Upload
basqtza
View
248
Download
4
Embed Size (px)
Citation preview
BAZA GENETICA SI
DIAGNOSTICUL
MOLECULAR AL
SINDROAMELOR
TALASEMICE
Asist. Univ. Dr. Rodica Talmaci
HEMOGLOBINOPATII
CALITATIVE
CANTITATIVE
SINDROAMELE TALASEMICE
HEMOGLOBINE “ANORMALE” http://content.dnalc.org/content/c15/15532/sickle_cell.mp4
CE SUNT SINDROAMELE TALASEMICE ?
Talasemiile reprezinta un grup de boli ereditare, caracterizate prin scaderea
cantitatii de hemoglobina.
Sediul hemoglobinei se afla in eritrocite. Daca hemoglobina este scazuta
eritrocitele sunt mai mici si mai goale. Este ceea ce se numeste anemie hipocroma
si microcitara.
Molecula de hemoglobină este un tetramer format din 4 grupări hemice (hem) şi globina constituită din
2 perechi de lanţuri polipeptidice.
Pe perioada dezvoltării, la om se sintetizează mai multe tipuri de Hb, implicând 6 tipuri de lanţuri
polipeptidice: α, β, δ, γ, ε, şi δ.
Moleculele hemoglobinelor sunt constituite din asocierea a 2 lanţuri tip cu:
2 lanţuri β în hemoglobina A (adultă majoră) 96-98%
2 lanţuri δ în hemoglobina A2 (adultă minoră) 1-3%
2 lanţuri γ în hemoglobina F (fetală) 0,5-1%
2 lanţuri ε în hemoglobina E (embrionară)
HEMOGLOBINELE NORMALE
•Hemoglobina embrionară (HbE):
Gower I - δ2ε2
Portland - δ2γ2
Gower II - 22
•Hemoglogina fetală (HbF) - 2γ2
•Hemoglobina adultă (HbA) - 22
•Hemoglobina 2 adultă (HbA2) - 22
Tipurile de lanţuri globinice sintetizate la
diferite etape de dezvoltare
Studiile genetice au demonstrat că fiecare lanţ
polipeptidic este codificat şi sintetizat de o altă genă
globinică de tip sau . Aceste lanţuri se asociază
în combinaţii specifice pentru a forma diferitele tipuri
de Hb. În diferite momente ale dezvoltării sunt
sintetizate şi utilizate diferite tipuri de Hb.
Locul de sinteză a lanţurilor globinice pe durata dezvoltării
La embrionul uman se sintetizează iniţial, în sacul vitelin, Hb E - un tetramer format din două polipeptide
şi două . Compârand secvenţele de aminoacizi, este un polipeptid de tip , iar este de tip . Se pare că
lanţul este unul dintre primele lanţuri globinice apărute.
HEMOGLOBINA EMBRIONARA
•Hemoglobina embrionară (HbE):
Gower I - δ 2ε2
Portland - δ2γ2
Gower II - 22
După trei luni de dezvoltare, sinteza Hb embrionare
încetează, iar locul de sinteză a lanţurilor globinice
se deplasează în ficat şi splină. Aici sunt sintetizate
adevăratele polipeptide , iar celelalte două catene
polipeptidice sunt de tip - A sau G care produc
două forme de Hb fetală (fiecare catenă este
codificată de o genă diferită). Hb prezentă în acest
stadiu se numeşte – Hb F.
HEMOGLOBINA FETALA
Locul de sinteză a lanţurilor globinice pe durata dezvoltării
Hb F este produsă până aproape înainte de naştere,
când sinteza catenelor încetează, iar locul de sinteză a
Hb se deplasează în măduva osoasă, unde sunt
sintetizate adevăratele catene şi împreună cu câteva
polipeptide de tip . Hb F apare după concepţie; la un
embrion de 2 luni 50% din Hb este reprezentată de Hb F,
iar la 2,5 luni Hb F reprezintă 90% din totalul de Hb.
