1

LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA GYVULININKYSTöS TECHNOLOGIJOS

FAKULTETAS GYVŪNŲ VEISIMO IR GENETIKOS KATEDRA

K. Janušausko gyvūnų genetikos laboratorija

Vaida Palačenkait÷

Kiaulių miostatino geno polimorfizmas ir jo ryšys su m÷sos kokybiniais bei kiekybiniais rodikliais

Magistro darbas

Darbo vadovas: e.prof.p. Ilona Miceikien÷

Kaunas, 2008

2

Magistro darbas atliktas 2007 – 2008 metais Lietuvos veterinarijos

akademijoje, Gyvūnų veisimo ir genetikos katedroje, K.Janušausko gyvūnų

genetikos laboratorijoje.

Magistro darbą paruoš÷: Vaida Palačenkait÷ (v., pavard÷) (parašas)

Magistro darbo vadovas: e.prof. p. dr. I.Miceikien÷

(LVA, Gyvūnų veisimo ir genetikos katedra)

(parašas)

Recenzentas:

(parašas)

3

TURINYS

Santrumpų sąrašas.......................................................................................................................4

Įvadas..........................................................................................................................................6

1. LITERATŪROS APŽVALGA...............................................................................................7

1.1. Genai, įtakojantys kiaulienos kiekį ir kokybę......................................................................7

1.2. Miogenino (MYOG) genas..................................................................................................7

1.3. Leptino (LEP) genas............................................................................................................8

1.4. Augimo hormono (GH) genas..............................................................................................8

1.5. Rapole (RN) genas...............................................................................................................9

1.6. Halotano (HAL) genas.........................................................................................................9

1.7. Melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) genas....................................................................11

1.8. Kiaulių selekcija genetinių žymenų pagalba......................................................................11

2. TYRIMŲ METODAI IR MEDŽIAGA................................................................................13

2.1. Tyrimų medžiaga ir metodai..............................................................................................13

2.2. Kiaulių fenotipinių požymių duomenų baz÷s....................................................................14

2.3.DNR skyrimas iš plauko svogūn÷lio ląstelių......................................................................14

2.4. DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas......................................................................14

2.5. Polimerazin÷ grandinin÷ reakcija.......................................................................................15

2.5.1. Kiaulių miostatino geno MYF5 (PGR-RFIP) tyrimo metodika………………………..15

2.6. Statistin÷ duomenų analiz÷.................................................................................................16

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR APTARIMAS........................................................................17

3.1. Kiaulių miostatino geno polimorfizmo ištyrimas..............................................................17

4. IŠVADOS.............................................................................................................................22

5. SUMMARY..........................................................................................................................23

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS................................................................................................24

4

SANTRUMPŲ SĄRAŠAS

ATP – adenozintrifosfatas

bp – bazių pora

CRC – halotono genas

DFD – tamsios, kietos, sausos m÷sos sindromas (dark, firm, dry)

DNR – dezoksiribonukleinin÷ rūgštis

DTT - dithiotreitolis

ESR – estrogenų receptorius

GH – augimo hormono genas

GHR – augimo hormono receptorius

GHRH – augimo hormoną atpalaiduojančio receptoriaus genas

GHRHR – augimo hormoną atpalaiduojanč receptorius

H-FABP –riebiąsias rūgštis jungiantis baltymo genas

IGF-I – insulino augimo faktorius

MC1R - melanocitus stimuliuojančio hormono receptoriaus genas

MC4R – melanokortino 4 receptorius

MHS – stresinį sindromą sąlygojantis genas

MYOG – miogeno genas

PGR – polimerazin÷ grandinin÷ reakcija

PIT-1 – hipofiz÷s transkripcijos faktorius

PSE – blyškios, minkštos, vandeningos m÷sos sindromas (pale, soft, exudative)

RFIP – restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas

RN – Rapole genas

QTL – kokybinių požymių lokusai

OD - optinis tankis

TaqI – restriktaz÷

TAE – TAE buferis

5

Darbo tikslas

Ištirti miostatino geno įvairovę kiaulių tarpe ir nustatyti polimorfizmo įtaką kiaulių

produktyvumo savyb÷ms.

