén (57. ábra), mind attól távolabb, részben a fehérállományban

(58. ábra).

53. ábra. Majom filum FT ultrastruktúrája. Vastagabb dendrit (D) körül számos 0,5 µm mérető szinaptizáló axonvégzıdés (Ax) sorako-zik (koszorú szinapszis). Mérték: 1 µm

49

54. ábra. BDA injekció beadási helye; patkány gerincvelı S2 szelvény. A nyilak az injekció helyére mutatnak. Mérték: 1mm

55. ábra. BDA-val jelzett neuronok (nyilak) és axonnyaláb. Patkány gerincvelı, a BDA injekció beadásával szomszédos szelvény. Mérték: 150 µm

56. ábra. Patkány CM, kettıs immunjelö-lés. Neuronok sejtmagját NeuN immun-reakcióval jelöltük (piros). BDA jelölés (zöld) a nyíllal jelzett idegsejt cytoplazmá-jában és a neuronok között (apró nyilak). Kilenc optikai szint összegzése. Mérték: 100 µm

57. ábra. Patkány FT, kettıs immunfestés. BDA jelzett vékony, varikózus idegrostok (zöld; apró nyilak) húzódnak a canalis centralis (CC) mindkét oldalán. A neuro-nok perikaryonjait NeuN jelöléssel ábrá-zoltuk. Tizenhét optikai szint összegzése Mérték: 100 µm

50

58. ábra. Patkány FT, kettıs immun-festés. BDA jelzett vékony, vari-kózus idegrostok (zöld; apró nyilak) húzódnak a fehérállomány-ban. CC = canalis centralis. A neuronok perikaryonjait NeuN jelöléssel ábrá-zoltuk. Huszonhét optikai szint ösz-szegzése. Mérték: 100 µm

51

5. Megbeszélés

A vizsgálatok eredményeinek a megbeszélésében kitérünk a caudalis gerinc-

velıben lezajló neuronális átrendezıdésekre, részletesen áttekintjük a patkány filum

terminaléban talált adatokat, összehasonlítjuk a három vizsgált állatban talált ered-

ményeket, majd megpróbálunk a jövıbe tekinteni.

5.1 Neuronális átrendezıdés a gerincvelı caudalis szakaszán

A gerincvelı szerkezetének a conus medullarisban történı átrendezıdése

megerısíti a szürkeállomány szerkezetérıl Golgi módszerrel kapott képekre alapozott

elképzelést. Ezek szerint a gerincvelı szürkeállománya a canalis centralis két oldalán

elhelyezkedı, szimmetrikus központi állományból (central core), és ezekhez dorsal-,

ventral- és lateral felıl kapcsolódó szarvakból áll (Réthelyi, 1976). A conus

medullarisban caudal felé haladva a szürkeállományból elıször a mellsı szarv tőnik el,

majd ezt követi a hátsó szarv. Ami a szürkeállományból a filum terminaléban

megmarad az a méretében lényegesen csökkent, központi állománynak felel meg.

A hátsó szarv idegrost komponenseinek az átalakulása, majd eltőnése megerısíti a

különbözı laboratóriumokban végzett kísérleteknek arra vonatkozó adatait, hogy a

gerincvelı hátsó szarvában a periféria felıl érkezı myelinhüvelyes idegrostok

végzıdési területe mind cranialis mind caudalis irányban kiterjedtebb, mint a vékony,

myelinhüvely nélküli rostoké (Réthelyi et al., 1979; Lamotte et al., 1991). Ennek

megfelelıen a conus medullarisban a hátsó szarv legvégsı részében csak vastag,

myelinhüvelyes érzı rostok fordulhatnak elı. A vékony rostok cranialisabban érnek

véget. Saját vizsgálati anyagunkban azt láttuk, hogy a hátsó szarv áttetszı csíkja, ami

megegyezik a substantia gelatinosaval, illetve a Rexed szerinti beosztás lamina II

rétegével, és ahol kizárólag myelinhüvely nélküli idegrostok végzıdnek (Réthelyi,

1977) cranialisabban ér véget, mint a hátsó szarv maga. Ebbıl a jelenségbıl arra a

további következtetésre jutottunk, hogy a hátsó szarv (lamina I-IV) alapvetıen két

neuroncsoportból épül fel: az egyik neuroncsoport a SG-hoz köthetı, a másik a SG-tól

független.

52

A SG, valamennyi IB4 jelölt idegrost, a PKCgamma jelölt neuronok és a CGRP-

jelölt idegrostok jelentıs része egyszerre tőnik el a CM területén. Kapcsolatot tételezünk

fel a SG különleges áttetszısége, és az IB4-ral jelölt idegrostvégzıdések szerkezete

között. Feltételezzük, hogy a PKCgamma idegsejtekhez az IB4 jelölt idegrostok

szállítják a meghatározó aktivitást a periféria felıl.

Hasonlóképpen az IB4 jelölt rostok és a CGRP jelölt rostok túlnyomó többsége

egyszerre tőnik el. A fenti két jelzıanyaggal a myelinhüvely nélküli idegrostok két

ismert csoportját lehet jelölni (Bailey és Ribeiro-da-Silva, 2006). Az IB4 jelölt

idegrostok képviselik a nem-peptiderg és glia sejt eredető neurotrófikus faktor- (glial

cell derived neurotrophic factor; GDNF) függı idogrostokat, míg a CGRP jelöléssel a

peptiderg, SP-t tartalmazó és neuronális növekedési faktor- (nerve growth factor; NGF)

függı idegrostokat lehet láthatóvá tenni. Az idegrostok szinaptizáló végzıdései és

fiziológiai tulajdonságai a két csoportban élesen eltérnek egymástól (Fang és mtsai.,

2006; Stucky és Lewin 1999). Ezek alapján feltételezhetjük, hogy IB4 és CGRP két

különféle rostfajtát jelöl a SG-ban. Ennek ellentmond az az észlelet, hogy IB4 és CGRP

jelölést lehetett találni ugyanabban az idegrostban a SG-ban (Hwang és mtsai., 2005).

Hasonló eredményekrıl mi is be tudunk számolni.

A SG eltőnésétıl caudal felé a hátsó szarv a lamina I és a lamina III-IV rétegbıl

áll. Érdekes, hogy a lamina II (SG) eltüntethetı a hátsó szarvból újszülött korban

végzett capsaicin kezeléssel. Különbözı neurohisztológiai módszerek alkalmazásával

lehetett bemutatni, hogy patkányban a vastag myelinhüvelyes perifériás idegrostok a

hátsó szarv mélyebb részébıl dorsal felé terjeszkedtek elfoglalva a SG területét

újszülöttkorban végzett capsaicin kezelést követıen (Nagy és Hunt 1983;. Réthelyi és

mtsai., 1986).

VGLUT1 és CGRP immunreakció, mint a SG-tól független neuronok jelölése

megmarad a CM végéig. VGLUT1 immunreakcióval különbözı típusú, vastag

myelinhüvelyes perifériás idegrostot tudtak jelölni. A legismertebbek a szırtüszı

afferensek, amelyeket lángnyelvszerő végzıdésként (flame shaped arborizations) a

hátsó szarvban találunk (Brown, 1981; Scheibel és Scheibel 1968). Elhelyezkedésük

alapján - a lamina I és a hátsó szarv mélyebb rétegei - a CGRP immunjelölt idegrostok

maradéka valószínőleg a vékony myelinhüvelyes A-delta perifériás idegrostok közé

tartoznak. Ennek ellentmondani látszik az, hogy fiziológiailag azonosított A-delta

53

rostok végzıdéseiben nem sikerült CGRP immunreakciót kimutatni. (Alvarez és mtsai.,

1993). VGLUT1 és CGRP immunjelölt idegrostok folytatódnak a filum terminaléban.

