INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ESTUDIOSSUPERIORES DE MONTERREY

CAMPUS MONTERREYDIVISIÓN DE INGENIERÍA Y AGRICULTURA

EL PAPEL DE LA TREHALOSA EN LACRIOPRESERVACION DE Saccharomyces cerevisiae

Meyen ex E.C. Hansen

T E S I SPRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL

PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE:

MAESTRIA EN CIENCIASESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA

EDGARD OSWALDO CALDERÓN ARCE

FEBRERO DEL 2002

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORESDE MONTERREY

CAMPUS MONTERREYDIVISIÓN DE INGENIERÍA Y AGRICULTURA

EL PAPEL DE LA TREHALOSA EN LA CRIOPRESERVACIÓN DESaccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen

TESIS

PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO

ACADÉMICO DE:

MAESTRÍA EN CIENCIAS

ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA

EDGARD OSWALDO CALDERÓN ARCE

Febrero del 2002

ÍNDICEÍNDICE I

ÍNDICE DE TABLAS viiÍNDICE DE FIGURAS ix

1. INTRODUCCIÓN 11.1. Generalidades de Saccharomyces cereviseae 11.2. Métodos de almacenaje de cepas 41.3. Criopreservadores 51.4. La trehalosa 7

2. ANTECEDENTES 11

3. OBJETIVOS 16

3.1. Objetivo general 163.2. objetivos particulares 16

4. MATERIAL Y MÉTODOS 174.1. Microorganismo de estudio 17

4.1.1. Preparación y almacenaje de resguardos 174.1.2. Reactivación de la cepa 174.1.3. Cinética de crecimiento 18

4.2. Porcentaje de células muertas 184.2.1.1. Interpretación 194.2.1.2. Cálculo de los resultados 19

4.3. Análisis fisiológico: Asimilación de aminoácidosy carbohidratos para levaduras 19

4.3.1. Pruebas de asimilación de aminoácidos 20

iii

4.3.2. Interpretación de resultados 204.3.3. Pruebas de asimilación de carbohidratos 214.3.4. Método Api 20 AUX 22

4.4. Determinación de trehalosa 224.4.1. Pasos preparativos para la extracción de trehalosa 22

4.4.1.1. Preparación de crisoles 224.4.1.2. Obtención de 12 mg de células (peso seco) 234.4.1.3. Extracción de la trehalosa 23

4.5 Determinación de azúcar intracelular 244.5.1 Cuantificación de azúcares por el método del reactivo de

Antrona 244.5.1.1 Curva de calibración 244.5.1.2 Análisis de las muestras tratadas 26

4.5.2 Determinación de trehalosa mediante el métodoenzimático para la determinación de glucosa (Peroxidasaoxidasa) 25

4.5.3 Contenido de trehalosa intracelular total 264.6 Análisis morfológico 274.7 Número de cicatrices 274.8 Tratamientos térmicos 284.9 Tratamiento 40 °C 294.10 Tratamiento 10 °C 294.11 Estrategia experimental tratamiento térmico a 10 °C 304.12 Estrategia experimental tratamiento térmico a 40 °C 314.13 Preparación de las cepas para congelación 324.14 Reactivación de los tratamientos 334.15 Análisis estadístico y evaluación 334.16 Diseño experimental 345 Resultados 36

5.1 Diagnóstico inicial: características morfológicas yfisiológicas 36

iv

5.1.1 Diagnostico inicial. Cinética y porcentajede células muertas 36

5.1.2 Diagnostico de los viales de resguardo 365.1.3 Análisis de las características morfológicas

y fisiológicas 375.1.4 Determinación del número de cicatrices 385.1.5 Asimilación de aminoácidos 395.1.6 Asimilación de carbohidratos 40

5.2 Características de la cepa previa a los tratamientos térmicos(cél/ ml_, número de cicatrices y contenido de glucosay hexosas totales 41

5.3 Contenido de azúcares totales, glucosa y trehalosa posterior altratamiento térmico 43

5.4 Comparación del contenido de trehalosa entre tratamientos(obtenidos por el método de Peroxidasa oxidasa) 45

5.4.1 Comparación del contenido de trehalosa entre tratamientos(obtenidos por el método de Antrona) 46

5.5 Resultados de los análisis elaborados después de 60 días dealmacenaje a -86 °C 47

5.6 Porcentaje de células muertas y su comparación entretratamientos 475.6.1 Porcentaje de células muertas vs. contenido

de trehalosa 485.7 Número de cél/mL respecto a la condición de almacenaje

después de su reactivación 515.8 Pruebas fisiológicas (asimilación de aminoácidos y carbohidratos

antes y después del almacenaje a -86 °C 545.8.1 Pruebas de asimilación de aminoácidos 545.8.2 Pruebas de asimilación de carbohidratos 555.8.3 Pruebas rápidas de identificación Api 20 C AUX 56

6 Discusiones 57

V

7 Conclusiones 658 Bibliografía citada 679 Anexos 71

vi

Índice de tablas

No. Descripción Pag.1 Carbohidratos y aminoácidos a usar en las pruebas de asimilación 21

2 Curva estándar para cuantificar azúcares totales por el método de 25antrona

3 Condiciones de almacenamiento 32

4 Diagnóstico base para la asimilación de aminoácidos 39

5 Diagnóstico base para la asimilación de carbohidratos 40

6 Diagnóstico base de las pruebas fisiológicas mediante el sistema 41rápido Api 20C AUX

7 Número de cél/ mL, frecuencia y contenido de glucosa y hexosas 42totales de la cepa antes del tratamiento térmico

8 Contenido de trehalosa en los tratamientos térmicos con y sin 43trehalosa incluida en el vehículo de tratamiento.

9 Determinación de trehalosa (mg/gcel) por dos diferentes métodos 44antrona y trehalasa

10 Comparación del contenido de trehalosa entre los diferentes 45tratamientos provenientes del método de Peroxidasa oxidasa (por elmétodo de muestras pareadas de t-studen, SPSS para Windowsversión 9)

11 Comparación del contenido de trehalosa entre los diferentes 46tratamientos Por el método de antrona 40 °C (por el método demuestras pareadas de t-student, SPSS para Windows versión 9)

12 Asimilación de aminoácidos para el control de 10 °C después de 60 72días de almacenamiento

13 Asimilación de aminoácidos para el tratamiento a 10 °C sin la adición 73de trehalosa al medio después de 60 días de almacenamiento

14 Asimilación de aminoácidos para el tratamiento a 10 °C con adición de 74trehalosa al medio externo después de 60 días de almacenamiento

vii

15 Asimilación de aminoácidos para el control de 40 °C, después de 60 75días de almacenamiento

16 Asimilación de aminoácidos para el tratamiento a 40 °C sin adición de 76trehalosa al medio externo después de 60 días de almacenamiento

17 Asimilación de aminoácidos para el tratamiento a 40 °C con adición de 77trehalosa al medio externo después de 60 días de almacenamiento

18 Asimilación de carbohidratos para el control 10 °C después de 60 días 78de almacenamiento

19 Asimilación de carbohidratos para el tratamiento a 10 °C sin la adición 78de trehalosa externa al medio después de 60 días de almacenamiento

20 Asimilación de carbohidratos para el tratamiento a 10 °C con la adición 79de trehalosa externa al medio después de 60 días de almacenamiento

21 Asimilación de carbohidratos para el control de 40 °C después de 60 79días de almacenamiento

22 Asimilación de carbohidratos para el tratamiento a 40 °C sin la adición 80de trehalosa externa al medio después de 60 días de almacenamiento

23 Asimilación de carbohidratos para el tratamiento a 40 °C con la adición 80de trehalosa externa al medio después de 60 días de almacenamiento

24 Pruebas Api 20 C AUX para el control de 10 °C después de 60 días de 81almacenamiento

25 Pruebas Api 20 C AUX para el tratamiento 10 °C sin la adición de 81trehalosa externa al medio después de 60 días de almacenamiento

26 Pruebas Api 20 C AUX para el tratamiento 10 °C con la adición de 82trehalosa externa al medio después de 60 días de almacenamiento

27 Pruebas Api 20 C AUX para el control de 40 °C después de 60 días de 82almacenamiento

28 Pruebas Api 20 C AUX para el tratamiento 40 °C sin la adición de 83trehalosa externa al medio después de 60 días de almacenamiento

29 Pruebas Api 20 C AUX para el tratamiento 40 °C con la adición de 83trehalosa externa al medio después de 60 días de almacenamiento

30 Constituyentes del medio basal para las pruebas de aminoácidos y 90carbohidratos

31 Cantidades en gramos de los aminoácidos usados en las pruebas de 91fisiológicas

32 Cantidades en gramos de los carbohidratos usados en las pruebas de 91fisiológicas

viii

Índice de figuras

No. Descripción Pag._

Ciclo de vida de Saccharomyces cerevisea: Esporulación. Cuando seaparean células hapoides de diferente tipo sexual, se obtienen célulasdiploides. Estas pueden dividirse mitóticamente, en el último caso seobtienen cuatro esporas haploides (Gonzáles, 2000)

2Ciclo de vida de Saccharomyces cerevisiae. Las células haploides ydiploides pueden tener diferentes vías de desarrollo. Las señalesfisiológicas están implicadas en la diferenciación tanto hacia elcrecimiento pseudohifal como al invasivo (Gonzáles, 2000)

3Representación de la acción protectora de la Trehalosa (Lodato, ef al., 91999)

4Biosíntesis de la Trehalosa en Saccharomyces cerevisiae (Arguelles, 102000)

5Observación del desempeño de la cepa de S.cerevisiae al ser 36reactivada del vial original aportado por CCM

6Diagnostico de los viales de resguardo 37

7Observación del número de cicatrices en una cinética de 48 h 38

8 Porcentaje de células muertas en función de la condición dealmacenaje según la nomenclatura de la estrategia experimental de las 48

Figuras 4.11 y 4.12.

ix

9 Porcentaje de células muertas y el contenido intracelular de trehalosa 50para el tratamiento térmico a 40 °C

10Porcentaje de células muertas y el contenido intracelular de trehalosa 50para el tratamiento térmico a 10 °C

11Número de células por mililitro agrupadas por serie, al reactivar los 52tratamientos después de 60 días de almacenamiento

12 Contenido de trehalosa intracelular vs. células por mililitro de la seriede tratamientos térmico a 40 °C después de de la reactivación de la 53cepa

13Contenido de trehalosa intracelular vs. células por mililitro de la serie 54de tratamientos térmico a 10 °C después de la reactivación de la cepa

14 Relación de los aminoácidos en los que no se observó crecimiento para las 55diferentes series (a excepción de la Usina)

15 Resultado de la asimilación de Trehalosa por medio de la prueba rápida de 56identificación Api 20 AUX en las diferentes series

16Observación de las cicatrices en levadura por medio de la tinción deBlanco de calcoflour a un aumento de 40X 88

17Observación de las cicatrices al microscopio de florescencia (flechasamarillas y rojas) 88

16

vivas. Flechas anaranjado indica células muertasObservación de células muertas. Flechas verdes indican a las células 00

X

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Generalidades de Saccharomyces cerevisiae

Las levaduras son hongos de la subdivisión Ascomycotina, clase

Ascomycetes, orden Endomycetales, pertenecientes a la familia

Saccharomycetaceae (Winter, 1881). Están agrupadas en 28 géneros y 159

especies. A nivel de género se caracterizan por presentar células

vegetativas que se reproducen por gemación, partición multilateral y/o

elipsoidal. Las ascosporas o estructuras reproductoras sexuales son

similares a las células vegetativas, sin cadenas bien definidas, más o menos

globosas y presentan de una a cuatro esporulaciones persistentes; las

ascosporas son usualmente esféricas, a menudo ornamentadas con un surco

ecuatorial (Ainsworth y Bisby, 1995). A nivel especie, se diferencian por su

capacidad de fermentar azúcares.

Dentro del género Sccharomyces, la especie cerevisiae representa lalevadura comúnmente usada y el microorganismo eucarionte mas estudiado.Esta especie se conoce también como la levadura de panadería, ya que seutiliza para preparar el pan. El término levadura proviene del latín levare quesignifica levantar. El ciclo de vida vegetativo (fase vegetativa), las levadurasse dividen por gemación. La célula hija inicia su crecimiento formando unayema en la célula madre, mientras se lleva a cabo la división nuclear, síntesisde la pared y finalmente la separación de las dos células (Figura 1)(González, 2000).

Ityo Sexual a

Tipo Sexual ct

a/*

Fusión

Wspsnüaáóa

a.Esperas faapioidtesr

-C

Disección

Germinación

4 esporasen una asea

Figura 1.- Ciclo de vida de Saccharomyces cerevisiae: Esporulación. Cuando seaparean células haploides de diferente tipo sexual, se obtienen células diploides.Estas pueden dividirse mitótica o meioticamente, en el último caso se obtienen cuatroesporas haploides (tomado de González, 2000).

Recientemente se encontró que S.cerevisiae es capaz de formar hifas

(pseudohifas) (Figura 2). Aparentemente, la cruzas de poblaciones haploides

con diferentes tipos de apareamiento (a y a) y en presencia de algunos

estímulos ambientales favorece la síntesis de metabolitos que permiten la

expresión de su crecimiento en forma de filamentos o pseudohifas. Esto

asegura un mecanismo de propagación mas eficiente (Figura 2) (González,

2000).

Figura 2 Ciclo de vida de Saccharomyces cerevisiae. Las células haploides ydiploides pueden tener diferentes vías de desarrollo, ya sea en forma de pseudohifaso levaduriforme. (González, 2000).

El ciclo de vida sexual de S. cerevisiae está determinado por un par de

alelos (a y a) heterocigotos denominados MATa y MATa. Si se cultiva una

mezcla de los dos tipos de alelos, MATa y MATa, las colonias resultantes

serán células diploides heterocigotas MATa/MATa (Figura 3). Las células

diploides pueden continuar dividiéndose como heterocigotas, ó debido a

estímulos ambientales (como la limitación de nutrientes), pueden esporular y

continuar con la fase sexual de la levadura. Durante la esporulación, las

células diploides se dividen por meiosis, lo que origina cuatro células

haploides, contenidas dentro de un saco denominado ascus. Las aseas

3

poseen una pared gruesa que posteriormente se rompe para liberar las

células haploides (González, 2000).

Entre las levaduras comercialmente importantes, se encuentra

Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen, especie que se ha

utilizado desde la antigüedad en fermentaciones de azúcares de arroz, avena

y maíz. S. cerevisiae es comúnmente usada en la elaboración de pan, y en

ocasiones se sugiere como complemento alimenticio, ya que puede contener

hasta 50% de proteína, es rica en vitamina B, niacina y ácido fólico

(Spelman, 1998). Destaca actualmente su uso para la producción de

cerveza.

1.2 Métodos de almacenaje de cepas

En los institutos de investigación y empresas, que utilizan regularmenteorganismos vivos, existe la necesidad de resguardar y almacenar losorganismos. El método de resguardo debe asegurar el mantenimiento de lascepas puras y viables, sin cambios morfológicos ni genéticos. Estos cultivosdeben estar disponibles para su uso cuando son requeridos (Gibson, et al.,

1986). Por tal motivo, es importante seleccionar adecuadamente el métodopara conservar y/o almacenar las cepas y así asegurar el abastecimientocontinuo de cultivos.

Existen varios métodos de preservación de cepas. Los más utilizados

son: subcultivo, criopreservación en nitrógeno líquido, liofilización y

ultracongelación. Las características de sensibilidad y tolerancia de las

diferentes cepas determinan el método de preservación que se deba usar.

Algunas características de resistencia de las levaduras se han aprovechado

para hacer más eficiente el proceso de almacenaje. S. cerevisiae presenta

tolerancia al proceso de congelación durante periodos prolongados de tiempo

(Gélinas, et al., 1996). Se ha tomado ventaja de esta tolerancia en la

industria panadera para la congelación y almacenaje de masas, después de

su producción masiva.

