การพัฒนาและตรวจสอบความ ...ir.swu.ac.th/jspui/bitstream/123456789/3677/2/Wanna_E.pdf · 2020. 4. 23. · PO 4 buffer (10 mM; pH2.5) and

การพฒนาและตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะหพรกาบาลนในตวอยางพลาสมา โดยการท าอนพนธกบ 4-คลอโร-7-ไนโตรเบนโซฟราแซน

กอนท าการแยกดวยวธโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง

ปรญญานพนธ ของ

วรรณา เอยมอาจ

เสนอตอบณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศรนครนทรวโรฒ เพอเปนสวนหนงของการศกษา ตามหลกสตรปรญญาวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาวทยาการเภสชภณฑ

มนาคม 2557



ปรญญานพนธ ของ



มนาคม 2557 ลขสทธเปนของมหาวทยาลยศรนครนทรวโรฒ



บทคดยอ ของ



มนาคม 2557

วรรณา เอยมอาจ. (2557). การพฒนาและตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะหพรกาบาลนใน ตวอยางพลาสมาโดยการท าอนพนธกบ 4-คลอโร-7-ไนโตรเบนโซฟราแซน กอนท าการแยกดวยวธโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง. ปรญญานพนธ วท.ม.(วทยาการ

เภสชภณฑ). กรงเทพฯ: บณฑตวทยาลย มหาวทยาลยศรนครนทรวโรฒ. คณะกรรมการควบคม: รองศาสตราจารย ดร.วระศกด สาม, รองศาสตราจารย สพชา วทยเลศปญญา.

การศกษานมวตถประสงคเพอพฒนาและตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะหพรกาบาลนในพลาสมามนษยดวยเทคนคโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสงทตอกบตวตรวจวดสญญาณชนด ฟลออเรสเซนส โดยการท าใหเกดอนพนธกบ 4-คลอโร-7-ไนโตรเบนโซฟราแซน (NBD-Cl) และใช กาบาเพนตนเปนสารมาตรฐานภายใน เตรยมตวอยางโดยวธการตกตะกอนโปรตนดวย อะซโตไนไตรล จากนนน าสวนใสมาท าปฏกรยากบ NBD-Cl ซงจากการศกษาสภาวะทเหมาะสมในการเกดอนพนธคอ ใชปรมาณของสาร NBD-Cl ความเขมขน 2.24 มลลกรมตอมลลลตร ในตวกลางทเปนเบสทพเอชเทากบ 11 ภายใตอณหภม 80 องศาเซลเซยสเปนเวลา 15 นาท และหยดปฏกรยาดวยกรดไฮโดรคลอรกความเขมขน 0.02 โมลาร วเคราะหหาปรมาณโดยใชคอลมนชนด C18 โดยใชเฟสเคลอนทซงประกอบดวยอะซโตไนไตรลและโปแทสเซยมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต ทความเขมขน 10 มลลโมลาร พเอช 2.5 ในอตราสวน 50 : 50 โดยปรมาตร อตราการไหล 1.2 มลลลตรตอนาท ตรวจวดปรมาณสารดวยตวตรวจวดฟลออเรสเซนส โดยก าหนดความยาวคลนเราอเลกตรอน 460 นาโนเมตรและความยาวคลนฟลออเรสเซนต 558 นาโนเมตร ใชเวลาในรอบการวเคราะห 11 นาท อนพนธทเตรยมขนมความคงตวมากกวารอยละ 96 เปนเวลาอยางนอย 48 ช วโมง เมอเกบไวทอณหภม 20 องศาเซลเซยส สามารถใชวเคราะหหาปรมาณพรกาบาลนในพลาสมาไดในชวงความเขมขน 20-10,000 นาโนกรมตอมลลลตร ใหคา R2 > 0.9999 โดยมขดจ ากดต าสดของการวเคราะหปรมาณเทากบ 20 นาโนกรมตอมลลลตร โดยใชปรมาตรในการวเคราะห 20 ไมโครลตร และไมพบการรบกวนขององคประกอบอนๆ ของพลาสมา การทดสอบความแมนย าของการวเคราะห พรกาบาลนภายในวนเดยวกนและระหวางวน ใหคาความแมนย าของการวเคราะหเทากบ 0.22-5.41% และ 1.84-5.19% ตามล าดบ และใหคาความถกตองของการวเคราะหพรกาบาลนภายในวนเดยวกนและระหวางวนเทากบ 95.87-106.89% และ 98.25-101.86% ตามล าดบ วธวเคราะหทพฒนาขนมความไว มความจ าเพาะเจาะจง มความถกตองและแมนย าตามมาตรฐานการวเคราะหสารทางชวภาพของ United States Food and Drug Administration (US FDA) guideline 2013 และ European Medicines Agency (EMEA) guideline 2011

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF PREGABALIN DETERMINATION IN HUMAN PLASMA BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY USING PRE-COLUMN

DERIVATIZATION WITH 4-CHLORO-7-NITRO-BENZOFURAZAN

AN ABSTRACT BY

WANNA EIAMART

Presented in Partial Fulfillment of the Requirements for the Master of Science in Pharmaceutical Product Development

at Srinakharinwirot University March 2014

Wanna Eiamart. (2014). Development and Validation of Pregabalin Determination in Human Plasma by Highperformance Liquid Chromatography using Pre-Column Derivatization with 4-Chloro-7-Nitro-Benzofurazan. Master thesis, M.S. (Pharmaceutical Product Development). Bangkok: Graduate School, Srinakharinwirot University. Advisor Committee: Assoc. Prof. Dr.Weerasak Samee., Assoc. Prof. Supeecha Wittayalertpanya.

The objectives of this study were to develop and validate method for quantitative

determination of pregabalin (PGB) in human plasma by HPLC equipped with fluorescence detecter. 4-Chloro-7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl) and gabapentin (GB) were used as derivatizing agent and internal standard, respectively. Sample preparation required plasma protein precipitating using acetonitrile. The supernatant was then aliquoted and pre-column derivatized with NBD-Cl. The optimum derivatization conditions established were 2.24 mg/ml of NBD-Cl, pH 11 and 80◦C. After 15 min, the reaction was terminated using 0.02 M HCl. The chromatographic separation was carried out on a Phenomenex C18 column. Mobile phase, a mixture of KH2PO4 buffer (10 mM; pH2.5) and acetonitrile (50:50, v/v), was eluted at the flow rate of 1.2 ml/min. The fluorescent derivatives were monitored at the excitation and emission wavelengths of 460 and 558 nm, respectively. The obtained derivatives were found to be stable (>96%) remaining for at least 48 hours at 20◦C. The developed assay for pregabalin was linear over the range of 20-10,000 ng/ml in plasma (R2 >0.9999). The lower limit of quantification was 20 ng/ml when 20 µl injection volume was applied. No interferences were found from pregabalin and gabapentin. The intra-day and inter-day precision values were 0.22-5.41% and 1.84-5.19%, respectively and the intra-day and inter-day accuracies were 95.87-106.89% and 98.25-101.86%, respectively. The proposed method, proved to be sensitive, selective, precise and accurate, meets the standards of bioanalysis method validation accepted by United States Food and Drug Administration (US FDA) 2013 and the European Medicines Agency (EMEA) guideline 2011.

ปรญญานพนธ

เรอง

การพฒนาและตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะหพรกาบาลนในตวอยางพลาสมา

โดยการท าอนพนธกบ 4-คลอโร-7-ไนโตรเบนโซฟราแซน


ของ


ไดรบอนมตจากบณฑตวทยาลยใหนบเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตร

วทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาวทยาการเภสชภณฑ ของมหาวทยาลยศรนครนทรวโรฒ

........................................................................คณบดบณฑตวทยาลย (รองศาสตราจารย ดร.สมชาย สนตวฒนกล)

วนท .........เดอน มนาคม พ.ศ 2557

อาจารยทปรกษาปรญญานพนธ คณะกรรมการสอบปากเปลา ..................................................ทปรกษาหลก ...........................................................ประธาน (รองศาสตราจารย ดร.วระศกด สาม) (ผชวยศาสตราจารย ดร.พชรวร นนทธนะวานช) ..................................................ทปรกษารวม ...........................................................กรรมการ(รองศาสตราจารย สพชา วทยเลศปญญา) (รองศาสตราจารย ดร.วระศกด สาม)

...........................................................กรรมการ (รองศาสตราจารย สพชา วทยเลศปญญา) ...........................................................กรรมการ

(ผชวยศาสตราจารย ดร.ชตมา เพชรกระจาง)

ประกาศคณปการ ปรญญานพนธฉบบนส าเรจลลวงไดดวยด เพราะผวจยไดรบความกรณา ชวยเหลอ พรอมทงขอเสนอแนะเพอแกปญหา ปรบปรงใหปรญญานพนธมความสมบรณและถกตอง ตลอดจนดแลเอาใจใสการด าเนนงานวจยทกขนตอนอยางดยงจาก รองศาสตราจารย ดร.วระศกด สาม อาจารยทปรกษาหลก และขอกราบขอบพระคณ รองศาสตราจารยสพชา วทยเลศปญญา ทใหความกรณาเปนอาจารยทปรกษารวม พรอมทงเปนผใหความรทเปนประโยชนตองานวจยนอยางดยง ใหค าปรกษาเพอน าไปพฒนางานวจยใหมความสมบรณและทรงคณคาสามารถน าไปใชประโยชนในสงคมได รวมทงใหความอนเคราะหในการใชหองปฏบตการและเครองมอในการท างานวจยครงนดวย ผวจยขอกราบขอบพระคณเปนอยางสงในความกรณาของอาจารยทปรกษาปรญญานพนธทงสองทาน ทไดเสยสละเวลาอนมคาทมเทใหกบงานดานการวจยและพฒนาอยางไมเหนดเหนอย ผวจยรสกซาบซงและขอกราบขอบพระคณเปนอยางสงไว ณ โอกาสน ขอกราบขอบพระคณ ผชวยศาสตราจารย ดร.พชรวร นนทธนะวานช ทใหความกรณาเปนประธานการสอบปากเปลาปรญญานพนธ ขอกราบขอบพระคณ ผชวยศาสตราจารย ดร.ชตมา เพชรกระจาง ทใหความกรณาเปนกรรมการสอบปากเปลาปรญญานพนธ ขอกราบขอบพระคณอาจารยทกทานทไดประสทธประสาทวชาความรแกผวจยในการศกษาตามหลกสตรวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาวทยาการเภสชภณฑ ซงท าใหผวจยมความรอยางเตมเปยม ขอกราบขอบพระคณหวหนาหองปฏบตการ Chula Pharmacokinetic Research Center คณะแพทยศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย และบคลากรในหองปฏบตการทกทาน ทเปนก าลงใจและคอยชวยเหลอมาโดยตลอด สดทายนผวจยขอกราบขอบพระคณบดา มารดา ทใหโอกาส ใหการสนบสนน ตลอดจนเปนก าลงใจในการศกษากบผวจยเปนอยางดเยยมเสมอมา


สารบญ บทท หนา 1 บทน า ……………………………………………………………………….............… 1 ภมหลง .....…………………………………….……….....................................… 1 วตถประสงค สมมตฐานการวจย ปจจยและตวแปรทศกษา …………...............… 5 ขอบเขตของงานวจย ……………………………………….................................. 5 ประโยชนทคาดวาจะไดรบ ................................................................................ 6 2 แนวคด ทฤษฎ และ งานวจยทเกยวของ……………………………...............…. 7 พรกาบาลน ………………………………………………………………................ 7 เทคนคเทคนคโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง ………….........................… 7 องคประกอบของเครอง HPLC ……………………………............................. 7 หลกการของเทคนค HPLC ……………………….………….....................…. 8 การใช HPLC ในการวเคราะหเชงคณภาพและปรมาณ ................................ 11 งานวจยทเกยวของในการวเคราะหพรกาบาลนโดยใชเทคนค HPLC ............. 12 วธการสกดพรกาบาลนออกจากพลาสมาดวยวธการตกตะกอนโปรตน .................. 13 พลาสมา ...................................................................................................... 13 การตกตะกอนโปรตน .................................................................................. 14 งานวจยทเกยวของในการสกดพรกาบาลนโดยใชวธการตกตะกอนโปรตน ..... 15 การใชสาร 4-Chloro-7-Nitrobenzofurazan ในการท าใหเกดอนพนธกบ พรกาบาลนและกาบาเพนตน .............................................................................. 16 การเตรยมเปนสารอนพนธ .......................................................................... 16 4-คลอโร-7-ไนโตรเบนโซฟราแซน ............................................................... 17 กาบาเพนตน .............................................................................................. 17 งานวจยทเกยวของในการวเคราะหพรกาบาลนและกาบาเพนตนโดยใช NBD-Cl ...................................................................................................... 18 การตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะห ......................................................... 19 ความหมายของ Method Validation ............................................................ 19 พารามเตอรทใชในการทดสอบความถกตองของวธวเคราะห.......................... 20

สารบญ (ตอ) บทท หนา 3 วธด าเนนการวจย ………………………………………………………….............. 22 อปกรณ เครองมอและสารเคม ……………………………………………............. 22 การเตรยมสารละลายเพอใชในงานวจย …………………………………...........…. 24 วธการทดลอง …………………………………………………….………...........…. 26 ศกษาสภาวะทเหมาะสมของเฟสเคลอนทในการแยกสาร .………........…..... 26 ศกษาการสกดพรกาบาลนออกจากตวอยางพลาสมาดวยวธการ ตกตะกอนโปรตน …………………………………………………….........….. 28 ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการท าอนพนธกบ NBD-Cl และการ หยดปฏกรยา …………………………………………………….…..........…… 29 การตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะห ………………….……...........…. 30 4 ผลการทดลอง ……………………………………………………......…...........….. 34 ผลการศกษาสภาวะทเหมาะสมของเฟสเคลอนทในการวเคราะห ปรมาณพรกาบาลนในพลาสมา …………………………………......….........…..... 34 ผลการศกษาการสกดสารออกจากตวอยางพลาสมาดวยวธการ ตกตะกอนโปรตน ……………………………....................……......…….............. 42 ผลการศกษาสภาวะทเหมาะสมในการเกดปฏกรยาระหวางพรกาบาลน กบสาร NBD-Cl ……………………………....................……......……................ 45 ผลการตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะห .............……......…….................. 52 5 สรปผลการวจย อภปรายและขอเสนอแนะ .............…...........…......……......... 67 บรรณานกรม ……………………………………………………......…….......................... 76 ภาคผนวก ……………………………………………………...........…….......................... 82 ภาคผนวก ก ตารางแสดงเกณฑการยอมรบคาความแมนย าของการวเคราะหซ า ........ 83 ภาคผนวก ข ภาพประกอบแสดงขอมลโครมาโทแกรมเพมเตมของงานวจย ................ 85 ประวตยอผวจย ……………………………………………………...........…….................. 88

บญชตาราง ตาราง หนา 1 แสดงขอบงใชของพรกาบาลนทไดรบการรบรอง (Approved) โดยประเทศตางๆ ..... 1 2 แสดงรายงานการพฒนาวธการวเคราะหปรมาณพรกาบาลนโดยใชเทคนคตางๆ ..... 3 3 แสดงความแตกตางของ Normal phase และ Reverse phase ............................... 9 4 เกณฑการยอมรบคาจากการตรวจสอบความเหมาะสมของพารามเตอร .................. 11 5 แสดงคาพารามเตอรตางๆ ในการวเคราะหพรกาบาลนและกาบาเพนตนโดยใช Phosphate buffer ตางชนดกน .......................................................................... 37 6 แสดงคาพารามเตอรตางๆในการวเคราะหพรกาบาลนและกาบาเพนตนทความ เขมขนของ KH2PO4 ตางกน ............................................................................... 38

7 แสดงคาพารามเตอรตางๆ ในการวเคราะหพรกาบาลนและกาบาเพนตนเมอใช

KH2PO4 ความเขมขน 10 มลลโมลาร ทพเอชตางกน ............................................ 39

8 แสดงคาพารามเตอรตางๆในการวเคราะหพรกาบาลนและกาบาเพนตนทอตราสวน

ของเฟสเคลอนทตางกน ...................................................................................... 41

9 สรปสภาวะของเฟสเคลอนททเหมาะสมในการวเคราะหพรกาบาลน ........................ 42

10 แสดงผลของการสกดพรกาบาลนและกาบาเพนตนออกจากพลาสมาโดยใชชนดของ สารแตกตางกน (n=3) ......................................................................................... 43 11 แสดงคา %Recovery ทไดจากการใชอตราสวน Plasma : ACN เทากบ 1 : 2 ........ 44 12 แสดงคา %Recovery ทไดจากการใชอตราสวน Plasma : ACN เทากบ 1 : 2.5 ..... 45 13 แสดงคา %Recovery ทไดจากการใชอตราสวน Plasma : ACN เทากบ 1 : 3 ........ 45 14 แสดงคา %Recovery ทไดจากการใชอตราสวน Plasma : ACN เทากบ 1 : 3.5 ..... 45 15 แสดงคารอยละการเปลยนแปลงพนทใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนหลงจาก เตมกรดไฮโดรคลอรกทความเขมขนตางๆทเวลา 1 ชวโมง..................................... 46 16 แสดงคาพนทใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนทความเขมขนของ

NBD-Cl ตางกน ................................................................................................... 48

17 แสดงคาพนทใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนทพเอชของ Borate buffer

ตางกน ................................................................................................................. 49

18 แสดงคาพนทใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนในการท าปฏกรยาทเวลาตางกน 51

19 สรปสภาวะทเหมาะสมในการเกดปฏกรยาของสารอนพนธ........................................ 52

บญชตาราง (ตอ) ตาราง หนา 20 แสดงคาพนทใตพคของ Blank plasma ท Retention time ของการวเคราะห

พรกาบาลนและกาบาเพนตน ............................................................................. 54

21 แสดงคา Signal to noise ของพรกาบาลนทจดความเขมขนของ LLOD และ LLOQ (n=5) ...................................................................................................... 55 22 แสดงผลการศกษากราฟมาตรฐานในชวงความเขมขนของพรกาบาลน 20-10,000 นาโนกรมตอมลลลตร (n=5) ............................................................................... 56 23 แสดงสมการเสนตรงของกราฟมาตรฐานและคา R2 (n=5) ...................................... 57

24 แสดงคาความถกตองและความเทยงตรงของการวเคราะหพรกาบาลนทความเขมขน

20 นาโนกรมตอมลลลตร (LLOQ) ในพลาสมา (n=15) ในวนเดยวกนเปนจ านวน

3 วน .................................................................................................................. 58


20 นาโนกรมตอมลลลตร (LLOQ) ในพลาสมา (n=15) ในระหวางวนเปนจ านวน

3 วน................................................................................................................... 59

26 แสดงคาความถกตองและความเทยงตรงของการวเคราะหพรกาบาลนทความเขมขน 60 นาโนกรมตอมลลลตร (Low quality control) ในพลาสมา (n=5) ในวนเดยวกน

เปนจ านวน 3 วน ……………………….............................................................. 59 27 แสดงคาความถกตองและความเทยงตรงของการวเคราะหพรกาบาลนทความเขมขน

5000 นาโนกรมตอมลลลตร (Medium quality control) ในพลาสมา (n=5) ในวน เดยวกนเปนจ านวน 3 วน .................................................................................... 60

28 แสดงคาความถกตองและความเทยงตรงของการวเคราะหพรกาบาลนทความเขมขน 7500 นาโนกรมตอมลลลตร (High quality control) ในพลาสมา (n=5) ในวนเดยว

กนเปนจ านวน 3 วน ........................................................................................... 60


60, 5000 และ7500 นาโนกรมตอมลลลตรในพลาสมา (n=15) ในระหวางวนเปน

จ านวน 3 วน ..................................................................................................... 61

30 แสดงคา %Recovery ของการสกดพรกาบาลนทความเขมขน 60, 5000 และ 7500

นาโนกรมตอมลลลตร ในพลาสมา (n=5) ……………........................................... 61

บญชตาราง (ตอ) ตาราง หนา 31 แสดงคา %Recovery ของการสกดกาบาเพนตน 75 ไมโครกรมตอมลลลตร

ในพลาสมา ……………………………………………………………….........…..... 62

32 แสดงรอยละการเปลยนแปลงความเขมขนของพรกาบาลนทเวลาเรมตนของการ

เตรยมและเมอตงทงไวในเครองฉดสารอตโนมต เปนเวลา 48 ชวโมง ทอณหภม

20 องศาเซลเซยส ............................................................................................. 63

33 แสดงรอยละการเปลยนแปลงพนทใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนทเวลา

ตางๆ ................................................................................................................ 64

34 แสดงรอยละการเปลยนแปลงความเขมขนของพรกาบาลนในพลาสมาทผานการ

แชแขง-ละลาย เปนจ านวน 3 รอบ ..................................................................... 65

35 แสดงรอยละการเปลยนแปลงความเขมขนของพรกาบาลนในพลาสมาทตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 0 , 3 และ 6 ชวโมง .......................................................... 66

36 แสดงคาความแมนย าทยอมรบไดในการเตรยมตวอยางทไมผานการสกด ............... 84

บญชภาพประกอบ ภาพประกอบ หนา 1 แสดงสตรโครงสรางทางเคมของพรกาบาลน.......................................................... 7

2 แสดงสวนประกอบของเครอง HPLC ..................................................................... 8

3 แสดงกราฟความแตกตางของ Isocratic elution และ Gradient elution .................. 10

4 แสดงสวนประกอบของเลอด.................................................................................. 14

5 แสดงโครงสรางทางเคมของ NBD-Cl .................................................................... 17

6 แสดงโครงสรางทางเคมของกาบาเพนตน............................................................... 18

7 แสดงหลกการหาคา Signal to noise ................................................................... 20

8 แสดงโครมาโทแกรมของพรกาบาลนและกาบาเพนตนในระบบทไมผานการสกด โดย (a) เปนโครมาโทแกรมทใชเฟสเคลอนทเปน ACN : KH2PO4, (b) MeOH : KH2PO4 และ (c) ACN : H2O ........................................................ 35

9 แสดงโครมาโทแกรมของพรกาบาลนและกาบาเพนตนในพลาสมา โดย (a) เปนโครมาโทแกรมทใชเฟสเคลอนทเปน ACN : Na2HPO4, (b) ACN : NaH2PO4, (c) ACN : KH2PO4 และ (d) ACN : K2HPO4 ................... 36 10 แสดงโครมาโทแกรมของพรกาบาลนและกาบาเพนตนในพลาสมา โดย (a) เปนโครมาโทแกรมทใช KH2PO4 ความเขมขน 10 มลลโมลาร และ (b) 5 มลลโมลาร ........................................................................................ 38 11 แสดงความสมพนธระหวางพเอชกบคาพารามเตอรในการแยกของพรกาบาลน (RT คอ Retention time, Rs คอ Resolution, T คอ Tailing factor และ N คอ Theoretical Plates) ................................................................................ 40 12 แสดงความสมพนธระหวางปรมาณ ACN กบคาพารามเตอรในการแยกของ พรกาบาลน (RT คอ Retention time, RS คอ Resolution, T คอ Tailing factor, N คอ Theoretical Plates และ A คอ Peak area) .............. 41 13 แสดงสารละลายทไดหลงจากการตกตะกอนโปรตนในพลาสมาดวยชนดของสารท

แตกตางกน ....................................................................................................... 43

14 แสดงโครมาโทแกรมของพรกาบาลนและกาบาเพนตนทใช MeOH และTCA ในการ ตกตะกอนโปรตนโดย (a) เปนโครมาโทแกรมทใช MeOH ในการตกตะกอน โปรตนและ (b) 20% TCA .................................................................................. 44

บญชภาพประกอบ (ตอ) ภาพประกอบ หนา 15 แสดงความสมพนธระหวางความเขมขนของ HCl กบรอยละการเปลยนแปลงพนท ใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตน ............................................................... 47 16 แสดงความสมพนธเชงเสนระหวางพนทใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนกบ

ความเขมขนของ NBD-Cl ทตางกน .................................................................. 48 17 แสดงความสมพนธเชงเสนระหวางพนทใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนกบ

pH ของ Borate buffer .................................................................................... 50 18 แสดงความสมพนธเชงเสนระหวางพนทใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนกบ

เวลาทใชในการท าปฏกรยา.................................................................................. 51 19 แสดงสของตวอยางหลงหยดปฏกรยาดวยกรดไฮโดรคลอรก (เมอใหความรอนใน

ชวง 5-25 นาท) ................................................................................................. 52 20 แสดงโครมาโทแกรมทไดจากการวเคราะหพรกาบาลนและกาบาเพนตนในพลาสมา

โดย (a) เปนโครมาโตแกรมของพรกาบาลนกบกาบาเพนตนในพลาสมา (b) กาบาเพนตนในพลาสมาและ (c) Blank plasma ............................................. 53

21 แสดงโครมาโทแกรมทไดจากการวเคราะหพรกาบาลนทจดความเขมขนของ LLOQ

(20 นาโนกรมตอมลลลตร) ................................................................................. 55

22 แสดงชวงความเปนเสนตรงของกราฟมาตรฐานเฉลย (n=5) ทความเขมขนของ พรกาบาลน 20-10,000 นาโนกรมตอมลลลตร ...................................................... 57

23 แสดงปฏกรยา Derivatization ระหวางพรกาบาลนกบ NBD-Cl ............................... 70 24 แสดงสของอนพนธทเกดขนเมอใหความรอนเปนเวลา 15 นาท (กอนหยดปฏกรยา

ดวยกรด HCl) .................................................................................................... 71 25 แสดงโครมาโทแกรมของพรกาบาลนและกาบาเพนตนในพลาสมาโดยไมเตม NBD-Cl ............................................................................................................. 86 26 แสดงโครมาโทแกรมของสารละลายแบลงคทไมผานการสกด ................................ 86 27 แสดงโครมาโทแกรมของสารละลายตางๆ ทไมผานขนตอนการท าใหเกดอนพนธ ... 87

บทท 1 บทน า

ภมหลง พรกาบาลน (Pregabalin) เปนยาทถกคดคนและจดสทธบตรโดยบรษทไฟเซอร (Pfizer) (Pfizer Canada Inc. 2013: Online) พฒนามาจากกาบาเพนตน (Gabapentin) ออกฤทธโดยจบกบ α2δ (Alpha2delta) ซงเปน Subunit ของ Voltage-gated calcium channels สงผลใหลดการหลงสารสอประสาทจงลดการกระตนเซลลประสาท ท าใหมฤทธในการลดปวด นอกจากนนพรกาบาลนยงไมจบกบโปรตนในกระแสเลอด จงมรปแบบทางเภสชจลนศาสตรเปน เสนตรง (Linear pharmacokinetic) และไมจบกบเอนไซม CYP450 จงลดปญหาการเกดปฏกรยากบยาอน การรบประทานยายงไม ตองค านงถงมออาหารเนองจากอาหารไมมผลตอการดดซมยา (Arain. 2009: 407-413) เมอเปรยบเทยบประสทธภาพของพรกาบาลนกบกาบาเพนตนพบวา พรกาบาลนสามารถบรรเทาความเจบปวดไดดกวาและมคาชวประสทธผล (Oral bioavailability) ทสงกวา (Bockbrader; et al. 2010: 661-669) ปจจบนพรกาบาลนไดรบการรบรองใหใชในการรกษาโรคไดหลายชนดดงแสดงในตาราง 1 ตาราง 1 แสดงขอบงใชของพรกาบาลนทไดรบการรบรอง (Approved) โดยประเทศตางๆ

Approved indication Thai FDA US FDA European Commission

Postherpetic neuralgia Diabetic peripheral neuropathy Adjunct in partial seizures Fibromyalgia Anxiety

ทมา: ปณณวชย ชนอารมณ; และคนอนๆ. (2554: ออนไลน).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bockbrader%20HN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20818832