După naştere concentraţia de Hb F scade, de la 10% (la
6 luni) pana la 2% (la 1 an). Hemoglobina adultului (Hb
A) apare la fetus la 6-8 săptămâni de viaţă extrauterină.
HEMOGLOBINA ADULTA
Locul de sinteză a lanţurilor globinice pe durata dezvoltării
— HbA2 (22)
Molecula integrala de hemoglobina este un tetramer 22.
Reprezentarea schematică a genelor globinice
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/chr11.html
BAZA GENETICA MOLECULARA A
TALASEMIEI
Mutatii produse in aceste gene determina aparitia talasemiilor. In prezent, in gena -globinei, secunosc aproape 300 de mutaţii ce determina transformarea in gene talasemice.
Clusterul de gene -globinice
Lanturile polipeptidice -globinice sunt sintetizate degena -globinica (11p15).
Clusterul de gene -globinice
Lanturile polipeptidice -globinice suntsintetizate de genele -globinice (16p13).
CLASIFICAREA GENETICA A
TALASEMIILOR
• IN FUNCTIE DE GENA AFECTATA:
1. .α-TALASEMIE
2. .β-TALASEMIE
3. .δβ-TALASEMIE
4. .γδβ-TALASEMIE
CE ESTE β-TALASEMIA ?
Cromozomii
11
DEFECTE GENETICE IN GENELE β-GLOBINICE PRODUC β-TALASEMIA
MUTATII CE DETERMINA
- TALASEMIA
FORMELE HETEROZIGOTE
DE β–TALASEMIE:
•Talasemia minima/silentioasa
– β++/ N
•Talasemia minora – +/N sau
0/N
MANIFESTARILE FENOTIPICE (CLINICE)
IN -TALASEMIE
Cariotip normal, 46, XY
FORMELE HOMOZIGOTE DE
β–TALASEMIE:
•Talasemia intermediara –
+/+ sau 0/+
•Talasemia majoră – 0/0
Homozigot
Heterozigot compus =Dublu heterozigot
Heterozigot
Daca ambii parinti sunt purtatori
de gena β-globinica defecta exista
riscul de 25% ca la fiecare sarcina
sa se nasca un copil cu β-
talasemie majora sau anemie
Cooley.
Exista o variabilitate foarte mare in ceea ce inseamna severitatea acestor boli talasemice, astfel
delimitarea intre TALASEMIA MAJORA si TALASEMIA INTERMEDIA poate creea confuzie. De aceea, in
acest caz este absolut necesara investigarea prin metode de genetica moleculara.
Fenotip
β-talasemie
majora
CE ESTE α-TALASEMIA ?
Daca o persoana are o singura gena α-globinica defecta (din cele patru), aceasta nu va avea nici un fel de manifestare
clinica. Aceasta situatie se numeste conditie de purtator silentios de α-talasemie. Diagnosticul este pus numai prin teste
genetice si este mai curand un diagnostic ―deductiv‖ la o persoana aparent sanatoasa care are un copil cu α-talasemie.
Daca persoana are doua gene α-globinice defecte, atunci diagnosticul va fi de α-talasemie minora. De regula, nu exista
manifestari clinice, iar in hemograma aceasta va avea o anemie usoara hipocroma microcitara. De obicei, pacientul este
gresit diagnosticat cu anemie prin lipsa de fier. Diagnosticul corect implica mai multa experienta din partea hematologului,
deoarece inclusiv electroforeza de hemoglobina este normala. Genele alfa defecte pot fi situate pe acelasi cromozom
(pozitie cis) sau pe fiecare cromozom din pereche (pozitie trans). Daca un parinte are α-talasemie minora cu genele defecte
in pozitie cis (situate pe acelasi cromozom), iar celalat parinte are conditia de purtator silentios (o singura gena este
defecta), exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa se nasca un copil cu trei gene α-talasemice defecte, adica boala Hb
H. Daca ambii parinti au α-talasemie minora cu genele defecte in pozitie cis (pe acelasi cromozom) exista riscul de 25% ca
la fiecare sarcina sa apara α-talasemia majora, in care toate genele α-globinice sunt defecte, adica Hemoglobina Bart -
Hidrops Fetalis si produsul de conceptie nu este viabil si va muri in uter.
