A DNS kémiája a bölcsőtől a sírig

Vértessy Beáta

MTA Kémiai Tudományok Osztálya Felolvasó ülés 2013. június 18.

Vázlat

• Általános elvek

• Célzott problémára fókuszálás

• DNS módosulások szerepei

• Egy szokatlan bázis a DNS-ben

• Enzimatikus reakció mechanizmus: dUTPáz

• Racionális inhibitor tervezés

Hogyan tegyünk fel kérdéseket a mai

molekuláris biológiában (kémiában)?

Kísérlet-vezérelt kutatás Adatbázisok / rendszerbiológia Omikák Hipotézis-vezérelt kutatás Esettanulmányok, specifikus problémák Ellenőrzés/Igazolás/ÉRTELMEZÉS!!! mindazon adatokra, melyeket a rendszerszemlélet begyűjtött

SAGE journals

Omikák - Technológiák

Választott megközelítés

Hipotézis-vezérelt kutatás Esettanulmányok, specifikus problémák Ellenőrzés/Igazolás/ÉRTELMEZÉS!!!

Kémiai biológia – mi az?

• Az élettudományok és a kémia/fizika közti határmezsgye

• Kémiai technológiákat használ a biológiai folyamatok leírásához és megértéséhez

• Rendszerszemléletű megközelítés: szintetikus biológia/kémia, szerkezeti/molekuláris/sejtbiológiai módszerek

• Kvantitatív megközelítési módok

• Dinamikus analízis – kinetika!

• Ismert példa: farmakogenomika – kémiai genomika

Paradoxon: stabil infotárolás reaktív

makromolekulákban??

DNS és sejtbeli környezet: reaktív!! Spontán kémiai módosítások normál élettani körülmények mellett Hogyan lehet feloldani a paradoxont? DNS javító mechanizmusok Genom stabilitás biztosítása Uracil – a leggyakoribb hiba Uracil – talán nem csak hiba? Jelátvitel!

Uracil Timin

A mi esetünk:

DNS – kémiai nézőpontból

Reaktív csoportok

sokasága

egy lineáris

polimerre fűzve

O N P C

H

Replikációs

hibák

UV sugárzás

Pirimidin

dimerek

adduktok

Környezeti

toxinok Alkilezés

Száltörés

Hamis párok,

inzerciók, deléciók

Ionizáló sugárzás

Radioterápia

Kemoterápia

Szabadgyökök

Repliszóma

leállás

DNS-polimer reaktív centrumai és a javítás útjai

DSB NER

BER

MMR

NER

Adott hibákra specializált javítás

Alapvető: a módosított kémiai szerkezet felismerése

UDG, dUTPáz BRCA

©M J Larkin Biology & Biochemistry. The Queen’s University of Belfast.

DNS károsodások

G A C T

ds DNS törés Hamis pár

Timidin dimer

AP hely

Kovalens keresztkötés

ss törés

C-U deaminálás

Figure 1. Schemes for target site location.

Halford S E , Marko J F Nucl. Acids Res. 2004;32:3040-3052

©2004 by Oxford University Press

ÉRZÉKELÉS: 3D 1D

Csúszik

Ugrál

Áthurkol

Bázis kivágó DNS hibajavítás (BER)

DNS-glikoziláz felismeri a sérült/hibás bázist

A sérült/hibás bázis lehasítása, szubsztrát elengedés, AP hely

AP endonukleáz a cukor-foszfát gerincet a hibától 5’ irányban elvágja

Polβ hidrolizálja az 5’ dezoxiribóz foszfátot és kitölti a lyukat; ligáz összevarr

Jacobs and Schär, DNA glycosylases: in DNA repair and beyond. 2012, Chromosoma

Jelátvitel

DNS módosulás

Érzékelők

Jelátalakítók

Végrehajtók

DNS javítás Sejtciklus leállítás

Továbbírás Sejthalál

Orvosbiológiai vonatkozások DNS-módosulások a karcinogenezisben:

mutációs gyakoriság – hibás gének, pl BRCA

Tumorsejtek támadása a DNS-károsodás

válaszreakciói útján

Fertőző mikroorganizmusok elleni küzdelem

(mikobaktérium stratégia: hibatűrő polimerázok)

Kutatási módozatok Organizmus-szint: humán tumoros vs normál sejtvonalak

Drosophila modellek (Szeged, Budapest)

In vitro: molekuláris és szerkezeti biológia, kinetika, egyedi

molekulavizsgálatok

BRCA: egy DNS-javító fehérje mutációi a

karcinogenezisben

A DNS kémiai tere limitált!

