in vitro 透析膜実験系による予測 - Nagasaki U- 1 - 修士論文粘性添加剤併用時の肝臓表面からの薬物吸収速度の in vitro 透析膜実験系による予測

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修士論文

粘性添加剤併用時の肝臓表面からの薬物吸収速度の

in vitro 透析膜実験系による予測

長崎大学大学院医歯薬学総合研究科

臨床薬学講座薬剤学研究室

近藤理美

2009 年

- 2 -

－目次－

緒言 3

実験方法 4

(1) 薬液調製 4 (2) 粘度測定 4 (3) In vitro透析膜透過実験 4 (4) 限外ろ過遠心 5 (5) 薬物の定量 5

結果および考察 7

Ⅰ 肝臓表面からの薬物吸収速度に及ぼす粘度の影響 7

Ⅰ-a. 粘性添加剤の粘度 7 Ⅰ-b. 粘度と肝臓表面からの薬物吸収速度との相関 8

Ⅱ 分子量の異なる薬物の in vitro 透析膜透過性 9

Ⅱ-a. 低分子モデル薬物の in vitro 透析膜透過性 9 Ⅱ-b. 高分子モデル薬物の in vitro 透析膜透過性 13

Ⅲ 肝臓表面からの薬物吸収速度と in vitro 透析膜透過性との相関 16

Ⅲ-a. 低分子モデル薬物における相関 16 Ⅲ-b. 高分子モデル薬物における相関 17

結論 19

謝辞 20

引用文献 21

- 3 -

緒言

当研究室では、薬物の新規投与形態として臓器表面への直接投与法を提案し、

肝臓 [1-9]、胃 [10-12] および腎臓 [13,14] などの腹腔内臓器表面からの薬

物吸収動態に関して、モデル薬物を用いて検討してきた。臓器表面投与法を実

際に臨床応用する場合、投与部位近傍での薬物の徐放性や局所滞留性を向上さ

せた製剤の開発が必要となるが、その手法として、薬液に粘性を付与する方法

がまず考えられる。当研究室でも、粘性添加剤として carboxymethylcellulose

sodium salt、polyvinyl alcohol を選択し、ラット肝臓表面からの各種モデル化合物

の吸収に及ぼす影響について検討し [15,16]、粘性の増大に伴い肝臓表面から

の薬物吸収動態を抑制できる可能性を示している。肝臓表面へ適用する製剤を

合理的に設計するために、製剤の物理化学的性質に基づいて、肝臓表面からの

薬物吸収性を予測する必要がある。

そこで本研究では、粘性添加剤併用時のラット肝臓表面からの薬物吸収速度

を in vitro で簡便に予測できる実験評価系を確立するため、粘度や透析膜の透過

性に及ぼす粘性添加剤の影響を調べ、in vivo における肝臓表面からの薬物吸収

速度定数との相関性を解析した。

- 4 -

実験方法

(1) 薬液調製

Phenolsulfonphthalein（PSP, Mw 354, ナカライテスク）を phosphate-buffer（PB;

pH 7.4 等張リン酸緩衝液）に、5-fluorouracil（5-FU, Mw 130, ナカライテスク）

および fluorescein isothiocyanate-dextran（FITC-dextran, FD: FD-4, Mw 4,400,

Sigma）については、phosphate-buffered saline（PBS; pH 7.4 等張リン酸緩衝液：

生理食塩水 = 1:1 (v/v)）に溶解させた。PSP、5-FU および FD-4 溶液（10 mg/mL）

10 mL に対し、carboxymethylcellulose sodium salt（CMC-Na, Sigma）を 0.1 g、0.3

g、あるいは polyvinyl alcohol（PVA, ナカライテスク）を 1.5 g の割合で添加後、

加熱撹拌し（80 C 以下）、CMC-Na 1%、3%（w/v）および PVA 15%（w/v）薬液

を調製した。

(2) 粘度測定

PB 100 mL に対し、CMC-Na を 0.5, 1, 2, 3 g、PVA は 1, 5, 10, 15, 20 g の割合で

添加後、一晩加熱撹拌し(80°C 以下)、粘度測定用の試料とした。

恒温水槽を用いて粘度測定用試料を 37°Cに保ち、TVB-10形粘度計(東機産業)

により粘度測定を行った。粘度は測定開始から 2 分後の粘度(mPa·s)を記録した。

(3) In vitro 透析膜透過実験

PSP、5-FU および FD-4 の CMC-Na 1%、3%薬液および PVA 15%薬液を、透過

実験用の試料とした。セルロース製透析膜（Molecular weight cut off (MWCO):

12,000～14,000; Viskase Sales Co.）あるいは再生セルロース製透析膜（MWCO:

- 5 -

50,000; Spectrum Laboratories Inc.）中に薬液を 3 mL 封入して両端をクローサーで

止め（ドナー側）、PB または PBS（300 mL）を満たしたビーカー内（レシーバ

ー側）に入れ、スターラーを用いて 360 分間攪拌した（Fig. 1）。レシーバー側か

ら経時的に 0.15 mL をサンプリングし、定量に供した。なお、サンプリング後は、

レシーバー側に 0.15 mL の PB あるいは PBS を加えた。

Fig. 1 Scheme of experimental method for in vitro dialysis membrane permeation.