Kevés CGRP pozitív rostot találtunk a nucleus dorsalisban, kiterjedtebb VGLUT1

idegrost nyalábok haladtak a nucleus lateralis területén.

5.2 A filum terminale definíciója

A FT vizsgálatainkban és kísérleteinkben, a klasszikus értelmezésnek meg-

felelıen, a gerincvelınek a conus medullarist követı szakasza volt. Leírtuk a CM

elfogyásával párhuzamosan a szürkeállomány változását, amely mindhárom vizsgált

állatfajban egyformán történt. Hangsúlyoztuk, hogy az utolsó gerincvelıi ideg a conus

medullarisból indul, a FT nem áll közvetlen kapcsolatban a perifériával. Hasonló

kritériumok alapján - a coccygealis gerincvelıi ideg gyökereinek azonosítása - történt

emberben is, boncolás után, a FT kezdetének megállapítása (Yamada és mtsai., 2000).

Patkányban a CM-FT átmenet, a vastagságbeli eltérések miatt, nem mutatta azt a

szöglettörést, amit emberben lehet látni, és amit Pinto és mtsai (2002) így írt le: a CM

ferde lateralis kontúrvonala találkozott a FT egyenes kontúrvonalával (the angled lateral

aspect of the conus medullaris met the straight lateral aspect of the filum terminale).

Mindezt azért tartjuk fontosnak rögzíteni, mert egy nemrég megjelent

közleményben (Kwiecien és Avram, 2008), az a kritika érte a korábbi

közleményünkben leírtakat, hogy amit filum terminalénak tartunk, az még a CM. Úgy

gondoljuk, hogy az általunk, és sokak mások által is filum terminalénak tekintett

gerincvelı szakasz mind külsı megjelenésében, mind belsı szerkezetében eltér az alsó

sacralis és a coccygealis gerincvelıi szelvényeket tartalmazó conus medullaristól.

5.3 A filum terminale rendezett idegszövet

Patkányban, macskában és majomban vizsgáltuk a FT szerkezetét klasszikus és

modern neurohisztológiai módszerekkel. Mindhárom speciesben a FT tengelyében a

canalis centralis húzódik, a canalis centralis körül rendezett idegszövetet találtunk.

A canalis centralist ependyma sejtek bélelték, amelyek szabad felszínén csillókat

és mikrobolyhokat egyaránt találtunk. Az ependyma sejteket egymáshoz zonula

adherens jellegő membránspecializációk kapcsolják. A vizsgált szakaszokon, amely a

FT cranialis része, az ependyma sejtek között réseket, a felszínnel közlekedı járatokat

54

patkányban nem találtunk. Ritkán elıforduló jelenségként, a liquor térrel érintkezı

neuront találtunk patkány filum terminaléban. Ugyancsak patkány filum terminaléban

találtunk, ritkaságként, axonvégzıdésekbıl álló fonatot a canalis centralisban,

ependyma sejtektıl körülvéve. Az axonvégzıdésekben a kerek szinaptikus vezikulák

mellett, nagy mérető (90-100 nm átmérıjő) vezikulákat figyeltünk meg, amelyekrıl

feltételeztük, hogy a monoaminok elıfordulását jelzik az axonvégzıdésekben. Ezt az

észleletet részleteiben nem vizsgáltuk, így nem tudjuk, hol és hogyan kerültek a

végzıdések a canalis centralis lumenébe, így funkcionális jelentıségükrıl sincs

információnk.

A rendezett idegszövetben a neuronok mindhárom speciesben, a keresztmetszeti

képeken kis- és közepes mérető, kerek neuronok voltak (8-15 µm átmérı). Már

fénymikroszkópos metszeteken (toluidinkék festett félvékony metszetek) fel lehetett

ismerni a neuronokat a sejtmag festıdésérıl, a maghártya behúzódásáról és a kerek,

sötéten festıdı magvacskáról. Mindezt az elektronmikroszkópos felvételeken látottak

megerısítették. Az apró sejtek neuron voltát bizonyította az idegsejtek magfehérjéje

ellen termelt antitesttel (NeuN) kapott pozitív reakció.

A filum terminaléról készített hosszmetszetekbıl és a sorozatban készített

keresztmetszetekbıl kiderült, hogy patkányban a perikaryonok jelentıs része a FT

hossztengelyével párhuzamosan orientált ovoid alakú. A sejtek hosszanti átmérıje

elérheti a 35-40 µm-t is.

Mindhárom speciesben megtaláltuk a FT hossztengelyével párhuzamosan orientált

myelinhüvelyes idegrostokat is.

Összefoglalva: A FT mindhárom fajban a gerincvelı idegszövetbıl álló,

ellentmondásos folytatása. Az ellentmondás lényege, hogy az idegszövet ellenére a FT

nincs közvetlen kapcsolatban a perifériával, noha a perifériával való közvetlen érzı és

motoros kapcsolat a gerincvelı sine qua non tulajdonsága.

5.4 A filum terminale rendezettsége állatfajonként változó volt

Patkány FT cranialis szakaszán a neuronok sőrőn fordultak elı, és három magba

rendezıdtek. Egy-egy neuroncsoportot láttunk a canalis centralis két oldalán (nucleus

lateralis), és egy harmadikat a canalis centralis dorsalis éle felett (nucleus dorsalis). Az

utóbbi mag a FT kialakulásakor volt látható, 0,5-1,0 mm-rel caudalisabban a nucleus

dorsalis eltőnt. A FT kialakulásából következıen (lásd késıbb) a nucleus lateralisokat a

55

conus terminalis zona intermedia része folytatásának, míg a nucleus dorsalist a hátsó

szarvak összeolvadt, csökevényes folytatásának tartjuk. A neuronok nyúlványrendszerét

Golgi módszerrel próbáltuk láthatóvá tenni, eredményeink mérsékeltnek nevezhetık. A

perikaryonokból kiinduló dendritekre abból következtethetünk, hogy az

elektronmikroszkópos képeken számos, különbözı mérető dendrit átmetszetet találtunk.

A FT felszínén, a gerincvelı kötegeit ismétlı módon találtunk a myelinhüvelyes

idegrostok átmetszeteit. A gerincvelıvel szemben a különbség abban jelentkezett, hogy

a filum terminaléban gyakorlatilag hiányzik a hátsó köteg, ezért a fehérállomány felfelé

nyitott U-alakú. A hátsóköteg rostok hiánya a filum terminaléban érthetı, mivel a FT

nem áll kapcsolatban a perifériával, s ezért hiányzanak a pseudounipolaris érzı

neuronoknak a hátsó kötegi pályákat alkotó centrális nyúlványai.