2

เนองจากพรกาบาลนมคณสมบตทดในการบ าบดรกษาโรคไดหลายชนด ท าใหมบรษทยาหลายแหงท าการผลตยาเลยนแบบขนมาอยางแพรหลาย หรอเรยกยาเลยนแบบนนวายาสามญ(Generic drugs) การศกษาเพอพสจนวายาสามญและยาตนแบบ (Original drugs) ใหผลการรกษาทเทาเทยมกน (Therapeutic equivalence) คอ การศกษาชวสมมล (Bioequivalence) (ศนยบรการภสชกรรม คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม . 2555: ออนไลน) ซงเปนวธทยอมรบวามความถกตองและใชกนอยางแพรหลายมากทสด ดงนนการวเคราะหระดบพรกาบาลนในพลาสมาจงมความส าคญเพอน าผลทไดมาใชเปรยบเทยบความสามารถของยาสามญวาดดซมและออกฤทธ ได ไ มแตกต างจากยาตนแบบ เพ อ เปนขอ มลยนยนว าสามารถใชแทนกนได (Interchangeability) ซงท าใหประชาชนมโอกาสไดใชยาราคาถกและลดการน าเขายาตนแบบทมราคาสงจากตางประเทศ (อสรยา เตชะธนะวฒน. 2552: 11-13) ปจจบนไมมวธมาตรฐานส าหรบวเคราะหปรมาณพรกาบาลน (Gujral; Haque; & Shanker. 2009: 422) แตไดมรายงานการพฒนาวธการวเคราะหเพอหาปรมาณพรกาบาลนโดยเทคนคตางๆ (ตาราง 2) ไดแก ESI-MS/MS, LC/MS /MS , UPLC-MS, GC/MS และ CE/ NMR ซงเปนเทคนคทมความไวและความแมนย าในการวเคราะหแตคาใชจายในการวเคราะหสง การใชเทคนคแกสโครมาโทกราฟ (Gas chromatography, GC) ไมนยมเนองจากพรกาบาลนเปนสารทไมระเหย ตองท าใหเปนอนพนธทสามารถระเหยและท าใหทนความรอนไดสง ซงสาร Derivatizing agent ทใชท าใหเกดอนพนธมจ านวนนอย การวเคราะหดวยเทคนคสเปกโตรฟลออโรเมทร (Spectrofluorometry) และสเปกโตรโฟโทเมทร (Spectrophotometry) เปนเทคนคทงาย ราคาถก แตเทคนค ยว-วสเบล สเปกโตรโฟโทเมทร (UV-VISspectrophotometry) มความไวในการวเคราะหต าไมสามารถวเคราะหสารผสมไดและไมเปนระบบการวเคราะหแบบอตโนมต เทคนคนจงยงไมเปนทยอมรบในการวเคราะหระดบยาเพอใชในการศกษาชวสมมล เทคนคโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง (High performance liquid chromatography, HPLC) เปนเทคนคทใหความไวและความจ าเพาะเจาะจงของการวเคราะหสงเมอใชตวตรวจวดชนดฟลออเรสเซนต (Fluorescence detector) สามารถวเคราะหสารผสมและสารปรมาณนอยได เปนระบบอตโนมต และสามารถวเคราะหซ าซงใหผลการวเคราะหทมความถกตองและแมนย า

3

ตาราง 2 แสดงรายงานการพฒนาวธการวเคราะหปรมาณพรกาบาลนโดยใชเทคนคตางๆ เทคนคการวเคราะหพรกาบาลน อางอง

ESI-MS/MS

Shah; Ghosh; & Thaker. 2010: 354-357

LC-MS/MS Nirogi; et al. 2009: 3899-3906 Heltsley; et al. 2011: 357-359 Uma; et al. 2011: 108-112

Vaidya; et al. 2007: 925-928 Mandal; et al. 2008: 237-243

UPLC-MS

GC-MS

Dahl; Olsen; & Strand. 2012: 37-42

Mudiam; et al. 2012: 310-319

CE/NMR

GC

Spectrofluorometry

Spectrophotometry

HPLC

Beni; et al. 2010: 842-852

Thejaswini; Gurupadayya; & Raja. 2012: 3112-3115

Abdel; & Shaalan. 2010: 250-267 Onal; & Sagirli. 2009: 68-71

Abdel; & Shaalan. 2010: 250-267 Bali; & Gaur. 2011: 1-7 Gujral; Haque & Shanker. 2009: 421-427 Onal; & Sagirli. 2009: 68-71

Gujral; Haque ; & Kumar. 2009: 327-334 Vermeij; & Edelbroek. 2004: 297-303 Mercolinia; et al. 2010: 62-67 Mishra; Gurupadhyya; & Verma. 2012: 130 Dousa; Gibala; & Lemr. 2010: 717-722

4

ในการวเคราะหตวอยางทางดานชวสมมลหรอเภสชจลนศาสตร ตวอยางทน ามาใชในการวเคราะหเปนตวอยางพลาสมาจงไมสามารถน าไปวเคราะหดวยเทคนค HPLC ไดโดยตรงตองมการเตรยมตวอยางใหสะอาดหรอบรสทธโดยการสกดยาออกจากพลาสมากอนน าไปวเคราะห นอกจากนตวอยางทางดานการศกษาชวสมมลในแตละครงมตวอยางจ านวนมาก การเลอกวธการสกดทเหมาะสมจงมความจ าเปนเพอน าไปสผลการวเคราะหทมความรวดเรว ถกตองและแมนย า โดยจากการศกษาทผานมาพบวามหลายวธทสามารถน ามาประยกตใชในการสกดยาได เชน Solid-phase extraction (SPE), Enzymatic digestion, Ultra-filtration, Dialysis, Liquid-liquid extraction (LLE) และ Protein precipitation เปนตน (ชนกพร โปตบตร; และวระชย สมย. 2554: ออนไลน) การตกตะกอนโปรตน (Protein precipitation) ถอเปนวธการสกดทงาย รวดเรว มราคาถก เหมาะกบการวเคราะหตวอยางจ านวนมาก แตตองมการเลอกชนดและปรมาณสารทใชในการตกตะกอนใหเหมาะสมเพอลดปญหาการสญเสยสารส าคญในระหวางการสกดและสามารถสกดซ าไดผลแมนย า จากการศกษาโครงสรางของพรกาบาลนพบวาไมมโครโมฟอร (Chromophore) และฟลออโรฟอร (Fluorophore) ท าใหพรกาบาลนไมสามารถตรวจวดดวยตวตรวจวดฟลออเรสเซนต

ไดโดยตรง ดงนนการท าใหเกดอนพนธ (Derivatization) จงเปนอกทางเลอกหนงของการเพมประสทธภาพในการตรวจวดโดยการท าใหเกดปฏกรยาทางเคมระหวางพรกาบาลนกบ Derivatizing agent เพอ เปล ยนหรอปรบปรงคณสมบตทางเคมฟสกสของสารใหสามารถตรวจวดได โดยสาร Derivatizing agent ทเคยมผศกษาเพอน ามาใชในการท าปฏกรยากบพรกาบาลน คอ o-Phtaldialdehyde (Vermeij; & Edelbroek. 2004: 297-303) ( Dousa; Gibala; & Lemr. 2010: 717-722) อนพนธทเกดขนมความคงตวสน, Fluorescamine (Abdel; & Shaalan. 2010: 250-267) เปนสารทมราคาแพง , 2,4-Dinitrofluorobenzene (Abdel; & Shaalan. 2010: 250-267), 2,3,5,6-Tetrachloro-1,4-benzoquinone (Abdel; & Shaalan. 2010: 250-267), 1,2-Naphthoquinone-4-sulphonate sodium (NQS) (Mercolinia; et al. 2010: 62-67) และ Ninhydrin (Bali; & Gaur. 2011: 1-7) ใชตวตรวจวดชนดยว-วสเบล ท าใหความไวในการวเคราะหต า นอกจากรเอเจนตตางๆ ดงกลาวขางตนยงพบวามสาร Derivatizing agent ทใชในการวเคราะหพรกาบาลนและสามารถเกดปฏกรยาไดด คอ 4-Chloro-7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl) (Onal; & Sagirli. 2009: 68-71)

ซงเปนรเอเจนตทมราคาถก อนพนธทเกดขนสามารถตรวจวดดวยตวตรวจวดฟลออเรสเซนตได มความไวในการวเคราะหสงและมความคงตวด (Elbashir; Suliman; & Aboul-Enein. 2011: 222-241) (Hao; et al. 2004: 77-85) จากขอมลทไดกลาวมาในเบองตนพบวาการพฒนาการวเคราะหพรกาบาลนในตวอยางพลาสมา เพอใหไดวธวเคราะหทมความไวในการวเคราะหสง เวลาทใชในการวเคราะหสนและใหผลการวเคราะหทมความถกตองและแมนย า รวมถงตนทนในการวเคราะหต า ตองพฒนาในสวนของเทคนคในการวเคราะห เทคนคในการสกดสารและเทคนคในการเพมประสทธภาพในการตรวจวด การศกษานจงมงเนนศกษาวธการวเคราะหหาปรมาณพรกาบาลนในตวอยางพลาสมาดวยเทคนค

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hao%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15560482

5

HPLC รวมกบตวตรวจวดฟลออเรสเซนต ใชกาบาเพนตนเปนสารมาตรฐานภายใน (Internal standard) สกดยาออกจากพลาสมาโดยใชวธการตกตะกอนโปรตน แลวท าใหเกดอนพนธกบสาร NBD-Cl กอนทจะน าสารอนพนธไปแยกดวยคอลมนชนด C18

ซงเปนการพฒนาวธวเคราะหทยงไมเคยมรายงานวจยการวเคราะหดวยวธนมากอน จากนนท าการตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะห (Method validation) โดยหาคาพารามเตอรตางๆ ตามขอก าหนดของ United States Food and Drug Administration guideline (US FDA guideline) (Food and Drug Administration. 2013: Online) และ European Medicines Agency guideline (EMEA guideline) (European Medicines Agency. 2011: Online) เพ อยนยนวาวธทพฒนาขนสามารถน าไปประยกต ใชวเคราะหพรกาบาลนในพลาสมาเพอศกษาชวสมมลได ซงปจจบนมรายงานคอนขางนอยเกยวกบการพฒนาวธการวเคราะหพรกาบาลนในตวอยางพลาสมาดวยเทคนค HPLC เพอศกษาชวสมมล วตถประสงค เพอพฒนาวธวเคราะหหาปรมาณพรกาบาลนในตวอยางพลาสมาใหสามารถวเคราะหหาปรมาณไดถกตองตามเกณฑมาตรฐานของ US FDA และ EMEA guideline สมมตฐานการวจย วธวเคราะหทพฒนาขนสามารถวเคราะหหาปรมาณพรกาบาลนไดถกตองตามเกณฑมาตรฐานของ US FDA และ EMEA guideline ปจจยและตวแปรทศกษา ตวแปรอสระ : วธการวเคราะหพรกาบาลน ตวแปรตาม : ปรมาณพรกาบาลน และ Method validation parameter ขอบเขตของงานวจย งานวจยนเปนงานวจยเชงทดลองมงศกษาการพฒนาวธวเคราะหปรมาณพรกาบาลนในตวอยางพลาสมาดวยเทคนค HPLC ทใชกาบาเพนตนเปนสารมาตรฐานภายใน โดยขนตอนการพฒนาวธวเคราะหคอ ศกษาสภาวะของเฟสเคลอนท (Mobile phase) ทเหมาะสมในการวเคราะหไดแก ชนดของเฟสเคลอนท,ความเขมขนของ Phosphate buffer, พเอชของเฟสเคลอนทและอตราสวนของเฟสเคลอนทโดยใช Reverse phase system ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการสกด พรกาบาลนออกจากตวอยางพลาสมาดวยวธการตกตะกอนโปรตน โดยศกษาชนดและปรมาณสารทใชในการตกตะกอนโปรตน ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการเกดอนพนธระหวางพรกาบาลนกบ NBD-Cl โดยศกษาปรมาณทเหมาะสมของ NBD-Cl พเอชทใชในการท าปฏกรยา เวลาทใชในการท าปฏกรยาและความเขมขนของกรดไฮโดรคลอรกทใชในการหยดปฏกรยา ตลอดจนตรวจสอบความ

6

ถกตองของวธวเคราะหทพฒนาขนตามเกณฑการยอมรบของ US FDA guideline และ EMEA guideline ประโยชนทคาดวาจะไดรบ 1. ไดวธใหมในการวเคราะหระดบยาพรกาบาลนในตวอยางพลาสมาของมนษยทมความจ าเพาะเจาะจงและมความไวในการวเคราะหสง ใชระยะเวลาในการวเคราะหสน ผลการทดลองทไดจากวธทพฒนาขนมความถกตองและแมนย า โดยทใชตนทนในการวเคราะหต า 2. ตวอยางทเตรยมไดมความคงตว ท าใหสามารถวเคราะหตวอยางทมจ านวนมากได โดยไมท าใหตวอยางทรอการวเคราะหเสอมสภาพ 3. สามารถน าวธวเคราะหทพฒนาขนไปประยกตใชในการวเคราะหปรมาณพรกาบาลนในตวอยางจรงส าหรบการศกษาชวสมมลหรอการศกษาทางดานเภสชจลนศาสตร

บทท 2 แนวคด ทฤษฎ และ งานวจยทเกยวของ

1. พรกาบาลน คณสมบตทางเคมกายภาพของพรกาบาลน พรกาบาลน มชอทางเคม (Chemical name) คอ (S)-3-(Aminomethyl)-5-methylhexanoic acid มสตรโมเลกล (Molecular formula) C8H17NO2 โดยมนาหนกโมเลกล (Molecular weight) เทากบ 159.23 คา pKa1 เทากบ 4.2 และ pKa2 เทากบ 10.6 มสมบตทางเคมกายภาพ (Physicochemical properties) เปนผลกของแขงสขาว เปนสารประกอบทมขวสงสามารถละลายไดดในนา (Uma; et al. 2011: 108) โครงสรางทางเคม (ภาพประกอบ 1) ประกอบดวยสายไฮโดรคารบอนชนดอมตวจงมคาความยาวคลนทพรกาบาลนสามารถดดกลนแสงอลตราไวโอเลตไดสงสด (max) ทชวงความยาวคลนสน (196.2 นาโนเมตร) (Bali; & Gaur. 2011: 2) นอกจากน พรกาบาลนยงไมสามารถเรองแสงฟลออเรสเซนต เนองจากโครงสรางไมคงรป (Rigid) และมพนธะคเพยงพนธะเดยว โดยโครงสรางของพรกาบาลนประกอบดวยหมฟงกชนทแสดงความเปนกรด คอหม Carboxylic (-COOH) และหมฟงกชนทแสดงความเปนเบส คอหม Primary amine (-NH2)

ภาพประกอบ 1 แสดงสตรโครงสรางทางเคมของพรกาบาลน

ทมา: Dahl; Olsen; & Strand. (2012: 38). 2. เทคนคโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง (High Performance Liquid Chromatography; HPLC) 2.1 องคประกอบของเครอง HPLC สวนประกอบหลกของเครอง HPLC ดงแสดงในภาพประกอบ 2 ประกอบดวย 1. เฟสเคลอนท (Mobile phase) คอตวทาละลายทใชในการชะหรอแยกตวอยาง มสถานะเปนของเหลว ทาหนาทในการนาสารตวอยางและตวทาละลายเขาสคอลมนเพอใหเกดกระบวนการแยกภายในคอลมน

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/0c/Pregabalin.svg

8

2. ปม (Pump) ทาหนาท ดงเฟสเคลอนทเขาสระบบ HPLC 3. ชองฉดสาร (Injector/Autosampler) ทาหนาท ฉดสารตวอยางเพอเขาสระบบ HPLC 4. คอลมน (Column) หรอจะเรยกวาเฟสอยกบท (Stationary phase) ภายในบรรจดวยเฟสทอยกบท มลกษณะเปนของแขงหรอเจล ทาใหเกดกระบวนการแยกองคประกอบของสารทสนใจ โดยกระบวนการแยกเกดขนระหวางเฟสเคลอนทกบเฟสอยกบท 5. ตวตรวจวดสญญาณ (Detector) ทาหนาท ตรวจวดสญญาณของสารทสนใจทไดจากกระบวนการแยก ซงชนดของตวตรวจวด ไดแก Photodiode array detector, Fluorescence detector, Refractive index detector เปนตน การเลอกใชตวตรวจวดขนกบตวอยางทสนใจวาสามารถตอบสนองกบตวตรวจวดชนดไหนไดด 6. เครองบนทกสญญาณ (Recorder) ทาหนาท รบสญญาณทออกจากตวตรวจ วดสญญาณ ซงเปนสญญาณไฟฟาและประมวลผลการวเคราะหออกมาเปนโครมาโทแกรม

ภาพประกอบ 2 แสดงสวนประกอบของเครอง HPLC

ทมา: จรนนท ชยวาฤทธ. (2555: ออนไลน). 2.2 หลกการของเทคนค HPLC เทคนค HPLC เปนเทคนคทใชสาหรบแยกสารทสนใจภายใตความดนของเหลว โดยกระบวนการแยกเกดขนระหวางเฟส 2 เฟส คอ เฟสอยกบทหรอคอลมนกบเฟสเคลอนทโดยใชหลกการทสารแตละชนดมความชอบตอเฟสอยกบทและเฟสเคลอนททแตกตางกนทาใหสารถกแยกออกมาในเวลาทตางกน โดยสารประกอบตวใดทสามารถเขากนไดดกบเฟสเคลอนทสารนนกจะถก

9

แยกออกมากอน สวนสารทเขากนไดไมดกบเฟสทเคลอนทหรอเขากนไดดกบเฟสอยกบทกจะถกแยกออกมาภายหลง

เทคนค HPLC เปนเทคนคการแยกสารผสมแบบใชเครองสบแรงดนสง (High pressure pump) สบเฟสเคลอนทพาสารตวอยางทถกฉดเขาทางชองฉดสารผานอนภาคทเปนเฟสอยกบทซงบรรจอยในคอลมน สารผสมตวอยางจะเคลอนทผานคอลมนและถกแยกออกมาแลวเขาสเครองตรวจวดในเวลาทตางกน สญญาณทวดไดจะอยในรปสญญาณไฟฟาตามเวลาและปรมาณของสารแตละตวทวดได จากนนสญญาณจะถกสงไปยงเครองบนทกสญญาณและสญญาณทบนทกไดจากตวตรวจวดจะมลกษณะเปนพคทเรยกวาโครมาโทแกรม

1. กลไกในการแยกสารโดยใชโครมาโทกราฟ สามารถแบงออกไดเปน 4 กลไกขนอยกบอนตรกรยาทเกดระหวางสารทสนใจวเคราะหกบคอลมน ไดแก 1.1 การกระจายตว (Partition liquid chromatography) เปนการใชหลกการแยกสารตวอยางตามความชอบการกระจายตวหรอละลายในเฟสคงทหรอเฟสเคลอนททแตกตางกน 1.2 การดดซบ (Adsorption liquid chromatography) แยกสารโดยใชหลกการดดซบของสารตวอยางบนเฟสคงททมขว อาศยความแตกตางความมขวของสารตวอยางทแตกตางกน 1.3 การแลกเปลยนไอออน (Ion-exchange chromatography) เปนการแยกสารทแตกตวเปนประจหรอสารประกอบไอออนก โดยอาศยความแตกตางของความแรงของประจของสารแตละชนด 1.4 การแยกโดยใชความแตกตางของขนาดสาร (Size exclusion chromatography) เปนการแยกสารโดยอาศยความแตกตางของนาหนกโมเลกล ขนาดและรปรางของสาร (แมน อมรสทธ; และคนอนๆ. 2555: 397-405) รปแบบการแยกสารโดยเทคนค HPLC ทใชโดยทวไปม 2 ประเภทตามความมขวของเฟสอยกบทและเฟสเคลอนท ไดแก Normal phase และ Reverse phase ดงแสดงในตาราง 3 ตาราง 3 แสดงความแตกตางของ Normal phase และ Reverse phase

Separation mode (solvent)

Stationary phase (packing materials)

Mobile phase

Normal phase Polar Non-polar Reverse phase Non-polar Polar

ทมา: Waters. (2014: Online).

10

2. การชะสารออกจากคอลมน (Elution) การใชสารละลายเฟสเคลอนทในการชะสารออกจากคอลมนพบได 2 ลกษณะ

ดงแสดงในภาพประกอบ 3 คอ 2.1 Isocratic elution เปนการใชอตราสวนของเฟสเคลอนทคงทตลอดทงรอบการวเคราะหอาจใชเฟสเคลอนทชนดเดยวหรอหลายชนดผสมกนกได แตสดสวนคงทไมมการเปลยนแปลงตลอดการวเคราะหเหมาะกบการวเคราะหสารเพยงชนดเดยวหรอสารผสมกได 2.2 Gradient elution เปนการเปลยนแปลงอตราสวนของเฟสเคลอนทในระหวางการวเคราะห ซงตองใชชนดของเฟสเคลอนทอยางนอย 2 ชนด เหมาะกบตวอยางทเปนสารผสม

ภาพประกอบ 3 แสดงกราฟความแตกตางของ Isocratic elution และ Gradient elution ทมา: Ravi, Sankar. (2013: Online). 3. พารามเตอรพนฐานทบงบอกถงประสทธภาพของเทคนค HPLC 3.1 Theoretical plate (N) เปนคาทบงชประสทธภาพของคอลมน คา N มากแสดงถงประสทธภาพในการแยกด 3.2 Capacity factor (k') เปนคาทแสดงวาสารถกหนวงเหนยวอยในคอลมนไดดเพยงใด 3.3 Tailing factor (T) เปนคาทบอกถงลกษณะพคของสารวามความสมมาตรมากนอยเพยงใด 3.4 Resolution (RS) เปนคาทแสดงวาพคของสารสองพคทอยตดกน แยกออกจากกนมากนอยเพยงใด

11

เกณฑการยอมรบคาพารามเตอรพนฐานเพอแสดงประสทธภาพการแยกของระบบตามมาตรฐาน US FDA guideline ดงแสดงในตาราง 4

ตาราง 4 เกณฑการยอมรบคาจากการตรวจสอบความเหมาะสมของพารามเตอร

Parameters US FDA guidline

N k' T RS

> 2000 > 2 ≤ 2 > 2

ทมา: Food and Drug Administration. (1994: Online).

2.3 การใช HPLC ในการวเคราะหเชงคณภาพและปรมาณ 1. การวเคราะหเชงคณภาพ (Qualitative analysis) การตรวจสอบชนดของสารวาเปนสารทสนใจหรอไม โดยการเปรยบเทยบกบ

สารมาตรฐาน มการยนยนชนดของสารได 2 วธ ไดแก 1.1 เปรยบเทยบคา Retention time (RT) กบสารมาตรฐาน โดยสารตวอยาง

และสารมาตรฐานตองทาการวเคราะหในสภาวะเดยวกน ถาสารตวอยางและสารมาตรฐานม RT เทากน แสดงวาเปนสารเดยวกนและอาจวเคราะหเพมเตมโดยเปลยนชนดของคอลมนและ/หรอเฟสเคลอนท

1.2 เตมสารมาตรฐานเขมขนปรมาณเลกนอยลงในสารละลายตวอยาง ซงเรยกวาการ Spike ถาเปนสารชนดเดยวกนจะทาใหพนทพคหรอความสงเพมขน

2. การวเคราะหเชงปรมาณ (Quantitative analysis) เปนการวเคราะหเพอหาปรมาณสารสามารถวดปรมาณของสารไดโดยวดความ

สงของพคหรอวดพนทพคเทยบกบกราฟมาตรฐาน โดยการเตรยมกราฟมาตรฐานสามารถทาได 2 วธ ไดแก 2.1 External standard method ใชสารละลายมาตรฐานทมความเขมขนแตกตางกน 3-5 ระดบความเขมขน นามาวเคราะหแลวเขยนกราฟระหวางความเขมขน (แกนนอน) กบพนทพคหรอความสงของพค (แกนตง)

12

2.2 Internal standard method เปนการวเคราะหหาปรมาณสารตวอยางโดยการเตมสารมาตรฐานชนดทไมมในตวอยางเรยกวาสารมาตรฐานภายในลงในสารตวอยางและสารมาตรฐานในปรมาณทเทากน นามาวเคราะหและเขยนกราฟมาตรฐานระหวางความเขมขน (แกนนอน) กบอตราสวนพนทพคของสารมาตรฐานกบพนทพคของสารมาตรฐานภายใน(แกนตง) การวเคราะหหาปรมาณสารดวยวธนใหความแมนยาและความเทยงตรงสง โดยสารมาตรฐานภายในควรมคณสมบต ดงน - เปนสารทไมมในตวอยาง - เปนสารในกลมเดยวกนมคณสมบตคลายกนกบสารตวอยาง - ไมทาปฏกรยาเคมกบสารใดๆ ในคอลมน และสารละลายตวชะ - ให Retention time ใกลเคยงกบพคของตวอยางและแยกออกจากพคของตวอยาง อยางชดเจน (แมน อมรสทธ; และคนอนๆ. 2555: 430-431)

2.4 งานวจยทเกยวของในการวเคราะหพรกาบาลนโดยใชเทคนค HPLC เทคนค HPLC สามารถตรวจวดไดทงเชงคณภาพวเคราะหและเชงปรมาณวเคราะห

โดยการเปรยบเทยบกบสารมาตรฐาน สวนใหญนยมใชวเคราะหสารประกอบทระเหยยาก (Low volatile substances) หรอมนาหนกโมเลกลสง (High molecular weight compounds) ซงปจจบนเทคนค HPLC เขามามบทบาทในการวเคราะหยามากขนทงในดานของการตรวจสอบคณภาพของวตถดบยา (Active pharmaceutical ingredients) การประเมนและควบคมคณภาพของยาสาเรจรป (Finished products) หรอการวเคราะหระดบยาในตวอยางทเปนชววตถ (Biological fluid) เชน เลอด ปสสาวะ พลาสมา เปนตน (ธญนนท พรายงาม. 2554: 10-12) มรายงานการพฒนาวธวเคราะหปรมาณพรกาบาลนโดยใชเทคนค HPLC ดงน

กจรล; แฮกค; และคมาร (Gujral; Haque; & Kumar. 2009: 327-334) ไดศกษาวธการวเคราะหพรกาบาลน ในตวอยางผลตภณฑยา 5 ชนดและในปสสาวะของมนษย โดยใชระบบ Isocratic reverse phase HPLC รวมกบตวตรวจวดยวทความยาวคลน 210 นาโนเมตร สภาวะทใช คอ คอลมนชนด C18 ขนาดอนภาค 5 ไมโครเมตร ยหอ Hypersil คอลมนขนาด 250 มลลเมตร × 4.6 มลลเมตร ระบบเฟสเคลอนท คอ เมทานอล (MeOH) : อะซโตไนไตรล (ACN) : ไดโปแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต (K2HPO4) ความเขมขน 0.02 โมลาร พเอชเทากบ 7 ในอตราสวน 3 : 1 : 16 โดยปรมาตร อตราการไหล 1.0 มลลลตรตอนาท โดยใชเวลาในการวเคราะหนอยกวา 10 นาท ซงสามารถวเคราะหพรกาบาลนไดอยในชวงความเขมขน 0.75 - 6.00 ไมโครกรมตอมลลลตร จากการ ศกษาพบวางานวจยนสามารถวเคราะหพรกาบาลนไดโดยไมตองผานขนตอนการทาใหเกดเปนสารอนพนธโดยใชตวตรวจวดยว ซงเปนวธทงาย ลดขนตอนการเตรยมตวอยาง ลดคาใชจายในการวเคราะห และใชเวลาในการวเคราะหสน แตจากผลการทดลองพบวายงเปนวธวเคราะหทใหความไวในการวเคราะหตา เนองจากใชตวตรวจวดยวและความยาวคลนทใชในการวเคราะห ยงไมใชความยาวคลนการดดกลนแสงสงสดของพรกาบาลน