(4) 限外ろ過遠心

PSP の CMC-Na 1%薬液および PVA 10%、15%、20%薬液を、限外ろ過遠心用

の試料とした。スピンカラム（VIVASPIN 500; VIVASCIENCE）に薬液 0.4 mL を

入れ、15,000 rpm で 20 分間遠心分離（微量高速遠心機 MCX-150; TOMY）した

後、ろ過された試料の定量を行った。

(5) 薬物の定量

(a) PSP

PSP の定量は Hart と Schanker らの方法 [17] に従って行った。レシーバー側

から採取したサンプルをPBで適宜希釈し、希釈したサンプル 50 µLに 1 M NaOH

Donor side (Drug solution 3 mL)

Receiver side (Buffer 300 mL)

Stirrer

Stirring bar



Stirrer



Stirrer



Stirrer

Stirring bar

- 6 -

0.5mLを加え、560 nmにおける吸光度を測定した（紫外可視分光光度計 UV-1600;

島津製作所）。

(b) 5-FU

5-FU の定量は、Shishu ら [18] の方法を参考に行った。レシーバー側から採

取したサンプル 50 µL に PB を 0.5 mL 加え、266 nmにおける吸光度を測定した。

(c) FD-4

FD-4 の定量は Kurtzhals らの方法を参考にして行った [19]。レシーバー側か

ら採取したサンプル 50 µL に PBS を 2 mL 加えて希釈し、励起波長 489 nm、蛍

光波長 515 nm における蛍光強度を測定した（分光蛍光光度計 RF-1500; 島津製

作所）。

- 7 -

CH2CH

OHn

CH2CH

OHn

結果および考察

Ⅰ 肝臓表面からの薬物吸収速度に及ぼす粘度の影響

肝臓表面投与法を臨床応用させる場合、医薬品の製剤設計などの点から、肝

臓表面からの薬物吸収性を正確に予測することは重要である。そこで本章では、

粘性添加剤の粘度を指標とした肝臓表面投与時の薬物吸収速度の予測の可能性

を検討するため、粘性添加剤の粘度を測定し、測定した粘度と肝臓表面からの

薬物吸収速度との相関性について解析した。

Ⅰ-a. 粘性添加剤の粘度

Table 1 には、本研究で用いた粘性添加剤 CMC-Na および PVA の構造式、分子

量並びに粘性添加剤各濃度における粘度を整理している。CMC-Na では、PVA

よりも低い濃度において高い粘度を示した（Table 1）。

Table 1 Viscosity of CMC-Na and PVA solution at 37℃

n

CH2OCH2COONa

HHOH

O

H

OH

O

H n

CH2OCH2COONa

HHOH

O

H

OH

O

H

Viscous additivesConcentration

(w/v)Viscosity (mPa·s)

CMC-Na(Mw 70,000)

PVA

(Mw 22,000)

0.5123

15

10 15 20

17.0285

9660 55900

1.24.7

20.3 98.6

264

Chemical structureViscous additivesConcentration

(w/v)Viscosity (mPa·s)

CMC-Na(Mw 70,000)

PVA

(Mw 22,000)

0.5123

15

10 15 20

17.0285

9660 55900

1.24.7

20.3 98.6

264

Chemical structure

- 8 -

Ⅰ-b. 粘度と肝臓表面からの薬物吸収速度との相関

肝臓表面からの薬物吸収速度に及ぼす粘性添加剤の粘度の影響を調べるため、

当研究室でこれまでに得られた肝臓表面からの PSP の一次吸収速度定数（ka）

[15] と粘度を Table 2 で比較している。

Table 2 Absorption rate constant (ka) of PSP at a dose of 2 mg in the presence of viscous additives after application to rat liver surface.