Patkány nucleus lateralisában a számos axo-dendritikus szinapszis mellett elvétve

axo-szomatikus szinapszist is találtunk. Az axo-dendritikus szinapszisok jellemzı

formája az általunk szinaptikus koszorúnak nevezett elrendezıdés volt: több

szinaptizáló axonvégzıdés vett körül egy-egy dendritátmetszetet. Fénymikroszkópos

ismeretek hiányában nem tudtuk megállapítani, hogy a FT neuronjainak a dendritjei

sima felszínőek-e, vagy tüskékkel borítottak-e. Az elektronmikroszkópos képekbıl arra

következtettünk, hogy a dendritek inkább sima felszínőek, bár ebben az esetben

szokatlan volt az a szinapszis, ahol a posztszinaptikus képlet mérete 0,2 µm alatt

maradt. Egy ilyen szinapszis jelezheti azt, hogy még a legvékonyabb

dendritszakaszokon is találunk szinapszisokat, vagy utalhat arra, hogy a dendritek

varikózusak, és az említett felvétel (35. ábra) éppen két varikozitás közötti

dendritrészletnek felel meg.

Macskában a neuronok ritkán, hangsúlyozottan az ependymasejtek

szomszédságában fordultak elı, neuron csoportokról (magokról) nem lehetett beszélni.

Macska filum terminaléban alig lehetett myelinhüvelyes rostkeresztmetszeteket találni a

félvékony metszetekben. Ezt az elektronmikroszkópos vizsgálatok eredményei

megerısítették. Ennek ellenére a szürke- és a fehérállomány közötti szerkezetbeli

különbség megfigyelhetı volt.

Majom filum terminaléban az idegszövet sajátságos, és a másik két speciesben

nem látott, globuláris formába rendezıdött. Az ependyma sejtek külsı felszínéhez

kapcsolódva különbözı mérető, kerek területeket találtunk a félvékony metszetekben,

56

amelyekben nagyrészt glia sejtek, helyenként neuronok és nagy mennyiségben

myelinhüvelyes idegrostok voltak szorosan egybekapcsolva. Az ugyancsak a majomban

talált axodendritikus szinaptikus koszorúk hasonlítottak a patkányban találtakhoz,

majomban nem volt ritka a 6-8 szinaptizáló axonvégzıdéssel körülfogott dendrit sem.

Összefoglalva: Annak ellenére, hogy a mindhárom állatfajban a FT rendezett

idegszövetbıl áll, a rendezettség lényegesnek látszó részletekben eltérı képet mutat.

Noha a macska és a majom FT szerkezetét közel sem tanulmányoztuk olyan

részletességgel, mint a patkányét, feltételezhetı, hogy a FT – eddig egyáltalán nem

tisztázott – jelentısége, a szerkezeti különbségek miatt állatfajonként más és más.

Ellenkezı esetben azt kell feltételeznünk, hogy eltérı neuronális szerkezettel ugyanazt a

neuronális funkciót lehetne teljesíteni.

5.5 A filum terminale chemoarchitecturája

A FT glia sejt struktúráját két ellenanyaggal vizsgáltuk. A GFAP pozitív gliasejtek

patkányban háromdimenziós, ritka szövéső hálózatot alkotnak. A festıdı astrocyták

soma részletét a nem festıdı sejtmag körüli vékony cytoplasmaszegély, a nyúlványaikat

az egyenes vonalú, festıdı képletek mutatják. A nyúlványok a keresztmetszeti és a

hosszmetszeti síkokban egyaránt hosszában orientáltak. A párhuzamosan megfestett

neuronális perikaryonokat körülveszik az astrocyta sejtek nyúlványai. Az ependyma

sejtek nem festıdtek. Ugyanazzal az ellenanyaggal, macskában finom nyúlványokból

álló sőrő hálózatot találtunk a FT teljes szélességében. Vékony festıdı fonalakat

találtunk még az ependyma sejtek között is. A két állatfajban mutatkozó eltérı astrocyta

szerkezet, amelynek ultrastruktúrális megjelenését is megtaláltuk (inkább plazmás

astrocyták patkányban és rostos astrocyták macskában) tovább erısíti a FT

szerkezetében lévı különbségekrıl leírt fenti megállapításunkat. GFAP-immunreaktív

astrocytákat írtak le patkány gerincvelıben (Hajós és Kálmán, 1989), az immunreakció

elsısorban a gerincvelı felszínének a közelében, és az erek körül mutatkozott. A

laboratóriumban végzett, nem közölt vizsgálatok alapján állítjuk, hogy a thoracalis vagy

lumbalis gerincvelı szakaszokkal összehasonlítva, a FT astrocyta hálózata rendkívül

dús.

Patkányban vizsgáltuk az oligodendroglia sejtek elhelyezkedését a filum

terminaléban. Az elvártaknak megfelelıen az idegrostokban gazdag fehérállományban

57

találtunk intenzív jelölıdést. Az oligodenroglia sejtek jelölése hívta fel a figyelmünket a

fehérállomány U-alakjára, ami annál is inkább feltőnı, mert az U két szárának a végén

az immunjelölés különösen intenzív (19. ábra). A fehérállomány ezen dorsolateralis

részének a jelentıségére még kitérünk.

Az idegsejtek kémiai jellegének meghatározásakor abból indultunk ki, hogy a

filum terminaléban a nucleus lateralis a CM zona intermedia területének a folytatása,

így olyan ellenanyagokkal dolgoztunk, amelyek a gerincvelı zona intermedia

neuronjaiban elıforduló peptideket jelölték. NOS tartalmú neuronok nemcsak a hátsó

szarvban, és a vegetatív gerincvelıi magokban, hanem a canalis centralis körül is

megtalálhatók (Dun és mtsai., 1993; Reuss és Reuss, 2001). Calretinin immunpozitív

neuronok elıszeretettel fordulnak elı a gerincvelı szürkeállományának a laminaV és VI

rétegében, valamint a sacralis szelvényekben a commissura grisea posteriorban (Ren és

Ruda, 1994). Különbözı mérető, calretinint felismerı ellenanyaggal jelölt neuronokat

találtak a macska gerincvelıben, mind a hátsó, mind mellsı szarvban, mind a zona

intermediában (Anelli és Heckman, 2005). A motoneuronokon kívül ChAT-

immunreaktív neuronok találhatók szétszórtan a gerincvelıben, és csoportosulnak a

canalis centralis körül (Houser és mtsai., 1983; Barber és mtsai., 1984). NK-1r-

immunpozitív neuronok is ismert sejtjei a gerincvelı szürkeállományának (Littlewood

és mtsai., 1995). A sejtek egy csoportja körbeveszi a canalis centralist (Brown és mtsai.,

1995; Benoliel és mtsai., 2000). SP tartalmú neuronokat találtak colchicinnel kezelt

patkány gerincvelıben (Ljungdhal és mtsai., 1978), a neuronok a canalis centralis

mentén is elıfordultak (Nahin, 1987). A canalis centralistól dorsalisan található

szürkeállomány különösen gazdag volt SP jelölt neuronokban (Sasek és mtsai., 1984).