13

เวอเมจ; และ อเดลโบรค (Vermeij; & Edelbroek. 2004: 297-303) ไดศกษาวธการวเคราะหสารผสมของยา 3 ชนด ไดแก พรกาบาลน กาบาเพนตน และ วกาบาทรน ในตวอยางซรมของมนษย โดยใชระบบ Isocratic reversed phase HPLC รวมกบตวตรวจวดฟลออเรสเซนตและใชเทคนคในการวเคราะหหาปรมาณดวยวธ Internal standard method เตรยมตวอยางโดยใชสาร ละลาย Trichloroacetic acid (TCA) ในการกาจดโปรตนและนาสวนใสมาทาใหเกดอนพนธกบสาร o-Phthaldialdehyde (OPA) และ 3-Mercaptopropionic acid กอนทจะนาสารนนไปแยกดวคอลมน ชนด C18 โดยใชเฟสเคลอนทเปน MeOH : ACN : Phosphate buffer ความเขมขน 20 มลลโมลาร พเอชเทากบ 7 ในอตราสวน 8.0 : 17.5 : 74.5 โดยปรมาตร อตราการไหล 0.8 มลลลตรตอนาท แลวทาการตรวจวดดวยตวตรวจวดฟลออเรสเซนต ชวงทใชในการวเคราะหของพรกาบาลน คอ 0.13 - 63 มลลลตรตอลตร กาบาเพนตน 0.53 - 40 มลลลตรตอลตรและวกาบาทรน 0.06 - 62 มลลลตรตอลตร ใชเวลาในการวเคราะห 25 นาทตอ 1 ตวอยาง จากการศกษาพบวางานวจยนใชตวตรวจวดฟลออเรสเซนต สามารถวเคราะหสารผสมไดอยางจาเพาะเจาะจง แตยงเปนวธวเคราะหทใหความไวในการวเคราะหตา เวลาในการวเคราะหนานและตองใชเฟสเคลอนทในการแยกสารหลายชนด ดอเซ; กบาลา; และเอลเมอ (Dousa; Gibala; & Lemr. 2010: 717-722) ไดศกษาวธวเคราะหพรกาบาลนในตวอยางผลตภณฑยาดวยระบบ Isocratic reversed phase HPLC รวม กบตวตรวจวดฟลออเรสเซนต ใชเฟสเคลอนทเปน MeOH : Acetate buffer ทความเขมขน 0.01 โมลาร พเอชเทากบ 5.0 ในอตราสวน 15 : 85 โดยปรมาตร แยกดวยคอลมนชนด C18 หลงจากนนทาใหเกดอนพนธกบ OPA และ 2-mercaptoethanol กอนทจะนาสารไปตรวจวดดวยตวตรวจวดชนดฟลออเรสเซนต ใชเวลาในการวเคราะห 15 นาท ซงผลการวเคราะหพรกาบาลนซา 8 ครง มคา %RSD (Relative standard deviation) ของ Retention time และพนทใตพคเทากบ 0.06% และ 0.51% ตามลาดบ จากการศกษาพบวางานวจยนเปนเทคนคทมความจาเพาะเจาะจงสง ใหผลการวเคราะหซาทแมนยา แตตองเพมอปกรณในการผสมสาร คอ Capillary coil หลงจากผานการแยกดวยคอลมน และเพมขนตอนการหาสภาวะทเหมาะสมเพอใหพรกาบาลนกบสาร Derivatizing agent เกดปฏกรยาไดอยางสมบรณใน Capillary coil กอนทาการตรวจวด

3. วธการสกดพรกาบาลนออกจากพลาสมาดวยวธการตกตะกอนโปรตน ในตวอยางพลาสมามโปรตนละสารอนปนอยเปนจานวนมาก กอนการวเคราะหจงตองแยกสารทตองการออกจากสารทรบกวนการวเคราะหเพอยดอายการใชงานของคอลมนและสามารถวเคราะหสารไดอยางถกตองและแมนยา 3.1 พลาสมา (Plasma)

พลาสมา คอ สวนประกอบของเลอดทเปนของเหลวดงแสดงในภาพประกอบ 4 ลกษณะเปนสเหลองใส มสดสวนคดเปน 55 เปอรเซนตในเลอด พลาสมาประกอบดวยนาประมาณ

14

92 เปอรเซนตและมโปรตนทสาคญ 7 ชนด เชน Albumin, Gamma globulin, Fibrinogen และ Anti-Hemophilic factor เปนตน นอกจากนอก 1 เปอรเซนตยงมนาตาล ไขมน ฮอรโมน วตามน รวมทงแรธาตชนดตางๆ เปนสวนประกอบอกดวย

ภาพประกอบ 4 แสดงสวนประกอบของเลอด

ทมา: American Red cross. (2014: Online).

3.2 การตกตะกอนโปรตน (Protein Precipitation) โดยปกตโปรตนสามารถละลายอยในนาไดมเหตผลหลกสองประการคอ โมเลกลของโปรตนในสวนทชอบนา สามารถเกดอนตรกรยา (Interaction) กบนาไดจงสามารถเกดแรงดงดดทางไฟฟาเอาโมเลกลของนามาลอมรอบโมเลกลของโปรตนได อกสาเหตหนงคอ บนโมเลกลของโปรตนมประจไฟฟาสทธ (Electrostatic repulsion) สงกวาแรงดงดดไฟฟาสถตทาใหโมเลกลของโปรตนอยหางกนจงไมสามารถรวมตวเขามาอยใกลกนแลวตกตะกอนลงมาได ดงนนปจจยใดกตามทสามารถเพมอนตรกรยาระหวางโมเลกลของโปรตนดวยกนเอง (Protein - protein interaction) หรอการลดอนตรกรยาระหวางโมเลกลของโปรตนและนา (Protein - Water interaction) ทาใหความสามารถในการละลายนาของโปรตนลดลง สงผลใหโปรตนตกตะกอนได ซงการตกตะกอนโปรตนมหลายวธ ไดแก การตกตะกอนทจดไอโซอเลคทรค (Isoelectric pH) เรยกวธนวา Isoelectric precipitation การตกตะกอนโปรตนโดยการเพมความแรงอออนดวยวธการตกตะกอนแบบลาดบสวนดวยเกลอ (Ionic strength หรอ Salt fractionation precipitation) และการตกตะกอนดวยตวทาละลายอนทรยทอณหภมตา (Organic solvent precipitation) เปนตน (ชรนทร เตชะพนธ. 2542: Online)

1. การตกตะกอนทจดไอโซอเลคทรค โปรตนแตละชนดมคาพเอชททาใหสมดลของประจสทธบนโมเลกลเปนศนย เรยก วาคานวาจดไอโซอเลคทรค (Isoelectric point; pI) เปนคาเฉพาะตวของโปรตนแตละชนด เมอใดกตามททาการปรบคาพเอชของสารละลายโปรตนผสมจนกระทงมคาเทากบคา pI ของโปรตนทตองการแยกโปรตนชนดนนจะเกดการรวมตวกนแลวตกตะกอนลงมาเนองจากบนโมเลกลของ

15

โปรตนนนมประจสทธเปนศนยจงไมมแรงผลกดนไฟฟาสถตยระหวางโมเลกลของโปรตนเอง ดงนนโปรตนจงเขาใกลกนมากพอทจะเกดการรวมตวกน (Aggregration) ตกตะกอนลงมาได 2. การตกตะกอนโดยอาศยหลกการเพมคาความแรงของอออนโดยใชเกลอ เปนการตกตะกอนโปรตนโดยใชเกลอทมความเขมขนสงซงเรยกวธการนวา " Salting out " เปนการเตมเกลอลงไปในสารละลายโปรตนผสมเพอเพมความแรงไอออน (Ionic strength) ของสารละลายใหสงขนจนกระทงอออนของเกลอไปแยงโมเลกลของนาทลอมรอบโมเลกลของโปรตนออกมาลอมรอบโมเลกลของเกลอเอง ซงอาจกลาวไดวาเปนการแขงขนระหวางโมเลกลของโปรตนและโมเลกลของเกลอในการเกดแรงกรยาทางไฟฟากบโมเลกลของนานนเองเมอใดกตามทแรงกระทาระหวางโมเลกลของโปรตนกบนามคาเหลอนอยกวาแรงกระทาระหวางโมเลกลของโปรตนกบโปรตน โปรตนกจะจบตวกนตกตะกอนลงมา 3. การตกตะกอนโปรตนดวยตวทาละลาย เปนการตกตะกอนโปรตนโดยตวทาละลายอนทรยจะไปลดคาความสามารถในการละลายนาของสารโดยไปลดคาคงทไดอเลคตรค (Dielectric constant) ของสารละลายทมนาเปนตวทาละลายทาใหความสามารถในการเปนตวทาละลายของนาลดลง เมอเพมความเขมขนของตวทาละลายอนทรยมากขนเรอยๆ จนถงจดทแรงกระทาระหวางโมเลกลของโปรตน (พลงงานไฟฟาสถตบนโมเลกลโปรตน) สงกวาแรงกระทาระหวางโปรตนกบนา ทาใหเกดการเขามารวมตวกนของโมเลกลโปรตนและตกตะกอนลงมาได (ชรนทร เตชะพนธ. 2542: Online) 3.3 งานวจยทเกยวของในการสกดพรกาบาลนโดยใชวธการตกตะกอนโปรตน จากการศกษารายงานวจยทเคยใชวธการตกตะกอนโปรตนในการสกดพรกาบาลนมดงน เมนเดล; และคนอนๆ (Mandal; et al. 2008: 237-243) ทาการพฒนาวธวเคราะหและตรวจสอบวธทพฒนาขนสาหรบใชในการวเคราะหพรกาบาลนในตวอยางพลาสมาของมนษยโดยใชกาบาเพนตนเปนสารมาตรฐานภายใน เตรยมตวอยางดวยวธการใชสารละลาย 20% TCA ในการกาจดโปรตน แลวนาสารละลายใสทไดไปวเคราะหดวยเทคนค LC-MS-MS ชวงความเขมขนทใชในการวเคราะห คอ 0.1-15.0 ไมโครกรมตอมลลลตร มคา Correlation coefficient เทากบ 0.9998 คา %Recovery ทไดจากการสกดพรกาบาลนในตวอยางพลาสมาอยในชวง 80.45-89.12% (%Coefficient of variation หรอ %CV = 6.11, 4.26, 3.08) และกาบาเพนตนมคาเทากบ 87.56% (%CV = 4.92) เวยดยา; และคนอนๆ (Vaidya; et al. 2007: 925-928) ไดใชเทคนค LC-MS-MS ในการศกษาวธการวเคราะหพรกาบาลนในพลาสมาของมนษย เตรยมตวอยางโดยใชวธการตกตะกอนโปรตนดวย ACN แลวนาสารละลายใสทไดวเคราะหดวยเทคนค LC-MS-MS ผลการทดลองพบวาชวงความเปนเสนตรงทวเคราะหไดอยในชวง 10-10,000 นาโนกรมตอมลลลตร คา

16

%Recovery เฉลยของการสกดเทากบ 69.99 % (%CV = 5.05) วธการทพฒนาขนนามาใชในการ ศกษาชวสมมลของยาแคปซลพรกาบาลนขนาด 150 มลลกรม แทง; และคนอนๆ (Tang; et al. 1999: 125-129) ไดศกษาวธการวเคราะหปรมาณกาบาเพนตนในตวอยางซรมของมนษยโดยใชเทคนค HPLC รวมกบตวตรวจวดฟลออเรสเซนตและ เตรยมตวอยางโดยใชวธการตกตะกอนโปรตนดวย MeOH แลวนาสารละลายใสทไดมาทาใหเกดอนพนธกบ OPA ผลการทดลองพบวาชวงความเขมขนทสามารถใชในการวเคราะหได คอ 0.1-10.0 มลลกรมตอมลลลตร ผลการวเคราะหซา (Repeatability) ใหคา %CV นอยกวา 6% คา %Recovery ทไดจากการสกดอยในชวง 96.2-103.9%

เวอเมจ; และ อเดลโบรค (Vermeij; & Edelbroek. 2004: 297-303) ไดศกษาวธการวเคราะหโดยใชเทคนค HPLC ในการวเคราะหสารผสมพรกาบาลน กาบาเพนตนและวกาบาทรน ในตวอยางซรมของมนษยใชวธการสกดพรกาบาลนออกจากซรมดวยสารละลาย 20%TCA ในการตกตะกอนโปรตนและนาสวนใสมาทาใหเกดอนพนธกอนทจะนาสารนนไปแยกในคอลมน (Pre-Column derivatization) ตรวจวดดวยตวตรวจวดฟลออเรสเซนตและจากผลการทดลองพบวา โครมาโทแกรมไมมสารรบกวนเกดขนในตาแหนงของยาแตละชนดและตรงตาแหนงของสารมาตรฐานภายในและได %Recovery ใกลเคยง 100% เดอจาสวาน; กรพาดายยา; และ ราจา (Thejaswini; Gurupadayya;& Raja. 2012: 3112-3115) ไดศกษาวธวเคราะหพรกาบาลนในตวอยางพลาสมา ดวยเทคนคแกสโครมาโทกราฟและเตรยมตวอยางดวยการเตม 10% Orthophosphoric acid ในพลาสมา แลวศกษาเปรยบเทยบวธการตกตะกอนโปรตนดวยตวทาละลาย 5 ชนด ไดแก ACN, MeOH, Ethylchloroformate, Pyridine และ Chloroform แลวทาใหเกดอนพนธกบ Ethylchloroformate เพอใหเกดเปนสารระเหย ไดแลวทาการตรวจวดดวย Flame ionization detector (FID) ผลการทดลองพบวาการใช ACN ในการตกตะกอนโปรตนไมมสารรบกวนการวเคราะหจากตวอยางพลาสมาเกดขนและใหคา %Recovery อยในชวง 96.75-102.4% (%CV อยในชวง 1.65-3.78%) จากการทบทวนวรรณกรรมเพอศกษาการสกดพรกาบาลนออกจากพลาสมาดวยวธการตกตะกอนโปรตน พบวาปจจบนสารทนยมนามาใชในการตกตะกอนโปรตน ไดแก ACN, MeOH และ TCA

4. การใชสาร 4-Chloro-7-Nitrobenzofurazan ในการท าใหเกดอนพนธกบ พรกาบาลนและกาบาเพนตน 4.1 การเตรยมเปนสารอนพนธ (Derivatization) สารบางชนดไมสามารถตอบสนองตอตวตรวจวดของ HPLC หรอมการตอบสนองตาจนไมสามารถตรวจวดไดจงจาเปนตองเตรยมเปนสารประกอบตวใหมเพอทาใหมหมฟงกชนทตอบ สนองตอเครองตรวจวดเรยกวาสารอนพนธ (Derivatizative) ในการเตรยมสารอนพนธจะใชสารท

17

ตองการวเคราะหทาปฏกรยาเคมกบสารทมหมฟงกชนทมสภาพไวตอการตรวจวด เรยกวา Derivatizing agent เกดเปนสารประกอบใหมซงมสมบตตางไปจากสารเดม เชน การดดกลนแสง การวาวแสง ในการเตรยมสารอนพนธสามารถทาไดกอนนาสารเขาสคอลมนเพอใหเกดการแยก เรยกวา Pre-Column derivatization หรอทาหลงจากสารออกจากคอลมนแยกสาร เรยกวา Post-Column derivatization (แมน อมรสทธ; และคนอนๆ. 2555: 435) 4.2 4-คลอโร-7-ไนโตรเบนโซฟราแซน (4-Chloro-7-Nitrobenzofurazan) คณสมบตของ 4-คลอโร-7-ไนโตรเบนโซฟราแซน

4-คลอโร-7-ไนโตรเบนโซฟราแซน (NBD-Cl) เปนรเอเจนตท ใชกนอยางแพรหลายกบยาทในโครงสรางมหมเอมน (Amine group) เพอเพมความไวในการตรวจวดใหดขนหรอทาใหเกดโครโมฟอรและฟลออโรฟอรทสามารถถกตรวจวดดวยตวตรวจวดยว-วสเบลและ ฟลออเรสเซนตได (Elbashir; Suliman; & Aboul-Enein. 2011: 222-241) NBD-Cl มชอตาม IUPAC Name คอ 4-Chloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole มชอพอง (Synonyms) คอ 7-Chloro-4-nitrobenzofurazan หรอ 7-Chloro-4-nitro-2,1,3-benzoxadiazole เปนตน มโครงสรางทางเคมดงภาพประกอบ 5 มสตรโมเลกล C6H2ClN3O3 นาหนกโมเลกล 199.551 มลกษณะเปนของแขง ผงละเอยดสเหลองออน สามารถละลายไดใน Dimethyl sulfoxide, Dimethyl formamide, MeOH, ACN และ Chloroform (FluoProbes®. 2012: Online)

ภาพประกอบ 5 แสดงโครงสรางทางเคมของ NBD-Cl

ทมา: FluoProbes®. (2012: Online).

4.3 กาบาเพนตน คณสมบตทางเคมกายภาพของกาบาเพนตน

กาบาเพนตน มชอทางเคม (Chemical name) คอ 1-(Aminomethyl) cyclohexaneacetic acid มสตรโมเลกล (Molecular formula) C9H17NO2 โดยมนาหนกโมเลกล (Molecular weight) เทากบ 171.24 มคา pKa1 เทากบ 3.7 และ pKa2 เทากบ 10.7 สมบตทางเคมกายภาพ (Physicochemical properties) เปนผลกของแขง สขาว เปนสารประกอบทมขว สามารถ

18

ละลายไดดในนา โครงสรางทางเคมประกอบดวยหมฟงกชนทแสดงความเปนกรด คอ Carboxylic (-COOH) และหมฟงกชนทแสดงความเปนเบส คอหม Primary amine (-NH2) ดงแสดงในภาพประกอบ 6

ภาพประกอบ 6 แสดงโครงสรางทางเคมของกาบาเพนตน

ทมา: Pubchem Compound. (2005: Online) 4.4 งานวจยทเกยวของในการวเคราะหพรกาบาลนและกาบาเพนตนโดยใช NBD-Cl โครงสรางทางเคมของพรกาบาลนและกาบาเพนตนมหม Primary amine อยในโครง สรางจงสามารถทาปฏกรยากบสาร NBD-Cl เพอใหไดอนพนธทสามารถเรองแสงฟลออเรสซนตได จากการศกษาขอมลยอนหลงพบวาเคยมการพฒนาวธวเคราะหพรกาบาลนโดยใช NBD-Cl เปน Derivatizing agent เพยง 1 รายงานโดย โอนอล; และ แซกกรล (Onal ;& Sagirli. 2009: 68-71) ไดทาการพฒนาวธการวเคราะหปรมาณพรกาบาลนในตวอยางวตถดบยาและยาเมดแคปซลโดยใช NBD-Cl เปน Derivatizing agent เพอทาใหพรกาบาลนเปลยนแปลงโครงสรางเปนFluorogenic และ Chromogenic สงผลใหสามารถตรวจวดไดดวยเทคนค Spectrofluorometry และ Spectrophotometry โดยจากผลการศกษาสภาวะทเหมาะสมในการเกดอนพนธพบวาอนพนธทเกด ขนมความคงตวนาน 12 ชวโมง และวธดงกลาวสามารถใชในการวเคราะหพรกาบาลนในชวงความเปนเสนตรงของกราฟมาตรฐานเทากบ 0.5-7.0 ไมโครกรมตอมลลลตรเมอวเคราะหดวยใชเทคนค Spectrophotometry และ 40-400 นาโนกรมตอมลลลตรเมอวเคราะหโดยใช Spectrofluorimetry เมอนาตวอยางมาวเคราะหดวยเทคนค Spectrophotometry และ Spectrofluorometry ทพฒนาขนพบวาไดคา %Recovery เทากบ 99.93% และ 99.96% ตามลาดบ จากการศกษางานวจยนพบวาอนพนธทเกดขนมความคงตวด และสามารถนามาวเคราะหไดทงเทคนค Spectrophotometry และSpectrofluorometry โดยเทคนค Spectrofluorometry ใหความไวในการวเคราะหสงกวา แตอยางไรกตามเทคนคนกยงไมสามารนามาใชวเคราะหสารผสมได จงสนใจนาเฉพาะวธการเตรยมตวอยางไปประยกตใชกบเทคนค HPLC เพอใหสามารถวเคราะหพรกาบาลนในตวอยางพลาสมาได

19

NBD-Cl ถกนามาใชเปน Derivatizing agent ในการพฒนาวธการวเคราะหปรมาณ กาบาเพนตนโดยจากรายงานวจยของ บาฮราม; และมฮมมาด (Bahrami ;& Mohammadi. 2006: 24-28) ไดศกษาวธการวเคราะหกาบาเพนตนในตวอยางซรมของมนษยโดยใชเทคนค HPLC เพมความไวดวยการทาใหเกดอนพนธกบ NBD-Cl ในสภาวะทเปนเบส (พเอช 11) อณหภม 60 องศาเซลเซยสเปนเวลา 10 นาท อนพนธมความคงตวอยางนอย 24 ชวโมง และทาการแยกดวยคอลมน C18 ตรวจวดดวยตวตรวจวดฟลออเรสเซนต ใชความยาวคลนในการเกด Excitation ท 470 นาโนเมตรและความยาวคลนในการเกด Emission ท 537 นาโนเมตรตามลาดบ ขดจากดการวเคราะห 0.002 ไมโครกรมตอมลลลตร สามารถวเคราะหความเปนเสนตรงไดในชวง 0.002-15 ไมโครกรมตอมลลลตร จากการศกษางานวจยนพบวากาบาเพนตนสามารถเกดปฏกรยากบ NBD-Cl เปนสารอนพนธท มโครงสรางใกลเคยงกบอนพนธระหวางพรกาบาลนกบ NBD-Cl โดยมกลไกการเกดปฏกรยาทเหมอนกน ทาใหสามารถนากาบาเพนตนมาใชเปนสารมาตรฐานภายในของระบบการวเคราะหได 5. การตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะห (Method Validation) 5.1 ความหมายของ Method validation Method validation หมายถง เปนกระบวนการตรวจสอบความถกตองและความเหมาะสมของวธวเคราะหทพฒนาขนกอนนาวธวเคราะหนนมาใชในการวเคราะหตวอยางจรงในหองปฏบตการ เพอใหเกดความมนใจวาวธวเคราะหมความถกตอง แมนยา คงทน และชวยใหทราบถงคณสมบต เงอนไข หรอขอจากดของวธวเคราะหนนๆ (เอกวรรณ อยสกล. 2556: 17)

5.2 พารามเตอรทใชในการทดสอบความถกตองของวธวเคราะห ตามมาตรฐานองคการอาหารและยาของสหรฐอเมรกา (Food and Drug Administration. 2013: Online) และองคการยาแหงสหภาพยโรป (European Medicines Agency. 2011: Online) มขอกาหนดวากอนดาเนนการวเคราะหตวอยางจรงใหทาการตรวจสอบความถกตองหรอความนาเชอถอของวธวเคราะหทพฒนาขน โดยตรวจสอบตามคาพารามเตอรตางๆ ดงน 1. ความจาเพาะเจาะจงของวธวเคราะห (Specificity หรอ Selectivity) หมายถง การทดสอบความสามารถของวธวเคราะหในการวเคราะหแยกตวอยางทตองการศกษาออกจากตวอยางชวภาพ ซงมสวนประกอบทอาจไปรบกวนผลการวเคราะหได เกณฑการยอมรบ: ผลการวเคราะหตองตรวจไมพบสงรบกวนทตาแหนงเดยว กบสารทตองการตรวจวด

2. ขดจากดตาสดของการวเคราะหปรมาณ (Lower limit of quantification, LLOQ) หมายถง การทดสอบความเขมขนตาสดทสามารถนามาใชในการวเคราะห

ปรมาณได เกณฑการยอมรบ: ตองเปนความเขมขนทใหคา Signal to noise ≥ 5

20

วธการคานวณ

S/N ratio = Peak Height of pregabalin Noise in RMS

ภาพประกอบ 7 แสดงหลกการหาคา Signal to noise

ทมา: Shimadzu. (2014: Online).