いずれの条件においても、粘性添加剤の併用により PSP の kaは control 群に比

べ低下した。しかし、CMC-Na 1%と PVA 15%では、粘度がほぼ同等の条件であ

るにも関わらず、PSP の kaの抑制効果が大きく異なった。また、CMC-Na 3%で

は、その他の条件と比較し顕著に高い粘度を有するが、PSP の ka は CMC-Na 1%

とほぼ同じ値を示した。データは示さないが、その他のモデル薬物 5-FU、FD-4

に関しても [16]、粘度と kaとの間には、PSP と同様に相関性は認められなかっ

た。したがって、粘度は肝臓表面からの吸収を制御する因子であるが、吸収速

度を正確に予測するためには、粘度以外の要因を考慮する必要性が明らかとな

った。

Viscous additives Viscosity (mPa·s)

Control

PVA 15%

CMC-Na 1%

CMC-Na 3%

0.81

98.6

285

55900

―

33.9

72.2

70.7

ka (min-1 x 10-3)

8.66

2.94

6.25

6.12

% (vs. ka of control)Viscous additives Viscosity (mPa·s)

Control

PVA 15%

CMC-Na 1%

CMC-Na 3%

0.81

98.6

285

55900

―

33.9

72.2

70.7

ka (min-1 x 10-3)

8.66

2.94

6.25

6.12

% (vs. ka of control)１）

1) K. Nishida, et al., Eur. J. Pharm. Biopharm., 50, 397-402 (2000) .

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Ⅱ 分子量の異なる薬物の in vitro 透析膜透過性

近年、Caco-2 単層膜などを用いた in vitro での膜透過実験より、in vivo におけ

る薬物の消化管吸収を予測する研究が行われているが [20]、肝臓表面での吸収

を予測可能な、肝臓の中皮細胞等を用いた in vitro 評価系は見当たらなかった。

そこで本章では、透析膜のような人工膜を用いて吸収速度を予測できるよう

なパラメーターの算出を試みた。in vitro での簡便な透析膜透過実験を用いて、

低分子モデル薬物 5-FU、PSP および高分子モデル薬物 FD-4 に関して検討を行っ

た。

Ⅱ-a. 低分子モデル薬物の in vitro 透析膜透過性

Fig. 1 に示した方法を用いて、透析膜を介した低分子モデル薬物の PSP および

5-FU の放出量(%)の経時的変化を測定した。なお、in vitro での実験は、in vivo

での肝臓表面投与のデータがある条件について検討を行っている。

Fig. 2 Release profiles of PSP (a) and 5-FU (b) through dialysis membrane from solution in the presence or absence of viscous additives. Each point represents the mean ± S.D. of three experiments.

(a) PSP (b) 5-FU

0

Time (min)

60 120 180 240 300 360

20

40

60

80

100

0

◇ Control■ CMC-Na 1%○ PVA 15%

0

Time (min)

60 120 180 240 300 360

20

40

60

80

100

0

◇ Control■ CMC-Na 1%○ PVA 15%

0

Time (min)

60 120 180 240 300 360

Am

ou

nt

in r

ece

ive

r s

ide

(%

)

20

40

60

80

100

0

◇ Control■ CMC-Na 1%△ CMC-Na 3%○ PVA 15%

0

Time (min)

60 120 180 240 300 360

Am

ou

nt

in r

ece

ive

r s

ide

(%

)

20

40

60

80

100

0

◇ Control■ CMC-Na 1%△ CMC-Na 3%○ PVA 15%

- 10 -

Fig. 2 では、各薬物のレシーバー側への放出量の経時的変化を示している。

透析膜からの PSP の放出は、実験開始後 360 分において、control で約 90%、

CMC-Na 1, 3%で約 80%であったのに対し、PVA 15%では約 50%と放出を大きく

抑制していた。一方、5-FU においては、PSP より速い放出を示し、control では

実験開始後 180 分で、ほとんど放出されていた。また、粘性添加剤による放出

抑制効果は、PSP ほど顕著ではなかった。

粘性添加剤による透析膜からの薬物放出抑制効果の定量的な評価を試みた。

PSP（実験開始後 180 分）および 5-FU（実験開始後 120 分）の透析膜内残存率

の経時変化を片対数グラフで表した（Fig. 3）。いずれの薬物についても直線的な

減少を示した。したがって、透析膜からの PSP および 5-FU の放出は、式 < 1 > に

示すような一次速度式に従うと考えられた。

< 1 >

ここで、Xaは時間 t (min) における透析膜内残存量、X0 は透析膜内封入量、kr

は透析膜からの一次放出速度定数 (min-1) を示す。

Fig. 3 Semi-log plot of remaining amount (% of dose) of PSP (a) and 5-FU (b) in the donor side in dialysis membrane permeation experiment. Each point represents the mean ± S.D. of three experiments.