A hátsó szarv ChAT- és NOS-tartalmú neuronjait gátló interneuronoknak tartják

(Laing és mtsai., 1994). Ugyancsak nagyrészt gátló interneuronok a calretinin tartalmú

idegsejtek is (Résobois és Rogers, 1992). Gylcin tartalmú neuronok mind a hátsó, mind

a mellsı szarvban a gátló neuronok prototípusai. GLYT2 ellenanyaggal jelölt neuronok

sőrő csoportját írták le a zona intermediában (Hossaini és mtsai., 2007). A FT gátló

neuronjait egyensúlyban tartják a serkentı NK-1r-immunreaktív neuronok (Littlewood

és mtsai., 1995) és a VGLUT2-immunjelölt gazdag axonális hálózat, amely szintén

serkentı tulajdonságú (Todd és mtsai., 2003).

58

Macska filum terminaléban végzett immunjelöléses vizsgálataink eredményei nem

jelentenek kellı alapot a fajok közötti összehasonlításra. NOS és calretinin immunjelölt

neuronok elıfordultak a macska filum terminaléban is.

Legalább hét különféle axonrendszer varikozitásait találtuk meg a FT nucleus

lateralisában. A NOS-, SP- és a ChAT-jelölt varikozitásokról feltételezzük, hogy a

lokális neuronok axonelágazódásaihoz tartoznak. A VGLUT1-immunreaktív axonok

valószínőleg a coccygealis szelvényekhez tartozó vastag elsıdleges érzı rostok leszálló

kollaterálisai. VGLUT2- és GLYT2 immunreaktív axonok is valószínőleg lokális

neuronokhoz tartoznak, noha jelzett perikaryonokat nem találtunk metszeteinkben. A

szerotonin és az enkephalin tartalmú varikozitások viszont a leszálló pályák rostjainak a

részei. Azok a varikozitások, amelyek SP-t és enkephalint együtt tartalmaznak, (29.

ábra) minden bizonnyal a substantia gelatinosa neuronjainak axonjai (Ribeiro-da-Silva

és Pioro, 1991).

Liquorkontakt neuronok gyakran fordulnak elı alacsonyabb rendő gerincesek

központi idegrendszerében, de patkányban is megtalálhatók. Feltételezik, hogy

receptorként mőködnek, amelyek a canalis centralisban uralkodó nyomásviszonyokat,

vagy a liquor cerebrospinalis összetételének változását regisztrálják (Vígh és mtsai,

2004). Mind az immunhisztokémiai (15. és 20. ábra), mind az elektronmikroszkópos

vizsgálatok során (31. és 32. ábra) számos neuront láttunk szorosan az ependyma

sejtekhez simulva, így lehet, hogy liquorkontakt neuronok sokkal nagyobb számban

fordulnak elı a filum terminaléban, mint arra a jelen anyagból következtetni tudunk.

Összefoglalva: Mind a neuronok, mind az axonrendszerek chemoarchitecturája

arra mutat, hogy a CM zona intermediája és a FT nucleus lateralisai egységes,

sokszorosan összekapcsolt, a formatio reticularisra emlékeztetı neuronális hálózatot

alkotnak. Mint munkahypothezis, feltételezzük, hogy a filum terminaléban a hálózat

afferens rostjai koncentráltan, a CM oldalkötegeibıl a váll-régión keresztül érkeznek. A

gazdag VGLUT1 projekció származhat a coccygealis gerincvelıi idegek myelin-

hüvelyes érzı rostjaiból is. Méretük, gazdag dendritrendszerük és a váll-régióban

követhetı axonjaik alapján az NK-1r neuronokat tekintjük a hálózat projekciós

neuronjainak. A különféle antitestekkel jelölhetı neuronok feltehetıen a hálózat

interneuronjai.

59

5.6 A filum terminale finomszerkezete

Elektronmikroszkópos vizsgálataink megerısítették a fénymikroszkópos

eredményeket, és további részleteket mutattak a perikaryonok közötti térség, a neuropil

szerkezetérıl. Az axonok elsısorban a neuronok dendritjeivel alkotnak szinaptikus

kapcsolatokat, az 1 axon : 1 dendrit arányú szinaptikus kapcsolatok mellett gyakran

találtunk több szinaptizáló axonvégzıdést 1-1 dendrit körül. Ezeket az együtteseket

neveztük koszorú szinapszisnak. A szinaptizáló axonvégzıdések a központi ideg-

rendszerben máshol is megtalálható kerek és ovoid szinaptikus vezikulákat, gyakran

láttunk dense-core vezikulákat is az axonvégzıdésekben. Hosszmetszeti képeinkbıl az

is kiderült (37. ábra), hogy különbözı vezikula tartalmú axonvégzıdések nemcsak a

dendrit keresztmetszeti, hanem annak hosszmetszeti képén is sorakozhatnak sőrőn

egymás mellett. Furcsán aránytalannak látszott az átlagos mérető axonvégzıdés

szinapszisa egy jóval vékonyabb dendritszakasszal, amire mind patkányban (35. ábra),

mind macskában (47. ábra) találtunk példát. Patkányban a nucleus dorsalisra és a

macska filum terminaléra jellemzı 0,1 µm átmérıjő, vagy még annál is vékonyabb

rostnyaláb nem ritkaság a gerincvelıben. Réthelyi (2006) az oldalsó köteg dorsalis

területén, a nucleus spinalis lateralis területén, Stoeckel és mtsai (2003) pedig a fissura

mediana anterior mentén talált hasonló idegrostokat. Egyik idézett esetben sem derült ki

az axonnyaláb jelentısége.

Szokatlan helyen, a canalis centralis üregében találtunk elemi vezikulákat

tartalmazó, egymásba ékelt axonvégzıdéseket. Hasonló szerkezető szabad axon-

végzıdésekben a harmadik agykamra recessus infundibuli részében vasoactiv

intestinalis peptid (VIP) aktivitást mutattak ki (Vígh és mtsai, 2004).

Elektronmikroszkópos vizsgálatok derítették ki, hogy patkányban és macskában

nemcsak a GFAP immunreakcióval kimutatható astrocyta nyúlványok elrende-

zıdésében, hanem a glia nyúlványok finomszerkezetében és különbség van. A patkány

filum terminaléban az astrocyta nyúlványok plazmás astrocytának, míg a macska filum

terminaléban hasonló nyúlványok rostos astrocytának tőnnek.

Összefoglalva: A FT neuronjai és az ott végzıdı axonrendszerek között a

központi idegrendszerre jellemzı szinaptikus kapcsolatrendszert találtuk. Az

axonrendszerek eredetének ismerete, és a végzıdési mintázatok hiányában korai lenne

funkcionális neuronkörökben gondolkodni. Ebben nagy segítség lenne a funkcionálisan

60

jellemzett, majd intracellulárisan megjelölt neuronok fény- és elektronmikroszkópos

vizsgálata.

5.7 A filum terminale kapcsolatai

Pályakutatási vizsgálatainkban csak addig jutottunk, hogy valószínősíteni tudjuk

mind a felszálló, mind a leszálló kapcsolatot a gerincvelı és a FT között. A

fehérállomány dorsolateralis, váll-régiónak elnevezett része minden bizonnyal a kapu

mind a leszálló, mind a felszálló pályák immunfestéssel jelölhetı komponensei

számára. Éppen az immunfestett axonok elhelyezkedése alapján gondoljuk, hogy a FT

felszálló kapcsolatot kialakító neuronjai a NK-1r- és a calretinin immunjelölt neuronok

között kell keresnünk. A kapuként feltüntetett váll-régió mellett nem zárható ki, sıt,

egyenesen alaposan feltételezhetı, hogy a FT fehérállományának oldalsó és a mellsı

kötegeiben haladó myelinhüvelyes idegrostok akár le- akár felszálló pályákhoz

tartozzanak.