Cromozomii
16
DEFECTE GENETICE IN GENELE α-GLOBINICE PRODUC
α-TALASEMIA
DELETII α-TALASEMICE
VARIANTE TALASEMICE-TALASEMIA
Conditia de -talasemie rezulta prin reducerea sintezei lanturilor - si -globinice si se caracterizeaza
printr-o cantitate crescuta de Hb F, un nivel de Hb A2 normal sau scazut si un indice MCV scazut.
Gena -globina, ce controleaza productia de lanturi - este localizata foarte aproape de gena - pe
cromozomul 11. Daca o gena este indepartata din cromozom in urma unei deletii, atunci si cealalta gena
poate fi afectata. In functie de deletia produsa in cromozomi, se pot distinge:
Macedonia
Sicilia
Lepore
-talasemia homozigota este similara
cu -talasemia, dar simptomele sunt mai
usoare. Majoritatea pacientilor supravietuiesc
pana la viata adulta cu necesitati minime de
transfuzie.
-talasemia heterozigota este similara cu
-talasemia minora, dar simptomele tind sa
fie mai putin severe.
Hemoglobina LEPORE este un amestec in productia de lanturi non-. Capatul N-terminal al proteinei contine
secventa aminoacidica a lantului -globinic, iar capatul C-terminal contine secventa aminoacidica a lantului -
globinic. Exista mai multe variante de Hb Lepore, in functie de lungimea segmentelor fuzionate: Washington,
Hollandia, Baltimore.
In Hb Lepore homozigota nu exista productie normala de lanturi -globinice sau -globinice. Aspectele clinice si
hemograma sunt identice cu cele de -talasemie majora
In Hb Lepore heterozigota aspectele clinice si de laborator sunt identice cu cele de -talasemie minora
DIAGNOSTICUL MOLECULAR
IN TALASEMII
PRINCIPALII INDICI HEMATOLOGICI IN β-
TALASEMIA HETEROZIGOTA
TESTELE DE GENETICA MOLECULARA
IN TALASEMIESTRATEGIA DE INVESTIGARE A MUTATIILOR TALASEMICE se refera la “cautarea” modificarilor
produse in genele globinice normale ce au dus la transformarea lor in gene talasemice.
α-talasemiile si -talasemiile sunt consecinta unor deletii ale genelor globinice, in timp ce β-talasemiile
sunt produse ca rezultat al mutatiilor punctiforme aparute in ADN la nivelul acestor gene β-globinice.
In scopul identificarii mutatiilor -talasemice se procedeaza la urmatoarea etape:
Recoltarea de sange periferic – extractie ADN din sange – amplificare prin PCR a genelor de investigat
Prin metode de biologie moleculara se realizeaza identificarea mutatiilor produse la nivelul genelor de interes.
Aceste metode ne indica exact mutatia produsa in gena studiata, fiind si metode de verificare, absolut necesare
intr-un diagnostic molecular.