1.2. a Subcultivo.

Consta en mantener una cepa activa constantemente. Se realizan

transferencias periódicas, en medio de cultivo apropiado y en condiciones de

incubación óptimas. Una vez agotados los elementos nutritivos del medio, se

procede a repetir la transferencia o a subcultivar la cepa. Este método es de

bajo costo tanto en material como en equipo, sin embargo presenta aspectos

desfavorables, como son los cambios genéticos y morfológicos, así como la

pérdida de vitalidad y/o viabilidad (Wang, 2000). Con el uso de este método,

existe el riesgo de contaminación durante cada transferencia, además de las

horas/laboratorista requerido.

1.2.b Criopreservación en nitrógeno líquido.

Conserva latente los organismos a -196°C. Las muestras puedenmantenerse hasta por más de 50 años, sin mostrar reducción significativa desu viabilidad (Smith y Onions, 1994). Estas se mantienen inmersas ennitrógeno líquido, constantemente previa con preparación previa a la sucongelación. Este método requiere inversión inicial de equipo paracongelación, además de la necesidad de asegurar el suministro constante delnitrógeno líquido. Aparentemente, los riesgos de mutación se reducen almantener latente la actividad celular. Sin embargo, algunas proteínas yenzimas son vulnerables a las temperaturas tan bajas. Este método seconsidera el más apropiado para el almacenamiento de tejidos animales(Smith y Onions, 1994).

1.2.c Liofilización.

Consiste en eliminar el agua del tejido por medio de la sublimación del

agua en tiempos relativamente cortos y a una temperatura menor a -20 °C.

Simultáneamente, la muestra se somete al vacío, a presione muy altas del

material para retener la forma, estructura y actividad del producto. Se ha

reportado que ésta técnica ofrece mejores resultados en células y tejidos deorigen animal. El costo de equipo y operación, aunado a las dificultadesintrínsecas asociadas con la conservación en frío es muy elevado, por ello,frecuentemente se descarta éste método. Por otra parte, se ha reportado, lapresencia de mutaciones espontáneas en bacterias y levaduras sometidas aeste proceso de preservación, además, de la disminución paulatina de suviabilidad conforme se incrementa el tiempo de almacenaje. (Diniz-Mendes,1998, Smith y Onions, 1994).

1.2.d Ultracongelación.

Consiste en mantener los organismos a una temperatura de -86°C. Lasmuestras almacenadas en ultracongelación, previa preparación, seconservan por largos periodos de tiempo ya que el metabolismo celular sereduce cuando el agua interna es congelada (Smith y Onions 1994). Estemétodo se caracteriza por ser de fácil manejo y bajo mantenimiento, aunque,requiere la inversión inicial de equipo y permite el fácil acceso a losmicroorganismos, cuando son requeridos. Otra ventaja, es que losorganismos, por encontrarse en un estado de latencia, no están,aparentemente sujetos a cambios morfológicos o fisiológicos. Sin embargo,es indispensable que el proceso de descongelación sea el adecuado, debidoal posible daño por la recristalización del agua al pasar por -60°C (Morris,2000).

1.3 Criopreservadores.

Los métodos de congelación requieren de la preparación de las muestras

para protegerlas de bajas temperaturas y deshidratación. Actualmente, se

utilizan agentes que coadyuvan en el proceso de congelación contra el daño

debido a la recristalización del agua al pasar por -60°C al momento de

descongelarlas. Durante éste proceso, es dónde se origina el daño celular

debido a la formación masiva de cristales que atraviesan el interior de las

células, lo que afecta membranas, organelos, etc. A la fecha, se conocen y

utilizan varias substancias permeantes y no permeantes como

crioprotectores.

1.3.a Permeantes

Este tipo de crioprotectores, penetran la célula e interactúan con las

proteínas celulares. Los crioprotectores previnienen la desnaturalización

de las proteínas mediante interacciones hidrofóbicas. Durante el proceso

de congelación, se forman complejos agregados entre el crioprotector las

moléculas de agua, donde forman pequeñas estructuras cristalinas que,

al momento de descongelar a las células, estos inhiben el proceso de

recristalización del agua Ejemplos: glicerol y dimetilsulfonato (Diniz-

Mendes, 1998).

1.3.b No permeantes

Este tipo de crioprotectores interactúan con las moléculas de agua, de talforma que durante el proceso de cristalización, se forman enlaces ointeracciones similares a puentes de hidrógeno de las moléculas de agua.Estos enlaces, incrementan el número de interacciones moleculares entreel crioprotector y las moléculas de agua, lo que prevé el fenómeno deseparación y/o colapso de las membranas celulares, gracias a la mínimaexposición de membranas y organelos celulares con las moléculas deagua. Algunos de éstos crioprotectores son polímeros, proteínas ydisacáridos, entre éstos últimos, está la trehalosa (Conrad y de Pablo,1998).

1.4 La trehalosa

Disacárido no reductor (oc-D-glucopiranosil-[1,1] - a-D-glucopiranosa). En

la naturaleza, se encuentra comúnmente en aquellas especies adaptadas a

condiciones anhídricas y que se mantienen viables en éstas condiciones.

Entre otros organismos se encuentran algunos insectos, lactobacilos y

levaduras, así como, algunas especies de hueveemos de camarón y

nemátodos que se ven expuestos a condiciones de desecación durante

alguna etapa de su ciclo de vida (Singer, et al., 1998). La trehalosa actúa

como protector de las proteínas contra la desecación durante el proceso de

congelación. La trehalosa promueve un efecto destructivo sobre la red

tetraédrica de enlaces de hidrógeno del agua durante el proceso de

recristalización (Lodato etal., 1999).

La capacidad de formar interacciones a nivel molecular, que modifican elarreglo de las moléculas de agua citoplásmica, así como su asociación conproteínas, ha sido utilizada para usar la trehalosa como un criprotector. Latrehalosa coadyuva en el proceso de desnaturalizacón de las proteíans porefecto de altas temperaturas, debido a que estabiliza el sustrato donde seencuentran éstas, lo que previene o reduce el proceso de agregación deproteínas denaturalizadas (Figura 3). Por otra parte, también se ha visto quepuede coadyuvar al proceso de recuperación de la estructura natural deproteínas que se han visto afectadas por la temperatura actuando como unaproteína chaperona en este proceso (Singer, etal., 1998).

En general, dada su estabilidad química y capacidad de prevenir en la

formación de cristales de hielo durante la recristalización del agua, la

trehalosa protege del daño celular al que se ven expuestas las células

durante proceso de descongelación (Voet. et al., 1995 y Conrad y de Pablo,

1998). Más aún, se ha reportado que cepas de levaduras almacenadas con

trehalosa adicionada al medio como crioprotector, muestran mayores

porcentajes de viabilidad al ser reactivadas (Lodato et al., 1999, Arguelles,

2000).

Figura 3 Representación de la acción protectora de la Trehalosa (Tomado de:Lodato era/., 1999)

S.cerevisiae, sintetiza produce trehalosa en el cytosol a través de la

acción secuencial de las proteínas Tps1 p y Tps2p que físicamente forman el

complejo trehalosa-sintetasa y junto a los complejos TsHp o Tps3p que

regulan la actividad del complejo. En este proceso comprende dos pasos

catalíticos en los que intervienen: trehalosa-6-fosfato sintasa y trehalosa-6-

fosfato fosfatasa (Bell, W. et al., 1998). Durante esta reacción los grupos

fosfatos son liberados de los anillos de trehalosa y reciclados como fosfatos

libres, formando así el disacárido trehalosa (Figura 4). Durante este proceso,

la trehalosa ya sintetizada se transporta del citosol al núcleo, donde es

acumulada. Lo que muestra que en respuesta a los cambios de temperatura

la trehalosa se moviliza de un lugar a otro donde es requerida (Bell, W. et al.,

1998). La trehalosa es considerada como un carbohidrato de reserva, la cual

es catabolizada cuando el nivel de glucógeno intracelular es bajo (Bell, W. et

al., 1998). Por su papel como crioprotector, así como por representar una

fuente alternativa de carbohidratos, se considera como gran ventaja, el uso

de éste disacárido en el proceos de criopreservación en los bancos de

germoplasma de levaduras.

o-I

"O—p=o

O"

H

|!HO

G lucose-6- phosphate

OH H H Ó

T rehalose-6-p h ospha te

HeH HO

HOCHj

Undine-diphosphale-glucose

HN CH

O=dC CH

NC' Q

0—P—O—P—O—CH^^N. I

*- £ JN/ piOH OH

Uridine cíphosphate

Treh alose

Figura 4.- Biosíntesis de 4a Trehalosa en S.cerevisiae ('Arguelles, 2000)

o-•o—p=o

o-

Inorganic phosphcite

10

2. Antecedentes

Algunos microorganismos tienen la capacidad de resistir variaciones

térmicas debido a la síntesis de compuestos que protegen la integridad de

sus biomoléculas. Lodato etal. (1999) describieron que posterior a un estrés

térmico las células de S. cerevisiae, mostraron un incremento en el contenido

de trehalosa intracelular. Además correlacionaron el incremento de éste

disacárido con la capacidad de protección a las proteínas citosólicas de la

levadura durante las condiciones térmicas desfavorables.

En condiciones nutricionales pobres, las levaduras utilizan la trehalosaexterna como material de reserva. Esta capacidad de utilización de éstedisacárido, depende también de la presión osmótica a la cual estánsometidas las células. Bajo ambas condiciones, (altas presiones osmóticas ynutricionales), la trehalosa periplásmica es hidrolizada, en un azúcarasimilable. En condiciones contrarias de baja osmolaridad, la trehalosa esinternalizada como trehalosa-6-fosfato por el sistema de transportefosfotransferasa y posteriormente hidrolizada en glucosa y glucosa-6-fosfato(Horlacher, et al., 1996). Además, también se ha reportado que durante lafase G1, donde se presenta una alta demanda de carbohidratos, el contenidode trehalosa y glucógeno celular disminuye (Silljé, etal., 1999). Esto sugiereque ambos tipos de carbohidratos son metabolizados en situaciones deescasez de alimento o en alta demanda energética de las levaduras.

Las levaduras presentan un mecanismo de defensa a condiciones

ambientales adversas como agentes químicos y físicos entre otros.

(Arguelles, 2000). En condiciones de sequía o de estrés térmico, las células

de levadura acumulan trehalosa y esta característica se refleja en la

estabilización de las membranas y organelos. Falta Cita bibliográfica aquí.

II

Fungundas, et al., (1999) observaron el efecto de la trehalosa enfracciones puras de membrana plasmática de Schizosaccharomyces pombe

en un estado solubilizado y en un estado reconstituido. Después de incubaréstas fracciones durante 1 min a 51 °C en presencia de trehalosa 1 M, el50% de la enzima (ATPasa) soluble permanece activa. En las mismascondiciones pero sin la presencia de trehalosa, la actividad enzimática estacompletamente abolida. Esto demuestra que la trehalosa incluida en elmedio donde se encuentra la proteína y al someterla a un incremento entemperatura, la proteína no pierde su actividad en el trasporte de iones. Almomento de reconstituir la membrana y someterla a un incremento detemperatura, en un medio conteniendo trehalosa observaron que loscontenidos de trehalosa internos eran mayores, lo que indica que laslevadura pueden sintetizar e internalizar trehalosa como un mecanismo deauto protección.

La resistencia térmica representa una ventaja para cepas que están

sujetas a variaciones térmicas extremas. Tracey, et al., (1998), mencionan

que cuando las levaduras (S. cereviseae) son expuestas a condiciones de

temperatura extremas, se induce el proceso de síntesis de, proteínas

denominadas de "choque térmico" y la acumulación intracelular de trehalosa.

Aparentemente, estos compuestos le confieren la característica de

termotolerancia a las células de levadura, ya que se observa un incremento

en el porcentaje de sobrevivencia, en condiciones de estrés ambiental. Se

ha reportado que la acumulación de trehalosa durante un estrés ambiental

previene el daño oxidativo provocado por las altas temperaturas actuando

como un componente antioxidante (Benaroudj, et al., 2001). Debido a que

las proteínas que se activan mediante un choque térmico y la acumulación de

trehalosa están implicadas en la adquisición de termotolerancia en las

células, se ha sugerido, que la trehalosa tiene un uso potencial en el proceso

de almacenaje de cepas y conservación de alimentos, envasados

congelados, medicamentos y otros productos (Conrad y de Pablo, 1998 ).

12

El papel termoprotector de la trehalosa ha sido de gran interés para el

almacenaje de masas para pan. Almeida, y Pais (1996), reportan que cepas

de Saccharomyces cerevisiae y Torulaspora delbrueckii (provenientes de

masa de maíz tradicional y masa de pan de centeno), después de haber sido

congeladas a -20 °C durante 30 días, no pierden la capacidad de fermentan

los azúcares. En estas cepas, se observó que el contenido intracelular de

trehalosa presentó un incremento 20% (peso/peso) después del proceso de

congelación, y le adjudican la acción de crioprotección a de este azúcar.

En el proceso de preservación y mantenimiento de bancos degermoplasma generalmente hay pérdida de viabilidad de losmicroorganismos durante el almacenaje (Smith y Onions, 1994). Krallish, et

al., (1997), también reportan para S. cerevisiae que los niveles de trehalosaintracelular se incrementan durante el proceso de criopreservación, por loque concluyen que el contenido de trehalosa está relacionado con lacapacidad de resistir a procesos de deshidratación/hidratación durante losciclos de congelación y reactivación de las cepas.

Se ha observado que el contenido intracelular de trehalosa también se

incrementa durante otro tipo de estrés. Horlacher, et al., (1996) observaron

el incremento de este azúcar en bacterias que se sometieron previamente a

un estrés osmótico. Ribeiro, et al. (1999) pre-acondicionaron células de

Saccharomyces cerevisiae al someterlas a un tratamiento de 40°C por 1 hr y

evaluaron el porcentaje de sobrevivencia a condiciones de estrés osmótico

en presencia de etanol. Nuevamente, se observó el incremento de trehalosa

intracelular, por lo que lo relacionaron como un protector en condiciones de

estrés osmótico

Éverson (2000), reporta que la internalización de trehalosa representa

una fuente de carbono. Esto se observa cuando en presencia de otros

13

azúcares, la trehalosa no es metabolizada (azúcar no reductor), sin embargo,

durante periodos de insuficiencia de alimento, es asimilada a través de la

membrana por un sistema de co-transporte. Este sistema de co-transporte

que se presenta en situaciones de escasez de alimento se observó la

utilización de hexosas y un cierto número de disacáridos como fuente de

carbono alterna en situaciones de anaerobiosis. (Efecto Kluyver por la

trehalosa).

La trehalosa también puede ser internalizada por las levaduras en

condiciones normales (sin estrés). El azúcar es tomado directamente del

medio, por lo que es posible inducir su acumulación interna. Esto se logra al

incubar las células en un medio de cultivo rico en trehalosa y así manipular el

contenido interno de trehalosa mediante la incubación en presencia de esta

en el medio de cultivo. La capacidad de internalización de trehalosa está

regulada por la expresión del gen AGT1, que codifica el mecanismo de

trasporte a-glucosídico, por medio del cual la trehalosa se internaliza a la

célula (Plourde-Owobi, etal., 1999).

Franco, et al., (2000) caracterizaron al gen que codifica la trehalosa-6P

sintetasa (tps1), el cual es responsable de los niveles de trehalosa interna en

células de levadura. Soto, et al., (1999) demostraron que el sobre-expresión

inducido del gen tps1, eleva el nivel intracelular de trehalosa. Con esta

información, ha sido posible incrementar la resistencia de levaduras a

diferentes procesos de: liofilización, deshidratación, estrés osmótico,

escasez de alimento y niveles tóxicos de etanol. Por lo que se considera que

la trehalosa es un metabolito anti-estrés.