• Ez sok korlátot jelent • De vannak azért érdekes, ritkább alkotók is! • Ritka bázisok: lehet hiba, lehet jel

A DNS kémiai tere limitált! • METILÁCIÓ: citozin, adenin • Prokarióták: „saját” DNS definiálása • Eukarióták: génkifejeződés szabályozása, epigenetika

Szokatlan alkotóelemek: szokatlan szerepek

Uracil

- Hiba

- Jel a immunoglobulin gének

diverzifikációjához

- Fejlődésbiológiai kapcsoló

- HIV genom

integrálódáshoz kell

- U-DNS fágok

Ribonukleotidok

- Hiba

- Távtartó-vezérelt száltörés indukálás

(architektúra-elem)

Első fejezet:

Uracil: hiba, amit javítani kell

Dezaminált citozin: mutagén uracil

N

N

N

NH

N

H

H

N

H

NH

O

O

CH3

H

N

NH

NH

O

H

N

NHNH

N

N

O

H

N

N

N

NH

N

H

H

N

H

NH

O

O

CH3

N

N

N

NH

N

H

H

N

H

NH

O

O

CH3

dezaminálás

adenin

guanin citozin uracil

uracil timin

vagyis: 5-metil-uracil adenin

DNS replikáció

G-C A-U

Timin-helyettesítő uracil:

ártalmatlan uracil

N

N

N

NH

N

H

H

N

H

NH

O

O

CH3

N

N

N

NH

N

H

H

N

H

NH

O

O

CH3

adenin uracil timin

vagyis: 5-metil-uracil adenin

DNS szintézis

A-T A-U

dATP > dUTP

DNS szintézis

Uracil a DNS-ben?

Két útvonal

Citozin dezaminálás

500/nap/genom

MUTAGÉN

Javító rendszert igényel: bázis- kivágó javítás (BER)

Timin-helyettesítő beépülés

magas sejtbeli dUTP/dTTP

ÁRTALMATLAN

nem feltétlenül javítandó, de

BER szubsztrát

hiábavaló ciklust generál

Uracil (dUMP) DNS-ben Hogyan jön létre? Hogyan távolítható el?

G A A C C T G T

G A A C C T G T

APE

UDG

dUTPase

dUTP hydrolysis

U

A T G C T G A C A T C C

A T C G A T

G G C A G A U T A G G T C

G A A C C T

C A

G

A

T

T

pol

AP-endonuclease

uracil-DNA Glycosylase

dNTP pool safeguarding

Uracil mentesség biztosítása

dNMP NDP

U

Bázis kivágó javítás

* *

KIVÁGÁS : UDG Dezaminált citozinra és timin-helyettesítő uracilra egyaránt

MEGELŐZÉS : dUTPáz Csak timin-helyettesítő uracilra

dUMP dTTP

dUTPáz

dUTP

A dUMP-nek, a

dTTP prekurzorának

termelése

A dUTP szint

csökkentése

dUMP dTTP

dUTPase

dUTP

high dUTP/dTTP

DNA polymerase

Uracil (U) substituted

DNA

Lack of

dUTPase

U

U

U

U U

provides dTTP

precursor

decreases dUTP

level

C U

dUMP dTTP

DNA double strand breaks

Chromosome fragmentation

CELL DEATH

U

U

U

U U

U

C

provides dTTP

precursor

decreases dUTP

level

dUTPase

dUTP

high dUTP/dTTP

DNA polymerase

BER

Lack of

dUTPase Uracil (U) substituted

DNA

dUTPáz hiánya

genomi instabilitást okoz Pécsi et al, 2011 PNAS

Toth et al 2007 JBC

Kovári et al 2004 JBC

Dubrovay et al 2004 JBC

Barabás et al 2004 JBC

Békési et al 2004 JBC

Németh et al 2007 NAR

Varga et al 2007 FEBS Lett

Vértessy 2009 Acc. Chem. Res.