(a) PSP (b) 5-FU

Re

ma

inin

g a

mo

un

t (%

of

do

se)

1

10

0

100

Time (min)

60 120 180

◇ Control (r2 = 0.990)■ CMC-Na 1% (r2 = 0.991)△ CMC-Na 3% (r2 = 0.992)○ PVA 15% (r2 = 0.999)

Re

ma

inin

g a

mo

un

t (%

of

do

se)

1

10

0

100

Time (min)

60 120 180

◇ Control (r2 = 0.990)■ CMC-Na 1% (r2 = 0.991)△ CMC-Na 3% (r2 = 0.992)○ PVA 15% (r2 = 0.999)

◇ Control (r2 = 0.999)■ CMC-Na 1% (r2 = 0.973)○ PVA 15% (r2 = 0.970)

10

100

Time (min)

30 120

10

60 90


10

100

Time (min)

30 120

10

60 90

tk r ・－

0

a eX

X tk r ・－

0

a eX

X

- 11 -

Table 3 First-order release rate constant (kr) of PSP, 5-FU in the presence or absence of viscous additives in dialysis membrane permeation experiment.

Fig. 3 で得られた片対数グラフの傾きより、各薬液の krを算出し、放出特性の

評価を行った（Table 3）。Table 3 で示しているように、PSP、5-FU の krは、粘性

添加剤により低下した。5-FU では、CMC-Na 1%及び PVA 15%の krは、control

の約半分に低下した。一方、PSP の krは、PVA 15%では大きく低下したのに対

し、CMC-Na 1%および 3%において約 3 分の 2 とほぼ同じ値を示した。

一般に、溶液の粘度と薬物の拡散定数は、反比例することが知られており

（Stokes-Einstein 式）、透析膜中での薬物の拡散を抑制したため、5-FU および PSP

の透析膜からの放出速度が低下したと考えられる。また、PVA においては、薬

物分子と親和性の高い官能基を多数保持しているため [21,22]、薬物分子との

相互作用により放出抑制効果が高かったのではないかと考えられた。

そこで、PSP と粘性添加剤との相互作用について、薬物のタンパク質との結合

性を調べるために利用されている限外ろ過遠心法 [23] を用いて解析した。

Table 4 には、限外ろ過遠心後の PSP ろ過率(%)について示してある。CMC-Na 1%

と比較し、PVA 15%では PSP のろ過率は大きく低下し、PSP は PVA と高い結合

性を示すことが示唆された。また、PVA の濃度上昇に伴って、ろ過率は低下し

た。したがって、先程の透析膜透過実験において、PVA で PSP の放出抑制効果

が高かった一因として、PSP と PVA との間に静電的な結合や吸着などの相互作

Condition5-FU

Control

PVA 15%

CMC-Na 1%

CMC-Na 3%

25.0

12.4

13.9

―

8.8

2.4

5.7

6.1

PSPViscosity (mPa·s)

0.81

98.6

285

55900

kr (min-1 x 10-3)Condition

5-FU

Control

PVA 15%

CMC-Na 1%

CMC-Na 3%

25.0

12.4

13.9

―

8.8

2.4

5.7

6.1

PSPViscosity (mPa·s)

0.81

98.6

285

55900

kr (min-1 x 10-3)

- 12 -

用が関与しているものと推察される。

Table 4 Filtration rate ( filtrated concentration (Cf) / initial concentration (C0) ) of PSP from the drug solution in centrifugal ultrafiltration.

さらに、PSP において、粘性添加剤の添加濃度を変化させ、粘度と kr との関

係について検討し、Fig. 5 には、結果を示している。

Fig. 4 Relationship between release rate constant (kr) of PSP and viscosity in various condition.

CMC-Na、PVA いずれの粘性添加剤においても、低い添加剤濃度では PSP の

kr は粘度の増大に伴って低下した。しかし、ある一定の粘度まで達すると、kr

(a) PVA (b) CMC-Na

kr(m

in-1

x1

0-3

)

0

2

4

6

8

10◇ Control△ PVA 1%□ PVA 5%◆ PVA 10%○ PVA 15%▲ PVA 20%

Viscosity (mPa·s)

100 101 10310-1 102 104 105

kr(m

in-1

x1

0-3

)

0

2

4

6

8

10◇ Control△ PVA 1%□ PVA 5%◆ PVA 10%○ PVA 15%▲ PVA 20%

Viscosity (mPa·s)

100 101 10310-1 102 104 1050

2

4

6

8

10

◇ Control■ CMC-Na 0.5%○ CMC-Na 1%▲ CMC-Na 2%□ CMC-Na 3%

Viscosity (mPa·s)

100 101 10310-1 102 104 1050

2

4

6

8

10

◇ Control■ CMC-Na 0.5%○ CMC-Na 1%▲ CMC-Na 2%□ CMC-Na 3%

Viscosity (mPa·s)