SINDROAMELE TALASEMICE
•α-talasemie
•β-talasemie
•-talasemie
•-talasemie
•γ-talasemie
α-globina
β-globina
-globina
-,-globina
γ-,-,-globina
METODE DE IDENTIFICARE A
MUTATIILOR -TALASEMICE
ELECTROFOREZA IN GEL
CU GRADIENT DE
DENATURARE (DGGE)
Amplificare seriata a
fragmentelor -globinice:
Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV
Electroforeza
fragmentelor F, I, II, III, IV
in gel de poliacrilamida
AMPLIFICARE SPECIFICA
A ALELELOR MUTANTE
(ARMS-PCR)
Electroforeza in gel de
agaroza
ANALIZA SITUSULUI DE
RESTRICTIE IN FRAGMENTE
DE AMPLIFICARE PCR
(PCR-RFLP)
Electroforeza in gel de
agaroza
Amplificarea fragmentelor
genice -globinice urmata
de restrictie enzimatica
ELECTROFOREZA îN GEL
CU GRADIENT DE
DENATURARE (DGGE)
1. Amplificare seriată a
fragmentelor -globinice:
Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV
AMPLIFICARE SPECIFICĂ
A ALELELOR MUTANTE
(ARMS-PCR)
ANALIZA SITUSULUI DE
RESTRICŢIE ÎN FRAGMENTE
DE AMPLIFICARE PCR
(PCR-RFLP)
2. Electroforeza
fragmentelor F, I, II, III, IV
în gel de poliacrilamidă cu
gradient de denaturare
Electroforeza în gel de
agaroză
Electroforeza în gel de
agaroză
Amplificarea fragmentelor
genice -globinice urmată
de restricţie enzimatică
METODE DE IDENTIFICARE A MUTAŢIILOR
-TALASEMICE
1. Amplificarea seriată a fragmentelor
genice -globinice:
Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IVSe realizeaza scanarea intreagii gene -globinice pentru identificarea mutatiilor.
Intr-o prima etapa se amplifica seriat 5 fragmente
ce compun intreaga gena -globinica
GENA β-GLOBINA
Amestec de reactie PCR:
ADN (template)
Amestec tampon PCR: Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4,MgCl2
Primer F (forward) - secventa scurta de ADN carese imperecheaza cu o portiune complementaradintr-o catena ADN si formeaza un capat 3‟-OHliber la care se ataseaza ADN-polimeraza siincepe sinteza unui lant ADN nou
Primer R (reverse)
Nucleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
ADN polimeraza (Taq DNA polynerase)
REACTIA DE POLIMERIZARE IN LANT –
PCR
3 ETAPE:
ADN genomic
.β-globina
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html
REACTIA DE POLIMERIZARE IN LANT –
PCR
3 ETAPE:
ADN genomic
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html
1. Denaturare – 90-95oC – 1 min
.β-globina
REACTIA DE POLIMERIZARE IN LANT –
PCR
3 ETAPE:
20-3
0 c
iclu
ri
ADN genomic
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html
1. Denaturare – 90-95oC – 1 min
2. Alinierea primerilor – 55-65oC - 0,5 min
3. Polimerizare – 72oC – 2 min
.β-globina
AMPLIFICAREA EXPONENTIALA
DETECTIE PRIN ELECTROFOREZA IN
GEL DE AGAROZA
ELECTROFOREZA ÎN GEL CU
GRADIENT DENATURANT (DGGE)
In aceasta etapa se realizeaza electroforeza
fragmentelor amplificate in DGGE.
In functie de modelul electroforetic obtinut avem informatia
despre prezenta sau absenta unei mutatii in fragmentul
analizat si locul genic al mutatiei.
Daca utilizam probe control, prin compararea modelelor
electroforetice, obtinem informatia privind mutatia exacta.
DGGE Fragment F
Fr. F
cd 2/N -87/N N/N +20/N N/N +20/N +20/+20 cd2/N -101/N N/N N/N -87/N N/N
cd 2/N -87/N N/N cd2/N +20/N N/N N/N -101/N N/N cd2/N cd2/N cd2/N cd2/cd2 N/N
Fr. F
Gena -globinei a fost împărţită în 5
fragmente diferite (Fr. F, Fr. I, Fr. II,
Fr. III, Fr. IV), ce acoperă întreaga
regiunea de codificare şi secveţele
de flancare 5' şi 3'.
Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru
electroforeza în gel cu gradient denaturant. Porţiunile
negre reprezintă exonii, iar porţiunile albe – intronii. 5’
UTR şi 3’ UTR – regiunile netranslate 5’ şi 3’
350 pb
Cele mai frecvente mutaţii identificate în fragmentul F:
Mutatia –87 (C-G) - ++
Polimorfismul +20 (C-T) lincat cu mutaţia IVS II-745 (C-G) - +
Polimorfismul cd2 (C-T)
DGGE Fragment I
N/N +20/+20 cd 6/N N/N +20/N N/N + 20/N N/N cd 2/N N/N cd 5/N
Fr.I
+20/+20 +20/N cd 2/N cd2/N N/N cd2/N cd6/N
Fr. I
Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru
electroforeza în gel cu gradient denaturant. Porţiunile
negre reprezintă exonii, iar porţiunile albe – intronii. 5’
UTR şi 3’ UTR – regiunile netranslate 5’ şi 3’.