Darbo uždaviniai

• Surinkti ir išanalizuoti mokslinę literatūrą apie miostatino geną.

• Įdiegti kiaulių miostatino geno tyrimo metodiką LVA K.Janušausko Gyvūnų

genetikos laboratorijoje.

• Ištirti miostatino geno įvairovę kiaulių tarpe, naudojant sumodeliuotus pradmenis

pagal geno seką.

• Suformuoti fenotipinių požymių duomenų bazę.

• Ištirti miostatino geno įvairov÷s įtaką kiaulių produktyvumo savyb÷ms.

Darbo naujumas

• LVA Gyvūnų genetikos laboratorijoje įdiegta kiaulių miostatino geno, ištyrimo

metodika.

• Pirmą kartą ištirtas miostatino geno polimorfizmas bei jo variantų įtaka kiaulių

produktyvumo savyb÷ms

Praktinis pritaikymas

Įdiegta metodika leidžia ištirti kiaulių genome miostatino geną, nustatyti alelių

polimorfizmą ir įvertinti jo poveikį kiaulių fenotipin÷ms savyb÷ms.

Siūloma atsižvelgti į kiaulių genome esančio miostatino geno polimorfizmą, atrenkant

ir parenkant gyvulius, turinčius ekonomiškai naudingus alelius, kad būtų galima pagerinti

produktyviąsias savybes.

6

ĮVADAS

Kiaulių produktyviąsias savybes veikia tiek fenotipiniai, tiek genetiniai faktoriai.

Kiaulių autosomose atrasti genai arba genų grup÷s, lemiantys vislumą, pen÷jimosi spartą,

raumeningumą, m÷sos kokybę, rezistentiškumą ligoms. Gyvulių atrinkimas veisimui, pagal

konkrečius genus, leidžia suformuoti bandas su pageidaujamais požymiais.

Pasaulyje, paskutiniu dešimtmečiu kiaulių genetikoje susidom÷ta esamais kiekybinių

požymių lokusais bei jų įtaka skerdenos sud÷ties pokyčiams (t.y. riebalų šalinimui bei liesos

m÷sos didinimui) ir skerdenos kokybei , tai svarbiausios šios charakteristikos apibr÷žiančios

skerdenos kokybę ir vartotojų poreikį. Kiekybinių požymių lokusų įtakos galvijų bei kiaulių

augimo greičiui ir skerdenos sud÷čiai tyrimai buvo aprašyta eil÷je publikacijų (Alexandra et

al., 1997; Switonski, 2002; Di Stasio et al., 2003).

Tačiau, kadangi aukštus kokybinius ir kiekybinius rodiklius įtakoja eil÷ genų bei genų

grupių, kurių ekspresija ne visada būna vienoda, tod÷l, prieš įtraukiant į selekcijos

programas, geno žymenio įtaką būtina įvertinti konkrečiose kiaulių veisl÷se (Chikuni et al.,

1997; Grochowska et al., 1999; Curi et al., 2005).

Lietuvos veterinarijos akademijoje veikianti K.Janušausko gyvūnų genetikos

laboratorija vykdo naminių gyvūnų ir paukščių paveldimų ligų ir ydų tyrimus, užsiima

selekcijos efektyvumo, gyvulių produktyvumo bei pieno ir m÷sos kokyb÷s gerinimu

molekulinių genetinių metodų pagalba, vykdo žem÷s ūkio gyvūnų genetinių išteklių

monitoringą. LVA gyvūnų genetikos laboratorijoje buvo atlikti tyrimai ir nustatyta

melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) geno įtaka Lietuvos baltųjų kiaulių augimo greičiui ir

skerdienos kokybei, o taip pat buvo analizuota kiaulių stresinį sindromą sąlygojančio geno

(MHS) įtaka kiaulių sveikatingumui, produktyvumui ir reprodukcin÷ms savyb÷ms (Jokubka

and Miceikien÷, 2001; Malevičiūt÷ et al., 2002; Jokubka and Miceikien÷,2003:).