100 101 10310-1 102 104 105

Condition

Control

CMC-Na 1%

PVA 10%

PVA 15%

PVA 20%

Filtration rate (Cf / C0) (%)

99.9 ± 2.10

74.2 ± 2.13

44.6 ± 0.62

36.1 ± 0.89

25.6 ± 1.48

Condition

Control

CMC-Na 1%

PVA 10%

PVA 15%

PVA 20%

Filtration rate (Cf / C0) (%)

99.9 ± 2.10

74.2 ± 2.13

44.6 ± 0.62

36.1 ± 0.89

25.6 ± 1.48

- 13 -

は頭打ちとなる傾向が認められた。これは、粘性を付与した薬液中では、ある

一定の粘度に達すると流動性が低下し、溶液中の薬物の移動が、溶液中の自由

水の移動のみによって起こるようになるためではないかと考えられる [24]。

このような実験系より、薬物の放出を最大限に低下させる適切な添加剤の濃

度を推定できると思われる。

Ⅱ-b. 高分子モデル薬物の in vitro 透析膜透過性

Fig. 5(a)では、高分子モデル薬物 FD-4 のレシーバー側への放出量の経時的変

化、Fig. 5(b)では、FD-4 の透析膜内残存率の経時変化について示している。実験

開始後 360 分における FD-4 放出量は、control、CMC-Na 1%薬液、PVA 15%薬液

の順に 16.4%、15.1%、6.7%と低い値を示した。Fig. 5 より、MWCO12,000-14,000

の透析膜では、FD-4 の透過速度が遅く、放出特性を正確に把握しにくいと考え

られたため、MWCO: 50,000 の透析膜を用いた透過実験を行った(Fig. 6)。

Fig. 5 (a) Release profiles of FD-4 through dialysis membrane (MWCO: 12,000-14,000) from solution in the presence or absence of viscous additives. (b) Semi-log plot of remaining amount (% of dose) of FD-4 in the donor side in dialysis membrane permeation experiment. Each point represents the mean ± S.D. of three experiments.

(a) (b)

500

Time (min)

60 120 180 240


300 360Re

ma

inin

g a

mo

un

t (%

of

do

se) 100

500

Time (min)

60 120 180 240


300 360Re

ma

inin

g a

mo

un

t (%

of

do

se) 100

500

Time (min)

60 120 180 240


300 360Re

ma

inin

g a

mo

un

t (%

of

do

se) 100

0

Time (min)

60 120 180 240 300 360

Am

ou

nt

in r

ece

ive

r s

ide

(%

)

10

20

30

0

◇ Control■ CMC-Na 1%○ PVA 15%40

50

0

Time (min)

60 120 180 240 300 360

Am

ou

nt

in r

ece

ive

r s

ide

(%

)

10

20

30

0


50

- 14 -

Fig. 6(a)では、FD-4 のレシーバー側への放出量の経時的変化について示してい

る。実験開始後 360 分における FD-4 の放出量は、control で約 40%、CMC-Na 1%

で約 30%であったのに対し、PVA 15%では約 20%と高い放出抑制効果を示した。

次に、FD-4 の透析膜内残存率の経時変化を片対数グラフで表したところ（Fig.

6(b)）、いずれの場合も直線的な減少を示した。したがって、FD-4 の透析膜から

の放出は、一次速度式に従うことが示され、Fig. 6(b)で得られた片対数グラフの

傾きより、各薬液の krを算出した（Table 5）。

Fig. 6 (a) Release profiles of FD-4 through dialysis membrane (MWCO: 50,000) from solution in the presence or absence of viscous additives. (b) Semi-log plot of remaining amount (% of dose) of FD-4 in the donor side in dialysis membrane permeation experiment. Each point represents the mean ± S.D. of three experiments.

Table 5 First-order release rate constant of FD-4 in the presence or absence of viscous additives.

(b) (a)

0

Time (min)

60 120 180 240 300 360

Am

ou

nt

in r

ece

ive

r s

ide

(%

)

10

20

30

0


50

0

Time (min)

60 120 180 240 300 360

Am

ou

nt

in r

ece

ive

r s

ide

(%

)

10

20

30

0


50

500

Time (min)

60 120 180 240 300 360Re

ma

inin

g a

mo

un

t (%

of

do

se) 100


500

Time (min)

60 120 180 240 300 360Re

ma

inin

g a

mo

un

t (%

of

do

se) 100


Condition kr (min-1 x 10-3)

Control

PVA 15%

CMC-Na 1%

1.41

0.70

1.09

Viscosity (mPa·s)