250 pb
Cele mai frecvente mutaţii identificate in fragmentul I:
cd 6 (-A) - 0
Polimorfismul +20 (C-T) lincat cu mutaţia IVS II-745 (C-G) - +
Polimorfismul cd 2 (C-T)
DGGE Fragment II
Cd 39/N N/N cd 39/N N/N IVS I-1/N IVS I-1/N
Fr. II
IVS I-110/N N/N IVS I-110/ cd39/N IVS I-110/N IVS I-6/N cd 39/N
IVS I-110
Fr. II
Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru
electroforeza în gel cu gradient denaturant. Porţiunile
negre reprezintă exonii, iar porţiunile albe – intronii. 5’
UTR şi 3’ UTR – regiunile netranslate 5’ şi 3’
370 pb
Cele mai frecvente mutatii identificate infragmentul II:
IVS I-1 (G-A) - 0
IVS I-6 (T-C) - +
IVS I-110 (G-A) - +
cd 39 (C-T) - +
IVS I-110/N N/N N/N cd 39/N N/N IVS I-110/N
Fr. II
DGGE Fragment IV
Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru
electroforeza în gel cu gradient denaturant. Porţiunile
negre reprezintă exonii, iar porţiunile albe – intronii. 5’
UTR şi 3’ UTR – regiunile netranslate 5’ şi 3’.
420 pb
300 pb
Poli A cd+6/N poli A
(+1480)
Fr. IV
Cele mai frecvente mutatii produse in fragmnetul IV:
•mutaţia în semnalul de poliadenilare (AATAAA-AATGAA) - +
•mutatia +1480 (C-G) - +
ELECTROFOREZA ÎN GEL
CU GRADIENT DE
DENATURARE (DGGE)
Amplificare seriată a
fragmentelor -globinice:
Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV
AMPLIFICAREA SELECTIVĂ
A ALELELOR MUTANTE
(ARMS-PCR)
ANALIZA SITUSULUI DE
RESTRICŢIE ÎN FRAGMENTE
DE AMPLIFICARE PCR
(PCR-RFLP)
Electroforeza
fragmentelor F, I, II, III, IV
în gel de poliacrilamidă cu
gradient de denaturare
Electroforeza în gel de
agaroză
Electroforeza în gel de
agaroză
Amplificarea fragmentelor
genice -globinice urmată
de restricţie enzimatică
METODE DE ANALIZĂ A MUTAŢIILOR
-TALASEMICE
AMPLIFICAREA SELECTIVĂ A
ALELELOR SPECIFICEMetoda se aplica pentru identificarea mutaţiilor punctiforme cunoscute. In amplificarea PCR se
utilizeaza un primer care prezinta aceeasi secventa de nucleotide cu ADN matrita, cu exceptia
nucleotidului terminal 3„. Acesta este complementar cu nucleotidul modificat prin mutatie.
Taq-polimeraza necesita o complementaritate perfecta a primerului la capatul 3' pentru a putea realiza
polimerizarea.
Astfel, alela dorita este intens amplificata. In cazul neamplificarii rezultatul este nepotrivirea dintre
ADN matrita si oligonucleotidul primer.
Pentru a confirma aceasta conditie, in amestecul de reactie se introduc 2 primeri control care
amplifica un fragment de alta dimensiune.