Yra žinoma visa eil÷ genų įtakojančių kiaulienos produkcijos kiekį bei kokybę. Tai

miostatino, leptino, augimo hormono, augimo hormono receptoriaus, halotano ir kt. genai

(Switonski, 2002). Lietuvoje miostatino geno įtaka kiaulių produktyvumui, produkcijos

kokybei bei reprodukcin÷ms savyb÷ms nebuvo tyrin÷ta.

7

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Genai, įtakojantys kiaulienos kiekį ir kokybę

Kiaulių DNR yra išsid÷sčiusi 19 chromosomų porų ir sudaryta iš daugiau kaip 100

tūkstančių funkcionuojančių genų. Kiaulių atrinkimas pagal genetinius markerius gali tur÷ti

svarbią įtaką kiaulienos kiekiui ir kokybei.

1.2. Miogenino (MYOG) genas

Miogeno (MYOG) geno pagrindinis vaidmuo yra raumenų diferenciacija, kontroliuojant

miofibrilių susidarymą. M÷siniuose gyvuliuose, tokiuose kaip kiaul÷s ir galvijai, miofibrilių

skaičius yra susijęs su augimo galia. Saumillion A. ir kt. (Saumillion, 1997) išanalizavo

kiaulių MYOG geno genetinį kintamumą ir jo ryšį su augimo savyb÷mis. MYOG geno

fragmentai buvo išskirti naudojant PGR ir patikrinti pagal genominę biblioteką su keturių

žmonių MyoD DNR fragmentais. Ir egzonų, ir promotoriaus regionai buvo labai panašūs į

žmogaus ir pel÷s genus. Sautern bloto 105 negiminingų kiaulių analiz÷ parod÷ tris

polimorfines MspI sritis, esančias geno promotoriaus regione, antrame introne ir 3’ krašte.

Buvo sukurti PGR-RFIP testai, randantys keturis MYOG alelius. PGR-RFIP testai ir

mikrosatelitų žymenys suteik÷ galimybę genotipuoti didelį kiaulių skaičių, norint išanalizuoti

m÷sos atsid÷jimo ir augimo savybių genetinį ryšį. MyoD geno šeima sudaryta iš keturių

struktūriškai artimų genų – tai MYOD1, MYOG, MYF5 ir MYF6. Šie genai koduoja

pagrindinius spiral÷-kilpa-spiral÷ (bHLH) baltymus ir susiję su raumeninių ląstelių

diferenciacija tiek in vitro, tiek in vivo. MYOG yra vienintelis MyoD genas, kuris randamas

visų skeleto raumenų ląstelių linijose. Pagrindinis MYOG vaidmuo raumenų diferencijos

procese, manoma, gali būti susijęs su skirtingais mioblastų ir miofibrilių kiekiais. Norint

nustatyti skirtingų MYOG alelių įtaką kiaulių raumenų vystimuisi ir augimui, reikia išskirti

genominius MYOG fragmentus ir apibūdinti keturis haplotipus, esančius MspI srityje. Greitas

PGR-RFIP testas suteikia galimybę nustatyti ryšius susijusius su augimo savyb÷mis

(Saumillion, 1997). Myf-5 ir MyoD1 genai ekspresuojami proliferuojančiose pirmin÷se

ląstel÷se, vadinamomis mioblastais. Myf-6 genas iš esm÷s ekspresuojamas pogimdyminiu

periodu (Pas, 1999).

8

1.3. Leptino (LEP) genas

Kiaulių riebumas yra vienas iš ekonomiškai svarbių požymių, kadangi rinka pageidauja

liesesn÷s kiaulienos, be to, riebalų kiekio padid÷jimas reikalauja didesnių pašarų sąnaudų.