3. ความเปนเสนตรง (Linearity) หมายถง กราฟความสมพนธระหวางความเขมขนของสารกบอตราสวนระหวาง

พนทใตพคของสารทตองการตรวจวดกบสารมาตรฐานภายใน (Area ratio) โดยความเขมขนทใชเปนจดของกราฟมาตรฐานตองไมตากวา 6 จดความเขมขนและจดความเขมขนตาสดตองเปนความเขมขนทระดบ LLOQ

เกณฑการยอมรบ: แสดงคาเปน Coefficient determination (R2) ซงตองมคามากกวา 0.990 และความเขมขนแตละจดของกราฟมาตรฐานตองใหคา %Recovery อยในชวง 85-115% ยกเวนทความเขมขน LLOQ ตองอยในชวง 80-120% 4. ความถกตองของวธวเคราะห (Accuracy)

หมายถง ความถกตองของวธวเคราะหทวดคาไดใกลเคยงกบคาทแทจรงมากทสด

เกณฑการยอมรบ: แสดงคาเปน %Recovery ตองอยในชวง 85-115% ยกเวนทความเขมขน LLOQ ตองอยในชวง 80-120% 5. ความเทยงตรงของวธวเคราะห (Precision)

Chromatogram

S = Peak Height

Time

N = Noise

21

หมายถง ความแมนยาของการวเคราะหซาหลายๆ ครง โดยการทดสอบความเทยงตรงของวธวเคราะหสารภายในวนเดยวกน (Intra day) และระหวางวน (Inter day) เกณฑการยอมรบแสดงคาเปน %CV ตองไมเกน 15% ยกเวนทความเขมขน LLOQ ตองไมเกน 20% 6. คาเปอรเซนตการกลบคนของวธการสกด (%Recovery) หมายถง การทดสอบประสทธภาพของวธการสกดวาวธการสกดทใชสามารถสกดตวอยางทตองการศกษาออกมาจากตวอยางชวภาพไดอยางสมาเสมอ แมนยาและสามารถทาซาได

เกณฑการยอมรบ: แสดงคาเปน %Recovery ของการสกด ซง %Recovery ไมจาเปนตองเทากบ 100% แตควรมความคงท แมนยา 7. การทดสอบความคงตว (Stability) 7.1 การทดสอบความคงตวของอนพนธ (Post-preparative stability) ทดสอบความคงตวของอนพนธเมอตงทงไวในเครองฉดสารอตโนมตตามอณหภมทกาหนดเพอรอการวเคราะห เกณฑการยอมรบ คาความเขมขนทตรวจวดไดตองเปลยนแปลงไมเกน 15% 7.2 การทดสอบความคงตวตอการแชแขง-ละลาย (Freeze & Thaw stability) ทดสอบความคงตวของพรกาบาลนในพลาสมาท เตรยมแลวนาตวอยางดงกลาวจดเกบทอณหภมทใชในการเกบตวอยางทดสอบ ใหเกดการแขงตวเปนเวลา 24 ชวโมง และนาออกมาตงทงไวทอณหภมหองใหเกดการละลาย (เทากบ 1 รอบ) เปนจานวน 3 รอบ เกณฑการยอมรบคาความเขมขนทตรวจวดไดตองเปลยนแปลงไมเกน 15% เมอเทยบกบคาเรมตน 7.3 ความคงตวในระยะสน (Short term stability) ทดสอบความคงตวของพรกาบาลนในพลาสมาทเตรยมขน แลวนาตวอยางดงกลาวจดเกบทอณหภมทใชในการเกบตวอยางทดสอบใหเกดการแขงตวเปนเวลา 24 ชวโมง แลวนามาละลายโดยตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลาท 0, 3 และ 6 ชวโมง เกณฑการยอมรบคาความเขมขนทตรวจวดไดตองเปลยนแปลงไมเกน 15% เมอเทยบกบคาเรมตน 7.4 การทดสอบความคงตวของสารละลายมาตรฐาน (Stock-solution stability) ทดสอบความคงตวของสารละลายมาตรฐานตามสภาวะท จดเกบและวเคราะหเปรยบเทยบพนทใตพคของ Stock solution ทเกบไวตามระยะเวลาทกาหนดกบพนทใตพคของ Stock solution ทเตรยมขนใหม เกณฑการยอมรบ คาพนทใตพคของ Stock solution ทเกบไวตองเปลยนแปลงไมเกน 5%

บทท 3 วธด าเนนการวจย

1. อปกรณ เครองมอและสารเคม (Materials, Instrument and Reagents)

1.1 สารเคม

1. สารมาตรฐาน Pregabalin HETERO DRUGS LIMITED,

India Gabapentin HIKAL, India

2. สารเคมอนๆ ทใช 4-Chloro-7-nitrobenzofurazan (analytical grade) Sigma-Aldrich, Germany Boric acid (analytical grade) BDH Chemicals Ltd., Poole,

England Potassium chloride (analytical grade) Merck, Germany Sodium hydroxide (analytical grade) Merck, Germany Hydrochloric acid 37% (analytical grade) Merck, Germany di-Potassium hydrogen phosphate (analytical grade) Merck, Germany Potassium di-hydrogen phosphate (analytical grade) Merck, Germany di-Sodium hydrogen phosphate (analytical grade) Merck, Germany Sodium di-hydrogen phosphate (analytical grade) Merck, Germany o-Phosphoric acid 85%(analytical grade) Merck, Germany Acetonitrile (HPLC grade) Merck, Germany Methanol (HPLC grade) Merck, Germany Trichloroacetic acid (analytical grade) Merck, Germany พลาสมา สภากาชาดไทย, ประเทศไทย

23

1.2 อปกรณ และเครองมอ

เครอง HPLC ยหอ Shimazu รน 10A บรษท Shimadzu Corporation, KYOTO, Japan ซงประกอบดวย - Column Oven : CTO-10AVP

- Detector : RF-10AXL (Xenon lame) - Auto sampler : SIL-20ACHT - Pump : LC-10ADVP - System controller : SCL-10AVP - โปรแกรมทใชเปนค าสงในการวเคราะหและประมวลผล คอ LC solution

software เครองหมนเหวยง Hettich Zentrifugen/Andreas HeHich GmbH&Co.Hg, Germany เครองชงทศนยม 4 ต าแหนง Sartorious, Germany เครองชงทศนยม 5 ต าแหนง Sartorious, Germany เครองวดความเปนกรด-ดาง SCHOTT/Schott-GerategbbH, Germany ตอบ Memmert/Memmert GmbH+Co.Kg, Schwabach, Germany ตเยน 0-4 องศาเซลเซยส Sunyo, Thailand ตแชแขง – 30 องศาเซลเซยส Sunyo Electric Biomedical Co.,Ltd.,

Japan เครองท าน าบรสทธ ELgA/Vivendi Water Systems ltf., Benelux, USA Autopipette Accumax PRO/TUV NORD,TUV India

Privvate Ltd., India Vortex Mixer Uzusio/ScientificIndustries, INC, USA HPLC column (C18, 250 ×4.6 mm, 5 µm) Phenomenex, USA Guard column (C18 , 4.0×10 mm, 5 µm) Inertsil, USA Filter cellulose acetate (ขนาด 0.2 µm) Whatman Limited Maidstone, England Nylon membrane filter (ขนาด 0.2 µm) Whatman Limited Maidstone, England

24

2. การเตรยมสารละลายเพอใชในงานวจย 2.1 การเตรยมสารละลายมาตรฐานของพรกาบาลน เตรยม Stock solution ของพรกาบาลนทความเขมขน 1 มลลกรมตอมลลลตร ปรมาตร 10.0 มลลลตร โดยชงพรกาบาลน น าหนก 0.01003 กรม ละลายดวยน าและปรบปรมาตรใหครบ 10.0 มลลตร ในขวดปรบปรมาตรจากนนเตรยมสารมาตรฐานของพรกาบาลนทความเขมขน 200, 120, 60, 30, 15, 4, 1 และ 0.4 ไมโครกรมตอมลลลตร เพอน าไปใชในการสรางกราฟมาตรฐานและเตรยมสารมาตรฐานของพรกาบาลนทความเขมขน 150, 100 และ1.2 ไมโครกรมตอมลลลตร ส าหรบท าชดตวอยางควบคมคณภาพ โดยท า Serial dilution ดงน

1. ปเปต Stock solution ของพรกาบาลนทความเขมขน 1 มลลกรมตอมลลลตร มา 2 มลลลตร ใสในขวดปรบปรมาตร แลวปรบปรมาตรดวยน าจนครบ 10.0 มลลลตร จะไดความเขมขน 200 ไมโครกรมตอมลลลตร

2. ปเปต Stock solution ของพรกาบาลนทความเขมขน 1 มลลกรมตอมลลลตร มา 1.2 มลลลตร ใสในขวดปรบปรมาตร แลวปรบปรมาตรดวยน าจนครบ 10.0 มลลลตร จะไดความเขมขน 120 ไมโครกรมตอมลลลตร

3. ปเปตสารละลายพรกาบาลนความเขมขน 120 ไมโครกรมตอมลลลตร มา 5 มลลลตร ใสในขวดปรบปรมาตร แลวปรบปรมาตรดวยน าจนครบ 10.0 มลลลตร จะไดความเขมขน 60 ไมโครกรมตอมลลลตร



6. ปเปตสารละลายพรกาบาลนความเขมขน 200 ไมโครกรมตอมลลลตร มา 200 ไมโครลตร ใสในขวดปรบปรมาตร แลวปรบปรมาตรดวยน าจนครบ 10.0 มลลลตร จะไดความเขมขน 4 ไมโครกรมตอมลลลตร

7. ปเปตสารละลายพรกาบาลนความเขมขน 4 ไมโครกรมตอมลลลตร มา 2.5 มลลลตร ใสในขวดปรบปรมาตร แลวปรบปรมาตรดวยน าจนครบ 10.0 มลลลตร จะไดความเขมขน 1 ไมโครกรมตอมลลลตร

8. ปเปตสารละลายพรกาบาลนความเขมขน 4 ไมโครกรมตอมลลลตร มา 1 มลลลตร ใสในขวดปรบปรมาตร แลวปรบปรมาตรดวยน าจนครบ 10.0 มลลลตร จะไดความเขมขน 0.4 ไมโครกรมตอมลลลตร

25

9. ปเปต Stock solution ของพรกาบาลนทความเขมขน 1 มลลกรมตอมลลลตร มา 1.5 มลลลตร ใสในขวดปรบปรมาตร แลวปรบปรมาตรดวยน าจนครบ 10.0 มลลลตร จะไดความเขมขน 150 ไมโครกรมตอมลลลตร


11. ปเปตสารละลายพรกาบาลนความเขมขน 120 ไมโครกรมตอมลลลตร มา 100 ไมโครลตร ใสในขวดปรบปรมาตร แลวปรบปรมาตรดวยน าจนครบ 10.0 มลลลตร จะไดความเขมขน 1.2 ไมโครกรมตอมลลลตร 2.2 การเตรยมตวอยางพรกาบาลนในพลาสมา เตรยม Blank plasma 200 ไมโครลตรและเตมสารละลายมาตรฐานของพรกาบาลน ความเขมขนตางๆ ทเตรยมไดจากขอ 2.1 ความเขมขนละ 10 ไมโครลตร ลงใน Blank plasma หากตองการเตรยมตวอยางพรกาบาลนในพลาสมาทปรมาตรมากกวาทระบไวใหค านวนโดยใชวธเทยบบญญตไตรยางศกบปรมาตรเรมตน 2.3 การเตรยมสารละลายมาตรฐานของกาบาเพนตนความเขมขน 75 ไมโครกรมตอมลลลตร ปรมาตร 50.0 มลลลตร เพอใชเปนสารมาตรฐานภายใน

เตรยม Stock solution ของกาบาเพนตน โดยชงสารปรมาณ 0.00375 กรม ละลายดวยน าและปรบปรมาตรใหครบ 50.0 มลลลตร ในขวดปรบปรมาตร 2.4 การเตรยมสารละลาย NBD-Cl ความเขมขน 30 มลลกรมตอมลลลตร

ชง NBD-Cl ปรมาณ 0.75 กรม ใสใน ขวดปรบปรมาตร ละลายดวย ACN และปรบปรมาตรใหครบ 25.0 มลลลตร 2.5 การเตรยมสารละลาย borate buffer ความเขมขน 0.1 โมลาร

ชง Boric acid น าหนก 0.62 กรม และ Potassium chloride (KCl) น าหนก 0.75 กรม ใสในขวดปรบปรมาตรอนเดยวกน ละลายดวยน าและปรบปรมาตรจนครบ 100.0 มลลลตร ปรบพเอชดวย o-Phosphoric acid หรอ NaOH ใหไดพเอชตามตองการ 2.6 การเตรยมสารละลายบฟเฟอรชนดตางๆ ไดแก KH2PO4, K2HPO4, NaH2PO4 และ Na2HPO4 ความเขมขน 20 มลลโมลาร

1. ชง KH2PO4, K2HPO4, NaH2PO4 และ Na2HPO4 น าหนก 2.7216, 3.4836, 2.3996 และ 2.8392 กรม ตามล าดบ 2. ละลายสารแตละชนดดวยน าและปรบปรมาตรใหครบ 1.0 ลตร ในขวดปรบปรมาตร

3. ปรบพเอชของสารละลายดวย o-Phosphoric acid หรอ Sodium hydroxide ใหไดพเอชตามตองการ

26

4. กรองสารละลายผานกระดาษกรอง (Membrane filter) ทมขนาดของ Pore size ไมเกน 0.45 ไมโครเมตรและก าจดฟองอากาศดวย Sonicator เปนเวลาอยางนอย 10 นาท 5. ในกรณทตองการเตรยมสารละลายทความเขมขนหรอปรมาตรอน ใหค านวนโดยใชวธเทยบบญญตไตรยางศกบปรมาณสารเดมทระบไว 2.7 การเตรยมสารละลายกรดไฮโดรคลอรก (HCl) ความเขมขน 2 โมลาร ตวงสารละลายกรดไฮโดรคลอรกเขมขน ปรมาตร 16.67 มลลลตร เจอจางดวยน าและปรบใหมปรมาตร 100.00 มลลลตร ในขวดปรบปรมาตร 2.8 การเตรยมสารละลาย TCA ความเขมขน 20% w/v

ชง TCA น าหนก 1 กรม ใสในขวดปรบปรมาตร ละลายดวยน าและปรบปรมาตรใหครบ 5.00 มลลลตร 3. วธการทดลอง (Methods)

การพฒนาวธวเคราะหหาปรมาณพรกาบาลนในตวอยางพลาสมา แบงออกเปน 4 สวน ไดแก

- ศกษาสภาวะทเหมาะสมของเฟสเคลอนทในการแยกสาร - ศกษาการสกดพรกาบาลนในตวอยางพลาสมาดวยวธการตกตะกอนโปรตน - ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการท าอนพนธกบ NBD-Cl ตลอดจนการหยดปฏกรยา - ตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะหทพฒนาขนโดยประเมนผลตามเกณฑการ

ยอมรบของ US FDA guideline 2013 และ EMEA guideline 2011 3.1 ศกษาสภาวะทเหมาะสมของเฟสเคลอนทในการแยกสาร เกณฑมาตรฐานของคาพารามเตอรตางๆท เหมาะสมในการแยกสาร ไดแก Resolution >2, Tailing factor ≤ 2 และ Theoretical plates (N) >2000

3.1.1 วธการเตรยมตวอยาง วธการเตรยมตวอยางดดแปลงมาจากวธของ โอนอล; และ แซกกรล (Onal A.; & Sagirli O. 2009: 68-71) และวธการตกตะกอนโปรตนดดแปลงมาจากวธของ เวยดยา; และคนอนๆ (Vaidya; et al. 2007: 925-928) โดยมขนตอน ดงน

1. ปเปตพลาสมา 200 ไมโครลตร ใสในหลอดทดลอง จากนนเตมสารละลาย พรกาบาลนความเขมขน 200 ไมโครกรมตอมลลลตร ปรมาตร 10 ไมโครลตร และเตมสารละลาย กาบาเพนตนความเขมขน 75 ไมโครกรมตอมลลลตร ปรมาตร 10 ไมโครลตร ลงในหลอดทดลอง (หรอใช KH2PO4 ความเขมขน 50 มลลโมลาร แทนพลาสมาในกรณทไมสกด)

2. เตม ACN ปรมาตร 500 ไมโครลตร เขยาใหเขากน 20 วนาทและปนเหวยงท 10000 รอบตอนาทเปนเวลา 5 นาท

27

3. น าสวนของสารละลายใสทไดมาเตม Borate buffer ความเขมขน 0.1 โมลาร พเอช 9.5 ปรมาตร 20 ไมโครลตร และเตม NBD-Cl ความเขมขน 30 มลลกรมตอมลลลตร ปรมาตร 20 ไมโครลตร ผสมใหเขากนแลวปดปากหลอดดวยฟรอยดน าไปใหความรอนทอณหภม 80 องศาเซลเซยสเปนเวลา 10 นาท

4. น าไปแชในอางน าแขงเปนเวลา 2 นาท แลวเตม HCl ความเขมขน 2 โมลาร ปรมาตร 5 ไมโครลตร น าสารทเตรยมไดไปตรวจวดระดบพรกาบาลนดวยเครอง HPLC สภาวะของเครอง HPLC ทใชในการวเคราะห - อตราการไหล : 1.2 มลลลตรตอนาท

- ตวตรวจวดสญญาณ : Fluorescence detector (460-558 นาโนเมตร) - คอลมน : Phenomenex C18 (250 มลลลตร × 4.6 มลลลตร) - อณหภม Auto sampler : 20 องศาเซลเซยส - อณหภม Oven : 40 องศาเซลเซยส - ปรมาตรทใชในการฉด : 50 ไมโครลตร 3.1.2 การศกษาชนดของเฟสเคลอนททเหมาะสม

1. น าตวอยางทเตรยมไดจากขอ 3.1.1 วเคราะหดวยเครอง HPLC โดยมการเปลยนแปลงชนดของเฟสเคลอนทซงชนดของเฟสเคลอนททน ามาใชในการศกษา คอตวท าละลายอนทรย กบ Phosphate buffer (โดยก าหนดใหความเขมขนของ Phosphate buffer เทากบ 20 มลลโมลาร, พเอช เทากบ 2.5 และอตราสวนของเฟสเคลอนท เทากบ 50 : 50 ปรมาตรตอปรมาตร เปนตวแปรคงท)

- ตวท าละลายอนทรย ไดแก ACN และ MeOH - Phosphate buffer ไดแก K2HPO4, KH2PO4, NaH2PO4 และ Na2HPO4

2. การเลอกชนดของเฟสเคลอนททเหมาะสมจะพจารณาจากคาพารามเตอร Retention time, Resolution, Tailing factor และ Theoretical plate ทไดเปรยบเทยบกนตามเกณฑมาตรฐานทก าหนดไว 3.1.3 การศกษาความเขมขนของ Phosphate buffer ทเหมาะสม

1. จากการศกษาในขอ 3.1.2 เมอไดชนดของเฟสเคลอนททเหมาะสมแลว

ก าหนดชนดของเฟสเคลอนทใหคงทและท าการทดลองเหมอนขอ 3.1.2 แตมการเปลยนแปลงความ

เขมขนของ Phosphate buffer เปน 5, 10, 20 และ 50 มลลโมลาร

2. การเลอกความเขมขนของ Phosphate buffer ทเหมาะสม จะพจารณาจาก

คาพารามเตอร Retention time, Resolution, Tailing factor และ Theoretical plate ทได

เปรยบเทยบกน ตามเกณฑมาตรฐานทก าหนดไว

3.1.4 การศกษาพเอชของเฟสเคลอนททเหมาะสม

28

1. จากการศกษาในขอ 3.1.3 เมอไดความเขมขนของ Phosphate buffer ทเหมาะสมแลวใหก าหนดคาทไดใหคงทและท าการทดลองเหมอนขอ 3.1.3 แตมการเปลยนแปลง พเอชของเฟสเคลอนทเปนพเอช 2.5, 3, 4, 5 และ 7

2. การเลอกพเอชของเฟสเคลอนททเหมาะสมจะพจารณาจากคาพารามเตอร Retention time, Resolution, Tailing factor และ Theoretical plate ทไดเปรยบเทยบกนตามเกณฑมาตรฐานทก าหนดไว 3.1.5 ศกษาอตราสวนของเฟสเคลอนททเหมาะสม 1. จากการศกษาในขอ3.1.4 เมอได pH ของเฟสเคลอนททเหมาะสมแลวก าหนดคาทไดใหคงท และท าการทดลองเหมอนขอ 3.1.4 แตมการเปลยนแปลงอตราสวนของเฟสเคลอนทระหวางตวท าละลายอนทรย : Phosphate buffer ใหเปน 40 : 60, 45 : 55, 50 : 50, 55 : 45 และ 60 : 40 2. การเลอกอตราสวนของเฟสเคลอนททเหมาะสมพจารณาจากคาพารามเตอร Peak area, Retention time, Resolution, Tailing factor และ Theoretical plate ทไดเปรยบเทยบกนตามเกณฑมาตรฐานทก าหนดไว 3.2 ศกษาการสกดพรกาบาลนออกจากตวอยางพลาสมาดวยวธการตกตะกอนโปรตน เมอไดสภาวะทเหมาะสมของเฟสเคลอนทในการแยกสารตามการทดลองในขอ 3.1 แลวใหใชสภาวะดงกลาวส าหรบการวเคราะหในหวขอตอไปน

3.2.1 ศกษาชนดของสารทใชในการตกตะกอนโปรตน 1. เตรยมตวอยางดวยวธการเชนเดยวกบขอ 3.1.1 โดยมการเปลยนชนดของสารทใชในการตกตะกอน ไดแก ACN, MeOH และ TCA ความเขมขน 20% 2. ชนดของสารทเหมาะสมจะพจารณาจากคา %Recovery ของการสกด พรกาบาลนและ %RSD

วธการค านวณหาคา %Recovery และ %RSD จากสตร %Recovery ของการสกด = พนทใตพคของยาในพลาสมา x 100 พนทใตพคของยาในสารละลาย %RSD = (SD / Mean) x 100 3.2.2 ปรมาณสารทใชในการตกตะกอนโปรตน

1. จากการศกษาใน 3.2.1 เมอไดชนดของสารทใชในการตกตะกอนทเหมาะสม

แลวก าหนดใหคงท และท าการทดลองเหมอนขอ 3.2.1 แตมการเปลยนแปลงปรมาณสารทใชในการ

29

สกดโดยอตราสวนทไดท าการศกษา คอ ปรมาณพลาสมา : ปรมาณสารทใชในการสกด เทากบ

1 : 2, 1 : 2.5, 1 : 3 และ 1 : 3.5

2. ปรมาณสารทใชในการตกตะกอนทเหมาะสมในการสกดจะพจารณาจากคา

%Recovery ของการสกดพรกาบาลนและ %RSD

3.3 ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการท าอนพนธกบ NBD-Cl และการหยดปฏกรยา เมอไดสภาวะทเหมาะสมในการวเคราะหพรกาบาลนโดยใชเทคนค HPLC จากขอ

3.1 และการสกดพรกาบาลนออกจากตวอยางพลาสมาดวยวธการตกตะกอนโปรตนจากขอ 3.2 ใหน าผลทไดมาใชในการวเคราะหหวขอตอไปน

3.3.1 ศกษาความเขมขนของ HCl ทใชในการหยดปฏกรยา 1. ศกษาความเขมขนของ HCl ทสามารถหยดปฏกรยาไดโดยเตม HCl ลงในตวอยางใหมความเขมขน 0, 0.01, 0.02 และ 0.03 โมลาร แลวน าไปวเคราะหทนทเปรยบเทยบกบตวอยางหลงหยดปฏกรยาดวยกรดแลวตงทงไว 1 ชวโมงสงเกตการเปลยนแปลงพนทใตพค

2. เกณฑการพจารณาโดยเลอกความเขมขนของ HCl ทใหรอยละการเปลยน แปลงพนทใตพคของอนพนธนอยทสดเมอทงสารอนพนธหลงหยดปฏกรยาแลว 1 ชวโมง

วธการค านวณหาคา %Change จากสตร %Change = 100 - พนทใตพคหลงหยดปฏกรยาแลว 1 ชวโมง x 100

พนทใตพคทวเคราะหหลงหยดปฏกรยาทนท

3.3.2 ศกษาปรมาณสาร NBD-Cl ทเหมาะสม 1. จากการศกษาในขอ 3.3.1 เมอหาความเขมขนของ HCl ทสามารถหยดปฏกรยาไดแลว ก าหนดคาทไดใหคงทและท าการทดลองเหมอนขอ3.3.1 แตมการเปลยนแปลงปรมาณสาร NBD-Cl เปน 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 และ 70 ไมโครลตร 2. ปรมาณ NBD-Cl ทเหมาะสม พจารณาจากพนทใตพคของอนพนธระหวาง พรกาบาลนกบ NBD-Cl ทใหคามากทสด แตใชปรมาณสาร NBD-Cl นอยทสด 3.3.3 ศกษาพเอชทเหมาะสมในการท าปฏกรยา 1. จากการศกษาปรมาณสาร NBD-Cl ในหวขอ 3.3.2 เมอไดปรมาณสารทเหมาะสมในการเกดอนพนธแลวใหก าหนดปรมาณสาร NBD-Cl ใหคงทและท าการทดลองเหมอนขอ 3.3.2 แตเปลยนแปลงพเอชเปน 8, 9, 10, 11, 12 และ 13 2. พเอชทเหมาะสมพจารณาจากพนทใตพคของอนพนธระหวางพรกาบาลนกบ

NBD-Cl มคามากทสด

30

3.3.4 ศกษาเวลาทเหมาะสมในการเกดปฏกรยา Derivatization 1. จากการศกษาพเอชทเหมาะสมในการเกดปฏกรยาจากหวขอ 3.3.3 แลวให

ก าหนดพเอชใหคงท ท าการทดลองเหมอนขอ 3.3.3 แตเปลยนแปลงระยะเวลาในการใหอณหภมท

80 องศาเซลเซยสเปน 5, 10, 15, 20 และ 25 นาท

2. เวลาทเหมาะสมในการท าปฏกรยาพจารณาจากเวลาทท าใหพนทใตพคของ

อนพนธระหวางพรกาบาลนกบ NBD-Cl มคามากทสด โดยใชเวลานอยทสดและตวอยางไมเสย

สภาพเมอใหความรอนนานเกนไป

3.4 การตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะห (Method Validation)

น าวธทพฒนาขนมาตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะห ตามขอก าหนดและเกณฑการยอมรบดงน

1. Specificity / Selectivity สกดและวเคราะห Blank plasma จ านวน 6 ตวอยางทแตกตางกน โดยผลการวเคราะห Blank plasma ทง 6 ตวอยางตองไมพบพคทเวลาเดยวกบพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนจงสามารถน า Blank plasma นนมาใชในการวเคราะหได

2. Lower limit of quantification (LLOQ) สกดและวเคราะหพรกาบาลนใน Blank plasma ดวยวธทพฒนาขนทระดบความ

เขมขน LLOQ จ านวน 5 ตวอยาง แลวน าผลทไดมาค านวณคา Signal to noise โดยใชโปรแกรม LC solution ซงน าคา Peak height ของพรกาบาลนเทยบกบสญญาณรบกวน (Noise)

วธการค านวณหาคา Signal to noise จากสตร

S/N ratio = Peak Height of Pregabalin

Peak Height of Noise

3. Linearity ท าการสกดและวเคราะหพรกาบาลนใน Blank plasma ดวยวธทพฒนาขนท

ความเขมขน 8 ระดบ โดยความเขมขนต าสดของกราฟมาตรฐานเปนความเขมขนทระดบ LLOQ แลวหาความสมพนธเชงเสนตรง (Linearity) ระหวางสญญาณ กบความเขมขนของยาทระดบตางๆ และค านวณหาสมการเสนตรง (y = mx+c) และคา Coefficient of determination (r2) ดวยโปรแกรม LC solution จากนนท าการวเคราะหซ าระหวางวนเปนจ านวน 5 วน น าจดความเขมขนแตละจดของกราฟมาตรฐานมาค านวณคา %Recovery และ %CV

31

วธการค านวณหาคา %Recovery และ %CV จากสตร % Recovery = คาความเขมขนของพรกาบาลนทวดได x 100

คาความเขมขนของพรกาบาลนทแทจง

% CV = Standard Deviation x 100

Mean การก าหนดความเขมขน 3 ระดบ ไดแก ความเขมขนต า (Low quality control ;

LQC), ความเขมขนกลาง (Medium quality control ; MQC) และความเขมขนสง (High quality control ; HQC) ในชวงความเขมขนของกราฟมาตรฐานเพอใชเปนตวแทนในการตรวจสอบหวขอการทดสอบพารามเตอรตางๆ ตามขอก าหนด โดยก าหนดความเขมขนทจดต า (Low) คอ ความเขมขนทเทากบ 3 เทาของ LLOQ (60 นาโนกรมตอมลลลตร) ความเขมขนทจดกลาง (Medium) คอ ความเขมขนทเทากบ 50% ของกราฟมาตรฐาน (5000 นาโนกรมตอมลลลตร) และความเขมขนทจดสง (High) คอ ความเขมขนทเทากบ 75% ของกราฟมาตรฐาน (7500 นาโนกรมตอมลลลตร) 4. Accuracy

ท าการสกดและวเคราะหพรกาบาลนใน Blank plasma โดยวธทพฒนาขนทความเขมขน 4 ระดบ ไดแก LLOQ, ต า (LQC), กลาง (MQC) และ สง (HQC) ในชวงความเขมขนของกราฟมาตรฐานความเขมขนละ 5 ตวอยางภายในวนเดยวกนและระหวางวนเปนเวลา 3 วน น าผลทไดมาค านวณคา %Recovery 5. Precision ท าการสกดและวเคราะหพรกาบาลนใน Blank plasma โดยวธทพฒนาขนทความเขมขน 4 ระดบ ไดแก LLOQ, ต า (LQC), กลาง (MQC) และ สง (HQC) ในชวงความเขมขนของกราฟมาตรฐานความเขมขนละ 5 ตวอยางภายในวนเดยวกนและระหวางวนเปนเวลา 3 วน แลวค านวณคาสมประสทธความแปรปรวน (Coefficient of variation; CV) 6. Stability 6.1 Post-preparative stability

ท าการสกดและวเคราะหพรกาบาลนใน Blank plasma ดวยวธทพฒนาขนทความเขมขน 2 ระดบ คอ ต า (LQC) และสง (HQC) ความเขมขนละ 3 ตวอยาง เปรยบเทยบการวเคราะหความเขมขนของตวอยางในพลาสมาทผานกระบวนการสกดทเวลาเรมตนกบตวอยางทตงไวในเครองฉดสารอตโนมตทอณหภม 20 องศาเซลเซยสเปนระยะเวลา 48 ชวโมง น าผลทไดมาค านวณคารอยละการเปลยนแปลง (%Change)