Diniz-Mendes, (1998), indica que el uso de trehalosa (adicionada o

sintetizada in situ) funciona como crioprotector y ayuda a conservar la

viabilidad de los microorganismos almacenados en bancos de germosplama.

Las cepas se mantienen homogéneas con mínimos cambios morfológicos y

14

genéticos. Es por ello que planteamos la evaluación del uso de trehalosa

como un crioprotector durante el proceso de almacenaje de cepas por

congelación.

15

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo general:

• Determinar el papel de la trehalosa (añadida y sintetizada) como

crioprotector en el proceso de almacenamiento por congelación de cepas de

levadura, para asegurar la viabilidad y homogeneidad del inoculo con

mínimos cambios morfológicos y fisiológicos.

3.2. Objetivos particulares

3.1 Determinar el estado original de desempeño fisiológico y morfológico de

una cepa de levadura (Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C.

Hansen) para obtener el diagnóstico base

3.2 Inducir la producción de trehalosa en levaduras mediante tratamientos

térmicos y evaluar las condiciones morfológicas y fisiológicas de la

levadura post-tratamiento para su congelación

3.3 Evaluar si la inducción de síntesis trehalosa por tratamientos térmicos

ofrece un beneficio en las características morfológicas y fisiológicas

posteriores a la congelación

3.4 Determinar si la adición de trehalosa al medio de cultivo previo a la

congelación ofrece un beneficio en las características morfológicas y

fisiológicas posteriores a la congelación

16

4. MATERIALES Y MÉTODOSLa manipulación de la cepa (inoculaciones, transferencias, preparación de

muestras para exámenes y diagnósticos) se llevó a cabo en condiciones de

esterilidad dentro de la campana de seguridad biológica. De igual manera se

procedió para la preparación de los medios de cultivo.

Todos los medios, reactivos, buffers, etc. se esterilizaron de acuerdo a las

instrucciones del fabricante. Sólo cuando se indica, se utilizaron soluciones

no estériles.

4.1. Microorganismo de estudioLa cepa de Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen, fue

proporcionada por el Departamento de Microbiología de Cervecería

Cuauhtémoc-Moctezuma planta Monterrey, N. L. Esta cepa presentaba

aproximadamente 3 meses de almacenaje a 4 °C.

4.1.1. Preparación y almacenaje de resguardosPara obtener suficiente inoculo del vial original se procedió de la siguiente

manera:

a) se recuperaron las células de levadura de la superficie

b) se inoculó un matraz de 250 mL con 150 mL de medio YMB (por sus

siglas en inglés yeast maltose broth)

c) se incubó durante 48 h a 28° C

d) se inocularon por estriación 120 viales inclinados con 5 mL de YMA

(yeast maltose agar). Se utilizó una asada por vial

e) se incubaron por 48 h a 28 °C

f) los viales se almacenaron a 4 °C para su posterior utilización

Este método fue recomendado por Damas, L. (comunicación personal). A

cada uno de estos viales se les llamó "vial de resguardo."

4.1.2 Reactivación de la cepa

Para la reactivación de cada vial de resguardo, se procedió como seindica a continuación:

17

a) un vial de resguardo se dejó a temperatura ambiente 20 minb) se inoculó un matraz estéril de 250 mL con 100 mL de medio estéril de

YMB con una asada del vial de resguardo

c) se agitó vigorosamente en el vórtex

d) se incubó a 28°C y 160 rpm durante 48 h

4.1.3 Cinética de crecimiento

Para determinar la evolución de la fermentación se procedió de lasiguiente manera:

a) De la reactivación previa (4.1.2) se calculó el número de células pormililitro con el hematocitómetro. Estas cuentas se hicieron porduplicado.

b) se inocularon dos matraces de 250 mL con 100 mL de medio YMB con5X106células/mL

c) se agitaron vigorosamente al vórtex para homogenizar la muestra

d) se incubó a 28°C a 160 rpm

e) se contaron el número de células cada 12 hf) se graficaron los datosExperimentos previos a esta investigación, arrojaron como resultado que

los cultivos alcanzaron un valor máximo a las 48 h (Damas, L., comunicaciónpersonal), por tal motivo, La cinéticas de crecimiento en esta investigación seanalizaron a las 48 h.

4.2. Porcentaje de células muertas

Para la determinación del porcentaje de células muertas se procedió a la

aplicación del Método Internacional de Tinción de Células Muertas de

Levadura (Krallish H. et al., 1997). Esta determinación se llevó a cabo al final

de las fermentaciones de la cinética del punto 4.1.3 de la siguiente manera:

18

a) se resuspendió un mililitro del cultivo mencionado en un tubo de ensaye

10 mL

b) se agregaron 10 mL de la solución de azul de metileno

c) se mezcló vigorosamente al vórtex

d) se dejó reposar por un min.

e) se tomó una alícuota (aproximadamente 10 microlitros) y se depositó

en en hematocitómetro

f) se procedió a su examen al microscopio con aumento de 20X y 40X

g) se contaron 1,000 células por cada muestra y de éstas, se contaron las

que tomaron la tinción azul.

4.2.1.1 Interpretación

a) las células teñidas de color azul oscuro se consideraron como células

muertas, mientras que las de color azul claro se consideraron como

células vivas.

b) Las células madres gemando se contaron como una célula, sin

considerar el tamaño de la célula hija.

4.2.1.2 Cálculo de resultados

% de células muertas = N o d e c é l u l a s t e ñ i d a s / N o total de células

4.3. Análisis fisiológico: Asimilación de aminoácidos y carbohidratospara levaduras

Esta evaluación se llevó a cabo al final de las fermentaciones producto delos tratamientos que se indican mas adelante, de acuerdo al método descritopor

Lavados:

19

a) 50 mL de muestra, se transfirieron a un tubo cónico estéril de 50 ml_

para centrifugación

b) se centrifugó a 3,000 rpm durante 10mim

c) se descartó el sobrenadante

d) la pastilla sé resuspendió en 50 mL de buffer de fosfato monosódico a

pH 7.0, y se mezclo bien al vortex. Para eliminar completamente

cualquier nutriente en el medio

e) el procedimiento de a)-d), se repitió tres veces

f) se resuspendió el botón de la última centrifugación en buffer de fosfato

monosódico (pH = 7) en un volumen de 5ml_

Preparación del medio mínimo basal (mezcla de vitaminas y

microelementos aun pH 7.27 que permite mantener a la célula en un medio

estable sin fuentes de carbono o nitrógeno) (anexo) el cual constituye el

medio para las pruebas de asimilación de aminoácidos y carbohidratos:

4.3.1. Prueba de asimilación de aminoácidos

El objetivo de esta técnica es incubar a S.cerevisiae un medio de cultivo

que contenga como fuente de nitrógeno exclusivamente el aminoácido que

se agrega individualmente.

4.3.2. Interpretación de resultados

Si hay crecimiento de levadura, nos indica que es capaz de utilizar el

aminoácido en cuestión como fuente de nitrógeno para llevar acabo sus

funciones metabólicas (Krallish H. etal., 1997)

a) Se tomo una muestra a una concentración aproximada de 20X106

(proveniente de los 5ml_ de los lavados). Se inoculó cada uno de los

aminoácidos y carbohidratos que se enlistan a continuación:

20

Tabla 1 Carbohidratos y aminoácidos a usar en las pruebasdeasimilación

Prolina FenilalaninaArginina ValinaAlanina GlucosaIsoleucina MaltotriosaTrehonina DextrinaLeucina FructuosaAc. Glutámico Control (+)Usina Control (-)

b) los tubos con su respectivo aminoácido e inoculo se incubó a 28°C por48h.

c) se observo la presencia o ausencia de turbidez en cada tubo porcomparación con el tubo de control negativo. Si hay turbidez, se leecomo (+)

4.3.3. Prueba de asimilación de carbohidratos

El objetivo de esta técnica es incubar a S.cerevisiae un medio de cultivo

que contenga como fuente de carbono exclusivamente el azúcar que se

agrega individualmente. Si hay crecimiento de levadura, nos indica que es

capaz de utilizar el azúcar en cuestión como fuente de carbono para llevar

acabo sus funciones metabólicas (Krallish H. et al., 1997)

a) se torno una muestra a una concentración aproximada de 20X106

(proveniente de los 5mL del inciso 4.3 )

b) se inoculó cada uno de los carbohidratos (Tabla 1)

c) Los tubos con su respectivo carbohidrato e inoculo se incubaron a28°C por 48h

21

d) se observo la presencia o ausencia de turbidez en cada tubo por

comparación con el tubo de control negativo. Si hay turbidez, se lee

como (+)

4.3.4 Método Api 20CAUX

El crecimiento de levaduras en cada tratamiento, determina el desempeño

metabólico en relación para determinar la capacidad de asimilación de

carbohidratos (Fenn, P. etal., 1994).

a) La preparación de la galería se realizó al distribuir 5ml de agua

destilada en todos los alvéolos, a fin de crear una atmósfera húmeda.b) Se realizó una suspensión de levaduras de turbidez igual a 2 de

McFarland. Para ello se retiró una fracción de colonia mediante unapipeta.

c) se depositó una gota de suspensión de levaduras en el RAT Médium(Riz Agar Tween)

d) se trasfirió 100 microlitros de la suspensión anterior a una ampolletade C Médium

e) se homogenizó en voortex

f) se llenaron las cúpulas con la suspensión en C Médium

g) se incubó la tira durante 48 h a 30 °C

h) Una cúpula más turbia que el testigo indicó una reacción positiva

4.4. Determinación de Trehalosa

4.4.1. Pasos preparativos para la extracción de trehalosa

4.4.1.1. Preparación de crisoles

a) Se desecaron los crisole de porcelana en la mufla a 550°C por 30 min

22

b) se trasfirieron los crisoles a un desecador por 20 min

c) se registro el peso de cada crisol en una balanza analítica (peso inicial

del crisol (Deegenaars, etal., 1998))

4.4.1.2. Obtención de 12 mg de células (peso seco)

a) se reactivó un vial de resguardo de acuerdo al inciso 4.1.2b) a 50 ml_ de la suspensión de células en cultivo YMB de 48h. Se

centrifugó a 3,000 rpm por 10 min para eliminar el medio de cultivo

c) la pastilla se resuspendió en agua bidestilada (30 mL) estéril y a una

temperatura de 4°C, en vórtex

d) se repitió el lavado dos veces

e) la pastilla obtenida del segundo lavado. Se transfirió al crisol con una

espátula, para recuperar la mayor cantidad posible de células

f) se introdujeron los crisoles conteniendo el recuperado del inciso e) al

horno a 80°C por 48h

g) se pesaron los crisoles (+) las células (-peso seco del crisol) = al peso

seco de la muestra de células (Lodato, etal., 1999)

4.4.1.3. Extracción deTrehalosa

a) se colocaron 12 mg de células (peso seco) en un tubo ependorí.

b) se adicionó 2 mL de ácido tricloro acético 0.5M a una temperatura de

4°C (en refrigeración).

c) se dejó en reposo por 30 min en hielo frape con agitaciones periódicas

cada 10 min por inversión (Ferreire et al., 1997, Krallish et al., 1997,

Ribeiro etal., 1999)

d) se centrifugó a 3,000 rpm por 10 min

e) se recuperó el sobrenadante en un tubo ependorí de 2 mL

f) se agregó 0.1 U de trehalasa refrigerada a -20°C

23

g) se mezcló por inversión moderada

h) se incubó por 1 hr a 37°C en baño maría (Blázquez et al., 1994), con

inversiones suaves 3 veces cada 20 min

4.5. Determinación de azúcares intracelular

4.5.1. Método de cuantificación de azúcares por el reactivoAntrona

Los carbohidratos en presencia de ácido sulfúrico del reactivo de antrona,experimentan deshidratación convirtiéndose en furfurai o hidroximetilfufural.Estos productos al condensarse generan complejos de color verde. Laintensidad del color desarrollado esta en función directa de la concentraciónde carbohidratos presente en la muestra

a) se preparó una curva de calibración con los valores de absorbancia,mostrados por distintas soluciones de concentración conocida deglucosa

4.5.1.1. Curva de calibración

Se siguió el método sugerido por Krallish, et al., (1997)

a) se prepararon seis tubos de ensaye con los siguientes reactivos

24

Tabla 2 Curva estándar para cuantificar azúcares totales por el métodode antrona

Identificación

del tubo

1

2

3

4

5

6

Concentración(mg/mL)

00

10

20

30

40

50

Estándar deglucosa

(g/mL)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Agua

bidestilada

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

a) se agitó vigorosamente en vortex

b) se dejó reposar 10 min en baño de hielo (hielo frape)

c) se agregó a cada tubo 4 mL de Antrona al 0.2% en ácido sulfúrico (sinsacar del hielo)

d) Se agregó el reactivo de Antrona lentamente por las paredes del tuboinclinado para formar dos fases (inferior amarilla, superior blancalechosa) Desechar aquellos tubos donde no se haya formado las faseso donde la solución adquiera un color verde.

e) Se dejó reposar por 5 min

f) Se mezcló vigorosamente en el vórtex

g) se regresaron los tubos al baño de hielo (La reacción es exotérmica yse debe evitar el calentamiento. Si esto sucede, la solución se tornaverde y se deberá descartar)

h) se sumergieron los tubos en un baño de agua hirviendo por diez

minutos. La solución cambia a un color verdei) se regresaron al baño de hielo para detener la reacción por cinco

minutos

25

j) se leyó al espectrofotómetro (una vez fríos) a a 640 nm. Con el tubo 1,

se ajusto a cero

4.5.1.2. Análisis de la muestra tratadas

a) se utilizó 2 mL de la muestra preparada en el inciso 4.4.1.3 y se

desarrollo el protocolo para la curva de calibración, anexando la

muestra problema

4.5.2. Determinación de trehalosa mediante el métodoenzimático para la determinación de glucosa(peroxidasa oxidasa)

Se siguieron las instrucciones según el fabricante del Kit para ladeterminación de glucosa en suero o plasma "Glicemia enzimático"

4.5.3. Contenido de trehalosa intracelular total

a) se reactivó la cepa según el inciso 4.1.2b) la determinación intracelular de trehalosa se realizó según los incisos

pertenecientes 4.4c) se utilizó para ambos tratamientos térmicos los protocolos descritos en

los incisos 4.5.1 y 4.5.2d) en ambos casos se determinó la glucosa intracelular de la levadura y

la glucosa obtenida por la conversión de trehalosa, mediante el uso de

la enzima trehalasa

26

e) se obtuvo el contenido de trehalosa total por la diferencia entre la

glucosa menos la glucosa obtenida a partir de la conversión de

trehalosa a glucosa por la enzima trehalasa

4.6 Análisis morfológico

Por medio de microscopía y análisis de imágenes, se analizaron alícuotas

obtenidas del inciso 4.5.3 de los cultivos para determinar su morfología y

número de cicatrices (gemación) (Sinclair, D. etal., 1998).

4.7 Número de cicatrices

Se determinó el número de cicatrices por medio de la tinción de blanco decalcofluor (Campbel y Duffus, 1998).

a) se reactivo un tubo del resguardo según el inciso 4.1.2

b) se transfirieron alícuotas de 2 ml_ de la suspensión de células a un

tubo ependorí de similar capacidad.

c) se centrifugó a 3,000 rpm por 10 min y se retiró el sobrenadante

d) la pastilla se resuspendió en 1 ml_ de buffer de fosfato salino.

e) se concentró y se centrifugó a 3,000 rpm por 10 min

f) se descartó el sobrenadante

g) los incisos e)-f) se repitieron 3 veces.

h) Tinción de blanco de calcofluor: el botón del último lavado se

resupendió en PBS

i) se agregó 10 uL de una solución 0.1 ug/mL de blanco de clacofluor.

j) se mezcló por inversión del tubo tres veces

k) se dejó incubar por 2 horas

I) Conteo de cicatrices. Se tomó una muestra de 5uL del inciso e),

previamente homogenizada al vórtex

m) se observó al micro de florescencia (filtros Barrera 365 - Emisión 450)

n) se observó las cicatrices de un mínimo de 60 células

o) se obtuvo el promedio (Powell, etal., 2000)

27

4.8 Tratamientos térmicos

Se siguió la técnica recomendada por Diniz-Mendes, et al., (1999).