Leptinas yra 16 kDa baltymas, išskiriamas baltųjų riebalų ląstelių (adipocitų), kuris reguliuoja

pašaro įsisavinimą, energijos sunaudojimą bei viso organizmo energijos balansą. Leptino

geno mutacijos nulemia visiškai nutukusio fenotipo ob/ob pasireiškimą pel÷se (Jiang, 1999).

Leptiną išskiria riebalinis audinys ir nulemia svorio praradimą graužikams, sumažinant

pašaro įsisavinimą ir padidinamas energijos suvartojimas. Pastaraisiais metais daug tyrimų

atliekama norint išsiaiškinti leptino įkatą svorio reguliavime, paaiškinant nutukimo fiziologiją.

Leptinas yra svarbus ne tik svorio reguliavimui ir energijos balansui, bet taip pat veikia kaip

metabolinis ir neuroendokrininis hormonas. Leptino receptoriai buvo rasti choroidiniame

rezginyje ir pagumburyje, taip pat hipofizio liaukoje skirtingose rūšyse, tokiose kaip žiurk÷s ir

pel÷s, kiaul÷s, avys ir žmogus.(Barata et.al., 2002; Saleri et al., 2002).

1.4. Augimo hormono (GH) genas

Augimo hormono geno pasireiškimo kelias susideda iš skirtingų tarpusavyje susijusių

genų, tokių kaip GH (augimo hormonas), IGF1 (insulino augimo faktorius), PIT1 (hipofiz÷s

transkripcijos faktorius), GHRH (augimo hormoną atpalaiduojantis hormonas),

somatostatinas, GHRHR (augimo hormoną atpalaiduojančio hormono receptorius), GHR

(augimo hormono receptorius) veiklos. Riebalų storis ir vidutinis dienos prieaugis yra labai

svarbūs požymiai kiaulienos produkcijai, nes jie koreliuoja su augimu ir liesos m÷sos kiekiu

skerdenoje. GH genas yra susijęs su šiais dviem požymiais. Tyrin÷damas ApaI ir HinpI

polimorfizmą, Knorr ir kiti (1997) rado ryšį tarp genų variantų ir riebalų savybių ir padar÷

išvadą, kad GH lokusas turi būti atidžiai ištirtas ir įtrauktas į naudingas selekcija žymenų

pagalba programas. Panašiai, Yu ir kiti (1995, 1999), Franco Mauricio ir kiti (2005) ištyr÷ ryšį

tarp PIT1 polimorfizmo ir skerdenos bei požymių savybių ir pareišk÷, kad šis genas gali būti

genas kandidatas, tiriant kiaulių QTL (kokybinius požymių lokusus) (Pierzchala et al., 2004).

Kiaulių augimo hormono genas yra sudarytas iš 190 amino rūgščių ir jį išskiria

priešakin÷s hipofiz÷s somatotropin÷s ląstel÷s. GH genas yra randamas 12 chromosomoje. GH

genas yra žinomas, kaip turintis didelę įtaką kiaulių skerdenos kokybei (Sun et al., 1997).

9

1.5. Rapole (RN) genas

Jeigu didžioji dalis pjetr÷nų savo genome turi streso (halotano) geną, tai hempšyrų ir su

jais poruotų kiaulių 15-toje chromosomoje yra atrastas RN genas. Pastarasis genas taip pat

blogina m÷sos kokybę, ypač kumpio.

RN geno neigiamų pasekmių priežastis yra glikogeno kiekio padid÷jimas raumenyje,

tose kiaul÷se, kurios turi geną. Šis genas egzistuoja 2 alelinių genų formoje: rn + alelinis

genas (normalus alelinis genas) ir RN-alelinis-genas (alelinis genas su neigiamu efektu N).

Ligi šiol, šis genas buvo surastas Hempšyrų veisl÷je ir Hempšyrų mišrūnų linijose.