32

วธการค านวณหาคา %Change จากสตร

% Change = 100 - ความเขมขนพรกาบาลนทตงไวในเครองฉดสารอตโนมต 48 ชวโมง x 100

คาความเขมขนของพรกาบาลนทเวลาเรมตน

6.2 Stock-solution stability ท าการวเคราะหหาพนทใตพคของพรกาบาลนในสารละลายทความเขมขน

กลาง (MQC) และ Internal standard โดยวเคราะหแยกกนจ านวน 3 ตวอยางแลวเปรยบเทยบ พนทใตพคของ Stock solution ทไดจากการวเคราะหสารละลายทเตรยมขนใหมกบ Stock solution ทเกบไวทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 สปดาห 2 สปดาห 3 สปดาห และ 4 สปดาห น าผลทไดมาค านวณคารอยละการเปลยนแปลง

วธการค านวณหาคา %Change จากสตร %Change = 100 - พนทใตพค ของ Stock solution ทเวลาตางๆ x 100

พนทใตพคของ Stock solution ทเวลาเรมตน

6.3 Freeze & Thaw stability เตรยมตวอยางพรกาบาลนในพลาสมาความเขมขน 2 ระดบ คอ ต า (LQC)

และสง (HQC) แลวท าการสกดและวเคราะหยาใน Blank plasma ทนทหลงจากการเตรยมดวยวธทพฒนาขนความเขมขนละ 3 ตวอยางเปรยบเทยบการวเคราะหความเขมขนของตวอยางในพลาสมาทเตรยมขนและถกจดเกบทอณหภม -70 องศาเซลเซยสใหเกดการแขงตวเปนเวลา 24 ชวโมง และน าออกมาตงทงไวทอณหภมหองใหเกดการละลาย (เทากบ 1 รอบ) เปนจ านวน 3 รอบน าผลทไดมาค านวณคารอยละการเปลยนแปลง

วธการค านวณหาคา % Change จากสตร % Change = 100 - ความเขมขนพรกาบาลนทเกบไวจ านวน 3 รอบ x 100

ความเขมขนพรกาบาลนทวเคราะหเวลาเรมตน

6.4 Short term stability

เตรยมตวอยางพรกาบาลนในพลาสมาความเขมขน 2 ระดบ คอ ต า (LQC) และสง (HQC) แลวท าการสกดและวเคราะหยาใน Blank plasma ทนทหลงจากการเตรยม ดวยวธทพฒนาขนความเขมขนละ 3 ตวอยางเปรยบเทยบการวเคราะหความเขมขนของตวอยางในพลาสมา

33

ทเตรยมขนและถกจดเกบทอณหภม -70 องศาเซลเซยส ใหเกดการแขงตวเปนเวลา 24 ชวโมงและน ามาละลายแลวตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 0, 3 และ 6 ชวโมง (ทเวลา 0 ชวโมง คอ เวลาทตวอยางพลาสมาละลายเปนของเหลวทงหมด) น าผลทไดมาค านวณคารอยละการเปลยนแปลง

วธการค านวณหาคา %Change จากสตร

%Change = 100 - ความเขมขนพรกาบาลนทตงทงไวทอณหภมหองทเวลาตางๆ x 100

ความเขมขนพรกาบาลนทวเคราะหทเวลาเรมตน

บทท 4 ผลการทดลอง

1. ผลการศกษาสภาวะทเหมาะสมของเฟสเคลอนทในการวเคราะหปรมาณ พรกาบาลนในพลาสมา แนวทางในการเลอกความเหมาะสมของเฟสเคลอนทในการแยกสารพจารณาจากคาพารามเตอรตามเกณฑมาตรฐานการยอมรบของ US FDA guideline ไดแก Theoretical Plates (N) > 2000, Tailing factor (T) ≤ 2, Resolution (RS) > 2 (Food and Drug Administration. 1994: Online) และเวลาในการวเคราะหนอย โดยตวอยางทใชในการศกษาสภาวะทเหมาะสมของเฟสเคลอนทในการวเคราะห คอ วธการสกดพรกาบาลนออกจากตวอยางพลาสมาดดแปลงมาจาก เวยดยา; และคนอนๆ (Vaidya; et al. 2007: 925-928) สวนวธการท าใหเกดอนพนธดดแปลงมาจากวธของ โอนอล; และแซกกรล (Onal; & Sagirli. 2009: 68-71) ซงสามารถสรปขนตอนการเตรยมตวอยางไดดงน ปเปตสารละลายพรกาบาลนความเขมขน 200 ไมโครกรมตอมลลลตร ปรมาตร 10 ไมโครลตร และปเปตสารละลายกาบาเพนตนความเขมขน 75 ไมโครกรมตอมลลลตร ปรมาตร 10 ไมโครลตร ลงในพลาสมาทมปรมาตร 200 ไมโครลตร (หรอใช KH2PO4 ความเขมขน 50 มลลโมลาร พเอช 7.7 แทนพลาสมาในกรณทไมสกด) เตม ACN ปรมาตร 500 ไมโครลตร เขยาใหเขากน 20 วนาท และปนเหวยงท 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5 นาท น าสวนของสารละลายใสทไดมาท าปฏกรยา Derivatization กบ NBD-Cl ความเขมขน 30 มลลกรมตอมลลลตรปรมาตร 20 ไมโครลตร ในสภาวะทเปนเบสโดยใสBorate buffer พเอช 9.5 ความเขมขน 0.1โมลาร ปรมาตร 20 ไมโครลตร ผสมใหเขากนแลวน าไปใหความรอนทอณหภมท 80 องศาเซลเซยสเปนเวลา 10 นาท น าไปแชในอางน าแขงเปนเวลา 2 นาท เตม HCl ความเขมขน 2 โมลาร ปรมาตร 5 ไมโครลตร น าสารทเตรยมไดไปตรวจวดดวยเครอง HPLC เพอด าเนนการศกษาสภาวะทเหมาะสมของเฟสเคลอนทในการวเคราะหปรมาณพรกาบาลนใพลาสมา

1.1 ชนดของเฟสเคลอนททเหมาะสม ในการวเคราะหปรมาณพรกาบาลนจ าเปนตองเลอกใชชนดของเฟสเคลอนทใหเหมาะสมกบสารทตองการวเคราะห เนองจากเฟสเคลอนทเปนปจจยหนงทสามารถพาสารทตองการวเคราะหออกจากคอลมนเพอท าใหเกดการแยกไดดงนนจงไดศกษาชนดของเฟสเคลอนททเหมาะสม โดยชนดของเฟสเคลอนททน ามาใชในการศกษา คอ เฟสเคลอนททเปนตวท าละลายอนทรย ไดแก ACN และ MeOH ผสมกบเฟสเคลอนททมขว ไดแก H2O, KH2PO4, K2HPO4, NaH2PO4 และ Na2HPO4 ผลการทดลองทไดแสดงดงตาราง 5, ภาพประกอบ 9 (a), (b) ,(c) และภาพประกอบ 10 (a), (b), (c) และ (d) ในระบบทวเคราะหตวอยางแบบผานและไมผานการสกดโดย

35

ถาใชตวท าละลายอนทรยเปน ACN : KH2PO4 เปนเฟสเคลอนทพบวาสามารถพาพรกาบาลนและกาบาเพนตนออกจากคอลมนไดภายในระยะเวลา10 นาท ดงแสดงในภาพประกอบ 8 (a) ซงเมอเปรยบเทยบกบการใชตวท าละลายอนทรยเปน MeOH : KH2PO4 พบวาไมสามารถพาพรกาบาลนและกาบาเพนตนออกจากคอลมนไดภายในระยะเวลา 10 นาท ดงแสดงในภาพประกอบ 8 (b) และจากการศกษา Phosphate buffer ชนดอน ไดแก K2HPO4, NaH2PO4 และ Na2HPO4 พบวา โครมาโทแกรมไมแตกตางจากการใช KH2PO4 แตเมอเปลยน KH2PO4 เปนน า (H2O) พบวาสารเคลอนทออกจากคอลมนชา ฐานพคกวางขน และความสมมาตรของพคลดลงซงแสดงในภาพประกอบ 8 (c)

ภาพประกอบ 8 แสดงโครมาโทแกรมของพรกาบาลนและกาบาเพนตนในระบบทไมผานการสกด

โดย (a) เปนโครมาโทแกรมทใชเฟสเคลอนทเปน ACN : KH2PO4, (b) MeOH : KH2PO4 และ

(c) ACN : H2O

(a)

(b)

(c)

36

ในระบบการวเคราะหพรกาบาลนในพลาสมาโดยใช Phosphate buffer ตางชนดกน พบวา Retention time ของพรกาบาลนและกาบาเพนตนไมแตกตางกน แตถาใช Phosphate buffer เปน K2HPO4, NaH2PO4 และ Na2HPO4 ดงแสดงในภาพประกอบ 9 (a), 9(b) และ 9(d) จะมพค รบกวนการวเคราะหทต าแหนงใกลเคยงกบกาบาเพนตน ในขณะทการใช KH2PO4 สามารถแยกพคของกาบาเพนตนกบพครบกวนไดดงแสดงในภาพประกอบ 9 (c)

ภาพประกอบ 9 แสดงโครมาโทแกรมของพรกาบาลนและกาบาเพนตนในพลาสมา โดย (a) เปนโครมาโทแกรมทใชเฟสเคลอนทเปน ACN : Na2HPO4, (b) ACN : NaH2PO4, (c) ACN : KH2PO4 และ (d) ACN : K2HPO4

จากผลการทดลองในตาราง 5 แสดงใหเหนวาการใช Phosphate buffer ตางชนดกนสงผลใหคาพารามเตอรของการแยกสารระหวางพรกาบาลนและกาบาเพนตนแตกตางกนเพยงเลกนอย แตมผลตอการแยกกาบาเพนตนออกจากพครบกวนซงพบวา KH2PO4 เปน Phosphate buffer ทสามารถแยกสารรบกวนออกจากกาบาเพนตนไดดทสด ซงสงเกตไดจากคา RS ของ กาบาเพนตนทมคามากทสด

(c)

(d)

(a)

(b)

37

ตาราง 5 แสดงคาพารามเตอรตางๆ ในการวเคราะหพรกาบาลนและกาบาเพนตนโดยใช Phosphate buffer ตางชนดกน

ชนดของ Phosphate buffer พารามเตอร Na2HPO4 NaH2PO4 KH2PO4 K2HPO4

PGB GB PGB GB PGB GB PGB GB RT (นาท) 7.958 9.090 8.021 9.173 8.023 9.179 7.970 9.104 RS 2.719 0.784 2.787 1.177 2.798 1.484 2.724 0.559 T 1.172 - 1.167 1.168 1.165 1.157 1.173 - N (*10^3) 6.386 6.992 6.569 7.256 6.567 7.265 6.414 7.020

PGB = pregabalin, GB = gabapentin จากผลการทดลองพบวาชนดของเฟสเคลอนททสามารถพาสารทตองการตรวจวดออกจากคอลมนและแยกสารไดดทสดคอ ACN ผสมกบ KH2PO4 จงน าสารดงกลาวไปใชในการทดลองตอไป

1.2 การศกษาความเขมขนของ Phosphate buffer (KH2PO4) เนองจากความเขมขนของ Phosphate buffer มผลตอความสามารถใหการพาสาร

ออกจากคอลมนและการแยกของสารผสมออกจากกน ถาหากใชความเขมขนของ Phosphate buffer นอยเกนไปอาจสงผลใหสารผสมเกดการแยกไดไมด แตถาหากใชความเขมขนของ Phosphate buffer มากเกนไปจะท าใหสนเปลอง นอกจากนความเขมขนของ Phosphate buffer ทมากเกนไปยงสงผลใหเกลอของบฟเฟอรเกดการอดตนในสวนตางๆ ของเครองมอวเคราะหได ฉะนนในการทดลองนจงท าการศกษาความเขมขน Phosphate buffer ในชวง 5-50 มลลโมลาร พบวาการใชความเขมขนของ KH2PO4 ในชวงดงกลาวใหผลการทดลองแสดงดงตาราง 6 ซงใหคาพารามเตอรทท าการศกษาใกลเคยงกนและผานเกณฑการยอมรบ แตเมอสงเกตลกษณะโครมาโทแกรมของพรกาบาลนและกาบาเพนตน ทใช KH2PO4 ทความเขมขน 5 มลลโมลาร พบวาฐานพคของสารทงสองชนดยงแยกออกจากกนไมชดเจนเมอเปรยบเทยบกบความเขมขนท 10 มลลโมลาร ดงแสดงในภาพประกอบ10 ดงนนจงเลอก KH2PO4 ความเขมขน 10 มลลโมลารไปใชในการทดลองตอไป

38

ตาราง 6 แสดงคาพารามเตอรตางๆ ในการวเคราะหพรกาบาลนและกาบาเพนตนทความเขมขนของ KH2PO4 ตางกน

ความเขมขนของ KH2PO4 (มลลโมลาร) พารามเตอร 5 10 20 50 PGB GB PGB GB PGB GB PGB GB RT (นาท)

8.018

9.184

8.036

9.198

8.029

9.182

7.935

9.136

RS 2.723 2.723 2.659 2.659 2.737 1.432 2.616 1.202 T 1.174 1.183 1.185 1.203 1.165 1.162 1.184 1.199 N (*10^3) 6.196 6.702 5.962 6.448 6.378 6.946 6.015 6.478

ภาพประกอบ 10 แสดงโครมาโทแกรมของพรกาบาลนและกาบาเพนตนในพลาสมา โดย

(a) เปนโครมาโทแกรมทใช KH2PO4 ความเขมขน 10 มลลโมลาร และ (b) 5 มลลโมลาร 1.3 การศกษาพเอชของเฟสเคลอนท

พเอชของเฟสเคลอนทมผลตอการแยกของสาร เนองจากโมเลกลของสารอนพนธในงานวจยนมหมฟงกชนทแสดงความเปนกรดและเปนเบส สามารถแตกตวในพเอชทแตกตางกน ดงนนพเอชจงเปนปจจยหนงทเปนตวก าหนดวาสารตวอยางจะเคลอนทออกมาจากคอลมนไดเรวหรอชา และการแยกจะเปนไปไดอยางมประสทธภาพดหรอไม การทดลองนจงท าการศกษาพเอชของเฟสเคลอนทในชวง 2.5-7 ผลการทดลองทไดแสดงตาราง 7 ซงพบวาเมอท าการเพมพเอชของ

(a)

(b)

39

เฟสเคลอนทจากพเอช 2.5-7 สงผลใหพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนมแนวโนมเคลอนทออกจากคอลมนเรวขนเรอยๆ เมอพเอชเพมขนจนเกดการซอนทบเปนพคเดยวกนทพเอชตงแตพเอช 5 จนถงพเอช 7 จากภาพประกอบ 11 สงเกตไดวาคาพารามเตอรตางๆ ในการแยกมแนวโนมลดลงตามพเอชทสงขน ดงนนจงเลอกพเอชของ KH2PO4 เทากบ 2.5 เนองจากคาพามเตอรผานเกณฑการยอมรบและสามารถแยกสารผสมออกจากกนไดดทสด จงน าคาพเอชดงกลาวไปใชในการทดลองตอไป

ตาราง 7 แสดงคาพารามเตอรตางๆ ในการวเคราะหพรกาบาลนและกาบาเพนตน เมอใช KH2PO4

ความเขมขน 10 มลลโมลาร ทพเอชตางกน พเอชของ KH2PO4 ความเขมขน 10 มลลโมลาร พารามเตอร 2.5 3 4 5 7 PGB GB PGB GB PGB GB PGB GB PGB GB RT (นาท) 8.043 9.205 7.980 9.098 7.579 8.337 5.708 2.558 RS 2.665 2.665 2.577 2.577 1.864 1.864 รวมเปนพค รวมเปนพค เดยวกน เดยวกน T 1.219 1.235 1.228 1.243 1.269 1.264 - - N (*10^3) 6.050 6.454 6.018 6.363 5.951 6.311 - -

40

ภาพประกอบ 11 แสดงความสมพนธระหวางพเอชกบคาพารามเตอรในการแยกของพรกาบาลน

(RT คอ Retention time, Rs คอ Resolution, T คอ Tailing factor และ N คอ Theoretical Plates)

1.4 การศกษาอตราสวนของเฟสเคลอนท

การศกษาอตราสวนของเฟสเคลอนทมผลตอการชะสารตวอยางออกมาจากคอลมน เนองจากสารตวอยางมความชอบกระจายตวอยในเฟสเคลอนทไดแตกตางกน ซงการปรบเพมหรอลดความมขวของเฟสเคลอนจงสงผลตอความเรวในการเคลอนทของสารออกจากคอลมน การแยกและปรมาณสารทถกพาออกจากคอลมน การทดลองนจงท าการศกษาอตราสวนของเฟสเคลอนทของสารผสมระหวาง ACN : KH2PO4 ในอตราสวน 40 : 60, 45 : 55, 50 : 50 และ 55 : 45 ผลการทดลองทไดแสดงในตาราง 8 พบวาเมอท าการเพมอตราสวนของอะซโตไนไตรลขนไปเรอยๆ สงผลใหสารถกพาออกจากคอลมนไดมากและพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนมแนวโนมเคลอนทออกจากคอลมนไดเรว ซงในทางกลบกนกสงผลใหการแยกสารลดลงดวย ซงสามารถแสดงไดดงภาพประกอบ 12 ดงนนจงเลอกอตราสวนของ ACN : KH2PO4 เทากบ 50 : 50 ไปใชในการทดลองตอไปเพราะสามารถแยกสารผสมไดดทสดโดยใชเวลาในการวเคราะหไมเกน 10 นาท

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5

Para

met

er

pH

RT

Rs

T

N (*10^3)

41

ตาราง 8 แสดงคาพารามเตอรตางๆ ในการวเคราะหพรกาบาลนและกาบาเพนตนเมอใชอตราสวนของเฟสเคลอนทตางกน

อตราสวนของสารผสมระหวาง ACN : KH2PO4 พารามเตอร 40:60 45:55 50:50 55:45 60:40 PGB GB PGB GB PGB GB PGB GB PGB GB A (*10^6) 7.201 4.199 8.050 4.641 8.973 5.243 9.249 5.680 13.912 RT (นาท) 18.143 21.324 11.559 13.417 8.043 9.205 6.044 6.825 4.317 RS 3.357 3.357 3.080 3.080 2.665 2.665 2.311 2.311 รวมเปน พคเดยวกน T 1.211 1.237 1.200 1.220 1.219 1.235 1.273 1.222 - N (*10^3) 6.898 6.979 6.712 6.979 6.050 6.454 5.514 6.085 -

ภาพประกอบ 12 แสดงความสมพนธระหวางปรมาณ ACN กบคาพารามเตอรในการแยกของ พรกาบาลน (RT คอ Retention time, RS คอ Resolution, T คอ Tailing factor, N คอ Theoretical Plates และ A คอ Peak area)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

40 45 50 55 60 65

Para

met

er

ปรมาณ ACN (%)

RT

Rs

T

N (*10^3)

A (*10^6)

42

จากผลการศกษาสภาวะทเหมาะสมของเฟสเคลอนททใชในการวเคราะหพรกาบาลนในพลาสมาสามารถสรปไดดงแสดงในตาราง 9

ตาราง 9 สรปสภาวะของเฟสเคลอนททเหมาะสมในการวเคราะหพรกาบาลน

สภาวะทท าการศกษา ผลทได

ชนดของเฟสเคลอนท ความเขมขนของฟอสเฟตบฟเฟอร

พเอชของฟอสเฟตบฟเฟอร

อตราสวนของเฟสเคลอนท

เวลาทใชในการวเคราะห

ปรมาตรสารทใชวเคราะห

ACN : KH2PO4

10 mM

2.5

50 : 50

11 นาท

20 ไมโครลตร

2. ผลการศกษาการสกดสารออกจากตวอยางพลาสมาดวยวธการตกตะกอนโปรตน

เนองจากการวเคราะหตวอยางพลาสมาโดยใชเทคนค HPLC ไมสามารถน าตวอยางไปวเคราะหไดโดยตรง จงจ าเปนตองมการเตรยมตวอยางใหมความบรสทธกอนฉดสารเขาสเครอง HPLC ดงนนการเลอกใชชนดและปรมาณสารทใชในการตกตะกอนโปรตนจงมความส าคญเพอใหไดผลการสกดทสญเสยสารส าคญในระหวางการสกดนอยทสดและสามารถสกดซ าไดผลอยางแมนย า การทดลองนจงไดท าการศกษาชนดและปรมาณของสารทใชในการตกตะกอนโปรตน

2.1 ศกษาชนดของสารทใชในการตกตะกอนโปรตน การศกษาชนดของสารทใชในการตกตะกอนโปรตน 3 ชนด ไดแก ACN, MeOH

และ 20% TCA ผลการทดลองทไดแสดงในภาพประกอบ 13 และตาราง 10 พบวา ACN (หลอดท1) สามารถตกตะกอนโปรตนไดสารละลายหลงจากการตกตะกอนทใสในขณะทเมอใช MeOH (หลอดท 2) และ 20%TCA (หลอดท 3) ไดสารละลายทขน นอกจากนการใช MeOH ในการตกตะกอนโปรตนยงเกดพครบกวนการวเคราะหทต าแหนงใกลเคยงกบพรกาบาลนดงภาพประกอบ 14(a) ซงแสดงโครมาโทแกรมเปรยบเทยบระหวางตวอยางแบลงคพลาสมา (โครมาโทแกรมเสนสด า) กบตวอยาง พรกาบาลนและกาบาเพนตนทไมผานการสกด (โครมาโทแกรมเสนสชมพ) เกดพคซอนทบกนสงผล

43

ใหการวเคราะหปรมาณพรกาบาลนไมถกตองและการตกตะกอนโปรตนดวย 20%TCA สารในระบบไมสามารถท าปฏกรยาเพอใหเกดอนพนธได ดงภาพประกอบ 14(b) ซงไมแสดงโครมาโทแกรมของ พรกาบาลนและกาบาเพนตนจงไมสามารถวเคราะหหาปรมาณพรกาบาลนได ดงนนจงเลอก ACN ไปใชในการทดลองตอไป

ภาพประกอบ 13 แสดงสารละลายทไดหลงจากการตกตะกอนโปรตนในพลาสมาดวยชนดของสารทแตกตางกน

ตาราง 10 แสดงผลของการสกดพรกาบาลนและกาบาเพนตนออกจากพลาสมา โดยใชชนดของสาร

แตกตางกน (n=3)

ชนดของสาร

Recovery (Mean±SD)

พนทใตพคของสารรบกวน

ความใสของ Supernatant

พรกาบาลน กาบาเพนตน

ACN 74.98 ± 0.57 56.20 ± 0.62 ไมพบ ใส MeOH - - พบพครบกวนทเวลา

ใกลเคยงกบพรกาบาลน ขน

20% TCA ไมพบพนทใตพคของ PGB และ GB (ไมเกดปฏกรยา) ขน

หลอดท 1 ACN

หลอดท 2 MeOH

หลอดท 3 TCA

44

ภาพประกอบ 14 แสดงโครมาโทแกรมของพรกาบาลนและกาบาเพนตนทใช MeOH และ TCA ใน

การตกตะกอนโปรตนโดย (a) เปนโครมาโทแกรมทใช MeOH ในการตกตะกอนโปรตน และ (b) 20% TCA

2.2 ศกษาอตราสวนของสารทใชในการตกตะกอนโปรตน การตกตะกอนโปรตนในพลาสมาดวย ACN ในอตราสวนระหวางพลาสมา : ACN

เทากบ 1:1, 1:2, 1:2.5, 1:3 และ 1:3.5 โดยปรมาตรพบวาอตราสวน 1:1 ไมสามารถน าสารทเหลอหลงจากตกตะกอนโปรตนมาท าปฏกรยาตอได เนองจากสารทไดยงคงมความขนจงไมเหมาะสมทจะฉดเขาเครอง HPLC ซงผลการทดลองทใชอตราสวนอนในการศกษาใหผลการทดลองแสดงในตาราง 11-14 จากผลการศกษาการสกดพรกาบาลนและกาบาเพนตนออกจากตวอยางพลาสมาพบวาทอตราสวน 1 : 2.5 ให %Recovery ของการสกดพรกาบาลนและกาบาเพนตน เทากบ 74.86 และ 55.80% ตามล าดบ โดยเมอเพมอตราสวนของ ACN จะท าให %Recovery เพมขนแตพนทใตพค ลดลงเพราะความเขมขนของสารทท าการวเคราะหลดลง แตเมอสงเกตท %RSD พบวาทอตราสวน 1:2.5 ม %RSD นอยทสด (ไมเกน 2%) ดงนนจงเลอกอตราสวนนไปใชในการทดลองตอไป ตาราง 11 แสดงคา %Recovery ทไดจากการใชอตราสวน Plasma : ACN เทากบ 1 : 2

สาร อตราสวน Plasma : ACN %Recovery (Mean±SD) %RSD

PGB 1 : 2 66.32 ± 4.76 7.18 GB 47.02 ± 4.37 9.29

(a)

(b)

พครบกวนการวเคราะห

45

ตาราง 12 แสดงคา %Recovery ทไดจากการใชอตราสวน Plasma : ACN เทากบ 1 : 2.5


PGB 1 : 2.5 74.86 ± 0.42 0.56 GB 55.80 ± 0.82 1.47

ตาราง 13 แสดงคา %Recovery ทไดจากการใชอตราสวน Plasma : ACN เทากบ 1 : 3


PGB 1 : 3 77.73 ± 2.66 3.42 GB 59.51 ± 2.36 3.97

ตาราง 14 แสดงคา %Recovery ทไดจากการใชอตราสวน Plasma : ACN เทากบ 1 : 3.5


PGB 1 : 3.5 81.39 ± 3.61 4.44 GB 59.90 ± 3.53 5.89

3. ผลการศกษาสภาวะทเหมาะสมในการเกดปฏกรยาระหวางพรกาบาลนกบสาร NBD-Cl วธการศกษาการเกดปฏกรยาส าหรบงานวจยนพฒนามาจากวธการศกษาของ โอนอล; และแซกกรล (Onal; & Sagirli. 2009: 68-71) 3.1 ศกษาการหยดปฏกรยาดวย HCl เนองจากปฏกรยาระหวางพรกาบาลนและ NBD-Cl มความไวในการเกดปฏกรยาไดดในสภาวะทเปนเบส ซงถามสารตวใดตวหนงดงกลาวเหลอในระบบหลงจากทตองการใหหยดปฏกรยาแลว อาจท าใหปฏกรยาสามารถเกดขนตอไปได สงผลใหการวเคราะหซ าอาจไดคาทไม

46

ถกตอง ดงนนเพอใหผลการทดลองมความถกตองและแมนย ามากขน การทดลองนจงไดมการศกษาความเขมขนของ HCl ทเหมาะสมในการหยดปฏกรยา โดยไดท าการทดลองหาความเขมขนของ HCl ในชวง 0.00-0.03 โมลาร ผลการทดลองทไดแสดงตาราง 15 และภาพประกอบ 15 พบวาเมอสารท าปฏกรยาเสรจสนทเวลา 10 นาท แลวไมมการเตม HCl เพอหยดปฏกรยาสงผลใหปฏกรยายงเกดตอเนองซงแสดงไดจากรอยละการเปลยนแปลงพนทใตพคทเพมขนเมอตงสารทงไวในเครองฉดสารอตโนมตเปนระยะเวลา 1 ชวโมง แตเมอเปรยบเทยบกบการเตม HCl ในชวงความเขมขน 0.01-0.03 โมลาร พบวาทความเขมขน 0.02 โมลาร สามารถหยดปฏกรยาไดด เนองจากใหคารอยละการเปลยนแปลงพนทใตพคใกลเคยง 100% มากทสด โดยหลงจากการเพมความเขมขนมากกวานรอยละการเปลยนแปลงพนทใตพคมแนวโนมคงท ดงนนจงเลอก HCl ความเขมขน 0.02 โมลาร เปนความเขมขนทเหมาะสมในการหยดปฏกรยาเพอใชในการทดลองตอไป ตาราง 15 แสดงคารอยละการเปลยนแปลงพนทใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนหลงจากเตม

กรดไฮโดรคลอรกทความเขมขนตางๆ ทเวลา 1 ชวโมง

Conc.HCl (โมลาร)

%Change of PGB (Mean±SD)

%RSD %Change of GB (Mean±SD)

%RSD

0.00 109.40 ± 0.33 0.30 106.58 ± 1.38 1.30 0.01 101.12 ± 0.99 0.98 101.55 ± 2.38 2.34 0.02 99.64 ± 0.47 0.47 99.17 ± 1.50 1.51 0.03 99.27 ± 0.70 0.71 98.49 ± 1.09 1.12

47

ภาพประกอบ 15 แสดงความสมพนธระหวางความเขมขนของ HCl กบรอยละการเปลยนแปลงพนทใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตน

3.2 ความเขมขนของ NBD-Cl ทเหมาะสมในการเกดปฏกรยาเคมกบพรกาบาลน ความเขมขนของ NBD-Cl มผลตอการเกดสารอนพนธเพราะ NBD-Cl เปนสารทเขา

ท าปฏกรยากบหมเอมน (Primary amine, -NH2) ในโครงสรางของพรกาบาลน ถาหากใชความเขมขนของ NBD-Cl นอยเกนไปจะท าใหปฏกรยาเกดขนไดไมสมบรณ แตถาหากใชความเขมขนของ NBD-Cl มากเกนไปจะท าใหสนเปลองหรอบางครงในกรณทรเอเจนตมากเกนพออาจมผลรบกวนตอการเกดอนพนธได ฉะนนในการทดลองนจงท าการศกษาความเขมขนของ NBD-Cl ทเหมาะสมเพอใหไดสญญาณในการวเคราะหทด ซงในการทดลองครงนไดท าการศกษาความเขมขนของรเอเจนต NBD-Cl ทเหมาะสมในชวง 0.00-3.04 มลลกรมตอมลลลตร ผลการทดลองทไดแสดงดงตาราง16 และภาพประกอบ 16 พบวาความเขมขนของ NBD-Cl มผลตอสญญาณในการวเคราะห โดยเหนไดวาสญญาณมแนวโนมเพมขน เมอเพมความเขมขนของ NBD-Cl ในชวงความเขมขน 0.00-2.24 มลลกรมตอมลลลตร และเมอเพมความเขมขนมากกวา 2.24 มลลกรมตอมลลลตรคาการดดกลนแสงของอนพนธทตรวจวดไดมแนวโนมคงท ดงนนจงเลอกความเขมขนของ NBD-Cl ท 2.24 มลลกรมตอมลลลตรเปนความเขมขนทเหมาะสมเนองจากใหสญญาณในการวเคราะหสงและเปนการประหยดรเอเจนตทใช ดงนนจงเลอกใชความเขมขนของ NBD-Cl ท 2.24 มลลกรมตอมลลลตรในการทดลองตอไป

96

98

100

102

104

106

108

110

0 0.01 0.02 0.03 0.04

%Ch

ange

of

peak

area

Concentration of HCl (M)

Pregabalin

Gabapentin

48

ตาราง 16 แสดงคาพนทใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนทความเขมขนของ NBD-Cl ตางกน

Conc. NBD-Cl (mg/ml)

Peak area of PGB (Mean)

%RSD Peak area of GB (Mean)

%RSD

0.00 0 - 0 - 0.48 1004453 4.28 342351 6.10 0.94 1746902 0.56 597049 1.47 1.39 2383628 2.56 796708 3.21 1.82 2984687 5.17 992451 6.20 2.24 3404996 1.83 1128341 1.84 2.65 3522343 3.08 1172921 2.73 3.04 3526954 3.32 1128893 3.88

ภาพประกอบ 16 แสดงความสมพนธเชงเสนระหวางพนทใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนกบความเขมขนของ NBD-Cl ทตางกน

0.0E+00

5.0E+05

1.0E+06

1.5E+06

2.0E+06

2.5E+06

3.0E+06

3.5E+06

4.0E+06

4.5E+06

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50

Peak

area

Concentration of NBD-Cl (mg/ml)

Pregabalin

Gabapentin

2.24 mg/ml

49

3.3 พเอชของ Borate buffer ทเหมาะสมในการเกดปฏกรยา Borate buffer เปนสารละลายทใชควบคมพเอชของตวกลางในระบบ ซงมผลตอการ

เกดอนพนธ เพราะวาสาร NBD-Cl สามารถเขาท าปฏกรยากบหม Primary amine ในต าแหนงทมอเลกตรอนคโดดเดยวทอะตอมของไนโตรเจนไดดในสภาวะทเปนเบส เนองจากในระบบทเปนเบส Primary amine group ของพรกาบาลนไมสามารถแตกตวเปน R-NH3

+ ได ดงนนการทดลองนจงศกษาพเอชของ Borate buffer ทเหมาะสมในการเตมลงในระบบเพอใหเกดปฏกรยาไดดทสด ซงถาหากใช Borate buffer พเอชต าเกนไปจะท าใหปฏกรยาเกดขนไดไมสมบรณ เนองจาก Primary amine group สามารถแตกตวได ฉะนนในการทดลองนจงท าการศกษาพเอชของ Borate buffer ทเหมาะสมในการเกดปฏกรยา โดยท าการศกษาในชวงพเอช 8-13 ผลการทดลองทไดแสดงดงตาราง 17 และภาพประกอบ 17 ซงพบวาพเอชของ Borate buffer มผลตอสญญาณในการวเคราะห โดยเหนไดวาสญญาณมแนวโนมเพมขนเมอเพมพเอชของ Borate buffer ในชวงพเอช 8-11 และเมอเพมพเอชมากกวานสญญาณของอนพนธทตรวจวดไดมแนวโนมลดลง ดงนนจงเลอกพเอชของ Borate buffer เทากบ 11 เปนพเอชทเหมาะสมเนองจากใหสญญาณในการวเคราะหสงทสด เพอน าไปใชในการทดลองตอไป

ตาราง 17 แสดงคาพนทใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนทพเอชของ Borate buffer ตางกน pH of Borate buffer Peak area of PGB

(Mean) %RSD Peak area of GB

(Mean) %RSD

8 2137168 4.41 558608 5.78 9 3184767 3.07 936382 4.29 10 3404996 1.83 1128341 1.84 11 3785117 2.28 1384005 2.33 12 3301257 3.50 1260256 3.53 13 3308299 2.98 1220444 5.33

50

ภาพประกอบ 17 แสดงความสมพนธเชงเสนระหวางพนทใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนกบ pH ของ Borate buffer

3.4 ระยะเวลาในการเกดปฏกรยาทเหมาะสม ในการทดลองนไดท าการศกษาระยะเวลาทเหมาะสมในการเกดปฏกรยาของสาร

อนพนธระหวางพรกาบาลนกบ NBD-Cl และกาบาเพนตนกบ NBD-Cl ทอณหภม 80 องศาเซยล

เซยส เนองจากระยะเวลาในการเกดปฏกรยานนมผลตอสญญาณทตรวจวดได ถาเวลาในการ

เกดปฏกรยานอยเกนไปท าใหปฏกรยาเกดขนไมสมบรณ และหากใชเวลานานเกนไปอาจสงผลตอ

การเสยสภาพของตวอยางได ดงนนจงไดท าการศกษาเวลาทเหมาะสมในการเกดปฏกรยาในชวง

5-25 นาท ผลการทดลองทไดแสดงดงตาราง 18 และภาพประกอบ 18

จากผลการทดลองพบวาระยะเวลาในการเกดปฏกรยามผลตอสญญาณของผลตภณฑทเกดขนจากปฏกรยาทตรวจวดได พบวาสญญาณของสารอนพนธมแนวโนมเพมขนอยางมาก เมอเพมระยะเวลาในการเกดปฏกรยาในชวงเวลา 5-15 นาท และเมอเพมระยะเวลาในการเกดปฏกรยาจนถง 20 นาท สญญาณของกาบาเพนตทตรวจวดไดมแนวโนมคงท แตสญญาณของพรกาบาลนยงเพมขนอกประมาณ 12% และเมอเพมระยะเวลาในการเกดปฏกรยาจนถง 25 นาท สญญาณทไดมคาเพมขนเพยงเลกนอย และเมอสงเกตการน าสารทท าปฏกรยาเปนเวลา 20 นาท ซงมสของตวอยางเขมกวาท 15 นาท ดงแสดงในภาพประกอบ 19 เมอฉดสารดงกลาวเขา สเครอง HPLC พบวามผลตอการอดตนในสวนของ Injector ซงเมอพจารณาถงปญหาความไมบรสทธของตวอยางจงไมเหมาะสมส าหรบการวเคราะหตวอยางจ านวนมากๆอยางตอเนองได

0.00E+00

5.00E+05

1.00E+06

1.50E+06

2.00E+06

2.50E+06

3.00E+06

3.50E+06

4.00E+06

4.50E+06

7 8 9 10 11 12 13 14

Peak

area

pH

Pregabalin

Gabapentin

51

นอกจากนการใชระยะเวลาในการเกดปฏกรยา 15 นาท ยงสามารถลดเวลาในการเตรยมตวอยางอกดวย ดงนนในการทดลองนจงเลอกใชระยะเวลาในการเกดปฏกรยาทเวลา 15 นาท ซงสญญาณของอนพนธทตรวจวดไดมคานอยกวาทเวลา 20 นาท ไมมากเกนไป ตาราง 18 แสดงคาพนทใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนในการท าปฏกรยาทเวลาตางกน

Time (min) Peak area of PGB (Mean)

%RSD Peak area of GB (Mean)

%RSD

5 1037574 6.69 344064 6.68 10 3785117 2.28 1384005 2.33 15 5095785 0.37 1982431 0.46 20 5685096 1.08 2063951 2.20 25 5716048 0.36 2151695 4.98

ภาพประกอบ 18 แสดงความสมพนธเชงเสนระหวางพนทใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนกบเวลาทใชในการท าปฏกรยา

0.00E+00

1.00E+06

2.00E+06

3.00E+06

4.00E+06

5.00E+06

6.00E+06

7.00E+06

0 5 10 15 20 25 30

Peak

area

Time (min)

Pregabalin

Gabapentin

52

ภาพประกอบ 19 แสดงสของตวอยางหลงหยดปฏกรยาดวยกรดไฮโดรคลอรก (เมอใหความรอนในชวง 5-25 นาท)

จากการศกษาสภาวะทเหมาะสมในการเกดปฏกรยาระหวางพรกาบาลนกบ NBD-Cl เพอใชส าหรบการวเคราะหปรมาณพรกาบาลน สามารถสรปไดดงตาราง 19 ตาราง 19 สรปสภาวะทเหมาะสมในการเกดปฏกรยาของสารอนพนธ

สภาวะทท าการศกษา ผลทได

ความเขมขนของกรดไฮโดรคลอรก

ความเขมขนของ NBD-Cl

พเอชของ Borate buffer

ระยะเวลาในการเกดปฏกรยา

0.02 โมลาร

2.24 มลลกรมตอมลลลตร

11

15 นาท

4. ผลการตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะห เมอกระบวนการพฒนาวธวเคราะหแลวเสรจ กอนน าวธการดงกลาวมาใชในการวเคราะหตวอยางจรง ตองผานการตรวจสอบความถกตอง แมนย า คงทน เพอใหเกดความมนใจวาวธวเคราะหใหผลทถกตอง มความเหมาะสมสามารถน ามาใชในการวเคราะหตวอยางจรงได ดงนนจงจ าเปนตองศกษา Method validation ซงเปนกระบวนการยนยนความใชไดของวธทพฒนาขนโดยม

53

Guideline ในการท า Method validation ทไดรบการยอมรบจากทวโลก ไดแก Guideline for Industry : Bioanalytical Method Validation ขององคการอาหารและยา ประเทศสหรฐอเมรกา (US FDA) ฉบบลาสดคอ ฉบบป 2013 และ Guideline on bioanalytical method validation ของ European Medicines Agency (EMA) ฉบบลาสดคอ ฉบบป 2011 (เอกวรรณ อยสกล. 2556: 18) จากผลการศกษาคาพารามเตอรทส าคญในการตรวจสอบความใชไดของวธวเคราะหสามารถแสดงผลไดดงการทดลองตอไปน 4.1 ความจ าเพาะเจาะจงของวธวเคราะห (Specificity / Selectivity) ความจ าเพาะเจาะจงของวธวเคราะหแสดงไดจากโครมาโตแกรมในภาพประกอบ 20 พบวาคา Retention time ของพรกาบาลนในพลาสมามคาประมาณ 8.0 นาท โดยแยกจากพคของกาบาเพนตนทใชเปน Internal standard ซงมคา Retention time ประมาณ 9.2 นาท และจากการทดสอบ Blank plasma จ านวน 6 ตวอยาง พบวาพคทงสองไมถกรบกวนการวเคราะหดวยสารอนๆ ในพลาสมา ดงแสดงในตาราง 20

(a)

(b)

54

ภาพประกอบ 20 แสดงโครมาโทแกรมทไดจากการวเคราะหพรกาบาลนและกาบาเพนตนใน

พลาสมาโดย (a) เปนโครมาโตแกรมของพรกาบาลนกบกาบาเพนตนในพลาสมา (b) กาบาเพนตนในพลาสมาและ (c) Blank plasma ตาราง 20 แสดงคาพนทใตพคของ Blank plasma ท Retention time ของการวเคราะหพรกาบาลน

และกาบาเพนตน

สารทตรวจวด Retention time (min)

พนทใตพคของ Blank plasma

No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6

พรกาบาลน 8.0 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 กาบาเพนตน 9.2 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

4.2 การหาความเขมขนต าสดทสามารถตรวจพบและความเขมขนต าสดทวเคราะหไดในเชงปรมาณ (Lower limit of detection, LLOD and Lower limit of quantification, LLOQ) จากผลการศกษาความเขมขนต าสดของพรกาบาลนในพลาสมาทตรวจพบและความเขมขนต าสดทน ามาใชในการวเคราะหปรมาณพรกาบาลน สามารถศกษาไดจากนยามอตราสวนของสญญาณระหวางสญญาณทตองการตรวจวดกบสญญาณรบกวน (S/N) เทากบ 3 ในการวเคราะห LLOD และมากกวาหรอเทากบ 5 ในการวเคราะห LLOQ เนองจากไมสามารถตรวจพบสญญาณของ Blank plasmaได ดงนนจงใชวธการหาคา LLOD และ LLOQ โดยท าการเพมความ

(c)

55

เขมขนของพรกาบาลนขนเรอยๆจากความเขมขนต าตงแต 5 นาโนกรมตอมลลลตร มาตรวจวดขนาดของสญญาณแลวน ามาค านวณหาคา S/N ผลการทดลองทไดแสดงในตาราง 21

จากผลการศกษาพบวาสญญาณทใหคา Signal to noise เทากบหรอมากกวา 5 คอ ความเขมขนของพรกาบาลนในพลาสมาเทากบ 20 นาโนกรมตอมลลลตร ซงพบวาความเขมขนท 20 นาโนกรมตอมลลลตร (ภาพประกอบ 21) มคาเฉลย Signal to noise เทากบ 7.747 และ %RSD เทากบ 6.40 ดงนนจงเลอกจดความเขมขนนมาใชในการวเคราะหปรมาณพรกาบาลนในการสรางกราฟมาตรฐานเพอท าการทดลองตอไป

ตาราง 21 แสดงคา Signal to noise ของพรกาบาลนทจดความเขมขนของ LLOD และ LLOQ

(n=5)

Conc. of PGB (ng/ml) Signal to noise (mean ± SD) %RSD

0.000 0.000 0.00

5.000 0.000 0.00

10.000 3.084 ± 0.29 9.37

15.000 4.846 ± 0.43 8.73 20.000 7.747 ± 0.50 6.40

ภาพประกอบ 21 แสดงโครมาโทแกรมทไดจากการวเคราะหพรกาบาลนทจดความเขมขนของ

LLOQ (20 นาโนกรมตอมลลลตร)

56

4.3 ความเปนเสนตรง (Linearity) ในการวเคราะหเชงปรมาณของสารโดยทวไปนยมใชวธวเคราะหแบบ Internal

standard โดยความเปนเสนตรงจะแสดงดวยกราฟความสมพนธเชงเสนระหวาง Peak area ratio กบความเขมขนของพรกาบาลน ความถกตองของวธวเคราะหขนอยกบความเปนเสนตรงของกราฟมาตรฐาน ซงแสดงโดยคาถดถอยเชงเสน (R2) และสามารถหาความเขมขนของตวอยางโดยการค านวณจากสมการ Y = mX+c ทไดจากกราฟมาตรฐาน ผลการศกษากราฟมาตรฐานส าหรบวเคราะหปรมาณพรกาบาลนแสดงได ดงแสดงในตาราง 22-23 และภาพประกอบ 22 จากการศกษาชวงความเปนเสนตรงของกราฟมาตรฐานในชวงความเขมขน 20-10,000 นาโนกรมตอมลลลตร ของพรกาบาลน พบวาชวงดงกลาวมสมการเชงเสนเฉลย คอ y = 0.00026529x + 0.000121948 และมคาถดถอยเชงเสน (R2) = 1 ซงเมอค านวณรอยละการกลบคนของแตละจดความเขมขนอยในชวง 96.82-103.89% ซงผานตามเกณฑการยอมรบ (เกณฑก าหนดวาคา R2 ตองมคามากกวา 0.990 และความเขมขนแตละจดของกราฟมาตรฐานตองใหคา %Recovery อยในชวง 85-115% ยกเวนทความเขมขน LLOQ ตองอยในชวง 80-120%)

ตาราง 22 แสดงผลการศกษากราฟมาตรฐานในชวงความเขมขนของพรกาบาลน 20-10,000 นาโนกรมตอมลลลตร (n=5)

ความเขมขนของ

พรกาบาลนทเตรยม (ng/ml)

ความเขมขนทวเคราะหไดจรง

(ng/ml)

รอยละการกลบคน

(เปอรเซนต)

Area ratio (Mean ± SD)

%CV

20.00 19.36 96.82 0.00526 ± 0.00037 6.97 50.00 51.95 103.89 0.01390 ± 0.00042 3.00

200.00 200.05 100.03 0.05319 ± 0.00180 3.39 750.00 745.61 99.41 0.19792 ± 0.00113 0.57

1500.00 1500.10 100.01 0.39808 ± 0.00743 1.87 3000.00 3005.25 100.17 0.79738 ± 0.01082 1.36

6000.00 5954.59 99.24 1.57981 ± 0.01723 1.09 10000.00 10043.08 100.43 2.66445 ± 0.03222 1.21

57

ตาราง 23 แสดงสมการเสนตรงของกราฟมาตรฐานและคา R2 (n=5)

Linearity Equation of standard curve Coefficient of determination (R2)

Linearity 1 y = 0.000268433x-0.000192805 0.9999 Linearity 2 y = 0.000263209x+0.000195026 0.9998 Linearity 3 y = 0.000265206x+0.000615848 1 Linearity 4 y = 0.000266919x-0.000241698 1 Linearity 5 y = 0.000262682x+0.000233371 0.9999

Mean

y = 0.00026529x+0.000121948 1

ภาพประกอบ 22 แสดงชวงความเปนเสนตรงของกราฟมาตรฐานเฉลย (n=5) ทความเขมขนของ

พรกาบาลน 20-10000 นาโนกรมตอมลลลตร

4.4 ความถกตองและความเทยงตรงของการวเคราะห (Accuracy and Precision) ความถกตองของการวเคราะหพรกาบาลนในพลาสมาแสดงดวยคารอยละการ

กลบคน (%Recovery) พบวารอยละการกลบคนของวธวเคราะหพรกาบาลนในพลาสมาส าหรบการ

ความเขมขนของพรกาบาลน (ng/ml)

y = 0.00026529x+0.000121948

R2 = 0.9999681

58

วเคราะหในวนเดยวกนเปนจ านวน 3 วนทความเขมขนของพรกาบาลนเทากบ 20, 60, 5000 และ 7500 นาโนกรมตอมลลลตร โดยมคา %Recovery ของแตละความเขมขนอยในชวง 99.33-106.89%, 97.19-104.47%, 96.27-100.23% และ 95.87-102.26% ตามล าดบ ดงแสดงผลในตาราง 24, 26, 27 และ 28 และผลการวเคราะหระหวางวนทความเขมขนของพรกาบาลนเทากบ 20, 60, 5000 และ 7500 นาโนกรมตอมลลลตร มคา %Recovery เทากบ 101.86, 99.62, 98.25 และ99.56% ซงผานตามเกณฑการยอมรบ (เกณฑก าหนดวาคา %Recovery ตองอยในชวง 85-115% ยกเวนทความเขมขน LLOQ ตองอยในชวง 80-120%) ดงแสดงในตาราง 25 และ 29

ความเทยงตรงของการวเคราะหพรกาบาลนในพลาสมาแสดงดวยคาสมประสทธความแปรปรวน (Coefficient of variation; CV) พบวา %CV ของพรกาบาลนในพลาสมาส าหรบการวเคราะหในวนเดยวกน ( Intraday precision) เปนจ านวน 3 วนทความเขมขนของพรกาบาลนเทากบ 20, 60, 5000 และ 7500 นาโนกรมตอมลลลตร โดยมคา %CV ของแตละความเขมขนอยในชวง 2.48-5.41%, 2.57-3.57%, 0.22-1.17% และ 0.73-1.28% ดงแสดงในตาราง 24, 26, 27 และ 28 และผลการวเคราะหระหวางวน (Between-day precision) ทความเขมขนของพรกาบาลนเทากบ 20, 60, 5000 และ 7500 นาโนกรมตอมลลลตร มคา %CV เทากบ 5.19%, 4.57%, 1.84% และ 2.97% ซงผานตามเกณฑการยอมรบ (ก าหนดคา %CV ตองอยในชวง ±15 % ยกเวนทความเขมขน LLOQ ตองอยในชวง ±20 %) ดงแสดงในตาราง 25 และ 29

ตาราง 24 แสดงคาความถกตองและความเทยงตรงของการวเคราะหพรกาบาลนทความเขมขน 20

นาโนกรมตอมลลลตร (LLOQ) ในพลาสมา (n=15) ในวนเดยวกน เปนจ านวน 3 วน

Within-day accuracy and precision of LLOQ Parameter Day 1 Day 2 Day 3

Measured value

%Recovery Measured value

%Recovery Measured value

%Recovery

Mean 19.874 99.37 19.866 99.33 21.378 106.89

SD 0.76 3.81 1.08 5.38 0.53 2.65

CV% 3.84 3.84 5.41 5.41 2.48 2.48

59

ตาราง 25 แสดงคาความถกตองและความเทยงตรงของการวเคราะหพรกาบาลนทความเขมขน 20 นาโนกรมตอมลลลตร (LLOQ) ในพลาสมา (n=15) ในระหวางวน เปนจ านวน 3 วน

Parameter Between-day accuracy and precision of LLOQ

Measured value %Recovery

Mean 20.373 101.86

SD 1.06 5.29

CV% 5.19 5.19

ตาราง 26 แสดงคาความถกตองและความเทยงตรงของการวเคราะหพรกาบาลนทความเขมขน 60

นาโนกรมตอมลลลตร (Low quality control) ในพลาสมา (n=5) ในวนเดยวกน เปนจ านวน 3 วน

Within-day accuracy and precision of Low

Parameter Day 1 Day 2 Day 3 Measured

value %Recovery Measured


value %Recovery

Mean 58.318 97.20 62.682 104.47 58.314 97.19

SD 2.08 3.47 1.90 3.16 1.50 2.50

CV% 3.57 3.57 3.03 3.03 2.57 2.57

60

ตาราง 27 แสดงคาความถกตองและความเทยงตรงของการวเคราะหพรกาบาลนทความเขมขน 5000 นาโนกรมตอมลลลตร (Medium quality control) ในพลาสมา (n=5) ในวนเดยวกนเปนจ านวน 3 วน

Within-day accuracy and precision of Medium




value %Recovery

Mean 4813.742 96.27 4911.842 98.24 5011.590 100.23

SD 24.07 0.48 57.44 1.15 11.21 0.22 CV% 0.50 0.50 1.17 1.17 0.22 0.22

ตาราง 28 แสดงคาความถกตองและความเทยงตรงของการวเคราะหพรกาบาลนทความเขมขน

7500 นาโนกรมตอมลลลตร (High quality control) ในพลาสมา (n=5) ในวนเดยวกน เปนจ านวน 3 วน

Within-day accuracy and precision of High




value %Recovery

Mean 7189.924 95.87 7541.552 100.55 7669.178 102.26

SD 52.40 0.70 96.82 1.29 74.20 0.99 CV% 0.73 0.73 1.28 1.28 0.97 0.97

61

ตาราง 29 แสดงคาความถกตองและความเทยงตรงของการวเคราะหพรกาบาลนทความเขมขน 60, 5000 และ 7500 นาโนกรมตอมลลลตร ในพลาสมา (n=15) ในระหวางวน เปนจ านวน 3 วน

Between-day accuracy and precision of pregabalin (ng/ml)

Parameter 60 5000 7500 Measured



value %Recovery

Mean 59.771 99.62 4912.391 98.25 7466.885 99.56

SD 2.73 4.55 90.19 1.80 221.44 2.95

CV% 4.57 4.57 1.84 1.83 2.97 2.96

4.5 ศกษาประสทธภาพของการสกด (Recovery) ประสทธภาพของการสกดพรกาบาลนและกาบาเพนตนในพลาสมาแสดงดวยคา รอยละการกลบคน (%Recovery) พบวา %Recovery ของการสกดพรกาบาลนทความเขมขนตางๆ มคาอยในชวง 94.76-103.57% และคา %Recovery ของการสกดกาบาเพนตนมคาเทากบ 101.6% ผลการทดลองแสดงดงตาราง 30 และ 31 ตามล าดบ ตาราง 30 แสดงคา %Recovery ของการสกดพรกาบาลนทความเขมขน 60, 5000 และ 7500 นาโนกรมตอมลลลตร ในพลาสมา (n=5) Concentration

of PGB (ng/ml)

Area under the curve (mean±SD) In plasma %RSD In solution %RSD %Recovery

60

26675.20±1152.42

4.32

25755.20±396.15 1.54 103.57

5000 2256761.00±20203.05 0.90 2301116.00±30290.05 1.32 98.07 7500 3422757.20±100914.32 2.95 3611992.60±55107.12 1.53 94.76

62

ตาราง 31 แสดงคา %Recovery ของการสกดกาบาเพนตน 75 ไมโครกรมตอมลลลตร ในพลาสมา Concentration

of GB (ng/ml)

Area under the curve (mean±SD) In plasma %RSD In solution %RSD %Recovery

75 1794125.00±58886.40 3.28 1765043.40±23012.14 1.30 101.65

4.6 การศกษาความคงตว (Stability) 4.6.1 การศกษาความคงตวของอนพนธ (Post-preparative stability) การศกษาความคงตวของอนพนธทเกดขนสามารถหาไดจากการเปรยบเทยบระหวางความเขมขนของสารทเตรยมขนแลวท าการตรวจวดทนท (T = 0) กบสารเดมทตงทงไวในเครองฉดสารอตโนมตทอณหภม 20 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง (T = 48) แลวค านวณคารอยละการเปลยนแปลงทเกดขน ผลการทดลองแสดงดงตาราง 32 ซงเมอตงสารอนพนธทงไวในเครองฉดสารอตโนมตเปนเวลา 48 ชวโมง ทอณหภม 20 องศาเซลเซยส แลวน ามาวเคราะหเพอค านวณคารอยละการเปลยนแปลง พบวาความเขมขนของพรกาบาลนท 60 นาโนกรมตอมลลลตร และ 7500 นาโนกรมตอมลลลตร มคารอยละการเปลยนแปลง เทากบ -3.49 และ 0.70% ตามล าดบ โดยผลการทดลองทไดผานเกณฑการยอมรบทก าหนดวาความเขมขนทวเคราะหไดตองมคารอยละการเปลยนแปลงไมเกน ± 15 %