Frissen megjelent közleményében Kwiecien és Avram (2008) anterográd és

retrográd jelöléssel tették láthatóvá a FT és a központi idegrendszer közötti

idegrostkapcsolatokat. Úgy találták, hogy még a kisagyban is vannak olyan neuronok,

amelyek a filum terminaléba projiciálnak. A FT roncsolása után meginduló

axonregenrációt, amely a filum terminaléban feltőnıen magabiztosan és gyorsan zajlik,

a FT ependyma sejtjei segítik. Kísérleti eredményeik megerısítésre szorulnak.

Összefoglalva: Miután az itt bemutatott vizsgálatokból kiderült, hogy a patkány

FT sokrétő, rendezett idegszövetbıl áll, nélkülözhetetlen és elkerülhetetlen a

morphológiai vizsgálatok folytatása axon-követı módszerekkel. A jelenleg ismert

adatok alapján elıre vetíthetı egy kétirányú, morphológiailag és kémiai jellegében is

különbözı idegrostok által fenntartott kapcsolatrendszer a gerincvelı és a FT között.

5.8 Perspektíva

A három vizsgált állatfajban kapott sok részletében összecsengı eredmények után

fontos lenne tisztázni az ember FT szerkezetét. Van, aki a modern vizsgálati

eredményekkel is a klasszikus, a Bevezetésben leírt véleményt erısítette meg. Fontes és

mtsai (2006) leírta, hogy emberben a FT tömegét hosszában rendezett I. típusú, és

61

haránt irányú III. típusú kollagén rostnyalábok építik fel. Nagy mennyiségben találtak

elasticus rostokat is filum terminaléban. Lehet, hogy a FT a hajlításnál és feszítésnél

kiegyenlítı „mozgási puffer”. Pásztázó elektronmikroszkópos vizsgálattal laza hálózatot

találtak a FT egész hosszában, azonos összetétellel. Ezzel párhuzamosan rutinszerő

beavatkozásnak tőnik a FT átmetszése, mint a vizelettartás zavaraiért felelıssé tehetı

„tight filum terminale syndrome” sebészi megoldása (Selcuki és Coskun, 1998). A

beavatkozás sikerével a szerzık nincsenek megelégedve, egy hónapon túl az objektív és

szubjektív javulást egyaránt mutató operáltak aránya csak 53%.

Az elıbbiekkel ellentétben Choi és mtsai (1992) egyértelmően kiállt amellett,

hogy az emberi FT nem kötıszövetbıl és erekbıl álló köteg, hanem idegsejteket

tartalmaz, és így valószínőleg fontos szerepe lehet a gerincvelı normális és kóros

mőködésében. Cummings és George (2003) átfogó, a CM és a FT sejtjeit összehasonlító

immunhisztokémiai vizsgálat után szintén úgy összegezte eredményeiket, hogy a FT

több mint egy „fibrovascular tag”. Az alkalmazott antitestek között ott volt a velıcsı

sejtjeit jelölı H4C4 és AC4, az adheziós molekulát jelölı VIN-IS-53, a fenéklemez

sejtjei jelölı FP3, a chorda dorsalis jelölésére szolgáló NOT1. GFAP-val jelölt

képleteket és intenzív szinaptofizin jelölést találtak mind a conus medullarisban, mind

filum terminaléban.

Egészen friss adat szerint felnıtt emberi filum terminaléból olyan sejteket sikerült

tenyészteni, amelyek képesnek tőntek, in vitro körülmények között, az idegszövet

mindhárom irányába – neuron, astrocyta és oligodendrocyta – differenciálódni

(Varghese és mtsai., 2008). A szerzık egy kongresszusi összefoglalóban ugyanakkor

elismerik, hogy a neuron irányba történı differenciálódás in vivo nem zárható ki, de

ennek eléréséhez még további vizsgálatok szükségesek.

Összefoglalva: A FT összeköttetéseinek állatkísérletekben történı vizsgálata

mellett a továbblépés megkerülhetetlen pontja az emberi FT neuronális és glia

szerkezetének feltárása.

62

6. Következtetések

A patkány, macska és majom FT szerkezetét felderítı vizsgálatok egy véletlen

megfigyelésbıl indultak, olyan idıben, amikor senki sem érdeklıdött a gerincvelınek

ezen a nagyon távoli szakasz iránt. Néhány korábbi, és alig-alig idézett közlemény után,

részletesen feldolgoztuk a FT neuronális- és chemoarchitecturáját.

A vizsgálatok egy újabb váratlan elágazáshoz vezettek. Felismertük, hogy a CM-

FT átmenetben a hátsó szarv rostrendszere két lépésben szőnik meg. Caudal felé

haladva elıször eltőnik a SG-val kapcsolatos vékony (myelinhüvely nélküli) idegrost

csoport és a velük kapcsolatban álló neuronok, majd egy következı lépésben a vastag,

myelinhüvelyes idegrostok és a velük kapcsolatban álló neuronok. Azt várjuk, hogy

ezekre az ismeretekre alapozva újra lehet majd gondolni a SG helyzetét és jelentıségét a

hátsó szarv egészében, és különösen a fájdalomérzés kialakulásában.

Vizsgálataink kezdete óta a FT népszerősége fokozódik, különösen az ıssejtekkel

kapcsolatos vizsgálatokban. Állandó osztódásban lévı, önmagát így fel nem számoló és

különféle irányban elkötelezıdı progenitor sejteket produkáló ıssejtek a központi

idegrendszerben elsısorban az oldalkamrák ependyma sejtjeivel érintkezı

subventricularis sejtek. Neuronok, astrocyták és oligodendrogliasejtek irányában

differenciálódó sejteket találtak a III. és a IV. agykamra környékén és a gerincvelıben,

canalis centralis körül (Weiss és mtsai., 1996).

Véleményünk szerint a FT, márcsak méretei miatt, par excellance subventricularis

terület. Úgy látjuk, hogy az értekezésben foglaltak megalapozták azokat a molekuláris

biológiai és genetikai módszerekkel végzendı vizsgálatokat, amelyek a FT szerepét

tovább tisztázzák.

63

7. Összefoglalás Patkányban, macskában és majomban tanulmányoztuk a gerincvelı caudalis végének (conus

medullaris) átalakulását és folytatásának, a filum terminalénak a neuronális és glia szerkezetét.

A conus medullarisban caudal felé haladva eltőnik a mellsı szarv, majd késıbb a hátsó szarv is.

A zona intermedia szürkeállománya tovább kíséri a canalis centralist a filum terminaléba. Patkányban,

a hátsó szarvban a substantia gelatinosa (lamina II), hamarabb szőnik meg, mint maga a hátsó szarv.

Patkány filum terminaléban a szürkeállományt a canalis centralis két oldalán szimmetrikusan

elhelyezkedı nucleus lateralisra és a canalis centralis felett, a középvonalban elhelyezkedı nucleus

dorsalisra osztottuk fel. A neuronok keresztmetszeti képen 8-15 µm átmérıjőek, de a hosszmetszetben

a méretük elérheti a 35-40 µm-t is. Nitric oxide synthase (NOS)-, calretinin-, cholin acetyltransferase

(ChAT)-, neurokinin 1 receptor (NK-1r), substance P (SP)-pozitív neuronokat találtunk, elsısorban a

nucleus lateralisban. A filum terminaléban arborizáló axonrendszereket négy csoportra osztottuk.