Nepalankus alelinis genas (RN-) paveikia technologinę m÷sos kokybę, radikaliai didindamas

glikogeno kiekį. Glikogenas yra susikaupusio cukraus kiekis, kurio atsargos yra kaupiamos

kepenyse ir raumenyse. Po skerdimo, glikogenas raumenyse yra paverčiamas į pieno rūgštį,

kuri sumažina raumens pH. Tod÷l, kuo daugiau glikogeno yra raumenyje, tuo pieno rūgšties

bus daugiau pagaminta ir tuo bus žemesnis galutinis raumens pH. Padidintas pieno rūgšties

kiekis, gali būti priežastis to, kad raumens pH nukrenta žemiau 5,5 per 24 valandas po

skerdimo. "Rūgšti m÷sa" labai panaši savo savyb÷mis į išblyškusią, minkštą ir vandeningą

(PSE) m÷są, sukeltą PSS geno. Iš tikrųjų, kai PSS genas dalyvauja, jis stiprina padarinį RN

geno m÷sos kokybei. Skirtingai nuo Hal geno, RN genas turi poveikį turiniui, bet ne normai,

pH nukritimo (pH 24 val. <5.5), kuris priveda prie “ rūrščios m÷sos”, geriau žinomos kaip

Hampšyro padarinys. RN-alelinio geno pasekm÷ yra vandeninga m÷sa (4% skirtumas) ir

padid÷ję virimo nuostoliai (8 % skirtumas), sąlygojantis didelius finansinius nuostolius.

Neseni atradimai molekulin÷je genetikoje, leido nustatyti RN geną 15 chromosomoje ir kitimą

PRKAG3 gene, susijusiame su glikogeno kiekiu. Jie gali būti identifikuoti nauju molekuliniu

metodu, geresnei šio geno kontrolei (Hamilton et al., 2001)

1.6. Halotano (HAL) genas

Halotano genas turi kelis pavadinimus. Jis dar vadinamas streso (STRES) genu, MH

(hipertermijos) genu, CRC (kalcio pralaidumo kanalo) genu, RYR (riadonino receptoriaus)

genu.

Intensyvinant selekciją m÷singumo gerinimo kryptimi, padid÷jo stresams jautrių kiaulių

skaičius. Šį reiškinį sukelia kiaulių 6-oje chromosomoje sutinkamas recesyvinis halotano

genas (n). Jeigu šis genas yra homozigotin÷s būkl÷s (nn), tokios kiaul÷s yra jautrios stresams.

Literatūros ir atliktų tyrimų duomenimis, stresams jautrios kiaul÷s sunkiau negu jiems

10

atsparios išgyvena stresines situacijas, blogiau prisitaiko prie pakitusių aplinkos sąlygų,

jautrios stresams kiaul÷s blogiau penisi, jų m÷sa šviesi, minkšta, vandeninga (angl., pale, soft,

exudative – sutrumpintai žymima PSE) arba atvirkščiai – tamsi, kieta ir sausa (angl., dark,

firm, dry – sutrumpintai žymima DFD). Jautrios stresams kiaul÷s yra raumeningesn÷s, tačiau

jų m÷sa, kuriai būdingos PSE savyb÷s, yra blogos kokyb÷s, ne taip tinka perdirbti, ypač

rūkytiems gaminiams, prastesn÷ jos prekin÷ išvaizda. Tokią m÷są perdirbant did÷ja gamybos

kaštai, maž÷ja produkcijos išeiga, o galiausiai – blog÷ja ekonominiai kiaulienos gamybos

rodikliai (Leach et al., 1996; Hamilton et al., 2001)

Įvairių veislių kiaul÷s į stresus reaguoja skirtingai. Labai produktyvių veislių gyvuliai

yra jautresni. Dažniausiai tai m÷sinių veislių kiaul÷s, ilgai selekcionuotos m÷singumo

gerinimo kryptimi. Tokių gyvulių organizme vykstantys intensyvūs metabolizmo procesai

skatina mas÷s augimą, o adaptacin÷s savyb÷s prast÷ja. Apibendrintais įvairių užsienio šalių

literatūros duomenimis, jautriausi stresams yra pjetr÷nai ir įvairios selekcijos landrasai. Be to,

stresams jautresni yra kuiliukai negu kiaulait÷s (Kriauzien÷ ir kt., 2005)