0.81

98.6

285

Condition kr (min-1 x 10-3)

Control

PVA 15%

CMC-Na 1%

1.41

0.70

1.09

Viscosity (mPa·s)

0.81

98.6

285

- 15 -

Table 5 で示しているように、高分子モデル薬物でも低分子モデル薬物と同様

に透析膜を変更することで、放出特性を評価できる kr を算出できた。

FD-4 の kr は、CMC-Na 1%において control の約 80%、PVA 15%では control の

約 50%に低下し、粘性添加剤による放出抑制効果は PSP や 5-FU と異なる傾向を

示した。したがって、薬物と粘性添加剤との組み合わせにより薬物放出抑制効

果が異なる可能性が示唆された。

- 16 -

Ⅲ 肝臓表面からの薬物吸収速度と in vitro 透析膜透過性との

相関

前章において in vitro における透析膜からの薬物放出速度定数を指標として in

vivo における肝臓表面からの薬物吸収速度定数を予測できる可能性を示した。

そこで本章では、肝臓表面からの薬物吸収速度を予測するため、in vitro にお

ける透析膜からの薬物放出速度定数と in vivo における肝臓表面からの薬物吸収

速度定数との相関性について解析した。

Ⅲ-a. 低分子モデル薬物における相関

本節では、低分子モデル薬物 PSP、5-FU について、Ⅱ章より得られた in vitro

での krと、当研究室の以前の報告 [15,16] より in vivo での肝臓表面からの ka

との相関性について解析した（Fig. 7）。

Fig. 7 の結果より、PSP、5-FU ともに、相関性の高い直線関係が得られた（相

関係数; PSP, r2 = 0.990: 5-FU, r2 = 0.928）。したがって、低分子モデル薬物 PSP 及

び 5-FU において、in vitro で求めた krより、in vivo において粘性添加剤併用時

に、control に対しどの程度 kaを抑制するか予測することができると考えられる。

また、Fig. 4 のような検討から krを求め、Fig. 7 のような相関図を用いて ka を予

測することも可能と思われる。

- 17 -

Fig. 7 Correlation between release rate constant (kr) and absorption rate constant (ka) of PSP (a), 5-FU (b) in the presence or absence of viscous additives.

Ⅲ-b. 高分子モデル薬物における相関

高分子モデル薬物の FD-4 について、Ⅱ章より得られた MWCO: 50,000 の透析

膜における in vitro での放出速度定数と、当研究室の以前の報告 [16] より in

vivo での肝臓表面からの吸収速度定数との相関について解析を行った（Fig. 8）。

Fig. 8 の結果より、FD-4 においても、相関性の高い直線関係が得られた（相

関係数; r2 = 0.978）。

したがって、高分子モデル薬物 FD-4 の場合も、MWCO: 50,000 の透析膜を用

いることで、in vitro で求めた krより、in vivo で粘性添加剤併用時に、control に

対しどの程度 kaを抑制するか予測することができると考えられる。

(a) PSP (b) 5-FU

5 10 15 20 25 30

ka

(min

-1x

10

-3)

4

5

6

7

8

kr (min-1x10-3)

PVA 15%

Control

CMC-Na 1%

y = 0.171x + 3.004(r2 = 0.928)

5 10 15 20 25 30

ka

(min

-1x

10

-3)

4

5

6

7

8

kr (min-1x10-3)

PVA 15%

Control

CMC-Na 1%

y = 0.171x + 3.004(r2 = 0.928)

0 2 4 6 8 10

ka

(min

-1x

10

-3)

0

2

4

6

8

10

kr (min-1x10-3)

PVA 15%

Control

CMC-Na 1%

CMC-Na 3%

y = 0.880x + 0.931(r2 = 0.990)

0 2 4 6 8 10

ka

(min

-1x

10

-3)

0

2

4

6

8

10

kr (min-1x10-3)

0 2 4 6 8 10

ka

(min

-1x

10

-3)

0

2

4

6

8

10

kr (min-1x10-3)

PVA 15%

Control

CMC-Na 1%

CMC-Na 3%

y = 0.880x + 0.931(r2 = 0.990)

- 18 -

Fig. 8 Correlation between release rate constant (kr) and absorption rate constant (ka) of FD-4 in the presence or absence of viscous additives.