Merényi et al, 2010 FEBS J

Pukáncsik et al 2010 FEBS J

Pécsi et al, 2010 NAR

Horváth et al, 2010 NAR

Békési et al, 2011 FEBS J

Muha et al, 2012 PLoS Genetics

C

Timinmentes sejthalál:

a kemoterápia egyik fő eszköze

dTTP

dUTP dUMP

dTMP dTDP

DNA

dUTPáz inhibitor

Fluorouracil

(FdUMP)

THF

dihydrofolate

TS DHF

reductase

Methotrexate

Az inhibitorok sejthalált indukálnak a dTTP / dUTP arány

perturbálása révén, a timidilát szintáz (TS), dihidrofolát

reduktáz (DHF) vagy a dUTPáz gátlásával.

p53-deficiens tumorsejtekben is működő stratégia!

Főbb céljaink

• A timinmentes sejthalál vizsgálata humán

tumoros és normál sejtvonalakban

• Az uracil-DNS szerepének felderítése

különböző organizmusokban

• dUTPáz-gátló gyógyszerjelöltek

azonosítása: tumorok ellen, de patogén

mikroorganizmusok ellen is!

Projektek/Módszerek

Élettani szerep

Developmental and cell-

cycle-dependent regulation

Role in DNA repair /

apoptosis

Mechanism of thymine-less

cell death

Expression patterns

Subcellular localisation

Proteomic search for

interacting networks

Overexpression

Knock-out / RNA interference

Nucleo-cytoplasmic trafficking

Szerkezeti biológia

Mechanistic studies

Species-specific characteristics

Folding

Enzyme kinetics

Low resolution conformational

spectroscopies (CD, fluoresc.)

EPR-ENDOR

Multidimensional NMR

X-ray crystallography

Mit vizsgálunk:

Uracil-DNS metabolizmus

Biostruct Laboratórium Kristályosítás és röntgenkrisztallográfia -kis- és makromolekuláris/komplexek-

Contact: BME CH épület Biostruct laboratórium Budapest, 1113 Szt Gellért tér 4 E-mail: vertessy@enzim.hu, leveles@enzim.hu

Mosquito kristályosító robot 96 csepp/2 perc

Képalkotó rendszer/Rock Imager

SuperNova egykristály diffraktométer

Homepage: www.biostruct.enzim.hu

C

A

B

A C

B

dUTPáz szerkezet

1 2 4 5 N C 3

Szimmetrikus homotrimer

Három aktív centrum

Mindhárom monomer részt vesz

az aktív centrum felépítésében

IV

III

I

II

Asp95

Ala39

Tyr98

Ser80

Ser81

Arg79

Asp42

Gln123

Arg120

Mg Wcat

nucleotide

Ile94 Val93

mc

Mg2+

+ 2H+ +

Mg2+

dUTPáz

Post-attack

Intermediate

(E-piP)

E-P

E a

b

c

d

e

f

S

P

E-S

*

Approach

Intermediate,

(E-AI)

TS mimic

intermediate

(E-S/E-piP mix)

Intermedierek a reakció koordináta mentén

Intermedierek a reakció koordináta mentén:

3D szerkezetek különböző intermedierekre

Note: Wcat and aP densities separate.

Near-attack conformer E-I int, mix density

Intermediate model shown in dark red.

Mixture model shown in two shades of green.