Kiaulininkyst÷je daugelį stresinių situacijų būtina pašalinti, tačiau jų visiškai

išgyvendinti neįmanoma. Tod÷l greta m÷singumo gerinimo turi būti vykdoma ir stresams

atsparesnių kiaulių atranka. Kiaulių stresinę reakciją galima nustatyti daugeliu metodų, tačiau

tiksliausią stresams atsparesnių kiaulių atranką galima padaryti, naudojant genotipinio

įvertinimo metodus. Daugelyje pasaulio šalių sparčiai diegiamas genetinių žymenų metodas

(polimerazin÷s grandinin÷s reakcijos metodas, sutrumpintai žymimas PGR). Juo galima ištirti

įvairaus amžiaus kiaules. Tam užtenka iškirpti ausies gabaliuką, galima paimti spermos,

kraujo arba šerių su šaknel÷mis pavyzdžius, kurie laboratorijoje specialiai apdorojami ir iš jų

išskiriama DNR (deoksiribonukleinin÷ rūgštis). Analizuojant DNR grandinę, genetinių

žymenų metodu nustatomos ne tik jautrios stresams kiaul÷s (nn), bet ir tos, kurios yra

heterozigotin÷s (Nn) ir su visiškai dominuojančiais atsparumo stresams genais (NN). Šis

metodas įdiegtas ir Lietuvoje.

1.7. Melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) genas

Genas yra lokalizuotas kiaulių 1 chromosomoje q22-27 regione. MC4R genas vaidina

svarbų vaidmenį reguliuojant kiaulių medžiagų apykaitos energijos balansą, riebalų

atsid÷jimą, augimo greitį ir maisto medžiagų pasisavinimą. Kiaulių energijos balansas remiasi

energijos suvartojimu iš maisto medžiagų kūno energijai ir medžiagų apykaitai.

11

Melanokortino 4 receptoriaus lokuso nustatytas pleotropinis poveikis produktyvumo

savyb÷ms: paros priesvoriui (g), nugaros lašinių storiui (mm), raumeningumui (%). Šis

genetinis žymuo gali būti naudojamas veisimo tikslais atrenkant gyvulius pagal tokius

požymius kaip riebalų atsid÷jimas, augimo greitis bei pašarų pasisavinimas. Atlikus tyrimus

Lietuvoje nustatyta, melanokortino 4 receptoriaus (MC4R) geno įtaka Lietuvos baltųjų kiaulių

augimo greičiui ir skerdienos kokybei. (Jokubka ir kt., 2003; Miceikien÷ ir kt., 2007).

1.8. Kiaulių selekcija genetinių žymenų pagalba

Dabartin÷s kiaulininkyst÷s tikslą galima būtų įvardinti kaip selekcijos proceso

spartinimą veisiant aukšto produktyvumo, atsparias ligoms bei aplinkos veiksniams, genetinių

defektų neturinčias kiaules, iš kurių gaunama produkcija būtų saugi žmonių mitybai, o jos

perdirbimas produktų gamybai reikalautų kuo mažiau ekonominių, energetinių bei laiko

sąnaudų. Vienas iš būdų per trumpesnį laiką pasiekti šiuos tikslus yra naujų biotechnologinių

metodų, tokių kaip genetinių žymenų (MAS), diegimas ir taikymas selekcijoje. Genas ar genų

grup÷, lemianti tam tikrą požymį, yra vadinama genetiniu žymeniu. Genetinių žymenų

įjungimas į veisimo programas leidžia padidinti selekcijos efektyvumą ir prapl÷sti požymių,

kuriais galima efektyviai manipuliuoti, spektrą. Panaudojant žymenis, galima vykdyti

selekciją tiek pagal vieną požymį, kurį lemia vienas genas, tiek pagal vieną ar kelis požymius,

kuriuos lemia keletas genų. Kiaulių veislininkyst÷je naudojamus genetinius žymenis galima

suskirstyti į dvi grupes:

Kai požymį lemia vienas genas:

HAL genas - esantis 6 chromosomoje, lemiantis jautrumą stresams, pablog÷jusią m÷sos

kokybę ir tuo pačiu įtakojantis didesnį raumeningumą;

RN genas - esantis 15 chromosomoje, lemiantis pablog÷jusią m÷sos kokybę;

ESR genas - esantis 1 chromosomoje, lemiantis paršelių skaičių lizde.