本研究で in vitro において透析膜のような人工膜の透過性より、肝臓表面から

の薬物吸収速度を予測できる可能性が示唆されたのは、PSP、5-FU 及び FD-4 は

水溶性薬物であり、肝臓表面からの吸収は細孔輸送の寄与が大きいためと考え

られる [2,9]。

また、本研究では、粘性添加剤として CMC-Na 及び PVA を選択したが、その

他にも hyaluronic acid、chitosan、alginic acid など様々な粘性添加剤が存在する

[25]。本研究の透析膜透過実験を用いて、他の粘性添加剤を併用した場合の肝

臓表面投与時の吸収速度の予測も可能と考えられ、薬物と粘性添加剤の最適な

混合比などの探索に役立つのではないかと考えられる。

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

k a(m

in-1

x1

0-3

)

0.5

1

1.5

kr (min-1x10-3)

PVA 15%

Control

CMC-Na 1%

y = 0.831x + 0.182(r2 = 0.978)

1.4 1.6 1.80.4 0.6 0.8 1.0 1.2

k a(m

in-1

x1

0-3

)

0.5

1

1.5

kr (min-1x10-3)

PVA 15%

Control

CMC-Na 1%

y = 0.831x + 0.182(r2 = 0.978)

1.4 1.6 1.8

- 19 -

結論

以上、in vitro での簡便な透析膜透過実験から薬物の一次放出速度定数を算出

し、in vivo での肝臓表面からの薬物吸収を予測できる可能性が示された。今回

得られた知見は、肝臓表面投与法に最適な製剤の設計において、有用な基礎的

指針になると考えられる。

- 20 -

謝辞

終わりに臨み、本研究に際して終始御懇篤なる御指導、御鞭撻を賜りました

長崎大学大学院医歯薬学総合研究科中村純三教授、西田孝洋准教授、麓伸太

郎助教、兒玉幸修博士並びに長崎大学医学部・歯学部附属病院薬剤部佐々木

均教授、長崎大学大学院医歯薬学総合研究科病院薬学研究室中嶋幹郎教授に

衷心より深甚なる謝意を表します。

また、本論文を作成するにあたり、御校閲ならびに御助言頂きました長崎大

学大学院医歯薬学総合研究科医療情報解析学研究室和田光弘准教授に心から

感謝の意を表します。

さらに、実験の一部に御協力頂いた永尾春歌学士、西村知紗学士、佐藤僚介

氏、松枝慧氏に深く感謝いたします。また、種々の有益な御助言と御指導頂き

ました長崎大学薬学部薬剤学研究室員一同に深く感謝いたします。

- 21 -

引用文献

[1] Nishida, K., Sato, N., Sasaki, H. and Nakamura, J., Absorption of organic

anions as model drugs following application to rat liver surface in-vivo. J.

Pharm. Pharmacol. 46: 867-870 (1994)

[2] Nishida, K., Sato, N., Sasaki, H. and Nakamura, J., Mechanism for drug

absorption from rat-liver surface membrane: effect of dose and transport

inhibitors on the pharmacokinetics of phenol red. J. Pharm. Pharmacol. 47:

227-231 (1995)

[3] Nishida, K., Sato, N., Sasaki, H. and Nakamura, J., Absorption characteristics

of dextrans with different molecular weights from the liver surface membrane

in rats: implications for targeting to the liver. J. Drug Target. 4: 141-150

(1996)

[4] Nishida, K., Sato, N., Nakakoga, Y., Mukai, T., Sasaki, H. and Nakamura, J.,

Effect of application volume and area on the absorption of phenol red, as a

model drug, from the liver surface in rats. J. Pharm. Pharmacol. 49: 976-980

(1997)

[5] Nakamura, J., Yoshida, Y., Mera, K., Mukai, T., Nishida, K. and Sasaki, H.,

Continuous microinstillation of phenol red on liver surface for liver

site-selective delivery. Biol. Pharm. Bull. 22: 713-715 (1999)

[6] Nishida, K., Yoshida, Y., Mukai, T., Kawakami, S., Sakaeda, T., Nakashima,

M., Sasaki, H. and Nakamura, J., Effect of instillation method on the

absorption of phenolsulphonphthalein as a model drug from the liver and small

intestinal serosal surface in rats. J. Pharm. Pharmacol. 53: 1341-1346 (2001)

[7] Nishida, K., Honda, T., Nakashima, M., Sasaki, H. and Nakamura, J., Influence

of liver disease on phenolsulfonphthalein absorption from liver surface to

examine possibility of direct liver surface application for drug targeting. Biol.