Kizárólag a nucleus dorsalisban calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunpozitív idegrostokat

találtunk. Elsısorban a nucleus lateralisban az ott lévı neuronok axonjaiként NOS-, SP-, és NK-1r

immunpozitív axon arborizációt figyeltünk meg. Sőrő vesicularis glutamate transporter 2 (VGLUT2)

varikózus axon-hálózat jellemezte a nucleus lateralist, a varikozitások jelentıs hányada szinaptofizin

pozitív volt. Finom glycin transporter 2 (GLYT2) pozitív axonokat is találtunk a nucleus lateralisban.

A szürkeállomány egészében ágazódtak el a vesicularis glutamate transporter 1 (VGLUT1)- és a

ChAT pozitív idegrostok. A fehérállomány dorsolateralis részében, az általunk váll-régiónak nevezett

területen szerotonin-, enkaphalin-, calretinin- és NK-1r axonjelölıdést találtunk.

Közelítı becslés alapján a filum terminale cranialis 5 mm-es szakaszában 35000 neuron

található, caudalisabban, ugyancsak 5 mm-es szakaszon a neuronok száma 15000-re csökken.

Patkányban az astrocytákat jelölı glial fibrillary acidic protein (GFAP) immunreakció egyenes

nyúlványokat mutatott. Az oligodendroglia sejtek elsısorban a fehérállományban helyezkedtek el.

Az ultrastruktúrális vizsgálatok során számos axo-dendritikus, és ritkábban elı-forduló axo-

szomatikus szinapszist találtunk.

Az idegszövet macskában is folytatódott a filum terminaléban, a neuronok ritkábban

helyezkedtek el, mint patkányban. A patkánytól eltérıen az astrocyta nyúlványok sőrő, finom

hálózatot alkotnak a filum terminaléban. Majom filum terminaléban az idegszövet apró göbökbe

rendezett, amely a canalis centralist bélelı ependyma sejtek basalis felszínéhez kapcsolódnak.

Pályakövetési kísérletek elızetes eredményei azt mutatták, hogy vékony ideg-rostok húzódnak a

gerincvelı sacralis területérıl a filum terminaléba.

64

8. Summary The neuronal and glial architecture of the transformation of the caudal end of the spinal cord

(conus medullaris) and its continuation as filum terminale were studied in the rat, cat and monkey.

Proceeding caudally in the conus medullaris first disappear the ventral horns followed by the

disappearance of the dorsal horns. The grey matter of the zona intermedia follows the central canal

towards the filum terminale. In the dorsal horn of the rat the substantia gelatinosa (lamina II), discontinue

more cranially than the dorsal horn itself.

The grey matter of the filum terminale in the rat has been subdivided into symmetrical lateral

nuclei lateral to the central canal into a midline medial nucleus located dorsally from the central canal. The

neuronal perikarya measure 8-15 µm in diameter in cross sections, but in longitudinally cut specimens

they may measure 30 to 35 µm. Nitric oxide synthase (NOS)-, calretinin-, cholin acetyltransferase

(ChAT)-, neurokinin 1 receptor (NK-1r), and substance P (SP)-immunostained neurons were detected

primarily in the lateral nucleus. The axons arborizing in the filum terminale formed four groups.

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunostained fibers arborized exclusively in the dorsal

nucleus. NOS-, SP-, and NK-1r immunostained were detected principally in the lateral nucleus, as the

axons of the resident neurons. Dense vesicular glutamate transporter 2 (VGLUT2) immunostained axon

arborization was found also in the lateral nucleus, large percent of the varicosities was synaptophysin

positive. Fine glycin transporter 2 (GLYT2) positive varicosities were also found in the lateral nucleus.

Vesicular glutamate transporter 1 (VGLUT1)- and ChAT immunostained axons arborized in the entire

grey matter. Serotonin-, enkephalin-, calretinin- and NK-1r immunostained axons were seen in the

dorsolateral portion of the white matter, called shoulder region. - Around 35000 neurons were estimated

in the cranial 5 mm long section of the filum terminale in the rat, more caudally the number of the

neurons dropped to 15000 in a 5 mm long portion. -The glial fibrillary acidic protein (GFAP)-

immunostained processes of the astrocytes showed radial and longitudinal orientation depending on the

plane of the specimens. Oligodendrocytes were located mainly in the white matter. - Various kinds of

axo-dendritic and a small number of axo-somatic synapses were seen under the electron microscope.

Nervous tissue continued into the filum terminale also in the cat, the neurons occurred less densely

than in the rat. Unlike in the rat the processes of the astrocytes formed a dense network in the cat filum

terminale. The nervous tissue is arranged as small spheres attached to the basal surface of the ependyma

in the filum terminale of the monkey.

Preliminary results of tract tracing studies indicated that fine caliber nerve fibers coursed from the

sacral segments to the filum terminale.

65

9. Irodalomjegyzék Altman J, Bayer SA (2001) Development of the human spinal cord. Oxford University

Press.

Alvarez FJ, Kavookjian AM, Light AR (1993) Ultrastructural morphology, synaptic

relationships, and CGRP immunoreactivity of physiologically identified C-fiber

terminals in the monkey spinal cord. J Comp Neurol 329:472-490.

Anelli R, Heckman CJ (2005) The calcium binding proteins calbindin, parvalbumin,

and calretinin have specific patterns of expression in the gray matter of cat spinal cord. J

Neurocytol 34:369-385.

Barber RP, Phelps PE, Houser CR, Crawford GD, Salvaterra PM, Vaughn JE (1984)

The morphology and distribution of neurons containing choline acetyltransferase in the

adult rat spinal cord: an immunocytochemical study. J Comp Neurol 229:329-346.

Bailey AL, Riberio-da-Silva A.(2006) Transient loss of terminals from non-peptidergic

nociceptive fibers in the substantia gelatinosa of spinal cord following chronic

constriction injury of the sciatic nerve. Neuroscience. 138:675-90.

Barr ML, Kiernan, JA. (1993) The human nervous system. An anatomical wiewpont,

6th ed. JB. Lippincott, Philadelphia, p 70.

Benoliel R, Tanaka M, Caudle RM, Iadarola MJ (2000) Co-localization of N-methyl-D-

aspartate receptors and substance P (neurokinin-1) receptors in rat spinal cord. Neurosci

Lett 291:61-64.

Boros C, Lukacsi E, Horvath-Oszwald E, Rethelyi M (2008) Neurochemical

architecture of the filum terminale in the rat. Brain Res 1209:105-114.

Brown AG (1981) Organization in the Spinal Cord. Springer-Verlag, Berlin-

Heidelberg-New York.

66

Brown JL, Liu H, Maggio JE, Vigna SR, Mantyh PW, Basbaum AI (1995)

Morphological characterization of substance P receptor-immunoreactive neurons in the

rat spinal cord and trigeminal nucleus caudalis. J Comp Neurol 356:327-344.

Catala M, Ziller C, Lapointe F, Le Douarin NM.(2000) The developmental potentials of

the caudalmost part of the neural crest are restricted to melanocytes and glia. Mech Dev.