Debido al número de muestras que se tenían que manejar simultáneamente,

los tratamientos de 10 y 40 °C se realizaron con 15 días de diferencia. Los

tratamientos de 10 grados se hicieron primero.

a) Se tomó un tubo de resguardo y se reactivó según el inciso 4.1.2por duplicado

b) se tomó una muestra de 50 ml_ en un tubo cónico estéril para

centrifugación

c) se dividió el cultivo original en dos tubos cónicos conteniendo cada

uno 50 mL de inoculo. Donde posteriormente cada tubo se sometió

al tratamiento térmico correspondiente

d) se centrifugó a 3,000 rpm por 10 min

e) se decantó el sobrenadante (el medio de cultivo YMB) (se marcan

las muestras)

f) las pastillas se resuspendierón en 50 mL de agua destilada a

temperatura de 4 °C y se agitó en vórtex

g) Lavados: se duplicaron los pasos c y d, para eliminar

completamente cualquier nutriente del medio

h) se centrifugó 3,000 rpm por 10 min

i) la pastilla de la muestra 1 se resuspendió en 50 mL de trehalosa al

10% en PBS. La pastilla de la muestra 2 se resuspendió en 50 mL

de PBS. Cada unos por duplicado.

1.- sin trehalosa externa

2.- con trehalosa al 10% externa

28

Nota: De uno de los dos matraces usados en el tratamiento térmico (con

la adición de trehalosa externa y sin trehalosa externa en el medio) se

reservaron 20 mL para los posteriores análisis de trehalosa total y para su

almacenaje en las diferentes condiciones de almacenamiento (Tabla 3)

4.9 Tratamiento a 40 °C(Deegenaars, L. and K. Watson 1998)

a) se realizó el procedimiento del inciso 4.8

b) la suspensión de 50 mL del inciso 4.8 i) se incubó en baño maría con

agitación durante 60 min. Posteriormente se procedió a congelar en

diferentes condiciones de almacenamiento (ver tabla 3)

4.10 Tratamiento a 10 °C

a) Se realizo el procedimiento del inciso 4.8.

b) El duplicado de la suspensión de 50 mL del inciso 6 i) se incubó a 10

°C en hielo frapé y agua, durante tres horas. Posteriormente se

procedió a congelar en diferentes condiciones (ver tabla 3)

Ambos tratamientos se mantuvieron en agitación a cada tratamiento se

lleva a cabo por duplicado.

29

Reactivación de un vial de respaldo

Resuspender lapastilla en PBS

(10-2) Tratamiento térmico a10 X por una hora

(10-3) Resuspender la pastilla en unasolución de PBS + trehalosa ai 10%

Tratamiento térmico a 10 rC por unahora

(10-1) Control del 10 *C. Sintratamiento térmico 1

oSe lavan las alícuotas por

triplicado

ICondición dealmacenaje

B 10-2-1 a PBS10-2-1 bPBS+gly10-2-1 c PBS+th10-2-1dPBS+th+gly

Condición dealmacenaje

Se lavan las alícuotas portriplicado

10-MaPBS10-1-ibPBS+gly10-1-1c PBS+th10-1-1d PBS+th+gly


10-3-1 a PBS10-3-1 b PBS+gly10-3-1 c PBS+th10-3-1 d PBS+th +gly

4.11 Estrategia experimental antes y después del tratamientotérmico a 10 °C

30

Reactivación de un vial de respaldo

Resuspender lapastilla en PBS

(40-2) Tratamiento térmico a40 °C por una hora

(40*3) Resuspender la pastilla en unasolución de PBS + trehalosa a!10%

Tratamiento ténnico a 40 *C por unahora

(40-1) Control del 40 °C. sintratamiento térmico I


JCondición dealmacenaje




40-2-1 a PBS40-2-1 bPBS+gly40-2-1 c PBS+th40-2-1 d PBS+th +gly

40-1-1 a PBS40-1-1bPBS+gly40-1-1c PBS+th40-1-1d PBS+th+gly

40-3-1 a PBS40-3-1 bPBS+gly40-3-1 c PBS+th40-3-1 d PBS+th +gly

4.12 Estrategia experimental antes y después del tratamientotérmico a 40 °C

31

4.13 Preparación de las cepas para congelación

De la alícuota reservada en los tratamientos térmicos.

a) del tratamiento térmico a 40 °C se tomaron alícuotas de 2 ml_ (20X106

cel/mL)

b) se prepararon para congelarse a (-) 86 °C en tubos criogénicos de

acuerdo a los siguientes tratamientos.

Tabla 3 Condiciones de almacenamiento para Sacharomyces cerevisiae

No.

1234

567

8

Control/Condición/

Tratamiento 10°C

PBSPBS+glyPBS+thPBS+th +gly10°C: PBS10°C: PBS+gly10°C: PBS+th

10°C:PBS+th+gly

No. En la

estrategia

experimental

10-1

10-1-1a

10-1-1b

10-1-1c

10-1-1d

No

1234567

8

Control/Condición

/ Tratamiento

40°C

PBSPBS+glyPBS+th

PBS+th +gly40°C: PBS40°C: PBS +gly40°C: PBS +th40°C: PBS +th

+giy

No. En la

estrategia

experimental

40-1

40-1-1a

40-1-1b

40-1-1c

40-1-1d

Th = Trehalosa al 10 %, Gly = glicerol al 10 %

NOTA: El no. 1 representa el control de las condiciones de almacenamiento 2, 3, y 4.

Los nos. 1, 2, 3, y 4 representan los controles de almacenamiento para cada

tratamiento térmico: El no. 1 es control del no. 5; el no. 2 es el control del no. 6; el

no. 3 es el control del no. 7 y el no. 4 es el control del no. 8.

El no. 5, representa el control de las condiciones de almacenamiento 6, 7, y 8.

Cada tratamiento se prepara por duplicado y se almacenan a -86°C durante 60 días

32

4.14 Reactivación de los tratamientos

a) una vez transcurridos 60 días de almacenamiento se retiró un vialde cada tratamiento del ultracongelador (-86°C)

b) se colocó en un recipiente con agua a temperatura 30°Cc) se dejó reposar por 1 min

d) para la reactivación de las cepas y análisis correspondiente, setomó alícuotas de 1 ml_

e) se inoculó 100 ml_ de medio YMBf) se incubó por 48 hr a 28 °C y 160 rpm

g) Al término de las 48 h se tomaron alícuotas para el análisis

morfológico, porcentaje de células muertas y fisiológicas

4.15 Análisis estadístico y evaluación

a) los resultados se analizaron mediante una media estándar T de

Student, para muestras dependientes en las cuales se evaluaron

todas las muestras (tratamientos y controles) y repeticiones

b) el análisis estadístico se realizó entre muestras pareadas siguiendo

una distribución normal, con una confianza de 0.05

c) los resultados de ambos tratamientos se analizaron en

comparación con las muestras control para determinar si la

trehalosa (interna o inducida) es un coadyuvante en el proceso de

almacenaje de cepas en ultra-congelación

d) los resultados se compararon con los obtenidos en los análisis de

la fermentación original para evaluar el desempeño del glicerol,

trehalosa externa, trehalosa inducida y combinación de éstos

33

4.16 DISEÑO EXPERIMENTAL

RECEPCIÓN DE LA

5.3Reactivación

I5.4 Preparación de resguardos

I6 Análisis morfológico, fisiológico

120 tubos con medio YMAalmacenados a 4 °C

DIAGNOSTICO BASE6 Análisis morfológico,

fisiológico

18 días de almacenaje a 4°C

26 Análisis morfológico,físiológico, % de células

I muertas v no de cicatrices J

75.4 Resguardo

120 viales en medio

5.3Reactivación de lacena

Inoculación delmaterial

34

Unidades de resguardo a 4 °CIncubación hasta la fase estacionaria

1Tratamiento

térmico

Suspensión de célulasen 10% de trchalosa

Ta10°C

Suspensión de células en

T1

a 40"C

J

IAnálisis del contenido deTrehalosa intracelular

Almacenamiento a -8o" °C por 60días

Reactivación

Análisis morfológico, fisiológico,viabilidad

35

5 RESULTADOS

5.1 Diagnóstico inicial: características morfológicas y fisiológicas

5.1.1 Diagnóstico inicial. Cinética y porcentaje de células muertas

Al término de las 48 h (Figura. 5). La concentración máxima de células

fue una crecimiento de 23.7X106 cel./mL. El porcentaje de células muertas a

las 48 h fue de 45% (Figura 5).

50.00%

40.00%

25000000

20000000 -i

15000000 ^u

10000000

0.00%

5000000

o

«

12 24 36Tiempo (h)

48

de cel. Muertas •No.de cel/mL

Figura 5 Observación del desempeño de la cepa de S.cerevisiae al ser reactivada delvial original aportado por CCM

5.1.2 Diagnostico de los viales de resguardo

La concentración máxima de cél/mL a las 48 h fue de 38X106 y el

porcentaje de células muertas fue de 10% (Figura 6). En el transcurso de

36

ésta cinética se tomaron valores intermedios de células muertas como se

observa en la Figura 6.

12.00%

w 10.00% -

§ 8.00% HEai 6.00%8•8 4.00% 99 / IH Wm "

ninmi wiiiiir ^ ^ ^ ^ H H ^ ^ B "* H H B H **

^^ fifflUMl fiBSHi ^^^^B ^^^^8 *

y l 1 , i i 1 j 1

50050000- 45050000- 40050000

3505000030050000

- 25050000- 20050000

1505000010050000505000050000

0 12 24 36 48Tiempo (h)

^ • % c e l muertas —•—No.de cel/mL

0)üoc

Figura 6 Diagnostico de los viales de resguardo

5.1.3 Análisis de las características morfológicas y fisiológicas

El diagnóstico base de los resguardos, después de 18 días de almacenajea 4o C, se obtuvieron los siguientes resultados (Figura. 6). A las 12 h seobtiene un número mayor de de cél/mL que en la cinética de la cepa original,con la curva de la cepa original. Al término de 36 h presentó unaconcentración de 43X106 cél/mL. Este valor disminuyó hacia las 48 h. Elporcentaje de células muertas alcanza un valor de 5% a las 12 h, el cualdecae a las 24h y se incrementa hasta alcanzar valor máximo de 10% a las48 h.

37

5.1.4 Determinación del número de cicatrices

En la Figura 7 se muestra la frecuencia del número de cicatrices por

célula. A 12 h de incubación (Figura 8a) la frecuencia de células con 1 a 2

cicatrices (colores rojo y verde respectivamente), es de 56 y 64%. A las 24 h

los valores de frecuencia mayor corresponden a células con 2, ,3 y 4

cicatrices (colores verde, azul y magenta). A las 36 h, los valores de mayor

frecuencia se encuentran entre las células con 3, 4, 4, y 5 cicatrices (verde,

azul, magenta y azul claro respectivamente). A las 48 h se observa que los

mayores valores de frecuencia los presentan las células con 2, 3, y 4

cicatrices (verde, azul y magenta), sin embargo, casi la mitad de las células

presentan de 4 a 8 cicatrices.

12hrs de crecimiento

Cinética de cicatrices

6.00

5.00

3.00

2.00 \ -i

^ i|§|jj||É| oo

24hrs de crecimiento


6.00

5.001.00

2.00

3.00

(a) (b)3óhrs de crecimiento


1.00

2.00

48hrS de crecimiento


7.00

5.00

2.00

3.00

© (d)

Figura 7 Frecuencia de cicatrices por célula en los viales de resguardo.

38

5.1.5 Asimilación de aminoácidos

De los 10 aminoácidos analizados, la levadura creció en 9 de los 10

aminoácidos. En el vial de Usina, no se observó crecimiento (Tabla 4).

Estos resultados representan el control para los tratamientos de 10 y 40 °C.

Con respecto a los carbohidratos a los que se sometió la cepa a su

análisis

Tabla 4 Resultado de las pruebas de asimilación de aminoácidos.

Pruebas de diagnostico baseAminoácido Control de 10 °C Control de 40 °C

~A¡a + +Glu + +

Arg + +

Isleu + +

Leu + +

Lys + +

Phe

Thr + +

Val + +

Pro + +

Control (-)

Control (+) + +

39

5.1.6 Asimilación de carbohidratos.

Los resultados se muestran en la Tabla 5. La cepa mostró crecimiento en

los dos carbohidratos analizados.

Tabla 5 Resultado de las pruebas de asimilación de carbohidratos.

Pruebas de diagnostico base

Carbohidratos Control de 10 Control de 40

°C °C

Maltotriosa + +

Fructuosa + +

Control negativo

Control positivo + +

Las pruebas de diagnóstico de carbohidratos de Api 20 C AUX se

muestran en la Tabla 6. Se observó crecimiento en las pruebas de glucosa,

maltosa y sacarosa, mientras que no hubo crecimiento en glicerol y lactosa.

En el caso de trehalosa, para los controles del tratamiento térmico sin

criopreservador (condición 1 de la Tabla 3) a 10 °C, no mostraron crecimiento

en la prueba de trehalosa. En contraste, en los controles del tratamiento

térmico de 40 °C, si se observó crecimiento en este azúcar.

40

Tabla 6 Resultado de las pruebas de asimilación de carbohidratosmediante el método Api 20C AUX

Pruebas de diagnostico base

Pruebas Control de 10 °C Control de 40 °C

Control negativo

Glucosa + +

Glicerol

Lactosa

Maltosa + +

Sacarosa + +

Trehalosa - +

5.2 Características de la cepa previas a los tratamientos térmicos (cél/mL, número de cicatrices y contenido de glucosa y hexosastotales).

Los resultados de los análisis de diagnóstico (frecuencia de cicatrices y el

número de células por mililitro a las 48 h) y determinación de la cantidad de

glucosa (método de Peroxidasa oxidasa) y hexosas totales (método de

Antrona) se presentan la (Tabla 4). El contenido de glucosa para ambas

repeticiones es constante (1.239 y 1.230 mg/g de cel (peso seco)). El

resultado del contenido de hexosas (método de Antrona) varió entre las dos

repeticiones (4.117 y 3.644 mg/g de cel (peso seco)).

41

La mayor frecuencia de cicatrices por célula en ambas repeticiones fue de

2 a 4 y el número de células por mililitro fue semejante en ambas

repeticiones (31x106 y 33x106 cél/ mL a la 42 h de incubación).

Tabla 7 Número de cél/ mL, frecuencia de cicatrices y contenido de glucosay hexosas totales de la cepa antes del tratamiento térmico.

Número de

repetición

Glucosa total(Método

Peroxidasaoxidasa)

Azúcares totales

(Método de Antrona)

Frecuencia decicatrices

No. de

células/mL a

las 48 h

1.239 4.117 33X106

1.230 3.644 31.4X106

42

5.3 Contenido de azúcares totales, glucosa y trehalosa posterior altratamiento térmico.

Tabla 8 Contenido de trehalosa observados en los tratamientos térmicoscon y sin trehalosa incluida en el vehículo de tratamiento.