Banda control de
861 pb
Banda specifică
mutaţiei IVS I-
110 de 390 pb
Mutatia IVS I-110 (G-A)
ELECTROFOREZA ÎN GEL
CU GRADIENT DE
DENATURARE (DGGE)
Amplificare seriată a
fragmentelor -globinice:
Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV
AMPLIFICAREA SELECTIVĂ
A ALELELOR MUTANTE
(ARMS-PCR)
ANALIZA SITUSULUI DE
RESTRICŢIE ÎN FRAGMENTE
DE AMPLIFICARE PCR
(PCR-RFLP)
Electroforeza
fragmentelor F, I, II, III, IV
în gel de poliacrilamidă cu
gradient de denaturare
Electroforeza în gel de
agaroză
Electroforeza în gel de
agaroză
Amplificarea fragmentelor
genice -globinice urmată
de restricţie enzimatică
METODE DE ANALIZĂ A MUTAŢIILOR
-TALASEMICE
ANALIZA SITUSULUI DE RESTRICŢIE
PRIN METODA PCR - RFLP
Prin stabilirea polimorfismului lungimii fragmentelor de restrictie ne dam
seama daca s-a produs mutatia cautata.
Unele mutaţii punctiforme potcrea sau desfiinţa un situs derestricţie în secvenţa ADN.Aceste mutatii pot fiidentificate prin analizasitusului de restricţie.
SECVENTIEREA ADNMetoda prin care se poate afla secventa in baze azotate a unuifragment ADN de interes
REAL TIME PCR GENOTYPING
IDENTIFICAREA DELEŢIILOR - Si -
TALASEMICE GENICE GLOBINICE PRIN
METODA GAP-PCRMetoda GAP-PCR se aplica in
identificarea deletiilor genice mari.
Metoda se bazeaza pe tehnica de
amplificare PCR cu 3 primeri specifici
pentru fiecare deletie. Acestia sunt
utilizati in aceeasi reactie de
amplificare, conducand la amplificarea
unui singur produs specific deletiei si
o banda control, de marime diferita,
corespunzatoare alelei normale.
0 MED-I (17,5 kb) / +(3.7
kb) = Boala Hb H
-talasemia
MED-I/ MED-I/ 20,5/ MED-I/ 20,5/
deleţia Macedonia (11,5 kb)
-talasemia
STUDIUL TALASEMIEI IN ROMANIASPECTRUL MUTATIILOR -TALASEMICE IDENTIFICATE
IN ROMANIA
-talasemiaα MED/N
α 3.7/N
0 MED-I (17,5 kb) / +(3.7 kb) = Boala Hb H
ααα/N
-talasemia
deleţia Macedonia (11,5 kb)
deleţia Lepore
O NOUA MUTATIE IN SITUSUL CAP
AL GENEI β-GLOBINEI - MUTATIA
CAP+3 (A-T)
Probele de material fetal se obtin prinAMNIOCENTEZA sau prelevare de probedin VILOZITATILE CORIALE. Ambele pot fiefectuate numai in centre specializate subcontrol ecografic.
Amniocenteza se efectueaza dupasaptamana a 15-a de sarcina prin recoltareade 10-15 ml de lichid amniotic.
Biopsia din vilozitatile coriale se poateefectua in saptamana 10-12 de sarcina prinrecoltare de fragmente foarte mici de tesutcu origine fetala.
TESTAREA PRENATALA PENTRU
TALASEMIE
ADNul extras din lichid amniotic sau vilozitati coriale
este analizat prin metodele moleculare pentru
identificare şi caracterizare de mutaţii -talasemice
prezente în genotip.
Prin aceste metode se stabileste diagnosticul de
homozigot (bolnav) sau heterozigot (purtator) al -
talasemiei, se identifica mutatia exacta prezenta la fat
si se anticipeaza fenotipul sau.
ANALIZA ADN
Pentru cuplurile la care diagnosticul detalasemie minora a fost pus la ambii parinti,dupa ce partenera a ramas insarcinata, serecomanda efectuarea testelor de geneticamoleculara la fat pentru a identifica prezentamutatiilor talasemice.
PRIMUL CAZ
Fragmente de amplificare din gena -globinei pentru
electroforeza in gel cu gradient denaturant.
250 pb
Pattern-uri DGGE in fragmentul I.