95:77-87.

Chesler M, Nicholson C (1985) Organization of the filum terminale in the frog. J Comp

Neurol 239:431-444.

Choi BH, Kim RC, Suzuki M, Choe W (1992) The ventriculus terminalis and filum

terminale of the human spinal cord. Hum Pathol 23:916-920.

Chvatal A, Anderova M, Ziak D, Orkand RK, Sykova E (2001) Membrane currents and

morphological properties of neurons and glial cells in the spinal cord and filum

terminale of the frog. Neurosci Res 40: 23-35.

Cummings TJ, George TM. (2003) The immunhistochemical profile of the normal

conus medullaris and filum terminale. Neuroemb. 2: 43-49.

Dun NJ, Dun SL, Wu SY, Forstermann U, Schmidt HH, Tseng LF (1993) Nitric oxide

synthase immunoreactivity in the rat, mouse, cat and squirrel monkey spinal cord.

Neuroscience 54: 845-857.

Fang X, Djouhri L, McMullan S, Berry C, Waxman SG, Okuse K, Lawson SN (2006)

Intense isolectin-B4 binding in rat dorsal root ganglion neurons distinguishes C-fiber

nociceptors with broad action potentials and high Nav1.9 expression. J Neurosci 26:

7281-7292.

67

Fontes RBV, Saad F, Soares M, de Oliveira F, Pinto F, Liberti E, (2006) Ultrastructural

study of the filum terminale and its elastic fibers. Neurosurg. 58: 978-984.

Gamble HJ (1971) Electron microscope observations upon the conus medullaris and

filum terminale of human fetuses. J Anat 110: 173-179.

Gonzalez-Robles A, Glusman S (1979) The filum terminale of the frog spinal cord.

Light and electron microscopic observations. Cell Tissue Res 199: 519-528.

Hajos F, Kalman M (1989) Distribution of glial fibrillary acidic protein (GFAP)-

immunoreactive astrocytes in the rat brain. II. Mesencephalon, rhombencephalon and

spinal cord. Exp Brain Res 78: 164-173.

Hossaini M, French PJ, Holstege JC (2007) Distribution of glycinergic neuronal somata

in the rat spinal cord. Brain Res 1142: 61-69.

Houser CR, Crawford GD, Barber RP, Salvaterra PM, Vaughn JE (1983) Organization

and morphological characteristics of cholinergic neurons: an immunocytochemical

study with a monoclonal antibody to choline acetyltransferase. Brain Res 266:97-119.

Hurst RW, Bagley LJ, Marcotte P, Schut L, Flamm ES (1999) Spinal cord arteriovenous

fistulas involving the conus medullaris: presentation, management, and embryologic

considerations. Surg Neurol 52: 95-99.

Hwang SJ, Oh JM, Valtschanoff JG (2005) The majority of bladder sensory afferents to

the rat lumbosacral spinal cord are both IB4- and CGRP-positive. Brain Res 1062: 86-

91.

Kwiecien JM, Avram R (2008) Long-distance axonal regeneration int he filum

terminale of adult rats is regulated by ependymal cells. J Neurotrauma, 25: 196-204.

68

Laing I, Todd AJ, Heizmann CW, Schmidt HH (1994) Subpopulations of GABAergic

neurons in laminae I-III of rat spinal dorsal horn defined by coexistence with classical

transmitters, peptides, nitric oxide synthase or parvalbumin. Neuroscience 61: 123-132.

LaMotte CC, Kapadia SE, Shapiro CM (1991) Central projections of the sciatic,

saphenous, median, and ulnar nerves of the rat demonstrated by transganglionic

transport of choleragenoid-HRP (B-HRP) and wheat germ agglutinin-HRP (WGA-

HRP). J Comp Neurol 311: 546-562.

Lenhossék M (1922) Az ember anatómiája. Budapest: Pantheon Irodalmi Intézet

Littlewood NK, Todd AJ, Spike RC, Watt C, Shehab SA (1995) The types of neuron in

spinal dorsal horn which possess neurokinin-1 receptors. Neuroscience 66:597-608.

Ljungdahl A, Hokfelt T, Nilsson G (1978) Distribution of substance P-like

immunoreactivity in the central nervous system of the rat--I. Cell bodies and nerve

terminals. Neuroscience 3: 861-943.

Miller C (1968) The ultrastructure of the conus medullaris and filum terminale. J Comp

Neurol 132:547 -566.

Nagy JI, Hunt SP (1983) The termination of primary afferents within the rat dorsal

horn: evidence for rearrangement following capsaicin treatment. J Comp Neurol

218:145-158.

Nahin RL (1987) Immunocytochemical identification of long ascending peptidergic

neurons contributing to the spinoreticular tract in the rat. Neuroscience 23: 859-869.

Nievelstein RAJ., Hartwig NG., Vermeij-Keers C., Valk J. (1993): Embryonic

development of the mammalian caudal neuronal tube. Teratology 48: 21-31

69

Phuong LK, Schoeberl KA, Raffel C (2002) Natural history of tethered cord in patients

with meningomyelocele. Neurosurgery 50: 989-993; discussion 993-985.

Pinto FC, Fontes RB, Leonhardt Mde C, Amodio DT, Porro FF, Machado J (2002)

Anatomic study of the filum terminale and its correlations with the tethered cord

syndrome. Neurosurgery 51: 725-729; discussion 729- 730.

Polgar E, Fowler JH, McGill MM, Todd AJ (1999) The types of neuron which contain

protein kinase C gamma in rat spinal cord. Brain Res 833: 71-80.

Rascher K, Booz KH, Donauer G, Donauer E (1988) The filum terminale. A

morphological study in the cat. Z Mikrosk Anat Forsch 102: 1-17.

Ren K, Ruda MA (1994) A comparative study of the calcium-binding proteins

calbindin-D28K, calretinin, calmodulin and parvalbumin in the rat spinal cord. Brain

Res Brain Res Rev 19: 163-179.

Résobois A, Rogers JH. (1992) Calretinin in rat brain: an immunhistochemical study.

Neurosci. 46: 101-134.

Réthelyi M (1976) Central core in the spinal gray matter. Acta Morph Acad Sci Hung

24: 63-70.

Réthelyi M (1977) Preterminal and terminal axon arborizations in the substantia

gelatinosa of cat's spinal cord. J Comp Neurol 172: 511-528.

Réthelyi M (2006) The ultrastructure of the lateral spinal nucleus. Eur J Anat 10: 61-74.

Rethelyi M, Horvath-Oszwald E, Boros C (2008) Caudal end of the rat spinal dorsal

horn. Neurosci Lett. 445: 153-157.

Rethelyi M, Lukácsi E, Boros C (2004) The caudal end of the rat spinal cord:

transformation to and ultrastructure of the filum terminale. Brain Res 1028: 133-139.

70

Rethelyi M, Salim MZ, Jancso G (1986) Altered distribution of dorsal root fibers in the

rat following neonatal capsaicin treatment. Neuroscience 18: 749-761.

Rethelyi M, Trevino DL, Perl ER (1979) Distribution of primary afferent fibers within

the sacrococcygeal dorsal horn: an autoradiographic study. J Comp Neurol 185: 603-

621.