Light green: the product dUMP,

dark green: the substrate a,b-imino-dUTP

2.5 A

Dissociative

mechanism

Associative

mechanism

Reactants Products

Expected intermediate

Expected intermediate

Crystallographic

intermediate 1

(E-AI)

Crystallographic intermediate 2

(E-S/E-piP mix)

Crystallographic

intermediate 3

(E-piP)

Experimentally

described

intermediates 1-3

0 24h 48h 72h 96h

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Su

rviv

al

(% o

f C

on

tro

l)

Incubation time (hours)

dUTPaz gatolt

kontroll1

kontroll2

dUTPáz gátlás hatása a sejt

proliferációra 5-FdUR jelenlétében

dUTPáz gátlás

nagyban növeli

az érzékenységet

5-FdUR-re

gyakran használt kemoterápiás szer

Timinmentes sejthalál: a kemoterápia

egyik fő eszköze

Proof of concept: igazoltuk, hogy itt a több

helyen való támadás előnyös!

dTTP

dUTP dUMP

dTMP dTDP

DNA

dUTPáz inhibitor. siRNS

Fluoro-

dezoxi-uridin

THF

dihydrofolate

TS DHF

reductase

Methotrexate

Az inhibitorok sejthalált indukálnak a dTTP / dUTP arány

perturbálása révén, a timidilát szintáz (TS), dihidrofolát

reduktáz (DHF) vagy a dUTPáz gátlásával.

Munkafolyamat 1. HTS In silico screening 2 millió vegyületre 2. In vitro enzimtesztek 100-200 vegyületre 3. Sejtbeli gátlás 350 vegyületre 4. Humán sejt vizsgálatok 50 vegyületre 5. Állatkísérletek 6. Szabadalmaztatás

Szerkezet és mechanizmus alapú inhibitor tervezés

Humán dUTPáz: rákos sejtekben túltermelt, védő faktor a tumornak Ha gátoljuk, csökken a tumorsejt életképessége

Tuberkulózis és malária: dUTPáz, mint közös target fehérje

Mycobacterium tuberculosis és Plasmodium falciparum Két fontos enzim hiányzik -dCMP dezamináz -Timidin kináz dUTPáz: Nemcsak a dUTP elbontásában, hanem a dUMP/dTTP termelésben is kulcsszerepe van

M. tuberculosis dUTPáz

Mikobaktérium-specifikus szegmensek

Varga et al 2008, Pécsi et al 2012

PDB ID: 2PY4

Specificitási szegmensek : fajspecifikus inhibitorok

Második fejezet:

Uracil: jel, ami élettanilag fontos

Paradigma váltás

Korábban csak hibaként tekintetbe vett

DNS módosulások új szerepei

Uracil, illetve egyéb DNS-hibák a javító útvonalakon kívül

más jelátviteli útvonalakba is bekapcsolódhatnak

Az uracil bázis fontos jelátviteli szignál:

IgG gének, indukált dezaminálás adott helyen

A megfelelő helyen keletkezett uracil elindítja a DNS-száltöréshez vezető utat

UNG enzim hiánya egérben: immundeficiens tünetegyütteshez vezet

©M J Larkin Biology & Biochemistry. The Queen’s University of Belfast.

DNS károsodások

G A C T

ds DNS törés Hamis pár

Timidin dimer

AP hely

Kovalens keresztkötés

ss törés

C-U dezaminálás

BER javítás és epigenetika kapcsolata

DNS glikoziláz

Hibás bázis vagy metil-citozin

Kivágott bázis UNG/TDG

TDG(UDG)-függő aktív demetiláció

Uracil-DNS:

- közvetlen mérés a genomi DNS-ből a személyre

szabott gyógyítás indikátora lehet

- mintázatának feltérképezése a jelátviteli

funkciók megértéséhez is kell

• Hogyan mérhető a genomi uracil? • Több módszer létezik: kvalitatív, kevéssé

érzékeny • Tömegspektrometria: viszonylag megbízható, de

hosszadalmas, indirekt • EGYIK SEM ALKALMAS A KÖRNYEZET

FELDERÍTÉSÉRE!