63

ตาราง 32 แสดงรอยละการเปลยนแปลงความเขมขนของพรกาบาลนทเวลาเรมตนของการเตรยม และเมอตงทงไวในเครองฉดสารอตโนมตเปนเวลา 48 ชวโมง ทอณหภม 20 องศาเซลเซยส

ความเขมขนของ

พรกาบาลน (ng/ml) ตวอยางท ความเขมขนของพรกาบาลนทวดได

(ng/ml) %Change

T = 0 hour T = 48 hour 1 57.85 56.66

60 2 59.48 57.59 3 59.40 56.31 Mean ± SD 58.91 ± 0.92 56.85 ± 0.66 -3.49 %RSD 1.56 1.16 1 7238.96 7271.69

7500 2 7171.39 7212.03 3 7248.69 7327.96 Mean ± SD 7219.68 ± 42.10 7270.56 ± 57.97 0.70

%RSD 0.58 0.80

4.6.2 การศกษาความคงตวของสารละลายมาตรฐาน (Stock standard stability) การศกษาความคงตวของสารละลายมาตรฐานพรกาบาลนและกาบาเพนตนทจดเกบไวในอณหภม 4 องศาเซลเซยส แลวน ามาวเคราะหเพอศกษาความคงตวทกๆ1 สปดาหเปนเวลา 1 เดอน สามารถแสดงไดจากการวเคราะหเปรยบเทยบพนทใตพคของ Stock solution ทเกบไวกบพนทใตพคของ Stock solution ทวเคราะหในเวลาเรมตนของการเตรยม (แทนดวย T initial) ผลการทดลองแสดงไดดงตาราง 33 เมอเกบสารมาตรฐานในอณหภมทก าหนด แลวน ามาวเคราะหทกๆ 1 สปดาห พบวาพนทใตพคของพรกาบาลนในสปดาหท 2, 3 และ 4 มคาการเปลยนแปลงเทากบ -2.78, -1.25 และ -1.52% ตามล าดบ และพนทใตพคของกาบาเพนตนในสปดาหท 2, 3 และ 4 มคาการเปลยนแปลงเทากบ -0.37, 2.26 และ -0.56% ตามล าดบ ซงผานเกณฑการยอมรบทก าหนดวาคาการเปลยนแปลงพนทใตพคของ Stock solution ตองไมเกน ±5%

64

ตาราง 33 แสดงรอยละการเปลยนแปลงพนทใตพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนทเวลาตางๆ ความเขมขน ตวอยางท พนทใตพค ของสาร T initial Week 2 Week 3 Week 4

พรกาบาลน 5000 ng/ml

1 2322063 2266151 2298384 2313056

2 2361211 2271110 2308406 2279588 3 2296009 2247839 2285114 2280429

Mean 2326428 2261700 2297301 2291024 SD 32819.40 12257.38 11683.68 19084.62 %RSD 1.41 0.54 0.51 0.83

%Change - -2.78 -1.25 -1.52 กาบาเพนตน

75 µg/ml 1 1706740 1733051 1780193 1757251 2 1732914 1751181 1771749 1696438 3 1758336 1694662 1763707 1715297

Mean 1732663 1726298 1771883 1722995 SD 25798.91 28858.30 8243.82 31128.82 %RSD 1.49 1.67 0.47 1.81 %Change - -0.37 2.26 -0.56

4.6.3 การศกษาความคงตวตอการแชแขง-ละลาย (Freeze & Thaw stability) ของพรกาบาลนในพลาสมา การศกษาความคงตวของพรกาบาลนในพลาสมาทถกเกบทอณหภม -70 องศาเซลเซยส ใหเกดการแขงตวเปนเวลา 24 ชวโมง และน าออกมาตงทงไวทอณหภมหองใหเกดการละลาย (เทากบ 1 รอบ) โดยท าการแชแขง-ละลายเปนจ านวน 3 รอบ สามารถศกษาความคงตวไดจากการเปรยบเทยบระหวางความเขมขนของพรกาบาลนในพลาสมาท เวลาเรมตนของการเตรยม (T initial) กบเมอท าการแชแขง-ละลายตวอยางเปนจ านวน 3 รอบ (Cycle 3) แลวค านวณคารอยละการเปลยนแปลงทเกดขน ผลการทดลองแสดงไดดงตาราง 34 เมอน าพรกาบาลนเตมลงในพลาสมาแลวน ามาวเคราะหเพอศกษาความคงตวของพรกาบาลนโดยการน าตวอยางพลาสมาทเตรยมผานการแชแขง-ละลายเปนจ านวน 3 รอบ ผลการทดลองพบวาคารอยละการเปลยนแปลงความเขมขนของพรกาบาลนท 60 และ 7500 นาโนกรมตอมลลลตร เทากบ 0.45 % และ 3.55 % ตามล าดบ

65

โดยผลการทดลองทไดผานเกณฑการยอมรบทก าหนดวาความเขมขนทวเคราะหไดตองมคารอยละการเปลยนแปลงไมเกน ±15 % ตาราง 34 แสดงรอยละการเปลยนแปลงความเขมขนของพรกาบาลนในพลาสมาทผานการแชแขง-

ละลายเปนจ านวน 3 รอบ

ความเขมขนของ พรกาบาลน (ng/ml)

ตวอยางท ความเขมขนของพรกาบาลนทวดได (ng/ml)

%Change

T initial Cycle 3 1 62.41 63.49 2 57.62 64.95

60 3 66.38 58.80 Mean 62.14 62.41 0.45

SD 4.39 3.21 %RSD 7.06 5.15

1 6624.50 7122.60 2 6982.36 7011.63

7500 3 6620.32 6811.17 Mean 6742.39 6981.80 3.55

SD 207.83 157.84 %RSD 3.08 2.26

4.6.4 การศกษาความคงตวในระยะสน (Short term stability) ของพรกาบาลนในพลาสมา การศกษาความคงตวของพรกาบาลนในพลาสมาทเตรยมขน โดยการน าตวอยางทเกบไวทอณหภม-70 องศาเซลเซยส มาละลายจนเปนของเหลวนบเปนเวลาท 0 ชวโมง แลวจงน าไปผานขบวนการสกดและวเคราะห โดยตวอยางทเหลอใหตงทงไวทอณหภมหองตอไปจบครบ 3 และ 6 ชวโมงแลวจงผานขบวนการสกดและวเคราะหเชนเดยวกน ค านวณหาคาการเปลยนแปลงโดยเปรยบเทยบกบความเขมขนทวดไดของเวลา 0, 3 และ 6 ชวโมง กบความเขมขน

66

ของตวอยางทเตรยมขนใหม (T initial) ผลการทดลองทไดแสดงดงตาราง 35 พบวารอยละการเปลยนแปลงความเขมขนของพรกาบาลน 60 นาโนกรมตอมลลลตร ทตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 0, 3 และ6 ชวโมง มคาเทากบ -7.02, -5.14 และ -3.28% ตามล าดบ และรอยละการเปลยน แปลงความเขมขนของพรกาบาลน 7500 นาโนกรมตอมลลลตร เปนเวลา 0, 3 และ 6 ชวโมง มคาเทากบ 2.19, 3.92 และ 2.11% ตามล าดบ โดยผลการทดลองทไดผานเกณฑการยอมรบทก าหนดวาความเขมขนทวเคราะหไดตองมคารอยละการเปลยนแปลงไมเกน ±15 % ตาราง 35 แสดงรอยละการเปลยนแปลงความเขมขนของพรกาบาลนในพลาสมาทตงทงไวท

อณหภมหองเปนเวลา 0, 3 และ 6 ชวโมง

ความเขมขนของ พรกาบาลน (ng/ml)

ตวอยางท ความเขมขนของพรกาบาลนทวดได (ng/ml)

T initial 0 hour 3 hour 6 hour 60

1 62.41 60.41 59.25 62.33 2 57.62 55.40 62.05 60.26 3 66.38 57.51 55.52 57.70

Mean 62.14 57.77 58.94 60.10 SD 4.39 2.52 3.28 2.32

%RSD 7.06 4.35 5.56 3.86

%Change - -7.02 -5.14 -3.28

1 6624.50 6981.26 7039.23 6986.30

2 6982.36 6896.40 7032.56 6890.75 7500 3 6620.32 6792.49 6948.05 6777.10

Mean 6742.39 6890.05 7006.61 6884.72

SD 207.83 94.55 50.83 104.73 %RSD 3.08 1.37 0.73 1.52

%Change - 2.19 3.92 2.11

บทท 5 สรปผลการวจย อภปรายและขอเสนอแนะ

1. สรปผลการวจย และอภปรายผลการทดลอง งานวจยนเสนอวธการวเคราะหปรมาณพรกาบาลนในตวอยางพลาสมา มกาบาเพนตนเปนสารมาตรฐานภายในตรวจวดดวยตวตรวจวดฟลออเรสเซนต ในการวเคราะหปรมาณ พรกาบาลนจะอาศยการเกดปฏกรยากบ NBD-Cl ภายใตสภาวะทเปนเบส จากนนท าการแยกสารผสมและตวรบกวนออกจากกนโดยใชเทคนค HPLC และตรวจวดความเขมขนของสารอนพนธทเกดขนดวยตวตรวจวดฟลออเรสเซนตโดยงานวจยนไดท าการศกษาหวขอตางๆ ดงตอไปน

1. ศกษาสภาวะของเฟสเคลอนททเหมาะสมในการวเคราะหไดแก ชนดของเฟสเคลอนท, ความเขมขนของ Phosphate buffer, พเอชของเฟสเคลอนทและอตราสวนของเฟสเคลอนท ซงพบวาสภาวะของการแยกทพฒนาขนในงานวจยนสามารถวเคราะหตวอยางไดจ าเพาะเจาะจงเนองจากใชตวตรวจวดฟลออเรสเซนตและสามารถวเคราะหตวอยางไดภายใน 11 นาท ซงถอวาเปนระยะเวลาทสนส าหรบการวเคราะหตวอยางพลาสมา (Retention time ของพรกาบาลนและ กาบาเพนตนประมาณ 8.0 และ 9.2 นาท ตามล าดบ) โดยใชองคประกอบของเฟสเคลอนทในการแยกสารเพยง 2 ชนดเทานน ซงเปนการประหยดสารเคมเพราะไมตองใชตวท าละลายอนทรยหลายชนดรวมถงใชความเขมขนของ Phosphate buffer ต า ลดปญหาการอดตนของเครองมอวเคราะหและคอลมน ดงนนจงสรปไดวาสภาวะทพฒนาขนมขอดเมอเปรยบเทยบกบงานวจยทเคยมการวเคราะหพรกาบาลนโดยใชเทคนค HPLC ไดแก กจรล; แฮกค; และคมาร (Gujral; Haque; & Kumar. 2009: 327-334) ตรวจวดพรกาบาลนโดย UV detector ใชเฟสเคลอนทเปน MeOH : ACN : 20 มลลโมลาร K2HPO4 ซงยงเปนวธวเคราะหทใหความไวในการวเคราะหต าและตองใชเฟสเคลอนท 3 ชนดในการแยก เวอเมจ; และ อเดลโบรค (Vermeij; & Edelbroek. 2004: 297-303) ใชเฟสเคลอนทเปน MeOH : ACN : 20 มลลโมลาร Phosphate buffer เวลาในการวเคราะห 25 นาทตอ 1 ตวอยางซงเปนวธทใชเวลาในการวเคราะหนานและตองใชเฟสเคลอนทในการแยกสารหลายชนด ดอเซ; กบาลา; และเอลเมอ (Dousa; gibala; & Lemr. 2010: 717-722) ใชวธการแยกแบบ Post-column derivatization โดยใชเวลาในการวเคราะห 15นาท ซงวธนตองเพมขนตอนการหาสภาวะทเหมาะสมเพอใหพรกาบาลนกบสาร Derivatizing agent เกดปฏกรยาไดอยางสมบรณใน Capillary coil กอนท าการตรวจวดและเวลาในการวเคราะหนานกวาวธทพฒนาขน 2. ศกษาการสกดพรกาบาลนออกจากตวอยางพลาสมาดวยวธการตกตะกอนโปรตน โดยศกษาชนดและปรมาณสารทใชในการตกตะกอนโปรตน ซงผลการทดลองพบวาคา %Recovery ของการสกดมคา 94.76-103.57% โดยทผลการวเคราะหซ าใหคา CV นอยกวา 5% ซงพบวาผลของ %Recovery และ %CV ของวธทพฒนาขนดกวาเมอเปรยบเทยบกบงานวจยทเคยศกษาการ

68

สกดพรกาบาลนในตวอยางพลาสมา ไดแก เมนเดล; และคนอนๆ (Mandal; et al. 2008: 237-243) ไดคา %Recovery อยในชวง 80.45-89.12% และ %CV มากกวา 6% เวยดยา; และคนอนๆ (Vaidya; et al. 2007: 925-928) ไดคา %Recovery เฉลยเทากบ 69.99 % และ%CV มากกวา 5%แทง; และคนอนๆ (Tang; et al. 1999: 125-129) ไดคา %Recovery อยในชวง 96.2-103.9% และ %CV มากกวา 5%

3. ศกษาสภาวะทเหมาะสมในการเกดอนพนธระหวางพรกาบาลนกบ NBD-Cl เนองจาก พรกาบาลนไมสามารถตรวจวดไดดวยตวตรวจวดฟลออเรสเซนต จงตองท าใหเกดเปนอนพนธโดยใชสาร NBD-Cl เพอใหสามารถตรวจวดไดและมความไวในการวเคราะหสง จากการศกษาขอมลยอนหลงพบวาเคยมการพฒนาวธวเคราะหพรกาบาลนโดยใช NBD-Cl เปน Derivatizing agent เพยง 1 รายงานโดย โอนอล; และ แซกกรล (Onal; & Sagirli. 2009: 68-71) วเคราะหดวยเทคนค Spectrofluorometry และ Spectrophotometry แตเทคนคนไมเหมาะสมส าหรบน ามาใชในการวเคราะหตวอยางพลาสมาเพอศกษาชวสมมลหรอ Pharmacokinetic จงไดดดแปลงวธการหาสภาวะทเหมาะสมในการเกดอนพนธของวธดงกลาวมาประยกตใชกบการวเคราะหพรกาบาลนในตวอยางพลาสมาและพฒนาใหดขนโดยท าการศกษาปรมาณ NBD-Cl, พเอชทใชในการท าปฏกรยา, เวลาทใชในการท าปฏกรยาและความเขมขนของกรดไฮโดรคลอรกทใชในการหยดปฏกรยา ซงจากผลการทดลองพบวาวธทพฒนาขนสามารถใหความไวในการวเคราะหสงและอนพนธทไดมความคงตวนานกวาวธเดม (20 นาโนกรมตอมลลลตร เปรยบเทยบกบวธเดมคอ 40 นาโนกรมตอมลลลตร และอนพนธมความคงตวอยางนอย 48 ชวโมง เปรยบเทยบกบวธเดมคอ 12 ชวโมง) และในการเตรยมตวอยางไมตองผานขนตอนการสกดสารอนพนธดวยคลอโรฟอรม 4. การตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะหทพฒนาขนตามเกณฑการยอมรบของ US FDA guideline และ EMEA guideline พบวาผานเกณฑการยอมรบทกหวขอ

การศกษางานวจยนสามารถอธบายผลการทดลองในแตละหวขอไดดงน การศกษาผลของเฟสเคลอนททเหมาะสมในการวเคราะหพรกาบาลน พบวาเฟส

เคลอนททเหมาะสมคอ สารผสมระหวาง ACN กบ KH2PO4 ความเขมขน 10 มลลโมลารทปรบ พเอชเทากบ 2.5 โดยอตราสวนของเฟสเคลอนท เทากบ 50 : 50 โดยปรมาตร ซงสภาวะของเฟสเคลอนทดงกลาวสงผลใหคาพารามเตอร ไดแก Retention time, Resolution, Tailing factor และ Theoretical plate มคาผานเกณฑการยอมรบและเหมาะสมในการวเคราะหพรกาบาลนซงสามารถ อธบายไดดงน

เนองจากตวอยางทตองการวเคราะหในงานวจยนเปนสารทมขว ดงนนจงแยกสารดวย HPLC แบบวฏภาคผนกลบ (Reverse phase HPLC) ซงระบบนตองใชเฟสเคลอนทเปนสารทมขว ดงนนจงท าการศกษาชนดของเฟสเคลอนททมขวผสมกบเฟสเคลอนทเปนตวท าละลายอนทรย ซงเฟสเคลอนททมขวทท าการศกษา ไดแก น าและ Phosphate buffer ชนดตางๆ ผลการทดลองพบวาการใช Phosphate buffer สามารถพาสารตวอยางออกจากคอลมนและเกดการแยก

69

ไดดกวาการใชน า และการศกษาชนดของ Phosphate buffer แตละชนดพบวาสามารถพาสารออกจากคอลมนไดดไมแตกตางกน ซงชนดของ Phosphate buffer ทเหมาะสมตอการแยกพรกาบาลนในพลาสมาไดดทสด คอ KH2PO4 สวนการศกษาชนดของเฟสเคลอนททเปนตวท าละลายอนทรยไดแก ACN กบ MeOH พบวา MeOH ไมสามารถพาสารตวอยางออกจากคอลมนไดภายในระยะเวลา 10 นาท และในการใช MeOH ยงสงผลใหเครอง HPLC มความดนสงเมอเปรยบเทยบ กบ ACN ทอตราการไหลเดยวกนดงนนจงเลอกใช ACN กบ KH2PO4 เปนเฟสเคลอนททเหมาะสมเนองจากมความสามารถในการพาสารพรกาบาลนและกาบาเพนตนออกจากคอลมนไดดวยการวเคราะหแบบ Isocratic elution โดยใชสารเพยง 2 ชนดเทานน ซงสารทง 2 ชนดนไมมผลรบกวนการวเคราะหเนองจากไมดดกลนแสงทความยาวคลนทใชในการวเคราะห ความเขมขนของ Phosphate buffer ท 10 มลลโมลาร มความเหมาะสมเนองจากความเขมขนดงกลาวสามารถแยกสารผสมออกจากไดอยางชดเจน โดยทความเขมขนนอยกวานพบวาฐานพคของพรกาบาลนกบกาบาเพนตนยงซอนทบกนอยและความเขมขนมากกวาน การแยกพคของพรกาบาลนกบกาบาเพนตนไดผลไมแตกตางกน ดงนนจงเลอกความเขมขนของ Phosphate buffer ท 10 มลลโมลาร เนองจากสามารถแยกสารผสมออกจากกนไดอยางชดเจน และเปนการประหยดสารเคมทใช นอกจากนยงสามารถชวยลดปญหาการอดตนของเกลอฟอสเฟตในสวนตางๆ ของเครองมอวเคราะหและคอลมนไดอกดวย

พเอชของเฟสเคลอนทมผลตอการแยกของพค โดยจากการทดลองการเพมพเอชจากต าไปสงมผลท าใหพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนมแนวโนมเคลอนทออกจากคอลมนไดเรวขนเรอยๆ โดยทพเอชมากกวา 4 สารเคลอนทออกจากคอลมนเรวมากจนไมเกดการแยกของพค จากผลการศกษาพบวาในโครงสรางของตวอยางอนพนธมหม Carboxylic (-COOH) ซงมคาคงทของการแตกตว (pKa) เทากบ 4.2 สงผลใหทพเอชเทากบหรอมากกวา 4 สารเกดการแตกตวเคลอนทออกจากคอลมนไดเรว สงผลใหพคเกดการแยกไดไมด ซงแสดงไดจากคา Resolution นอยกวา 2 ดงนนจงเลอกพเอชของเฟสเคลอนทเทากบ 2.5 เนองจากสามารถแยกพคของสารแตละพคออกจากกนไดอยางชดเจน ซงสามารถอธบายไดวา ทพเอช 2.5 จะชวยลดการแตกตวของสารตวอยางท าใหสารสามารถเกดอนตรกรยา (Interaction) กบเฟสอยกบทมากขน

อตราสวนของเฟสเคลอนทมผลตอพนทใตพคของสารทถกชะออกจากคอลมน , Retention time และการแยกของพค จากผลการศกษาพบวาทอตราสวนของ ACN จากต าไปสง สารทงสองชนดมแนวโนมเคลอนทออกจากคอลมนไดเรวและพนทใตพคของสารสงขน โดยทอตราสวนของ ACN สงท าใหสารเกดการแยกไดนอยลง สามารถอธบายไดวาการเพม ACN ท าใหระบบของเฟสเคลอนทมความสามารถในการกดการแตกตวของสารตวอยางไดนอยลง เนองจากอตราสวนของ Phosphate buffer ลดลง นอกจากน ACN เมอเขาสระบบจะไปเกาะทแขนของ C18

ท าใหหมทไมมขวในโครงสรางของสารตวอยางไมมแขนทจะยดเกาะกบ Silanol group จงท าใหหลดออกมาไดเรวและสญญาณในการวเคราะหกเพมสงขนตามปรมาณของ ACN ทเพมมากขน

70

ดงนนจงเลอกอตราสวนของเฟสเคลอนทระหวาง ACN กบ KH2PO4 เทากบ 50 : 50 โดยปรมาตร เนองจากใหสญญาณในการวเคราะหสงและสามารถแยกพคของสารแตละพคออกจากกนไดอยางชดเจน การศกษาการสกดยาพรกาบาลนออกจากตวอยางพลาสมาดวยวธการตกตะกอนโปรตนพบวาชนดของสารทใชในการตกตะกอนโปรตนทเหมาะสม คอ ACN โดยใชอตราสวนของพลาสมาตอ ACN เทากบ 1 : 2.5 โดยปรมาตร เพราะปรมาณดงกลาวเพยงพอทจะก าจดโปรตนไมใหเกดการอดตนในคอลมนได, ใหผลการสกดซ าทแมนย าทสดและสญญาณในการวเคราะหไมต าเกนไป โดยสามารถอธบายไดดงน เนองจาก ACN สามารถตกตะกอนโปรตนไดดทสดซงแสดงไดจากสารละลายทไดหลงจากการตกตะกอนโปรตนมความใสกวาการใช MeOH และ 20%TCA เมอเปรยบเทยบในปรมาณทเทากนและเมอฉดสารเขาเครอง HPLCไมพบสารรบกวนการวเคราะห แตการใช MeOH สกดพบสารรบกวนทต าแหนงใกลเคยงกบพคของพรกาบาลนจงสงผลใหการวเคราะหไมถกตอง ซงการท ACN สามารถตกตะกอนโปรตนไดดกวา MeOH สามารถอธบายไดโดย ACN มคาคงทไดอเลคตรคนอยกวา MeOH จงสามารถลดคาการละลายระหวางน ากบโปรตนไดดกวา โดยเมอเพมปรมาณของ ACN มากขนเรอยๆ จนถงจดทแรงกระท าระหวางโมเลกลของโปรตนมคาสงกวาแรงกระท าระหวางโปรตนกบน าจงท าใหเกดการรวมตวกนของโมเลกลโปรตนตกตะกอนลงมาได สวนการใช TCA สามารถตกตะกอนโปรตนได โดยใชหลกการทวาในสภาวะทเปนกรด โปรตนจะมประจเปนบวก จงสามารถจบกบประจลบของโมเลกลทเปนลบของสารละลาย TCA และตกตะกอนลงมาได ซงสารละลายทไดหลงการตกตะกอนไมเหมาะสมในการน าไปท าปฏกรยาตอได เพราะอนพนธจะเกดขนในสภาวะทเปนเบสเทานน การศกษาสภาวะทเหมาะสมในการเกดอนพนธระหวางพรกาบาลนกบ NBD-Cl พบวาปฏกรยาสามารถเกดขนได ดงแสดงในภาพประกอบ 23

NH2

COOH+

Cl

NO2

NO

N456 7

NH

COOH

NO2

NO

N

-HCl80 oC

PGB NBD-Cl

ภาพประกอบ 23 แสดงปฏกรยา Derivatization ระหวางพรกาบาลนกบ NBD-Cl

ภาพประกอบ 23 แสดงกลไกลการเกดปฏกรยาระหวางพรกาบาลนกบ NBD-Cl โดยเกดปฏกรยาแทนทดวยนวคลโอไฟด (Nucleophilic substitution) ในสภาวะเบส อนพนธทไดมสเขยวอมเหลองดงภาพประกอบ 24 ซงเกดโครงสรางทสามารถดดกลนแสดงฟลออเรสเซนตได

71

เนองจากโครงสรางของอนพนธทเกดขนมคณสมบต ดงน Conjugate double-bonds, Aromatic rings, Rigid planar structures และในโครงสรางไมมหม Quencher (-Cl) ซงเปนสาเหตทท าใหความเขมของแสงฟลออเรสเซนตลดลง

ภาพประกอบ 24 แสดงสของอนพนธทเกดขนเมอใหความรอนเปนเวลา 15 นาท (กอนหยดปฏกรยาดวย HCl )

โดยการเกดปฏกรยามขนตอนยอยอย 2 ขนตอน คอ

ขนตอนท 1 ในโครงสรางของพรกาบาลนมอะตอม N ในหม Primary amine ซงมอเลกตรอนคโดดเดยวสภาพขวเปนลบ และมความวองไวในการเกดปฏกรยาซงอะตอมไนโตรเจน(N) ท าหนาทเปนนวคลโอไฟดจะเกดปฏกรยาบรเวณคารบอนต าแหนงท 4 ในโครงสรางของ NBD-Cl ซงมสภาพขวเปนบวก

ขนตอนท 2 Cl ทตออยทคารบอนจะหลดออกไป เรยกหมนวา Leaving group ซงอนพนธทไดสามารถดดกลนแสง UV และสามารถ Fluorescence ได

จากผลการทดลองพบวาสภาวะทเหมาะสมในการเกดปฏกรยา ไดแก ความเขมขน NBD-Cl เทากบ 2.24 มลลกรมตอมลลลตร ซงความเขมขนดงกลาวสงผลใหเกดเปนสารอนพนธไดอยางสมบรณและใหสญญาณในการวเคราะหสง โดยทความเขมขนต ากวานสญญาณในการวเคราะหจะมคาต า เนองจากรเอเจนตไมเพยงพอตอการเกดปฏกรยา สงผลใหปฏกรยาเกดขนไมสมบรณ และความเขมขนสงกวานสญญาณของอนพนธทตรวจวดไดมแนวโนมคงท ดงนนจงเลอกความเขมขนของสาร NBD-Cl ท 2.24 มลลกรมตอมลลลตร เปนความเขมขนทเหมาะสมเนองจากใหสญญาณในการวเคราะหสงและเปนการประหยดรเอเจนตทใช ประหยดคาใชจายในการทดลอง การศกษาพเอชของสารละลาย Borate buffer ทใชในการควบคมสภาวะใหเปนเบสของระบบการเตรยมตวอยาง พบวาพเอชมผลตอสญญาณในการวเคราะห กลาวคอสญญาณจะมคา

72

เพมขนตามพเอชทสงขนตงแตในชวงพเอช 8 -11ซงหลงจากพเอชในชวงนเปนตนไป พบวาสญญาณในการวเคราะหมการเปลยนแปลงโดยมคาลดลง เนองจากในสภาวะทเปนเบสมากเกนไป NBD-Cl สามารถเกดการ Hydrolysis ไปเปน NBD-OH ได สงผลใหสญญาณในการวเคราะหลดลง ดงนนจงเลอกพเอช 11 เปนพเอชทเหมาะสมในการเกดปฏกรยาของสารอนพนธ ทงนเนองจากใหสญญาณในการวเคราะหสงทสด