Reuss MH, Reuss S (2001) Nitric oxide synthase neurons in the rodent spinal cord:

distribution, relation to Substance P fibers, and effects of dorsal rhizotomy. J Chemical

Neuroanat 21: 181-196.

Rexed B (1954) Cytoarchitectonis atlas of the spinal cord in the cat. J Comp Neurol

100: 297-379.

Ribeiro-da-Silva A, Pioro EP (1991) Sustance-P and enkephalin-like immunoreactives

are colocalized in certain neurons of the substancia gelatinosa of the rat spinal cord An

ultrastructural double-labeling study. J Neurosci 11:1068-1080.

Sasek CA, Seybold VS, Elde RP (1984) The immunohistochemical localization of nine

peptides in the sacral parasympathetic nucleus and the dorsal gray commissure in rat

spinal cord. Neuroscience 12: 855-873.

Scheibel ME, Scheibel AB (1968) Terminal axonal patterns in cat spinal cord. II. The

dorsal horn. Brain Res 9: 32-58.

Schoenwolf (1984) Histological and ultrastructural studies of secondary neurulation in

mouse ambryo. J Comp Neurol 169: 361-376.

Selcuki M, Coskun K (1998) Management of tight filum terminale syndrome with

special emphasis on normal level conus medullaris (NLCM). Surg Neurol 50: 318-322;

discussion 322.

71

Selcuki M, Vatansever S, Inan S, Erdemli E, Bagdatoglu C, Polat A (2003) Is a filum

terminale with a normal appearance really normal? Childs Nerv Syst 19:3 -10.

Stoeckel M-E, Uhl-Bronner S, Hugel S, Veinante P, Klein M-J, Mutterer J, Freund-

Mercier M-J, Schlichetr R (2003) Creberospinal fluid-contacting neuron sin the rat

spinal cord, a gamma-aminobutiric acidergic system expressing the P2X2 subunit of

purinergic receptors, PSA-NCAM and GAP-43 immunoreactivities: light and electron

microscopic study. J Comp Neurol 457: 159-174.

Streeter GL (1919) Factors involved in the formation of the filum terminale. Am J Anat

25: 1-11.

Stucky CL, Lewin GR (1999) Isolectin B (4) - positive and -negative nociceptors are

functionally distinct. J Neurosci 19: 6497-6505.

Todd AJ, Hughes DI, Polgar E, Nagy GG, Mackie M, Ottersen OP, Maxwell DJ (2003)

The expression of vesicular glutamate transporters VGLUT1 and VGLUT2 in

neurochemically defined axonal populations in the rat spinal cord with emphasis on the

dorsal horn. Eur J Neurosci 17: 13-27.

Varghese M, Olstorn H, Berg-Johnsen J, Moe M, Murrell W, Langmoen I (2008)

Isolation of human multipotnt neural progenitors from adult filum terminale. Stem Cells

Dev. 2008 Jul 24 (Epub ahead of print)

Vígh B, Manzano MJ, Frank CL, Vincze C, Czirok SJ, Szabo A, Lukáts A, Szél A

(2004) The system of cerebrospinal fluid-contacting neurons. Its supposed role in the

nonsynaptic signal transmission of the brain. Histol Histopathol 19: 607-628.

Wagner W, Schwarz M, Perneczky A (2002) Primary myelomeningocele closure and

consequences. Curr Opin Urol 12: 465-468.

72

Weiss S, Dunne Ch, Hewson J, Wohl Ch, Wheatley M, Peterson AC, Reynolds BA

(1996) Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and

ventricular neuroaxis. J Neuroscience 16: 7599-7609

Yamada S, Lonser RR (2000) Adult tethered cord syndrome. J Spinal Disord 13: 319-

323.

Yamada S, Won D, Kido DK (2001) Adult Tethered Cord Syndrome: New

Classification Correlated With Symptomathology, Imaging and Pathophysiology.

Neurosurgery Quarterly 11: 260-276.

73

10. Saját közlemények jegyzéke

Eredeti közlemények:

Réthelyi M., Lukácsi E., Boros Cs. (2004) The caudal end of the rat spinal cord:

transformation to and ultrasructure of the filum terminale. Brain Res. 1028, 133-139.

Boros Cs., Lukácsi E., Horváth-Oszwald E., Réthelyi M. (2008) Neurochemical

architecture of the filum terminale in the rat. Brain Res. 1209, 105-14.

Réthelyi M., Horváth-Oszwald E., Boros Cs. (2008) Caudal end of the rat spinal dorsal

horn. Neurosci Lett. (megjelenés alatt)

Konferencia absztraktok: Boros Cs., Lukácsi E., Réthelyi M. (2003) Neuronal structure of the caudal end of the

rat spinal cord. Clin. Neurosci. 57, 15-16.

Réthelyi M., Lukacsi E., Boros Cs. (2004) Neurons and synapses in the caudal

extension of the spinal cord (filum terminale). Arch. Hung. Med. Assoc. Am. 12: 17.

Boros Cs., Lukácsi E., H. Oszwald E., Réthelyi M. (2005) Immunhistochemical

characterization of the neuron sin the filum terminale. Clin. Neurosci. 58, 112.

Poszterek: Réthelyi M., Boros Cs., Lukácsi E.

Neuronal structure of the conus terminalis and filum terminale in the rat

Anatomical Society of Great Britain and Ireland. Drezda, 2003, március 28-31.

Boros Cs.,Lukácsi E., Réthelyi M.

The stucture of conus medullaris and filum terminale in rat

74

A Magyar Idegtudományi Társaság IX. konferenciája. Balatonfüred,

2003. január 23-35.

Boros Cs., Lukácsi E., Oszwald E., Réthelyi M.

The immunhistochemical characterization of neurons in the filum terminale

A Magyar Idegtudományi Társaság XI. konferenciája. Pécs, 2005. január 27-29.

Réthelyi M., Boros Cs., Lukácsi E.

The neuronal sructure of the caudal spinal cord

A Magyar Ideg- és Elmeorvosok Társaságának konferenciája. Szeged,

2005. október 13-15.

75

11. Köszönetnyilvánítás

Ezúton szeretném megköszönni több éves munkámhoz nyújtott segítségét,

szakmai és emberi útmutatását témavezetımnek, Réthelyi Miklós Professzor Úrnak, aki

kezdetben mint intézetvezetı is lehetıvé tette a Szentágothai János Laboratóriumban a

kísérleti tevékenységet.

Köszönöm Csillag András Professzor Úrnak, mint jelenlegi intézetvezetınek,

hogy munkámat a Semmelweis Egyetem Anatómiai, Szövet- és Fejlıdéstani

Intézetében végezhettem a mai napig.

Szintén köszönöm Dr. Puskár Zitának a laboratóriumi munkában, annak

elsajátításában nyújtott segítségét, az építı kritikát és az ösztönzést.

Kísérleti munkám során Lukácsi Erika segített fáradhatatlanul, melyet ezúton

külön megköszönök.

A Szentágothai János Laboratóriumban, munkatársaimnak Dr. Kozsurek

Márknak, Horváthné Oszwald Erzsébetnek szeretném megköszönni a sok tanácsot és

segítséget, melyet tılük kaptam az elmúlt évek során.

Intézeti munkatársaimnak Dr. Tóth Zsuzsannának, Szabó Istvánnénak, Deák

Szilviának szintén köszönöm segítségüket.