1-ADN mama (N), 2-ADN tata (pozitiv), 3-
ADN bunic (pozitiv), 4-ADN fetal pozitiv
pentru mutatia IVS II-745 (C-G), 5-ADN
bunica (N).
“SCANAREA” GENICA PENTRU IDENTIFICARE DE MUTATII
Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru
electroforeza in gel cu gradient denaturant.
370 pb
Pattern-uri DGGE in fragmentul II.
1-ADN bunica (N),
2, 3-ADN fetal pozitiv pentru mutatia IVS I-110 (G-A),
4-ADN mama (pozitiv),
5-ADN control negativ.
Allela IVS II-745
Alela Normala
Allela IVS I-110
Alela Normala
REZULTATE
GENOTIP FENOTIP
FETUS Homozigot IVS I-110
(G-A) / IVS II-745 (C-G)
.β+/ β+
MAMA heterozigot IVS I-110 (G-
A) / N
.β+/ βA
TATAL heterozigot IVS II-745
(C-G) / N
.β+/ βA
BUNICUL PATERN heterozigot IVS II-745
(C-G) / N
.β+/ βA
BUNICA PATERNA Normal .βA/ βA
AL DOILEA CAZ
Fragmente de amplificare din gena -globinei pentru
electroforeza in gel cu gradient denaturant.
250 pb Pattern-uri DGGE in fragmentul I.
1-ADN control negativ,
2-ADN fetal din proba de lichid amniotic (pozitiv-
contaminare),
3-ADN control pozitiv pentru polimorfism cd 2 in
stare heterozigota,
4-ADN mama (pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA +
polimorfism cd 2 in trans),
5-ADN fetal din proba CVS, pozitiv pentru mutatia cd
8 (-AA) in stare homozigota,
6-ADN tata (pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in stare
heterozigota,
7-ADN control pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in
stare heterozigota,
8-AND control pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in
stare homozigota.
“SCANAREA” GENICA PENTRU IDENTIFICARE DE MUTATII
Alela normala
Alela patologica
cd 8 (-AA)
REZULTATE
GENOTIP FENOTIP
FETUS Homozigot cd 8 (-AA) /
cd 8 (-AA)
.β0/ β0
MAMA heterozigot cd 8 (-AA)/ N .β0/ βA
TATA heterozigot cd 8 (-AA)/ N .β0/ βA
DIAGNOSTIC PRENATAL PENTRU
-TALASEMIE
GENOTYPE PHENOTYP
E
FETUS Homozygot IVS I-110 (G-A) / IVS II-
745 (C-G)
.β+/ β+
MOTHER Heterozygot IVS I-110 (G-A) / N .β+/ βA
FATHER Heterozygot IVS II-745 (C-G) / N .β+/ βA
FETUS Homozygot CD 8 (-AA) / CD 8 (-AA) .β0/β0
MOTHER Heterozygot CD 8 (-AA)/N .β0/βA
FATHER Heterozygot CD 8 (-AA)/N .β0/βA
FETUS Homozygot IVS I-110 (G-A) / IVS II-
745 (C-G).β+/ β0
MOTHER Heterozygot IVS II-745 (C-G) / N.β+/ βA
FATHER Heterozygot IVS I-110 (G-A) / N .β0/ βA
FETUS Heterozygot IVS I-1 (G-A)/N .β0/βA
MOTHER Heterozigot IVS I-1 (G-A)/N .β0/βA
FATHER Heterozygot IVS I-110 (G-A) / N .β+/ βA
FETUS Heterozygot IVS I-110 (G-A) / N .β+/ βA
MOTHER Heterozygot IVS I-110 (G-A) / N .β+/ βA
FATHER Heterozygot IVS I-110 (G-A) / N .β+/ βA
Profile DNA obtinute prin genotipare STR. Profilul probei CVS
(CVS1) este diferit de profilul probei din lichidul amniotic (R) si de
cel al probei materne (06-33), aceasta indicand necontaminarea cu
AND matern. Profilul probei de lichid amniotic este acelasi cu profilul
probei materne, aceasta indicand o contaminare a acestei probe cu
AND matern.