Pharm. Bull. 26: 988-993 (2003)

[8] Nishida, K., Fujiwara, R., Kodama, Y., Fumoto, S., Mukai, T., Nakashima, M.,

Sasaki, H. and Nakamura, J., Regional delivery of model compounds and

5-fluorouracil to the liver by their application to the liver surface in rats: its

implication for clinical use. Pharm. Res. 22: 1331-1337 (2005)

[9] Kodama, Y., Fumoto, S., Nishi, J., Nakashima, M., Sasaki, H., Nakamura, J.

and Nishida, K., Absorption and distribution characteristics of 5-fluorouracil

(5-FU) after an application to the liver surface in rats in order to reduce

- 22 -

systemic side effects. Biol. Pharm. Bull. 31: 1049-1052 (2008)

[10] Nakamura, J., Tsurumaru, A., Mera, K., Mukai, T., Nishida, K. and and Sasaki,

H., Absorption of drugs applied to the gastric serosal surface in rats. Pharm.

Pharmacol. Commun. 5: 519-522 (1999)

[11] Mukai, T., Tsurumaru, A., Mera, K., Nishida, K., Nakamura, J., Sasaki, H. and

and Sakaeda, T., Absorption Characteristics of model drugs from the gastric

serosal surface in rats. Pharm. and Pharmacol. Commun. 5: 609-614 (1999)

[12] Nakamura, J., Kobayashi, K., Fumoto, S., Nishi, J., Mukai, T., Nakashima, M.,

Sasaki, H. and Nishida, K., Stomach- and site-selective delivery of

5-fluorouracil following its application on the gastric serosal surface in rats.

Biol. Pharm. Bull. 28: 1049-1053 (2005)

[13] Kawakami, S., Horimoto, T., Nishida, K., Hirayama, R., Mukai, T., Nakashima,

M., Sasaki, H., Sakaeda, T. and Nakamura, J., Kidney- and site-selective

delivery of 5-fluorouracil utilizing the absorption on the kidney surface in rats.

Biol. Pharm. Bull. 25: 928-930 (2002)

[14] Nakamura, J., Horimoto, T., Hirayama, R., Mukai, T., Nakashima, M., Sasaki,

H. and Nishida, K., Further studies on the kidney- and site-selective delivery of

5-fluorouracil following kidney surface application in rats. Biol. Pharm. Bull.

26: 1761-1764 (2003)

[15] Nishida, K., Nakakoga, Y., Sato, N., Kawakami, S., Mukai, T., Sasaki, H.,

Sakaeda, T. and Nakamura, J., Effect of viscous additives on drug absorption

from the liver surface in rats using phenol red as a model. Eur. J. Pharm.

Biopharm. 50: 397-402 (2000)

[16] 堀下美由紀, 肝臓表面投与の癌化学療法への応用に向けた製剤学的検

討：5-fluorouracil の吸収動態制御. 修士論文 (2005)

[17] Hart, L. G. and Schanker, L. S., The chemical forms in which phenol red is

secreted into the bile of rats. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 123: 433-435 (1966)

[18] Shishu, Gupta, N. and Aggarwal, N., Stomach-specific drug delivery of

5-fluorouracil using floating alginate beads. AAPS PharmSciTech 8: Article 48.

(2007)

[19] Kurtzhals, P., Larsen, C. and Johansen, M., High-performance size-exclusion

chromatographic procedure for the determination of fluoresceinyl

isothiocyanate dextrans of various molecular masses in biological media. J.

Chromatogr. 491: 117-127 (1989)

[20] Saitoh, R., Sugano, K., Takata, N., Tachibana, T., Higashida, A., Nabuchi, Y.

and Aso, Y., Correction of permeability with pore radius of tight junctions in

Caco-2 monolayers improves the prediction of the dose fraction of hydrophilic

- 23 -

drugs absorbed by humans. Pharm. Res. 21: 749-755 (2004)

[21] Yamaoka, T., Tabata, Y. and Ikada, Y., Comparison of body distribution of

poly(vinyl alcohol) with other water-soluble polymers after intravenous

administration. J. Pharm. Pharmacol. 47: 479-486 (1995)

[22] Mikos, A. G. and Peppas, N. A., Systems for controlled release of drugs V.

Bioadhesive systems. S.T.P. Pharma 2: 705-716 (1986)

[23] 緒方宣邦., 野島博., 遺伝子工学キーワードブック改訂第 2 版. 羊土社;

2001.

[24] Momo, K., Shiratsuchi, T., Taguchi, H., Hashizaki, K., Saito, Y., Makimura, M.

and Ogawa, N., Preparation and clinical application of indomethacin gel for

medical treatment of stomatitis. Yakugaku Zasshi. 125: 433-440 (2005)

[25] Ludwig, A., The use of mucoadhesive polymers in ocular drug delivery. Adv.

Drug Deliv. Rev. 57: 1595-1639 (2005)

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in vitro 透析膜実験系による予測 - Nagasaki U- 1 - 修士論文 粘性添加剤併用時の肝臓表面からの薬物吸収速度の in vitro 透析膜実験系による予測

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