การศกษาระยะเวลาทเหมาะสมในการเกดปฏกรยาโดยการตรวจวดสญญาณของอนพนธทเกดขนในชวงเวลา 25 นาท จากการสงเกตพบวาสารอนพนธทเกดขนในชวงเวลา 5-20 นาท มสญญาณทไดจากการวเคราะหเพมขนตามระยะเวลาทใชในการท าปฏกรยา และหลงจากระยะเวลาในชวงดงกลาวสญญาณทตรวจวดไดเรมคงท ในการทดลองเลอกใชระยะเวลาในการเกดปฏกรยา15 นาทเปนระยะเวลาทเหมาะสมเนองจากเปนชวงเวลาทสารอนพนธเกดขนไดสญญาณทสงโดยทใชระยะเวลาสนในการเตรยมตวอยาง ซงจากผลการทดลองทเวลา 20 นาท ใหสญญาณในการวเคราะหสงสด แตพบวาการใหความรอนทนานเกนไปสงผลตอความสะอาดของตวอยาง เนองจากโปรตนทเหลอในระบบเสยสภาพไดเมอไดรบความรอนทนานเกนไปสงผลตอการอดตนในสวนของเครองฉดสารอตโนมตได เพราะการสกดโดยใชวธการตกตะกอนโปรตนไมสามารถก าจดโปรตนออกจากตวอยางไดทงหมด ศกษาความเขมขนของกรดไฮโดรคลอลกทใชในการหยดปฏกรยาพบวาทความเขมขนของกรด 0.02 M เปนความเขมขนทเพยงพอส าหรบใชหยดปฏกรยาของพรกาบาลนและ กาบาเพนตนได ซงการหยดปฏกรยาศกษาไดจากการน าสญญาณของพรกาบาลนและกาบาเพนตนทเปลยนแปลงหลงจากการเตมกรดไฮโดรคลอลกแลวทงไวเปนระยะเวลา 1 ชวโมงเปรยบเทยบกบสญญาณเรมตน ซงสามารถอธบายไดโดยในสภาวะกรด รเอเจนต NBD-Cl ไมสามารถเกดปฏกรยากบพรกาบาลนไดเนองจากหม Primary amine (-NH2) ซงเปนเบสออน สามารถท าปฏกรยากบกรดแกอยาง HCl ไดเปนอยางด ไดผลตภณฑเปนเกลอทละลายน าได ดงสมการ RNH2 (l) + HCl (aq) RNH3

+Cl- (aq) โดยหาก NH2 จบกบ H+ จงไมท าปฏกรยากบคารบอนต าแหนงท 4 ในโครงสรางของ NBD-Cl

การตรวจสอบความใชไดของวธทพฒนาขนเพอยนยนวาวธดงกลาวสามารถน ามาใชวเคราะหปรมาณพรกาบาลนในพลาสมาไดอยางถกตอง ผลการทดสอบพบวาวธทพฒนาขนผานตามเกณฑการยอมรบของ US FDA guideline และ EMEA guideline โดยผลการทดลองในแตละพารามเตอรของหวขอการทดสอบสามารถอธบายไดดงน

การศกษาความจ าเพาะเจาะจงของวธวเคราะห โดยการทดสอบ Blank plasma จ านวน 6 ตวอยาง พบวาพคของพรกาบาลนและกาบาเพนตนไมถกรบกวนการวเคราะหดวยสารอนๆ ในพลาสมาทง 6 ตวอยาง ซงแสดงใหเหนวาวธทพฒนาขนมความจ าเพาะเจาะจงตอสารท

73

ตองการตรวจวด เนองจากตวตรวจวดเปนฟลออเรสเซนต มการเลอกทงความยาวคลน Excitation (ex) ส าหรบการเราอเลกตรอนและเลอกวดฟลออเรสเซนตทออกมาอกความยาวคลน Emission (em) ของแตละโมเลกลใหเหมาะสม ดงนนถาโมเลกลอนทถกเราและเกดฟลออเรสเซนตทคนละความยาวคลนกนกจะไมรบกวนการวเคราะห นอกจากนการใชเทคนคในการแยกสารดวย HPLCยงท าใหตวรบกวนในพสามาและสารทสนใจแยกออกจากกนไดด ไมสงผลรบกวนตอการวเคราะห

การศกษาความเขมขนต าสดของพรกาบาลนทสามารถน ามาใชในการวเคราะหปรมาณได (LLOQ) คอ 20 นาโนกรมตอมลลลตร ซงเปนความเขมขนทสามารถน ามาใชในการวเคราะหปรมาณไดอยางถกตองและแมนย า โดยใหอตราสวนของสญญาณระหวางสญญาณทตองการตรวจวดกบสญญาณรบกวน (S/N) เฉลย เทากบ 7.747 ± 0.50 มคา % RSD เทากบ 6.40% ซงมคา S/N มากกวา 5 ตามเกณฑการยอมรบ นอกจากนจะเหนไดวาวธนมความไวในการวเคราะหเนองจากใชตวอยางพลาสมาเพยง 200 ไมโครลตร ในการเตรยมตวอยาง และปรมาณสารทฉดเขาเครองใชเพยง 20 ไมโครลตร ซงเหมาะกบกรณทเกบตวอยางไดนอยซงปญหานมกเกดขนบอยในกรณเกบตวอยางเลอดจากมนษย

การศกษาความเปนเสนตรงของพรกาบาลนในพลาสมาในชวงความเขมขน 20-10,000 นาโนกรมตอมลลลตร พบวามคา Coefficient of deyermination (R2) เฉลยเทากบ 1 เมอท าการวเคราะหจากกราฟมาตรฐาน 5 กราฟตางวนกน ซงแสดงถงความเปนเสนตรงทด สามารถน ามาใชเทยบเพอหาความเขมขนของตวอยางไดอยางถกตอง และเมอน าผลทไดมาค านวณยอนกลบเพอหาคารอยละการกลบคนของแตละจดความเขมขนของกราฟมาตรฐานพบวาอยในชวงรอยละ 96.82-103.89 ซงคาทไดอยในเกณฑการยอมรบ คอ ±15% ทงนจะเหนไดวากราฟมาตรฐานมชวงความเขมขนทกวางเพอแสดงใหเหนวาสามารถน าวธทพฒนาขนไปใชในการวเคราะหตวอยางทไดรบยาในชวงขนาดยาทหลากหลาย ซงยาพรกาบาลนในรปแบบยาแคปซลทมขายในทองตลาดมขนาดตงแต 25-300 มลลกรม การน าวธนไปใชในการวเคราะหตวอยางจรง สามารถเลอกบางชวงของกราฟมาตรฐานทเหมาะสมกบความเขมขนของตวอยางจรงไปใชในการวเคราะหได

ความแมนย าและความถกตองของวธวเคราะหสามารถแสดงไดในรปของ %CV และ %Recovery ตามล าดบ จากการทดสอบความแมนย าและความถกตองของวธ ว เคราะห พรกาบาลนทความเขมขน 20, 60, 5,000 และ 7,500 นาโนกรมตอมลลลตร ภายในวนเดยวกนและระหวางวน พบวาผลการวเคราะหซ ากนหลายๆ ครง แสดงคาความแตกตางของขอมลไมเกน 6% และแสดงคาความถกตองของการวเคราะหอยในชวง 95.87-106.89% ซงแสดงใหเหนวาวธวเคราะหทพฒนาขนมความถกตองและแมนย าสง อยในเกณฑการยอมรบตามมาตรฐาน การศกษาประสทธภาพการสกดพบวาวธการสกดทใชสามารถสกดพรกาบาลนและกาบาเพนตนออกมาจากพลาสมาไดดมากโดยมคา %Recovery อยในชวง 94.76-103.57% และสามารถท าซ าไดอยางแมนย าซงใหคา %RSD ไมเกน 5%

74

การศกษาความคงตวของพรกาบาลนทงในรปแบบสารละลาย คอการศกษาความคงตวของสารละลายมาตรฐานพรกาบาลนและกาบาเพนตน การศกษาความคงตวของตวอยาง พรกาบาลนในพลาสมาทถกเตรยมขนเพอทดสอบความคงตวตอการแชแขง-ละลาย และความคงตวในระยะสนเมอตงทงไวทอณหภมหอง รวมทงการศกษาความคงตวของอนพนธทเกดขน สามารถอธบายผลการทดลองไดดงน

ผลการศกษาความคงตวของสารละลายมาตรฐานพรกาบาลนและกาบาเพนตน พบวาเมอเกบสารมาตรฐานทงสองชนดทอณหภม 4 องศาเซยลเซยส เปนระยะเวลา 1 เดอน ไดคารอยละการเปลยนแปลงไมเกน 3%ซงแสดงใหเหนวาสารทงสองชนดมความคงตวเมอเกบไวทอณหภม 4 องศาเซยลเซยส แมจะผานการเตรยมมาแลวเปนระยะเวลา 1 เดอน ผลการศกษาความคงตวตอการแชแขง-ละลายของพรกาบาลนในพลาสมา พบวามคารอยละการเปลยนแปลงความเขมขนของพรกาบาลนท 60 และ 7500 นาโนกรมตอมลลลตร เทากบ 0.45% และ 3.55% ตามล าดบ ซงแสดงใหเหนวาแมวาตวอยางพรกาบาลนในพลาสมาจะถกเปลยนแปลงสภาวะใหเกดการแชแขง-ละลาย 3 รอบ กไมมผลตอการสลายตวของ พรกาบาลน ดงนนในทางปฏบตเมอน าตวอยางจรงมาใชในการวเคราะหกสามารถน าตวอยางแชแขง-ละลายได 3 รอบโดยไมท าใหตวอยางเสยความคงตว ผลการศกษาความคงตวของพรกาบาลนในพลาสมาเมอน าตวอยางทถกแชแขงทอณหภม -70 องศาเซลเซยส ออกมาตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 6 ชวโมง พบวาคารอยละการเปลยนแปลงความเขมขนของพรกาบาลนท 60 และ 7500 นาโนกรมตอมลลลตร อยในชวง -7.02 ถง 3.92% ดงนนในทางปฏบตสามารถน าตวอยางจรงมาใชในการวเคราะหแลวตงทงไวทอณภมหองเปนเวลา 6 ชวโมงไดโดยไมสงผลตอความเขมขนของพรกาบาลนในตวอยาง ผลการศกษาความคงตวของอนพนธทเกดขนเมอตงทงไวในเครองฉดสาร อตโนมตทอณหภม 20 องศาเซลเซยส เปนเวลา 48 ชวโมง พบวาความเขมขนของพรกาบาลนท 60 และ7500 นาโนกรมตอมลลลตรมคารอยละการเปลยนแปลงเทากบ-3.49 และ 0.70% ตามล าดบ ซงแสดงใหเหนวาอนพนธทเกดขนมความคงตวมาก ดงนนหากตองวเคราะหตวอยางจรงจ านวนมาก สารตวอยางทรอการวเคราะหยงสามารถวเคราะหไดอยางถกตองเนองจากไมเสยความคงตวหลงจากการเตรยมตวอยางมาแลว 2 วน การศกษางานวจยทพฒนาขนสามารถสรปไดวาการวเคราะหหาความเขมขนของ พรกาบาลนในพลาสมาดวยเทคนค HPLC เปนวธทงาย มความจ าเพาะและความไวในการวเคราะหด ถกตอง เทยงตรง มประสทธภาพในการสกดไมพบสารรบกวนทมอยในพลาสมาและอนพนธมความคงตว เหมาะกบการวเคราะหในตวอยางจ านวนมาก ซงวธทพฒนาขนไดผานการทดสอบความนาเชอถอของวธการวเคราะหตามมาตรฐาน US FDA guideline และ EMEA guideline ดงนนวธการวเคราะหน จงมความเหมาะสมและเชอถอได สามารถน ามาใชในการวเคราะห

75

พรกาบาลนในพลาสมาส าหรบการวเคราะหในตวอยางจรงเพอศกษาชวสมมลหรอการศกษา Pharmacokinetic ได 2. ขอเสนอแนะ

ส าหรบผสนใจพฒนาระบบดงกลาวในการวเคราะหพรกาบาลน ผท างานวจยมขอ เสนอแนะดงตอไปน 1. แนวทางในการพฒนาวธวเคราะหตอ ควรท าการศกษาความยาวคลนและอณหภมทเหมาะสมในการวเคราะหเพมเตม 2. ในการน าวธนไปใชในการวเคราะหตวอยางจรง ควรมการศกษา Matrix effect ในพลาสมาเพมเตมในตวอยางทเปน Hemolysis และ Hyperlipidemia เพอใหงานมความสมบรณมากขน 3. การน าวธทพฒนานไปใชวเคราะหในตวอยางจรงเพอศกษาชวสมมล ตองเลอกจดความเขมขนของกราฟมาตรฐานและชดตวอยางควบคมคณภาพทความเขมขนต า กลาง และสงใหเหมาะสม โดยตองค านงถงระดบความเขมขนของยาพรกาบาลนทอาสาสมครไดรบและความเขมขนสงสดของการดดซม (Cmax) 4. สามารถน าวธทพฒนาขนไปประยกตใชกบการวเคราะหพรกาบาลนในตวอยางอนๆ ไดแกวตถดบยา (Active pharmaceutical ingredients), ยาส าเรจรป (Finished products) หรอการวเคราะหระดบยาในตวอยางทเปนชววตถ (Biological fluid) เชน ซรมและปสสาวะ

76

บรรณานกรม

77

บรรณานกรม จรนนท ชยวาฤทธ. (2555). High Performance Liquid Chromatography (HPLC). สบคนเมอ 2 เมษายน 2556, จาก http://www.mfu.ac.th/center/stic/index.php/chemical-analysis- instrument-menu/item/126-high-performance-liquid-chromatography-hplc.html ชนกพร โปตบตร; และวระชย สมย. (2554). การพฒนาวธการสกดยานอนหลบและยารกษา

อาการซมเศราในพลาสมาโดยวธการ Solid-Phase Extraction. สบคนเมอ 2 เมษายน 2556, จาก http://www.sci.rmuti.ac.th/grad23rd/proceeding/Oral%20Paper/3095%

20pp%20293-299.pdf ชรนทร เตชะพนธ. (2542). การท าโปรตนใหบรสทธ. สบคนเมอ 2 เมษายน 2556, จาก http://20

2.28.24.44/e_books/protein/Book-lesson1.pdf ธญนนท พรายงาม. (2554, กรกฎาคม-กนยายน). Derivatization Methods in HPLC. วารสาร

เพอการวจยและพฒนาองคการเภสชกรรม. 18(3): 10-12. แมน อมรสทธ; และคนอนๆ. (2555). หลกการและเทคนคการวเคราะหเชงเครองมอ. พมพครงท

2. กรงเทพฯ: ชวนพมพ 50. หนา 397-405, 430-431, 435. ปณณวชย ชนอารมณ; และคนอนๆ. (2554). เอกสารประกอบการเรยนวชายาใหมและแนวคด

ใหม. สบคนเมอ 2 มกราคม 2556, จาก http://service.pharmacy.psu.ac.th/images/ stories/New%20drugs/595-501.pdf ศนยบรการเภสชกรรม คณะเภสชศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม . (2555). การศกษาชวสมมล.

สบคนเมอ 7 ธนวาคม 2555, จาก http://www.psc.pharmacy.cmu.ac.th/%E0%B8%B Abe-study/ เอกวรรณ อยสกล. (2556, กรกฎาคม-กนยายน). Bioanalytical Method Validation. วารสารเพอ

การวจยและพฒนาองคการเภสชกรรม. 20(3): 17-18. อสรยา เตชะธนะวฒน. (2552, เมษายน-มถนายน). การศกษาชวสมมลและการศกษาทางคลนก.

วารสารเพอการวจยและพฒนา องคการเภสชกรรม. 16(2): 11-13. Abdel, Rasha; & Shaalan, Aziz. (2010). Spectrofluorimetric and Spectrophotometric

Determination of Pregabalin in Capsules and Urine Samples. Journal of Biomedical Science. 6(3): 250-267.

American Red Cross. (2014). Blood Components. Retrieved January 20, 2014, from http://www.redcrossblood.org/learn-about-blood/blood-components

AOAC. (1990). Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 15th ed. Virginia modified. 1094.

http://www.mfu.ac.th/center/stic/index.php/chemical-analysis-

http://www.mfu.ac.th/center/stic/index.php/chemical-analysis-

http://202.28.24.44/e_books/protein/Book-lesson1.pdf

http://www.psc.pharmacy.cmu.ac.th/%E0%B8%BAbe-study/

http://www.redcrossblood.org/learn-about-blood/blood-components

78

Arain, Amir M. (2009). Pregabalin in the Management of Partial Epilepsy. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5: 407-413.

Bahrami, Gholamreza; & Mohammadi, Bahareh. (2006). Sensitive Microanalysis of Gabapentin by High-Performance Liquid Chromatography in Human Serum using Pre-column Derivatization with 4-Chloro-7-nitrobenzofurazan: Application to a Bioequivalence Study. Journal of Chromatography B. 837: 24-28.

Bali, Alka; & Gaur, Prateek. (2011). A Novel Method for Spectrophotometric Determination of Pregabalin in Pure Form and in Capsules. Chemistry Central Journal. 59: 1-7.

Beni, Szabolcs; et al. (2010). Separation and Characterization of Modified Pregabalins in Terms of Cyclodextrincomplexation using Capillary Electrophoresis and Nuclear Magnetic Resonance. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 51: 842-852.

Bockbrader, HN.; et al. (2010). A Comparison of the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Pregabalin and Gabapentin. Clinical Pharmacokinetic. 49(10): 661-669.

Dahl, Sandra Rinne; Olsen, Kirsten Midtboen; & Strand, Dag Helge. (2012). Determination of Gamma-Hydroxybutyrate (gHB),Beta-Hydroxybutyrate (BHB), Pregabalin, 1,4-Butane-Diol (1,4BD) and Gamma-butyrolactone (gBL) in Whole Blood and Urine Samples by UPLC–MSMS. Journal of Chromatography B. 885-886: 37– 42.

Dousa, Michal; Gibala, Petr; & Lemr, K. (2010). Liquid Chromatographic Separation of Pregabalin and its Possible Impurities with Fluorescence Detection After Postcolumnderivatization with o-Phtaldialdehyde. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 53: 717-722.

Elbashir, Abdalla A.; Suliman, Fakhr Eldin O.; & Aboul-Enein, Hassan Y. (2011). The Application of 7-Chloro-4-nitrobenzoxadiazole (NBD-Cl) for the Analysis of Pharmaceutical-bearing Amine Group using Spectrophotometry and Spectrofluorometry Techniques. Applied Spectroscopy Reviews. 46(3): 222-241.

European Medicines Agency. (2011). Guideline on Bioanalytical Method Validation. Retrieved August 13, 2012, from http://www.ema.europa.eu/docs/en_gb/ document_library/Scientific_guideline/2011/08/WC500109686.pdf

FluoProbes®. (2012). NBD. Retrieved December 07, 2012, from http://www.interchim.fr/ft/ 4/46540A.pdf

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Arain%20AM%5Bauth%5D

http://www.sciencedirect.com/science/journal/15700232

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bockbrader%20HN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20818832

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20818832


http://www.ema.europa.eu/docs/en_gB/document_library/Scientific_guideline/2011/08/WC500109686.pdf

http://www.interchim.fr/ft/4/46540A.pdf

79

Food and Drug Administration. (1994). Reviewer Guidance Validation of Chromatographic Methods. Retrieved June 01, 2013, from http://www.fda.gov/downloads/Drugs/ guidances/UCM134409.pdf

Food and Drug Administration. (2013). Guidance for Industry : Bioanalytical Method Validation. Retrieved December 13, 2013, from http://www.fda.gov/downloads/

Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM368107.pdf Gujral, Rajinder Singh; Haque, Sk Manirul; & Kumar, Sanjeev. (2009). A Novel Method for

the Determination of Pregabalin in Bulk Pharmaceutical Formulations and Human Urine Samples. African Journal of Pharmacy and Pharmacology. 3(6): 327-334.

Gujral, Rajinder Singh; Haque, Sk Manirul; & Shanker, Prem. (2009). A Sensitive Spectrophotometric Method for the Determination of Pregabalin in Bulk, Pharmaceutical Formulations and in Human Urine Samples. International journal of Biomedical science. 5(4): 421-427.

Hao, F.; et al.(2004) Determination of Aliphatic Amines in Mineral Flotation Liquors and Reagents by High-Performance Liquid Chromatography After Derivatization with 4-Chloro-7- nitrobenzofurazan. Journal Chromatograph A. 1055(1-2): 77-85.

Heltsley, Rebecca; et al. (2011). Urine Drug Testing of Chronic Pain Patients. IV. Prevalence of Gabapentin and Pregabalin. Journal of Analytical Toxicology. 35: 357-359.

Mandal, Uttam; et al. (2008). Determination of Pregabalin in Human Plasma using LC-MS-MS. Chromatographia. 67: 237-243.

Mercolinia, Laura; et al. (2010). Simultaneous HPLC-F Analysis of Three Recent Antiepileptic Drugs in Human Plasma. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 53: 62-67.

Mishra, Sarvesh Kumar; Gurupadhyya, B.M.; & Verma, Surajpal. (2012). Stability RP-HPLC Method for Determination of Pregabalin using ICH Guidelines. International Journal of Natural Product Science. (1): 130.

Mudiam, Mohana Krishna Reddy; et al. (2012). Development, Validation and Comparison of Two Microextraction Techniques for the Rapid and Sensitive Determination of Pregabalin in Urine and Pharmaceutical Formulations After Ethyl Chloroformate Derivatization Followed by gas Chromatography–Mass Spectrometric Analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 70: 310-319.

http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/UCM134409.pdf

http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hao%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15560482

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15560482

http://www.sciipub.com/index.php/forum/4-international-journal-of-natural-product-science-issn-2249-6335/index.php?option=com_kunena&func=showcat&catid=4&Itemid=74

80

Nirogi, Ramakrishna; et al. (2009). Liquid Chromatography Atmospheric Pressure Chemical Ionization Tandem Mass Spectrometry Method for the Quantification of Pregabalin in Human Plasma. Journal of Chromatography B. 877: 3899-3906.

Onal, Armagan; & Sagirli, Olcay. (2009). Spectrophotometric and Spectrofluorimetric Methods for the Determination of Pregabalin in Bulk and Pharmaceutical Preparation. Spectrochimica Acta Part A. 72: 68-71.

Pfizer Canada Inc. (2013). Product monograph. Retrieved July 2, 2013, from http://www. pfizer.ca/en/our_products/products/monograph/141

Pubchem Compound. (2005). Gabapentin. Retrieved December 2, 2012, from http://pub chem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=3446#itabs-2d

Ravi, Sankar. (2013). HPLC. Retrieved January 20, 2014, from http://www.slideshare.net/ banuman35/hplc-high-perpromance-liquid-chromatography-or- high-pressure-liquid-chromatography-brief-history-definition-what-is-hplc-uses-of-hplc-separation-mechanism-classification-elution-texhniques-gradient-and-isocratic-normal-phase-and-rp-hplc-stationary-phase-m

Shah, GR.; Ghosh, C.; & Thaker, BT. (2010). Determination of Pregabalin in Human Plasma by Electrospray Ionisation Tandem Mass Spectroscopy. Journal of Advanced Pharmaceutical Technology & Research. 1(3): 354-357.

Shimadzu. (2014). Definition of S/N Ratio. Retrieved January 20, 2014, from http://www. shimadzu.com/an/definition_sn_ratio.html

Tang, PH.; et al. (1999). Automated Microanalysis of Gabapentin in Human Serum by High-Performance Liquid Chromatography with Fluorometric Detection. Journal of Chromatography. B, Biomedical Sciences and Application. 727(1-2): 125-129.

Thejaswini, J.C.; Gurupadayya, B.M.; & Raja, P. (2012). Gas Chromatographic Determination of Pregabalin in Human Plasma using Ethyl Chloroformate Derivatizing Reagent. Journal of Pharmacy Research. 5(6): 3112-3115.

Uma, G.; et al. (2011). LC-MS-MS Method for the Determination of Pregabalin in Human Plasma. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 4(3): 108-112.

Vaidya, Vikas V.; et al. (2007). LC-MS–MS Determination of Pregabalin in Human Plasma. Chromatographia. 66: 925-928.


http://www.pfizer.ca/en/our_products/products/monograph/141

http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=3446#itabs-2d

http://www.slideshare.net/banuman35/hplc-high-perpromance-liquid-chromatography-or-

http://www.shimadzu.com/an/definition_sn_ratio.ht

81

Vermeij, T.A.C.; & Edelbroek P.M. (2004). Simultaneous High-performance Liquid Chromatographic Analysis of Pregabalin, Gabapentin and Vigabatrin in Human Serum by Precolumn Derivatization with o-Phtaldialdehyde and Fluorescence Detection. Journal of Chromatography B. 810: 297-303.

Waters. (2014). HPLC Separation Modes. Retrieved January 20, 2014, from http://www. waters.com/waters/en_TH/HPLC-Separation- Modes/nav.htm?cid=10049076& locale=en_TH


http://www.waters.com/waters/en_TH/HPLC-Separation-%20Modes/

82

ภาคผนวก

83

ภาคผนวก ก

84

ตารางแสดงเกณฑการยอมรบคาความแมนยาของการวเคราะหซ า

ตาราง 36 แสดงคาความแมนย าทยอมรบไดในการเตรยมตวอยางทไมผานการสกด

ความเขมขนของสารตวอยาง คาเฉลยของ % RSD

100 % 10 % 1 %

0.1% 100 ppm

10 ppm 1 ppm 100 ppb 10 ppb 1 ppb

± 1.3 ± 2.7 ± 2.8 ± 3.7 ± 5.3 ± 7.3 ± 11 ± 15 ± 21 ± 30

ทมา: AOAC manual for Peer Verified Methods program, VA, NOV 1993

85

ภาคผนวก ข

86

ภาพประกอบแสดงขอมลโครมาโทแกรมเพมเตมของงานวจย

ภาพประกอบ 25 แสดงโครมาโทแกรมของพรกาบาลนและกาบาเพนตนในพลาสมาโดยไมเตม NBD-Cl

ภาพประกอบ 26 แสดงโครมาโทแกรมของสารละลายแบลงคทไมผานการสกด

87

ภาพประกอบ 27 แสดงโครมาโทแกรมของสารละลายตางๆ ทไมผานขนตอนการท าใหเกดอนพนธ

Borate buffer

NBD-Cl

Pregabalin

Gabapentin

ประวตยอผวจย

89

ประวตยอผวจย

ชอ ชอสกล นางสาววรรณา เอยมอาจ

วนเดอนปเกด 15 ตลาคม 2527

สถานทเกด อ.เมองนครปฐม จ.นครปฐม

สถานทอยปจจบน 419/368 อาคารนรนดรคอนโด ซอยพงม 52

ถนนสขมวท 93 แขวงบางจาก เขตพระโขนง

กรงเทพมหานคร 10260

ต าแหนงหนาทการงานปจจบน เจาหนาทบรการวทยาศาสตร P7

สถานทท างานปจจบน ฝายวจย คณะแพทยศาสตร มหาวทยาลย

จฬาลงกรณ

ประวตการศกษา

พ.ศ. 2545 ชนมธยมศกษาปท 6

จากโรงเรยนราชนบรณะ

พ.ศ. 2550 ปรญญาตร วทยาศาสตรบณฑต (วท.บ.) เคม

จากมหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลกรงเทพ

พ.ศ. 2557 ปรญญาโท วทยาศาสตรมหาบณฑต (วท.ม.)

วทยาการเภสชภณฑ

จากมหาวทยาลยศรนครนทรวโรฒ

Documents

การพัฒนาและตรวจสอบความ ...ir.swu.ac.th/jspui/bitstream/123456789/3677/2/Wanna_E.pdf · 2020. 4. 23. · PO 4 buffer (10 mM; pH2.5) and