Peroxidasa oxidasa Glucosa Glucosa + Th TrahalosaVehículo detratamiento "Glucosa s/Eth **Glucosa

c/Eth Diferencia

(1) Control = 10.1(5)PBS + 10°C = 10.2(7)10°C+Th=10.3

(1) Control = 40.1(5) PBS + 40°C = 40.2(7) 40°C+ Th = 40.3

0.2142.099

0.2141.852

1.5962.9979.859

1.2316.0327.849

1.3820.8987.76

1.0174.1815.997

Método de AntronaVehículo de tratamiento * Antrona s/Eth ** Antrona c/Eth Diferencia(1) Control = 10.1(5)PBS + 10°C = 10.2(7)10°C+Th = 10.3

(1) Control =40.1(5) PBS + 40°C = 40.2(7) 40°C+ Th = 40.3

0.7580.715

0.7580.657

1.5651.271

17.378

0.7676.168

20.432

0.8070.55616.663

0.0925.51119.774

(Loscel)

datos están dados en mg/g

* Th = Trehalosa

** E-th = Enzima trehalasa

Nota: Los números en paréntesis indican la condición/tratamiento correspondiente en la Tabla

3.

Para las condiciones 2, 3 y 4 el resultado del contenido de trehalosa es el mismo que el

no. 1. Para la condición 6 el resultado del contenido de trehalosa es el mismo que el no.

5 y para la condición 8 el resultado de trehalosa es el mismo que el no. 7 (ver Tabla 3).

43

Se observó una variabilidad en los resultados de contenido de trehalosa

entre las condiciones 1 y 5 por el método de Peroxidasa oxidasa, mientras

que en los resultados del método de Antrona, entre estas condiciones, fueron

mas homogéneos.

El resultado de mayor contenido de trehalosa sin su adición externa

(condición 5), se presenta en el tratamiento a 40°C. Este resultado es

consistente para ambos métodos de cuantificación.

El resultado de mayor contenido de trehalosa con la adición previa de

este azúcar (condición 7), se presenta en el tratamiento a 10 °C con el

método de Peroxidasa oxidasa, mientras que en el método de Antrona, se

presenta en el tratamiento a 40 °C.

El análisis de los métodos para la cuantificación del contenido intracelular

de trehalosa (Peroxidasa oxidasa y Antrona) arroja una correlación de 0.790

(Tabla 9). El análisis estadístico t para muestras pareadas, indica que no hay

una diferencia significativa (p<0.05) entre ambos métodos.

Tabla 9 Determinación de trehalosa (mg/gcel) por dos diferentesmétodos Antrona y Peroxidasa oxidasa.

DeterminaciónTratamiento

Control 10°CT.t.10°CsmiT.t.10°CcmiControl 40°CT.t.40°C sfThT.t.40°C cATh

de trehalosaAntrona

0.8070.55616.6630.0925.51119.774

(mg/gcel) por:

^oxidas?3

1.3820.8987.7601.0174.1815.997

44

5.4 Comparación del contenido de trehalosa entre tratamientos(obtenidos por el método de Peroxidasa oxidasa)

Los resultados de esta comparación se presentan en la Tabla 10. El

análisis estadístico de la comparación de métodos de cuantificación de

trehalosa para ambos tratamientos térmicos, con y sin uso de trehalosa

externa, no presentan diferencia significativa (t = -1.847; p < 0.05, t = -1.673;

p < 0.05). Esta comparación se llevó a cabo de acuerdo a la estrategia

experimental y nomenclatura de los tratamientos del diagrama de las Figuras

4.11 y 4.12.

Tabla 10 Comparación del contenido de trehalosa entre losdiferentes tratamientos provenientes del métodoPeroxidasa oxidasa (por el método de muestraspareadas de f-student, SPSS para Windows versión 9)

a) Para el tratamiento a 40°CTratamiento

40-140-1

vs. tratamiento40-240-3

b) Para el tratamiento a 10°CTratamiento

10-110-1

c) Entre

Tratamiento


ambos tratamientosvs. tratamiento

Valor de P7= 4.503; p>0.057= 3.404; p>0.05

Valor de P7 = 3.343; p>0.05r=0.439;p<0.05

Valor de P

40-1 10-1 7=0.626; p<0.0540-2 10-2 7=-1.673; p<0.0540-3 10-3 T=-1.847;p<0.05

5.4.1 Comparación del contenido de trehalosa entre tratamientos(obtenidos por el método Antrona)

45

Los resultados de esta comparación se presentan en la Tabla 11. El

análisis estadístico de la comparación entre ambos tratamientos de 10 °C y

de 40 °C con y sin uso de trehalosa, no presentan diferencia significativa (t =

0.083; p < 0.05, t = 0.036; p < 0.05). Esta comparación se llevó a cabo de

acuerdo a la estrategia experimental y nomenclatura de los tratamientos del

diagrama de las Figuras 4.11 y 4.12.

Tabla 11 Comparación del contenido de trehalosa entre losdiferentes tratamientos por el método de antrona (por elmétodo de muestras pareadas de f-student, SPSS paraWindows versión 9)

d) Para el tratamiento a 40°CTratamiento

40-140-1


e) Para el tratamiento a 10°CTratamiento

10-110-1

f) EntreTratamiento


ambos tratamientosvs. tratamiento

Valor de P7=-1.351;p<0.05T= -3.404; p>0.05

Valor de PT= 0.709; p<0.05r=-5.638;p>0.05

Valor de P

40-140-240-3

10-110-210-3

7= 2.203; p<0.05T= 0.083; p<0.05T= 0.036; p<0.05

Nota: la nomenclatura de los diferentes tratamientos, a la Tabla 3

46

5.5 Resultados de los análisis elaborados después de 60 días dealmacenaje a -86 °C

A continuación se presentan los resultados de los análisis elaborados

después de 60 días de almacenaje a -86 °C. Estos resultados se analizan en

función de la nomenclatura dada a los tratamientos del esquema presentado,

en la estrategia experimental antes y después de los tratamientos de las

Figuras 4.11 y 4.12.

5.6 Porcentaje de células muertas y su comparación entre tratamientos

El resultado del porcentaje de células muertas se presenta en la Figura 8.Para el tratamiento 10-1 (control), con respecto a la condición dealmacenamiento del tratamiento 10-1-1c, presenta diferencia significativa (t >3..245) comparado con los tratamientos 40-1-1 a., b y c, ,no presenta unadiferencia significativa (t > 1.750). En contraste, la condición dealmacenamiento 40-1 -1d comparada con el control 40-1, si presentadiferencia significativa en el porcentaje de células muertas después dedescongelar la cepa.

El análisis de los tratamientos térmicos a 10-2 y 40-2, comparado con sus

correspondientes tratamientos (10-2-1 a, b, c y d, y 40-2-1 a, b, c y d

respectivamente), indica que: para ambas condiciones, la diferencia

significativa se presenta en las condiciones 10-2-1 a y 40-2-1 a

respectivamente 81.51 % y 84.84 %, ó sea para aquellas cepas que se

almacenaron sin crioprotector.

47

I a) PBS

10-1 40-1

H b) PBS + gly

10-2 40-2

ü d) PBS+ Th+ gly

10-3 40-3

I c) PBS + Th

Figura 8 Porcentaje de células muertas en función de la condición de almacenaje

según la nomenclatura de la estrategia experimental de las Figuras 4.11 y 4.12.

5.6.1 Porcentaje de células muertas vs. contenido de trehalosa

La comparación del porcentaje de células muertas y la cantidad de

trehalosa al reactivar la cepa, después de 60 días se presenta en la Figuras 9

para los tratamientos a 40 °C y en la Figura 10 para los tratamientos a 10 °C.

El porcentaje de células muertas en los tratamientos 40-1-1 b, c d (cepas

resuspendidas sólo en PBS y sometidas al tratamiento térmico de 40°C)

presentan valores más altos comparados con las condiciones

correspondientes 40-2-1 b, c, d. En contraste, la condición a en ambas

series, difieren notablemente. El porcentaje de células muertas para el

tratamiento térmico a 40 °C y sin crioprotector (40-2-1) presenta casi el doble

de mortandad que su correspondiente 40-1-1 a.

48

valores mayores que el control a excepción del tratamiento 40-1-1c que

corresponde al que se almacenó con trehalosa adicionada.

De la comparación entre las dos series de 40 °C sin y con trehalosa (40-2-1 a, b, c, d y 40-3-1 a ,b, c, d, respectivamente), se observó que los valoresde porcentaje de células muertas son menores en el tratamiento térmico sintrehalosa adicionada (40-2-1 a, b, c, d).

El porcentaje de células muertas en la serie 10-1-1 b, c d (cepas

resuspendidas sólo en PBS y sometidas al tratamiento térmico de 10°C)

presentan valores más altos comparados con las series correspondientes 10-

2-1 b, c, d. El tratamiento 10-2-1 a presentó los valores más altos de células

muertas de las tres series.

En la comparación de la serie 10-3-1 a, b, c, con el controlcorrespondiente 10-1-1 a, b, c, la primera serie presenta menor porcentaje decélulas muertas que su control correspondiente. En el caso del tratamiento10-3-1 d,(tratamiento a 10 °C con trehalosa externa) presentó casi el dobledel porcentaje de células muertas que su correspondiente control (10-1-1 d).

Para la serie 10-2-1 a, b, c, d, el porcentaje de células muertas decrece

paulatinamente en cada uno de los tratamientos mencionados. El menor

porcentaje de células muertas se obtuvo en el tratamiento a 10 °C con

glicerol y trehalosa como crioprotectores. En la comparación de ésta serie

con la serie 10-3-1 b, c, d se observa una marcada diferencia.

49

90 -

*40-1 1a 1b 1c 1 d *40-2 2 a 2b 2c 2d *40-3 3a 3b 3c 3d

m % de cel. muertas B Th (mg/gcel) para cada la serie

E3 % de cel. muertas • Th (mg/gcel) para cada la serie

La nomenclatura dada a los tratamientos del esquema presentados en la estrategia

experimental antes y después de los tratamientos la Figura 4.12.Figura 9 Porcentaje de células muertas y el contenido intracelular de trehalosapara el tratamiento térmico a 40 °C

oo*10-1 1a 1b 1c 1 d *10-2 1a 1b 1c 1 d *10-3 1a 1b 1c 1 d

m % de cel. muertas, n Th (mg/gcel) para cada la serie

* la nomenclatura dada a los tratamientos del esquema presentado en la

estrategia experimental antes y después de los tratamientos de la

Figura 4.11Figura 10 Porcentaje de células muertas y el contenido intracelular de trehalosa para

el tratamiento térmico a 10 °C

50

5.7 Número de cél/mL respecto a la condición de almacenaje despuésde su reactivación

Los valores de células por mililitro después 48 h de incubación se

presentan en la Figura 11. Los resultados se analizan en función de la

nomenclatura dada a los tratamientos del esquema presentado en la

estrategia experimental antes y después de los tratamientos de las Figuras

4.11 y4.12.

La concentración celular fue variable en las distintas series, salvo en la

40-3, en la que los resultados fueron más homogéneos. La mayor

concentración de células por mililitro (38 x106) se presentó en la serie 10-1-1

c (tratamiento a 10 °C con trehalosa como crioprotector). El valor mas alto

para las series de 40°C, se presentó las condiciones de 40-2-1 b y d

(tratamientos a 40°C con glicerol y glicerol mas trehalosa), de 32 X 106 cél/

mL. (Las condiciones que presentaron menor contenido de células por

mililitro al final de la fermentación, fueron los controles sin crioprotector las

dos primeras series (sin tratamiento térmico a 10 y 40 °C y con tratamiento

térmico a 10 y 40°C), mientras que el control del tratamiento térmico a 10°C

con trehalosa adicionada presentó valores altos 38X106 cél/ mL.

51

«c lio

"i

l/m

0)u

45.0540.0535.0530.0525.0520.0515.0510.055.050.05

-JÍ

• in 1 1•HBB I J M « | *

J-IL*-r-

9 !f4i H-1 •" • 1 111i ti

10-1 40-1 10-2 40-2 10-3

Condiciones de almacenamiento40-3

la) PBS Ib) PBS + gly le) PBS + Th Id) PBS+Th+gly

Figura 11 Número de células por mililitro agrupadas por serie, al reactivar lostratamientos después de 60 días de almacenamiento

La comparación del número de células por mililitro y la cantidad de

trehalosa al reactivar la cepa después de 60 días, se presentan en las figuras

12y 13.

La serie 40-2, muestra los valores mas altos de trehalosa y de

concentración celular en los tratamientos b (32.4X106) y c (33.7 X106). Estos

tratamientos corresponden a los que se contenían como criopreservador,

glicerol solo y sólo trehalosa sola. En esta misma serie, se observó la menor

concentración celular para el tratamiento control que recibió el tratamiento

térmico, pero que se almacenó sin criopreservador. Sin embargo, en la serie

40-1, tratamiento d, se observaron altos valores de concentración celular

(28.5 X106) , el que no recibió tratamiento térmico, pero se utilizó la

combinación de glicerol y trehalosa como crioprotector.

52

Para el tratamiento a 10°C, los valores mas altos de concentración celular

(38.8X106) correspondieron, a el tratamiento control con glicerol y trehalosa

como criopreservador (40-1-1 d) a pesar de que el contenido de trehalosa es

uno de los más bajos. Otra concentración celular alta (34X X106) se observó

para el tratamiento térmico con trehalosa y sin crioprotector durante el

almacenaje. En este tratamiento también se observó el valor de contenido

de trehalosa intracelular mas alto (10 mg/g cél aprox.). La menor

concentración de de células por mililitro se presentó en los tratamientos sin

crioprotector de la serie 10-1 y 10-2 (sin y con tratamiento térmico a 10°C

respectivamente.

4.000E+07

3.500E+07

§ 3.000E+07

I 2.500E+07E 2.000E+07i:

S 1.500E+07

•JJ 1.000E+07Z 5.000E+06

O.OOOE+00I 0.000

*40-1 1a 1b 1c 1 d MO-2 1a 1b 1c 1 d *40-3 1a 1b 1c 1 d

m Th (mg/gcel) por cada serie • No de cel/mL

* la nomenclatura dada a los tratamientos del esquema presentado en la estrategia

experimental antes y después de los tratamientos de la Figura 4.12

Figura 12 Contenido de trehalosa intracelular vs. células por mililitro de la serie detratamientos térmico a 40 °C después de de la reactivación de la cepa

53

4.500E+074.000E+073.500E+07

l

3.000E+07 r2.500E+072.000E+071.500E+071.000E+075.000E+06O.OOOE+00 !

*10-1 1a 1b 1c 1 d *10-2 1a 1b 1c 1 d *10-3 1a 1b 1c 1 d

O Th (mg/gcel) por cada sene • No de cel/mL

* la nomenclatura dada a los tratamientos del esquema presentado en laestrategia experimental antes y después de los tratamientos de laFigura 4.11

Figura 13 Contenido de trehalosa intracelular vs. células por mililitro de la serie detratamientos térmico a 10 °C después de la reactivación de la cepa

5.8 Pruebas fisiológicas (asimilación de aminoácidos y carbohidratos)antes y después del almacenaje a -86 °C

5.8.1 Pruebas de asimilación de aminoácidos

La prueba de asimilación de los 10 aminoácidos analizados, se observó

un comportamiento semejante a la prueba de diagnóstico inicial (Tabla 4,

donde se obtuvo crecimiento en todos los aminoácidos a excepción de la

Lisina), salvo en los casos que a se indican en la Figura 14. Los resultados

se muestran en e|. Anexo 1.

En general, el crecimiento en la serie de 10-1 (sin tratamiento térmico) fue

consistente con la prueba de diagnóstico salvo el caso de la Alanina en el

tratamiento c (+ trehalosa) y Fenilalanina en el tratamiento (+glicerol). La

serie 10-2, se comportó igual a la prueba de diagnóstico inicial. En la serie

54

10-3 se observó ausencia de crecimiento para los tratamientos c y d (+

trehalosa y + glicerol y trehalosa).