N U N N N N N N N N N N N N N N N N N N N

N N N N N N N N N N Pfuwt pol 5’

5’

N U N N N N N N N N N N N N N N N N N N N

N N N N N N N N N N 5’

5’

PfuV93 pol

0 10 20 30 40

0

10000

20000

30000

40000

50000

Pfu V93 (544b)

Pfu wt (544b)

flu

ore

sc

en

ce

cycle number

Cq

Sh

ift

0 10 20 30 40

0

10000

20000

30000

40000

50000 Pfu V93 (1057b)

Pfu wt (1057b)

flu

ore

sc

en

ce

cycle number

Cq shift

PCR-alapú

assay:

Közvetlen

Egylépcsős

Kvantitatív

Horváth and Vértessy, Nucleic Acids Research, 2010

Muha et al PLoS Genetics, 2012

0 100-50

050

100150200250300350400450

5FUdR added (M)

de

ox

yu

rid

ine

co

nte

nt

(1/m

illi

on

)

wt MEF

Ung-,- MEF

1 10 100 1000

25

50

75

100V

iab

ilit

y (

%)

5FUdR (M)

wt MEF

Ung-,- MEF

0

250

500

750

6500

7000

7500

8000

8500

de

ox

yu

rid

ine

co

nte

nt

(1/m

illi

on

)

5 10 15 20 25 30 35 405

10

15

20

25

30

35

40 wt E. coli

Ung- E. coli

Dut-,Ung- E. coli

Cq

(P

fu w

t)

Cq (Pfu V93)+ + - + + + + -

+ - - + - - - -

- - - - - 30.7 61.3 -

dut

ung

5FUdR (µM)

A B

C

D

Génhiányos sejtek

Génhiányos sejtek

és FUdR kezelés

Génhiányos sejtek

FUdR kezelés

Sejtciklus állapotok

A DNS-beli uracil tartalom

a kvantitatív PCR módszerrel

az egyes különböző sejtekben

és állapotokban

-sejtciklus fázisok,

- gyógyszeres kezelés,

- génkiütések

jól mérhető, „tetszőlegesen”

feltérképezhető

disc sal.gl.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Rela

tive d

UT

Pase

mR

NA

le

vel

E L1 L2 L3 P

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Re

lative

dU

TP

ase

mR

NA

le

ve

l

Developmental stages

DA

PI

dU

TPas

e

WT RNAi

dUTPáz jelenléte negatív korrelációt mutat a DNS-beli uracil szinttel

Uracil-DNA in Drosophila

Muha et al. 2012, PLoS Gen.

Uracil szint

dUTPáz szint

0%

20%

40%

60%

80%

100%

21883 21883; DmDut20

21883; DmDut29

21884 21884; DmDut20

21884; DmDut29

WT

blistered

MS1096 siRNA

0

100

200

300

400

500

dut RNAino

of

TU

NE

L p

ositiv

e c

ells

/im

g.

dis

c

WT

WT RNAi

deformed

dUTPáz gátlása transzgénikus muslicában letális

Uracil-DNA in Drosophila

TUNEL assay Báb-állapotbeli elhalás

WT RNAi

Muha et al. 2012, PLoS Gen.

dUTPáz gátlás egyes szöveti régiókra irányítható: ahol gátolva van, pontosan ott elhal a szövet!

Ecetmuslica modellszervezet: A dUTPáz élet/halál döntést közvetít,

a DNS-beli uracil jelenléte a fejlődési állapottól függ

A dUTPáz jelenlétében túlélnek, hiányában elhalnak a szövetek

Konklúziók:

A DNS módosulások karcinogén hatásuk mellett más szerepeket is betöltenek A DNS-beli uracil adekvát példája a kettős szerepnek A rákterápiában gyakori gyógyszerek hatásmechanizmusát vizsgáljuk többféle nézőpontból Módszert alkottunk a DNS-beli uracil genom-környezetbeli feltérképezésre A dUTPáz lényegi voltát igazoltuk, jelenleg a kapcsolódó jelátviteli utakat vizsgáljuk

Genom Metabolizmus

Laboratórium

Köszönet:

Hudecz Ferenc

Perczel András

ELTE

Erdélyi Miklós

Szabad János

Henn László

SZBK Genetika