Para el tratamiento a 40°C, se observó que en casi todos los tratamientosno hubo crecimiento en la Fenilalanina (40-1-1 a, b, c y d; 40-2-1 b, c y d; 40-3-1 a, b, c, y d). En estas series, sólo se obtuvo crecimiento en el tratamientosujeto a 40°C y sin criopreservador (40-2-1 a).

Serie

10-1

10-2

10-3

40-1

40-2

40-3

Aminoácido

Ala

Lys

Phe

Lys

Lys

Phe

Lys

Phe

Lys

Phe

Lys

Phe

Tratamientos

a

-

-

-

-

-

-

-

-

b

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

c-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

d

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Figura 14 Relación de los aminoácidos en los que no se observó crecimientopara las diferentes series (a excepción de la Lisina)

5.8.2 Pruebas de asimilación de carbohidratos

Los resultados de asimilación de carbohidratos para las diferentes series,

fueron iguales a las pruebas del diagnóstico inicial, en las que se observó

55

crecimiento en Maltotriosa y Fructuosa en todos los tratamientos. Los

resultados se muestran en el Anexo 1.

5.8.3 Pruebas rápidas de identificación Api 20 C AUX

Los resultados de asimilación de carbohidratos por este método para las

diferentes series, fueron iguales a las pruebas del diagnóstico inicial. En el

caso de trehalosa, los resultados fueron variables tanto en el diagnóstico

inicial (Figura 6), como para todos los tratamientos (Figura 15).

Serie

10-1

10-2

10.3

40-1

40-2

40-3

Tratamiento

a

-

-

-

b-

-

c-

-

-

d-

-

-

-

Figura 15 Resultado de la asimilación de Trehalosa por medio de la prueba rápidade identificación Api 20 AUX en las diferentes series

56

DISCUSIONES

En este estudio, se examinó el contenido de trehalosa al inicio de la fase

estacionaria de crecimiento (42 h) por ser la etapa de mayor acumulación de

trehalosa intracelular (Krallish, etal., 1997). Nuestras observaciones indican

que fue posible inducir la síntesis de este disacarido por medio de un estrés

térmico de 1 h a 40°C, donde se observó un dramático incremento (4X) en

contenido de trehalosa (Tabla 8 y 10). Además, el análisis estadístico nos

indica que el incremento en los "tratamientos correspondientes" de ambas

temperaturas no es significativo. Sin embargo, en el tratamiento de 3 h a 10

°C, no se observó tal incremento. Conrad, et al, (2001) reportan que el

contenido intracelular de trehalosa es posible inducir su síntesis mediante un

estrés térmico a temperaturas mayores de 40 °C.

Ribeiro, et al., (1999) y Diniz-Mendes, et al., (1999), reportan que loscontenidos intracelulares de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae varíande cepa a cepa. Los valores encontrados para la cepa utilizada en esteestudio, oscilaron entre 1.017 y 1.382 mg/g cel. (peso seco), de acuerdo almétodo de Peroxidasa oxidasa.

Por otra parte, el proceso de internalización de trehalosa durante el estrés

térmico fue evidente para ambos tratamientos térmicos (según se observa

por ambos métodos de cuantificación). Debido a que no se incubó un vial

con trehalosa a temperatura ambiente, no podemos concluir si el proceso de

internalización fue acelerado por el estrés térmico. Sin embargo, Benaroud,

et al, (2001) indica que la internalización de trehalosa es inducida mediante

someter a S. cereviceae a temperaturas extremas, confirmando lo

observado.

Con respecto a la comparación de ambos tratamientos de cuantificación

de trehalosa, observamos que el método de Peroxidasa oxidasa, presenta la

57

ventaja de ser específico para cuantificación de glucosa ya que con la

combinación del uso de la trehalasa (que desdobla la trehalosa en dos

moléculas de glucosa,) es posible cuantificar específicamente la glucosa

proveniente de la actividad enzimática de la trehalasa. Por otra parte, el

método de la Antrona, no es tan específico, ya que reacciona con hexosas

aldopentosas, ácidos urónicos, etc. Los resultados obtenidos por el método

de Antrona en ambos casos son más elevados, llegando hasta más de

doscientas veces el valor obtenido en el control. Nuevamente, este resultado

se atribuye al método no especifico ya que el contenido de hexosas varían

según los componentes internos en las células. El tipo y cantidad de

hexosas producidas depende del contenido previo de xilitol, ergoesteroles,

prolinas glicógeno, etc. (Krallish, etal., Tracey, etal.).

Por ello consideramos mas confiable el método de Peroxidasa oxidasa,

ya que este método muestra una especificidad hacia el contenido de glucosa,

descartando cualquier otro componente presente. Nuestras observaciones

son consistentes con las hechas por Ferreira, et al, (1997) donde comparan

tres métodos cuantitativo para trehalosa (método de Antrona, Peroxidasa

oxidas y HPLC), donde observaron que métodos como Peroxidasa oxidasa y

HPLC presentan mayor confiabilidad en la cuantificación de este disacárido.

El análisis del contenido de trehalosa demuestra que la acumulación

intracelular de este disacárido, representa una ventaja en la supervivencia de

la levadura durante y después de la congelación como se observó en las

Figuras 9 y 10. Este fenómeno se pone de manifiesto al reactivar la cepa,

donde el menor porcentaje de células muertas se presenta en las series con

mayor contenido de trehalosa. Krallish, et al., (1997), y Ribeiro, et al. (1999),

indican que la acumulación de trehalosa ofrece una mayor resistencia al

estrés térmico (Ribeiro, et al., 1999) y que esta capacidad de acumulación

del disacárido es mas notoria en células jóvenes.

58

En el tratamiento térmico a 10 °C con la adición de trehalosa externa al

medio de tratamiento, se observa que los contenidos de trehalosa interna se

incrementan cinco veces comparados con los obtenidos para el control. Con

respecto al mismo tratamiento, la utilización del método de Antrona muestra

que el contenido de trehalosa se ve incrementado 20 veces con respecto al

valor del control. Estos resultados coinciden con lo descrito Parrou, et al.,

(1999) en Scchizomyces pombe. Estos autores observaron que al congelar

la masa con esta levadura, no perdía las características potenciales para la

elaboración de pan. Al analizar el contenido de las levaduras de las masas

congeladas, encontraron consistentemente un incremento en trehalosa. Por

lo que se sugiere que bajo condiciones de estrés térmico, la levadura

acumula este disacárido.

Se observa que para ambos tratamientos, las células expuestas al

tratamiento térmico, combinado con la adición de trehalosa externa al medio

reportan un incremento en el contenido intracelular de trehalosa. Esta

observación ha sido descrita por Diniz-Mendes, L, et al. (1999) con el objeto

de "preadaptar" las levaduras a la resistencia por estrés térmico, al

exponerlas a un medio con alto contenido de trehalosa.

En el método de Antrona, podemos observar que para los tratamientos

sin la adición de trehalosa externa al medio, tanto el tratamiento a 10 °C

como el tratamiento a 40 °C, no presentan diferencia significativa en los

niveles de trehalosa. Esto sugiere que la acumulación de trehalosa

intracelular durante el estrés térmico es menor.

Lewis, y Young, (1995) reportan que una viabilidad >95% es típica de un

cultivo saludable, mientras que cultivos con < 85% no son adecuados para

producción. Se observó que los tratamientos que presentan mayor

59

porcentaje de células muertas, provienen de cepas que fueron congeladas

sin criopreservador, (controles de los tratamientos térmicos a 10 °C y 40 °C,

sin trehalosa adicionada al medio). En el almacenaje sin criopreservador,

para los tratamientos térmicos, se observa que los porcentajes de células

muertas se encuentran entre el 40 y 60%. Esto es un comportamiento similar

al diagnóstico base de la cepa al recibirla (con tres meses en almacenaje

aprox. a 4 °C, Figura 5), mientras que en el diagnóstico de los viales de

resguardo (con días de almacenaje a 4°C) se obtiene un máximo de 10% de

células muertas. Esto quizá se deba al efecto de protección contra estrés,

particularmente durante el almacenamiento a bajas temperaturas reportado

por Van Dijck, et al., (1995). Por otra parte, Singer, et al., (1998),

confirmaron la homogeneidad en el porcentaje de células muertas y el

número de células total, al reactivar una cepa que ha sido almacenada a -86

°C por un periodo de 60 días.

Para la condición de almacenamiento con glicerol al 10 % se observa que

en algunos casos el porcentaje de células muertas es mayor que lo

observado para la condición sin crioprotector, situación que se ha presentado

en estudios previos de esta cepa en particular (Damas, comunicación

personal). No obstante, para esta misma condición, para el tratamiento

térmico a 40 °C sin la adición de trehalosa, se observa un menor porcentaje

de células muertas, que en los demás tratamientos.

La combinación de glicerol y trehalosa, ambos al 10 %, presenta una

acción en la cual los porcentajes de supervivencia, para los tratamientos

térmicos de 10 y 40 °C sin la adición de trehalosa (al medio de tratamiento)

son mayores al 60 %. Para el tratamiento a 10°C el porcentaje de células

muertas es menor cuando solo se usa glicerol. Por otro lado, en el

tratamiento a 40 °C, se obtuvo que el uso de glicerol al 10 % sin trehalosa

como crioprotector, presenta un porcentaje de células muertas que es

todavía menor que con la combinación de ambos crioprotectores.

60

Un aspecto interesante se presenta en la condición de almacenamiento

con trehalosa al 10%, donde el control del tratamiento de 10 °C (el cual no se

sometió a estrés térmico) muestra el menor porcentaje de células muertas.

Este control muestra mayor supervivencia que los tratamientos térmicos a 10

y 40 °C con y sin la adición de trehalosa (al medio de tratamiento). Esta

condición de almacenamiento (trehalosa al 10%) presenta aún mayor

supervivencia que la presente en el diagnostico inicial. Este dato nos indica

que existe un efecto de protección hacia el almacenamiento a -86 °C por la

trehalosa. Plourde-Owobi, y colaboradores (2000), reportan datos similares,

donde la trehalosa presenta una acción protectora contra la congelación,

aumentando la viabilidad de las células al momento de descongelar el

microorganismo. Este efecto se presenta ya que el disacárido interactúa

entre la membrana de las células y los hidrógenos del agua evitando que se

presenten daños al momento de la recristalización al descongelar.

En los tratamientos térmicos, con la adición de trehalosa al medio de

tratamiento, se observa que las cuatro condiciones de almacenamiento

presentan un rango de 40 a 60 % de células muertas. Por ello, se pude

considerar que el tratamiento térmico a 10 °C y la consecuente acumulación

intracelular de trehalosa, representa un mecanismo importante de protección

de la célula. Así este tratamiento incrementa la tolerancia a la congelación,

lo que se refleja en el las diferentes condiciones de almacenaje respectivas a

este tratamiento.

Se ha determinado que existe una relación entre la concentración de

trehalosa y el porcentaje de células muertas presentes para los tratamientos

térmicos con y sin la adición de trehalosa externa al medio. Para el

tratamiento térmico a 10 °C con trehalosa adicional al medio, el porcentaje de

células muertas es menor que en el tratamiento sin la adición de trehalosa

externa al medio y su respectivo control. Esto es, el porcentaje de células

muertas es mayor e inversamente proporcional al contenido de trehaiosa

intracelular. Esto indica que la combinación del tratamiento térmico a 10 °C y

la presencia de un crioprotector incrementan el porcentaje de supervivencia

de las células durante el proceso de almacenaje a -86 °C por 60 días.

El tratamiento térmico a 40 °C con la adición de trehaiosa externa almedio, exhibe la mayor cantidad de trehaiosa acumulada internamente. Sinembargo, el porcentaje de células muertas es mayor, a pesar de que elcontenido de trehaiosa acumulado es mayor al del control. El porcentaje decélulas muertas no presenta una diferencia significativa con el control (p <0.05), aunque sí para el contenido de trehaiosa. El tratamiento a 40 °C sin laadición de trehaiosa externa también exhibe un porcentaje menor de célulasmuertas con un contenido intracelular de trehaiosa mayor comparado alcontrol.

El número de células por mililitro para estos tratamientos, expuestos a 10

°C y 40 °C con y sin la adición de trehaiosa externa al medio se comparó con

su respectivo control. Se obtuvo que el número de células por mililitro al

reactivar los tratamientos sin la adición de trehaiosa al medio, con

tratamientos térmicos a 10 °C y 40 °C, es menor que el control. Por otro lado

en los tratamientos térmicos con la adición de trehaiosa externa al medio, se

observa que el número de células por mililitro es mayor en comparación al

control. Sin embargo, la comparación entre los tratamientos térmicos de 10

°C y 40 °C; mostró que el tratamiento a 10 °C presenta un mejor desempeño

de la cepa al ser reactivada después de la congelación (Eleuterio, et al.

1993), lo que se puede atribuir al contenido de trehaiosa.

Con respecto al tratamiento térmico a 40 °C en relación al número de

células por mililitro presente en la reactivación y la relación del contenido de

trehaiosa acumulado internamente, se presenta que, la condición en la cual

no se adiciono trehaiosa al medio, el contenido celular es mayor comparado

62

con la condición en la cual se adiciono trehalosa al medio, donde el número

de células por mililitro al reactivarse es menor, aun con la presencia de una

mayor cantidad de trehalosa acumulada durante el tratamiento térmico. El

tratamiento térmico a 10 °C, se observa el mayor número de células por

mililitro al reactivarse, esto relacionado con un mayor contenido de trehalosa

acumulado en la condición de tratamiento térmico con adición de trehalosa al

medio.

Al término de los 60 días de almacenamiento, se reactivaron los viales

correspondientes a las diferentes condiciones de almacenamiento por 48 hrs

y se observo el comportamiento en la asimilación de aminoácidos. Para

ambos tratamientos a 10 °C y 40 °C, se obtuvo un dato negativo para la

asimilación de Usina, dato similar a los resultados obtenidos en el

diagnostico base de la cepa. Esta situación se observa en las diferentes

repeticiones y tratamientos, lo que indica que este aminoácido no se

presenta como una fuente de nitrógeno para mantener el crecimiento de la

levadura (Patterson, y Ingledew 1999).

La asimilación de Fenialanina en las condiciones de almacenamiento de

glicerol al 10% mas trehalosa al 10% y en la condición de trehalosa al 10%,

para al tratamiento a 10 °C fue positiva. Este comportamiento no ha sido

reportado para las condiciones de almacenamiento con crioprotectores

comerciales como el glicerol. La condición normal de la asimilación de este

aminoácido es positiva en casos en los cuales las células no son sometidas a

un estrés térmico y a diferentes condiciones de almacenamiento.

La asimilación de aminoácidos se presenta en situaciones donde la

glucosa se presenta limitada. El estrés que representa esta condición

provoca que la levadura acumule trehalosa y glicógeno. Se obtuvo que en el

tratamiento térmico a 10 °C sin adición de trehalosa al medio, la cantidad de

63

trehalosa acumulada es menor. Por ello, la asimilación del aminoácido

Fenialanina no es posible por falta de metabolitos de reserva.

Esto representa un sistema de identificación rápido, ya que en el caso de

una ausencia de glucosa, se almacenan carbohidratos como trehalosa y

glicógeno (Cansado, et al. 1998). Así mismo se observa que la actividad

enzimática es mayor para el desdoblamiento de estos dos azúcares. Esto lo

vemos en el poder de asimilación que se presento en las condiciones de

almacenamiento para la asimilación de trehalosa.

El comportamiento de la cepa durante los tratamientos térmicos muestra

que las condiciones morfológicas y fisiológicas (para el tratamiento térmico a

10 °C) no presentan un cambio significativo en comparación al diagnóstico

base de la cepa. No así para el tratamiento térmico a 40 °C donde el

porcentaje de células muertas y el numero de células por mililitro al

reactivarse es menor al tratamiento térmico a 10 °C y al diagnostico base.

64

7 Conclusiones

El diagnóstico inicial de la cepa al reactivar el vial original, presenta

valores para el número de células por mililitro y para el porcentaje de células

muertas, menores a los observados en el diagnóstico base de los viales de

resguardo. Los valores de la segunda reactivación tanto para el número de

células por mililitro como para el porcentaje de células muertas alcanzan los

parámetros requeridos para una fermentación.

La capacidad de asimilación de carbohidratos y aminoácidos en todos los

tratamientos se mantuvo similar a los resultados del diagnóstico base. Para

esta cepa, se observó consistentemente la falta de asimilación para Lisina y

en algunos tratamientos para la Fenilalanina. Para la asimilación de

carbohidratos se presentó una asimilación positiva para maltoriosa y

fructuosa. Las pruebas Api 20 C AUX, presentaron crecimiento en el

disacárido trehalosa en la mitad de los tratamientos.

Al reactivar las cepas después de ser almacenadas a -86 °C, el

porcentaje de células muertas en las diferentes condiciones de

almacenamiento, se presenta superior al 30 % con excepción del control de

10 °C (en la condición con trehalosa al 10%). En este control, el porcentaje

de células muertas es menor a los demás tratamientos y condiciones de

almacenamiento, presentando la trehalosa un efecto de crioprotector.

El tratamiento a 40 °C no presenta la misma correlación entre el

contenido de trehalosa y el porcentaje de células muertas. En este caso no

se relaciona la acumulación de trehalosa intracelular con el efecto de

termotolerancia. La correlación existente entre el contenido de trehalosa y el

porcentaje de células muertas, presenta un mejor desempeño en el

tratamiento a 10°C. Con este tratamiento se logra la mayor cantidad de

65

trehalosa acumulada internamente ya sea por síntesis o internalización, y el

porcentaje de células muertas es menor.

En general, observamos que para la serie control (sin tratamiento

térmico), los mayores valores de cél/ mL y menor porcentaje de células

muertas, se presentan en los tratamientos que fueron congelados con glicerol

y trehalosa como criopreservador (10-1d y 40-1 d). Las pruebas fisiológicas

de éste tratamiento fueron idénticas al diagnóstico base de la cepa original.

Para la serie de 10-2, el contenido de trehalosa intracelular es el doble deltratamiento control. Los tratamientos que tuvieron un mejor desempeño encuanto a número de cél/ mL y porcentaje de células muertas fueron los 10-2c y d. Sin embargo estos valores representan aprox. la mitad de los valoresde diagnóstico inicial. Los resultados de asimilación de aminoácidos fueronidénticos al diagnóstico base inicial. En contraste, para la serie 40-2, losmejores valores de número de cél/ mL y menor porcentaje de célulasmuertas, se encuentran en los tratamientos con glicerol y con trehalosa comocrioprotector. Estos valores están más cercanos a los valores del diagnósticoinicial. Estos tratamientos no mostraron la capacidad de asimilación deFenilalanina.

Para la serie 10-3 (con tratamiento térmico y trehalosa externa), el

contenido de trehalosa fue de los mayores. Los mejores tratamientos con

respecto al número de cél/ mL y menor porcentaje de células muertas, fueron

en los que no se utilizó ningún criopreservador y su comportamiento

fisiológico fue igual que el diagnóstico base inicial. Para la serie 40-3, el

contenido de trehalosa fue uno de los mejores (similar a la serie 10-3). Esta

serie observó un comportamiento muy homogéneo con respecto al número

de cél/ mL y al porcentaje de células muertas en los cuatro tratamientos. Se

observó una carencia en la capacidad de asimilación de Fenilalanina en

todos los tratamientos.

66

8 BIBLIOGRAFÍA CITADA

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70

9ANEXOS

71

ANEXO 1 .RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DE ASIMILACIÓN DEAMINOÁCIDOS

Tabla 12 Asimilación de aminoácidos para el control de 10 °C despuésde 60 días de almacenamiento

Tratamiento control de 10 °C

glicerolal 10%Condición de Sin glicerol al 10% Trehalosaal

+ thal10%enalmacenaje crioprotector en PBS 10% en PBS

PBS

Aminoácido_ _ _ _ _ .

Glu + + + +

Arg + + + +

lie + + + +Leu + + + +Lys . . . .

Phe + - + +

Thr + + + +

Val + + + +

Pro + + + +

Control (-) -

Control (+) + + + +

72

Tabla 13 Asimilación de aminoácidos para el tratamiento a 10 °C sin adición detrehalosa externa al medio después de 60 días de almacenamiento

Tratamiento a 10 °C

Tratamiento térmico a 10°C sin th adicional en el medio

glicerol al 10%Condición de Sin glicerol al 10% Trehalosa al


PBS

Aminoácido_ _ _ _ _ _

Glu + + + +Arg + + + +

lie + + + +

Leu + + + +Lys . . . .

Phe + + + +

Thr + + + +

Val + + + +

Pro + + + +

Control (-) -

Control (+) + + + +

73

Tabla 14 Asimilación de aminoácidos para el tratamiento a 10 °C conadición de trehalosa al medio externo después de 60 días dealmacenamiento

Tratamiento a 10 °CTratamiento térmico a 10°C con th adicional en el medio



PBS


Glu + + + +Arg + + + +Me + + + +

Leu + + + +Lys . . . .

Phe + + -

Thr + + + +

Val + + + +

Pro + + + +

Control (-) -

Control (+) + + + +

74

Tabla 15 Asimilación de aminoácidos para el control de 40 °C despuésde 60 días de almacenamiento

Tratamiento control de 40 °Cglicerol al 10%

Condición de Sin glicerol al 10% Trehalosa al+ thal10%en

almacenaje crioprotector en PBS 10% en PBSPBS


Glu + + + +

Arg + + + +

lie + + + +

Leu + + + +Lys . . . .Phe . . . .

Thr + + + +

Val + + + +

Pro + + + +

Control (-) -

Control (+) + + + +

75

Tabla 16 Asimilación de aminoácidos para el tratamiento a 40 °C sinadición de trehalosa al medio externo después de 60 días dealmacenamiento


Tratamiento térmico a 40°C sin th adicional en el medio


+ thaM0%enalmacenaje crioprotector en PBS 10% en PBS

PBS

Aminoácido

~Ála + + + +

Glu + + + +

Arg + + + +

lie + + + +

Leu + + + +Lys . . . .

Phe +

Thr + + + +

Val + + + +

Pro + + + +

Control (-) -

Control (+) + + + +

76

Tabla 17 Asimilación de aminoácidos para el tratamiento a 40 °C conadición de trehaiosa al medio externo después de 60 días dealmacenamiento


Tratamiento térmico a 40°C con th adicional en el medio

glicerol al 10%Condición de Sin glicerol al 10% Trehaiosa al


PBSAminoácido

"Ala + + + +Glu + + + +

Arg + + + +Me + + + +

Leu + + + +

Lys . . . .

Phe . . . .

Thr + + + +

Val + + + +

Pro + + + +

Control (-) -

Control (+) + + + +

77

ANEXO 2. RESULTADOS DE LAS PRUEBAS DE ASIMILACIÓN DECARBOHIDRATOS

Tabla 18 Asimilación de carbohidratos para el control 10 °C después de60 días de almacenamiento

Tratamiento control de 10 °Cglicerol al 10%

Condición de Sin glicerol al 10% Trehalosaal+ thaM0%en

almacenaje crioprotector en PBS 10% en PBS

Carbohidratos

Maltotriosa + + + +

Fructuosa + + + +

Control negativo - - - -

Control positivo + + + +

Tabla 19 Asimilación de carbohidratos para el tratamiento a 10 °C sin laadición de trehalosa externa al medio después de 60 días dealmacenamiento


Tratamiento térmico a 10°C sin adicional en el medio

glicerol al 10%Condición de Sin glicerol al 10% Trehalosaal

+ th al 10% enalmacenaje crioprotector en PBS 10% en PBS

PBS

Carbohidratos

Maltotriosa + + + +

Fructuosa + + + +

Control negativo -


78

Tabla 20 Asimilación de carbohidratos para el tratamiento a 10 °C con laadición de trehaiosa externa al medio después de 60 días dealmacenamiento

Tratamiento a 10 °CTratamiento térmico a 10°C con adicional en el medio



Carbohidratos

Maltotriosa + + + +

Fructuosa + + + +

Control negativo - - - -


Tabla 21 Asimilación de carbohidratos para el control de 40 °C despuésde 60 días de almacenamiento




PBS

Carbohidratos

Maltotriosa + + + +

Fructuosa + + + +Control negativo - - - -


79

Tabla 22 Asimilación de carbohidratos para el tratamiento a 40 °C sin laadición de trehaiosa externa al medio después de 60 días dealmacenamiento

Tratamiento a 40 °CTratamiento térmico a 40°C sin adicional en el medio

Condiciónele

almacenaje

Sin glicerol al 10%

crioprotector en PBS

glicerolal 10%+ thaM0%en

Trehaiosa al10%enPBS

Carbohidratos

Maltotriosa +Fructuosa +Control negativo -Control positivo +

Tabla 23 Asimilación de carbohidratos para el tratamiento a 40 °C con laadición de trehaiosa externa al medio después de 60 días dealmacenamiento


Tratamiento térmico a 40°C con adicional en el medio

Condición de

almacenaje

Sin glicerol al 10%

crioprotector en PBS

glicerolal 10%

+ thal 10% en

PBS

Trehaiosa al

10% en PBS

Carbohidratos

MaltotriosaFructuosaControl negativoControl positivo

++

80

ANEXO 3. RESULTADOS DE LAS PRUEBAS Api 20 C AUXTabla 24 Pruebas Api 20 C AUX para el control de 10 °C después de 60

días de almacenamientoTratamiento control de 10 °C

glicerol al 10%Condiciónele Sin glicerol al 10% Trehalosaal 10% en

+ thal10%enalmacenaje crioprotector en PBS PBS

PruebasControl negativo . . .

Glucosa + + + +Glicerol . . .Lactosa . . .

Maltosa + + + +

Sacarosa + + + +

Trehalosa + - -

Tabla 25

Tratamiento

Pruebas Api 20 C AUXde trehalosa externaalmacenamiento

a10°C

Tratamiento

para el tratamiento 10al medio después

°C sinde 60

térmico a 10°C sin adicional en

la adicióndías de

el medio

glicerol al 10%Condición de Sin glicerol al 10% Trehalosa al 10% en

+ thaM0%enalmacenaje crioprotector en PBS PBS

PBS

Pruebas

Control negativo . . .

Glucosa + + + +Glicerol . . .

Lactosa . . .

Maltosa + + + +

Sacarosa + + + +Trehalosa - + +

Tabla 26 Pruebas Api 20 C AUX para el tratamiento 10 °C con la adiciónde trehalosa externa al medio después de 60 días dealmacenamiento





Pruebas


Glucosa + + + +

Glicerol . . .

Lactosa . . .

Maltosa + + + +

Sacarosa + + + +

Trehalosa - + +

Tabla 27 Pruebas Api 20 C AUX para el control de 40 °C después de 60días de almacenamiento



+ th al 10% enalmacenaje crioprotector en PBS PBS

PBS

PruebasControl negativo . . .

Glucosa + + + +Glicerol . . .

Lactosa . . .

Maltosa + + + +

Sacarosa + + + +

Trehalosa + - - +

82

Tabla 28 Pruebas Api 20 C AUX para el tratamiento 40 °C sin la adiciónde trehalosa externa al medio después de 60 días dealmacenamiento


Tratamiento térmico a 40°C sin adicional en el medio



Pruebas


Glucosa + + + +

Glicerol . . .

Lactosa . . .

Maltosa + + + +

Sacarosa + + + +

Trehalosa - + - +Tabla 29 Pruebas Api 20 C AUX para el tratamiento 40 °C con la adición

de trehalosa externa al medio después de 60 días dealmacenamiento




+ th al 10% enalmacenaje crioprotector en PBS PBS

PBSPruebas


Glucosa + + + +

Glicerol - - - ... -

Lactosa . . .

Maltosa + + + +

Sacarosa + + + +Trehalosa + + - +

83

ANEXO 4. TABLAS DE ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Correlación entre ambos métodos

antro na Pearson CorrelationSig. (2-tailed)N

trehalasa Pearson CorrelationSig. (2-tailed)N

antro na1.000

6.790.061

6

trehalasa.790.061

61,000

6

Comparación de

Pair Tratamiento térmico1 10"C s/Th (glucosa/T) -

Tratamiento térmico10"C s/Th (hexosas/T)

Pair Tratamiento térmico2 10'C c/Th (glucosa/T) -

Tratamiento térmico10"C c/Th (hexosas/T)

Pair Tratamiento térmico3 40*C s/Th (glucosa/T) -

Tratamiento térmico40*C s/Th (hexosas/T)

Pair Tratamiento térmico4 40*C c/Th (glucosa/T) -

Tratamiento térmico40'C c/Th (hexosas/T)

dos métodos indirectos para la cuantificacion de

Diferencia entre pares

Mean

1.7268

-7.5266

-.1358

-12.5830

Std.Deviation

2.6301

8.8567

7.9925

12.0072

Std. ErrorMean

1.3150

4.4284

3.9963

6.0036

95% ConfidenceInterval ofthe

DifferenceLower

-2.4583

-21.6196

-12.8537

-31.6891

Upper

5.9118

6.5664

12.5822

6.5231

t

1.313

-1.700

-.034

-2.096

:rehalosa

df

3

3

3

3

Sig.(2-tailed)

.281

.188

.975

.127

84

CMÍ

tfaintaw con «t «entrel «en y 4n fe «rftei&i <k ttotataa «xttnM «1 mttfo

Pair Control 1O"C(gfuCosá/Di -Tratamiento térmico

1ü"C s/Th (glucosa/T)Pair Control ÍO'C (glucosa/T)2 - Tratámiertta térmico

10'C c/Th (glucosaír)Pair Tratamiento térmico1

3 10"C.S/Tri(glUCOSá/T)-TrátamientQ térmico10'C c/Th (glucosa/T)

Pair Control tratamiento 10'C4 (hexosás/T) -

Tratamiento térmico1O'C s/Th (tíexosas/T)

P.air Control tratamiento 10'C5 (hexpsas/T);.-

Tratamiénto térmicoiO'C c/Th (hexosas/T)

Pair Tratamiento térmico, .6 1O"Cs/Th(hexosas/T)-

Tratamiento térrrtlcóÍO"C:c/Ttv(hexosas/T)

Pair Control: 40"C (glücosa/t)7 - Tratárhientaiérmico

ÍO'Cs/TK (glucosaíT)Pair Control 40"C (glúcosá/T)8 -Tratarrijenta térmico

4O'6c/Th(giücosa/T)Pair Tratamiento térmico9 4Íi"Csfni(g¡ucosaiT)-

Tratamientq térmico40"C:c/Th(glucosa/J>

Pair Control trátamiehto-40'C10 (hexosas/T);-;

Tratárhíé.nto térmico4O'C s/Th (hexosas/T)

Pair Control tratamienta40"C1.1 (hexosas/Tjr

Tratamiento térmico:40"C;c/Th (hexosas/T)

Pair Tratamiento térmico12 4O'C s/Th (héxosas/T) -

Tratamiento térmico4G"C c/Th (hexosas/T)

PairedPirferencés.

Mean

4.8275

-2.0271

-6.8546

:2940

-16.814B

-16Í08d

.2298

-1.5863

-1.8160

"5.3969

-19.6601

-14.2633

Std.Deviatiori

2.8877

9:2364

7.4238

.8289

5.6100

5:3é0t

27992

.9320.

3.3846

7.9894

Í2.0945

11.1398

StdiErrorMear

1,4439

4.6182:

3.7119

.4144

2:8050

2.6804

1.3336:

,4660

16923:

3.9947

6.0473

.5.5699:

95%fConfldenceIñtérval of.We

DifferenceLpwer

.2325

-16.7243

-1.8:6675

-1.0249

-24.7408.

-24.6381

-4.2243:

-3.0693

-7.2016

-18.1098

-38:9052

-31.9892

r Upper

9.4225

12.6701

4 9583

1:6129

-:6.8872

'7,5779

4.6836

-,10.32

3:5696

7,3161

-.4150

3.4627

t

3.343

-.439

-1.847

:703

-5.638

-6.010

.164.

r3;404

4-073

'1.351

-31251

-2:561

df

3

3

3

3

3f

3

3:

3

3

3;

3

3

Sig.(2-tailed)

.044

.690

.162

.529

.011

.009

.880

.0*2

.362:

.270/

.04.7

.083

85

Frecuencia de cicatrices a 12 hrs. de ferementación Frecuencia de cicatrices a 24 nrs.de ferernentactón

Valid 1 002.003 005 006.00Total

Frequency5745161.1

120

Percent47.537.513.3

.8

.8100.0

ValidPercent

47.537,513.3

,8.8

100.0

GürnulatlvePercent

47:585,098.399,2

100.0

Valid 1:002.003.004.0Q5.006.00Total

Frequency4

373526144

120

Percent3.3

30.829.221.711.73.3

100:0

ValidPercent

3.330.829.221.711.73.3

100.0

Cumulatíve Percent

3.334.263.385.096.7

100.0

Frecuencia de cicatrices a 36 hrs. de ferement ación

Valid 1.00:2.003;0Q4:005.006.007.00Total

Frequency10313217187:5

120

Percent8.3

25.826.714.215.0

5.84.2

100.0

ValidPercent

8.325.826.714.215.05.84.2

100.0

Cumülatjve Percent

8.334,260.875.090.095.8

100.0

Frecuencia de cicatrices a 48 hrs. de ferementacion

Valid 1.002.003.00:4.005.006.007.008.00Total

Frequency5

19*32111876

120

Percent4.2

15.835.817.59.26.75.85.0

100.0

ValidPercent

4.215.835,817.59.2B.75.8.5.0

100.0

CumulativePercent

4.220.055,873.382.589.295.0

100.0

Comparación entre el porcetaje de viabilidad en tre los tratamietnos y su contenido de trehalosa int racelular

Pair T.10Xc/Th-1 T.40X c/TriPair Control 10X -2 Control 4 0 XPair T.10Xs/Th-3 T.40X srrriPair T.10Xc/Th-4 T.40X cmi

Paired DirTerences

Mean

-1.7675

9.7500

11.9900

-1.7675

Std.Deviation

9.1625

24.1230

18.4228

9.1625

Std. ErrorMean

4.5812

12.0615

92114

4 5812

95% ConfidenceInterval of the

DifferenceLower

-16.3471

-28.6351

-17.3249

-16.3471

Upper

12.8121

48.1351

41.3049

12.8121

t

-.386

.808

1.302

-.386

df

3

3

3

3

Sig.(2-tailed)

.725

478

.284

.725

86

Comparación de el porcentaje viabilidad vs contenido détréfialosa en los dos tratamientos térmicos

Pair cohtdelO'C-1 trat s/Th 10'CPair contde10"C-2 trat c/Th 10"CPair trat's/Th-10-C-3 tratcíTh1O"CPair contde40"C-4 trat 40"C sfThPair cont 40"C - trat5 4 0 X c/ThPair trat 40"C síTh -6 trat 40'C c/Th

Paired Differences

Mean

.3170

.8860

.5690

2.2675

-1.5340

-3.8015

Std.Deviation

2.4296

12.9386

10.509Q

2.8390

7:354E-02

2.7655

Std. ErrorMean

1 7180

9.1490

7.4310

2.0075

5.200E-02

1.9555

95% ConfidenceInterval of the

OifferenceLower

-21.5123

-115.3631

-93,8508

-23.2402

-2.1947

-28.6485

Upper

22.1463

117.1351

94.9888

27.7752

-.8733

21.0455

t

.185

.097

.077

1.130

-29:500

-1.944

df

1

1

1

1

1

1

Síg,(2-tailed)

.884

.939

,951

.461

.022

.302

87

ANEXO 5. ANÁLISIS DE CICATRICES POR FLOURECENCIA

Figure 14 observación de las cicatrices en levadura por medio de latinción de Blanco de calcoflour a un aumento de 40X

Figure 15 Observación de las cicatrices al microscopio de florescencia(flechas amarillas y rojas)

Figure 16 Observación de células muertas. Flechas verdes indican a lascélulas vivas. Flechas anaranjado indica células muertas.

ANEXO 6. PREPRACION DE MEDIOS Y REACTIVOS

• Medio líquido de cultivo YMBSe disuelven 21 gr de medio YMB en un litro de agua des-ionizada, y se

disuelve por agitación magnética.

• Medio sólido de cultivo YMA

Se disuelven 21 gr de medio YMB en un litro de agua des-ionizada y se

agrega 2 gr de agar-agar. Se disuelve por agitación magnética

• Reactivos para la solución de azul de metileno para el método detinción de células muertas de levadura

o Soluciones

a) 0.1 gr de polvo de azul de metileno y disolver en 500 mi deagua destilada

b) Fosfato de potasio monobásico.

Pesar 13.6 gr de fosfato de potasio monobásico anhidro(KH2 PO4) en 5oo mi de agua destilada

c) Fosfato dibásico heptahidratado.

Pesar 0.24 gr de fosfato dibásico heptahidratado (Na2 HPO47H2O) en 10 mi de agua destilada

d) Mezclar 498.75 mL de la solución (b) con 1.25 ml_ de lasolución (c)

e) Mezclar 500 mL de la solución (d) con 500mL de la solución(a) para obtener una solución de azul de metileno con pH4.6

• Solución amortiguadora de fosfato monobásica.

Para preparar dos litros de solución amortiguadora. Se pesan 68 gr de

fosfato monobásico y se diluye en 2 It de agua des-ionizada por agitación

magnética. Se esteriliza por 20 min a 121 °C

• Medio basal para pruebas de aminoácidos y carbohidratos a pH7.27

89

Mezclar las siguientes cantidades de microelementos para preparar 1 It

de medio basalTabla 30 Constituyentes del medio basal para las pruebas de

aminoácidos y carbohidratos

Constituyente Cantidad gr/ Lt

Riboflavina 0.0011

Ca. Pantoténico 0.0019

Piridoxina 0.0009Biotina 0.0001

Uracil 0.0255Sulfato de adenina 0.0341

Ácido ascórbico 0.5000

Mg SO4 7H2O 0.4002

Fe SO4 0.0200Mn SO4 0.0200

NaCI 0.0200Calibrar a pH 6.48

KH2PO4 0.3199Ajustar a pH 7.27

Los reactivos se mezclan por agitación magnética por 30 min

• Preparación de los diferentes aminoácidos y carbohidratos

En 12 matraces con 125 mL de medio basal cada uno se les agrega elaminoácido y/o carbohidratos correspondientes y se somete a agitaciónmagnética por 30 min

90

Tabla 31 Cantidades en gramos de los aminoácidos usados en laspruebas de fisiológicas

Aminoácido Cantidad gr~A¡a 0.0625

Glu 0.1875

Arg 0.0625

Isleu 0.0313

Leu 0.0438

Lys 0.1250

Phe 0.0313

Thr 0.0313

Val 0.0438

Pro 0.0163

Control (-)

Caseína (Control (+)) 1.2500

Tabla 32 Cantidades en gramos de los carbohidratos usados en las pruebas defisiológicas

CarbohidratoMaltotriosa

Dextrina

Fructuosa

Control negativo

Control positivo (caseína)

Cantidad gr0.55

0.550.55

1.250

Ambos los aminoácidos y los carbohidratos se esterilizan por filtración confiltros Nalgene de 0.22 mieras.

• Preparación de la suspensión de Blanco de Calcofluor

Disolver 1mg/ml_ en agua des-ionizada estéril y dejar reposar toda la

noche por un mínimo de 8 h. Al término del reposo guardar a 4 °C en la

oscuridad (Campbell y H. Duffus)

• Preparación de ácido tricloro acéticoPara preparar a una concentración de 0.5 M. disolver 8.16 gr en 100 mi-

de agua des-ionizada. Guardar en oscuridad y a 4°C

• Preparación de la solución amortiguadora de fosfato salino (PBS)Se diluye una pastilla de PBS (SIGMA P-4417) en 200m. se disuelve por

agitación manual. Se esteriliza a 121°C por 20 min

• Método enzimático para la determinación de glucosa (Peroxidasaoxidasa)

o Preparación del reactivo de trabajoColocar en una probeta 500 partes de agua bi-ionizada.

-sumar 50 partes di reactivo 4-AF

-sumar 50 partes del reactivo fenolLlevar a 1000 partes de agua destilada

-Adicionar 3 partes de GOD/PODMezclar por inversión.

• Preparación el reactivo de Antrona

En 50ml_ de ácido sulfúrico concentrado y frió disolver poco a poco y con

agitación manual, 0.2 gr de Antrona. Aforar a 100ml_ con ácido sulfúrico.

La solución tomara un color amarillo claro. Guardar en un frasco oscuro y

bajo refrigeración.

o Preparación del estándar de glucosa (1 OOmg/L)

Disolver 0.100 gr de glucosa e 50 mL de agua destilada y aforar

a un litro con agua destilada. Guardar en refrigeración

92

ANEXO 7 EQUIPO UTILIZADO

Equipo Marca y modelo

Api-20 CAUX

Asa Bacteriológica

Autoclave

Cámara de seguridad biológica

Centrífuga

Crisoles

Espetrofotómetro

Filtros de jeringa 0.2 u. 25 mm

Hematocitómetro

Horno incinerador

Incubadora con agitación

Jeringas 20 ml_

Método enzimático para la

determinación de glucosa

Micropipettes (1000,200,100,50,20,1 o ni.)

Microscopio de campo claro

Microscopio de florescencia

Pipetas de vidrio

Tubos cónicos para centrifugación

Tubos criogénicos 2 ml_

Tubos de ensaye 13X150 mm

Ultracentrífuga

Ultracongelador

Vortex

BIOMERIEUX

HICLAVE HV- 50Hirayama

LABCONCO 47X

Beckman CS-15R

Staatkich berlin B1

Beckman

Nalgene Cat.No. 192-2520HAUSSER SCIENTIFIC BRIGHTLINE

O.IOOmm deep

G Y R O M A X ™ 703 Amerex Instrumets Inc.

PLASTIPAK

Wienner Lab (Glicemia Enzimatica)

High Tech Lab

BMAX OLYMPUS BX50

OLYMPUS VANOX AHB53

CORNIG

Fisher Brand Cat.No. 05-539-6

50mL

CORNIG Cat.No. 430659

CORNIG

Eppendorf 5415C

REVCO

Fisher Genie 2 Cat.No. 12-812

93

ANEXO 8. TABLA DE REACTIVOS UTILIZADOS

Reactivos No de catalogo

Ac. glutámico

Ácido tricloroacético

Ácido ascórbico

Alanina

Antrona

Arginina

Azul de Metileno

Biotina

Blanco de Calcofluor

Buffer de fosfato salino

Ca. Pantoténico

Caseína

Dextrina

Fenilalanina

FeSO4

Fosfato de potasio monobásico

Fosfato dibásico heptahidratado

Fructuosa

Glucosa

Isoleucina

KH2PO4

Leucina

Usina

Maltotriosa

MnSO4

NaCI

p-Fenilendiamina

Piridoxina

SIGMA G-6904

Fermont Cat.No. 03702

SIGMA A-5960

Merck

Flukacat. No. 10740

SIGMA A-3784

SIGMS H-776

SIGMA B-4501

SIGMA F-3543

SIGMAP-4417

Aldrich Chem.

Difco Cat.No. 211610

SIGMA

Merck


DEQ- 7778770


SIGMA F-2543

SIGMA D-2006

SIGMA I-7268


Aldrich C-60-2

Aldrich

SIGMA M-8378


Productos Quim. MTY Cat.No. 24902

SIGMA P-6001

SIGMA P-5669

94

Prolina

Riboflavina

Sulfato de Adenina

Sulfato de Magnesio 7 H2O

Trehalasa

Trehalosa

Trehonina

Uracil

Valina

YMA

YMB

Aldrich

SIGMA R-4500

Aldrich

Fermont Cat.No 63622

SIGMA T-8778

SIGMA T-0167

Merck

SIGMA U-0750

SIGMA V-6504

DIFCO Bacto-agar Cat.No 01401

DIFCO Cat.No. 0711-17-1

95

ANEXO 9. TABLA DE DATOS PARA LA CUANTIFICACION DE TREHALOSA

Medición de la cantidad de trehalosa(absorbancia)

Peroxidasa oxidasa (glucosa)Controlinicial Trat.10°Cs/Th Trat.10°CcATh

0.00850.001

0.00270.0007

0.00490.00580.0139

0.001

0.00380.02540.00930.0115

Medición de la cantidad de trehalosa

Controlinicial

25.2452.9708.0192.079

(mg/ml)Peroxidasa oxidasa (glucosa)

Trat.10°Cs/Th13.76916.29839.0592.810

Trat.10°Cc/Th10.67871.37426.13332.315

promedio

Controlinicial

4.2080.4951.3370.3471.596

Medición de la cantidad de trehalosa(mg/gcel peso seco)

Peroxidasa oxidasa (glucosa)

Trat.10°Csmi2.2952.7166.5100.4682.997

Trat.10°Cc/Th1.780

11.8964.3565.3865.854

96


Peroxidasa oxidasa (glucosa)Controlinicial Trat.40°Cs/Th Trat.40°Cc^Th

0.00060.00070.00080.0009

0.00090.0090.01

0.009

0.00910.00950.00940.0096

Medición de la cantidad de trehalosa

Controlinicial

30.06035.07040.08045.090

(mg/ml)Peroxidasa oxidasa (glucosa)

Trat.40°Cs/Th4.509

45.09050.10045.090

Trat.40°Cc/Th45.59147.59547.09448.096

promedio

Controlinicial

5.0105.8456.6807.5156.263


Peroxidasa oxidasa (glucosa)

Trat.40°CsATh0.7527.5158.3507.5156.033

Trat.40°Cc/Th7.5997.9337.8498.0167.849

97


Antrona (hexosas)Controlinicial Trat.10°Cs/Th Trat.10°Cc/Th

0.07480.2080.2390.105

0.15030.12030.10240.1183

1.6322.2781.3342.706

Medición de la cantidad de trehalosa(mg/ml)

Controlinicial

5.13412136

.036

.652

.725

Antrona

Trat.10°

(hexosas)

Cs/Th9.0467.4926.5647.388

Trat.10°CcfTh85.839

119.33170.419

141.449

Controlinicial

promedio

0.8562.0062.2751.1211.564


Antrona (hexosas)

Trat.10°Cs^Th1.5081.2491.0941.231

Trat.10°Cc/Th14.30719.88911.73723.575

1.270 17.377

98

Controlinicial

0.0910.0560.0620.095

Controlinicial

4.1787.0292.9354.378

Medición de la cantidad de(absorbancia)

Antrona (hexosas)

Trat.40°Cs/Th

Medición de la cantidad de(mg/ml)

Antrona (hexosas)

Trat.40°Cs/Th

trehalosa

0.20822.4920.1510.356

trehalosa

10.978111.144

8.46917.46

Trat.40°Ccn"h0.27283.85893.41963.4609

Trat.40°Cc/Th13.811

171.096151.828

153.64


Antrona (hexosas)Controlinicial Trat.40°Cs/Th

0.6961.1720.4890.730

promedio 0.772

1.83018.5241.4122.9106.169

Trat.40°Cc/Th2.302

28.51625.30525.60720.432

99

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