Kai požymį lemia genų grup÷, vadinama "kiekybinių požymių lokusu":

OPN lokusas - esantis 8 chromosomoje, lemiantis paršelių skaičių lizde;

Lokusas 4 chromosomoje, įtakojantis pen÷jimosi spartą;

K 88 lokusas, esantis 13 chromosomoje, lemiantis atsparumą kai kurioms ligoms.

Taigi, atsiradus naujiems - molekuliniams - genotipo įvertinimo metodams, atsiveria naujos

galimyb÷s kiaulių selekcijoje. Ją galima vykdyti pagal šiuos genetinius žymenis (EPL -

ekonominių požymių lokusus):

12

• m÷sos kokyb÷s rodiklius - m÷sos pH (rūgštingumą), vandens rišlumą,

tarpraumeninių riebalų kiekį sąlygojančius genų žymenis;

• reprodukcines savybes - paršelių skaičių vadoje sąlygojantį estrogeno

receptoriaus žymenį;

• produktyvumo požymius - pen÷jimosi intensyvumo lokuso žymenį, m÷singumo

lokuso žymenį;

• sveikatingumo požymius – organizmo bendro atsparumo ligoms (MHC) lokuso

žymenis, organizmo atsparumo stresams (HAL) geno žymenį.

Išvardinti pagrindiniai rodikliai yra svarbūs kaip objektas, atliekant kiaulių genetinius

tyrimus. Žem÷s ūkio gyvulių genomų tyrimai sudar÷ sąlygas žem÷s ūkio gyvulių genetinių

žem÷lapių sudarymui, o jų palyginimas leido atlikti genų, susijusių su kiekybinių požymių

lokusais, paiešką. Gyvulių genomo genetiniai žem÷lapiai yra pritaikyti atliekant kelių lokusų

sąsajų, lokusų ir genų, susijusių su kiaulių ekonomiškai naudingais požymiais, tyrimus.

Nežiūrint į tai, nustatytų kiekybinių požymių lokusų skaičius vis dar yra nedidelis, o nustatytų

atskirų genų, kurie yra identifikuoti kaip atsakingi už kiekybinius požymius skaičius – dar

mažesnis. Nustatyti pavieniai genai, susiję su kiekybinių požymių lokusais, įtraukiami į

veisimo programas, derinant juos su įprastiniais fenotipiniais selekciniais metodais – atliekant

gyvulių selekciją genetinių žymenų pagalba (MAS). Toks kombinuotas populiacijos

selekcijos būdas daug efektyvesnis ir rezultatai pasiekiami per trumpesnį laiko tarpą.

Genetinių žymenų, kurie gali būti panaudoti selekcijoje, paieška yra pagrįsta dvejomis

strategijomis: kiekybinių požymių lokuso kartografavimu ir potencialių genų įtakos

nustatymu. Kiekybinių požymių lokusų paieška, atliekant pilną genomo skenografiją, yra

apibūdinama kaip chromosomų segmentų, kuriuose yra lokalizuoti kandidatiniai genai,

atsakingi už požymį, tyrimas, nenustatant konkretaus geno ar mutacijos. Kandidatinio geno

tyrimo būdas yra parankus, kadangi yra tiriami vienas ar keletas konkrečių genų, kurie,

manoma, turi įtakos tiriamiems požymiams (Miceikien÷ ir kt., 2007).

13

2. TYRIMŲ METODAI IR MEDŽIAGA

2.1. Tyrimų medžiaga ir metodai

M÷giniai tyrimams imti Valstybin÷je kiaulių veislininkyst÷s stotyje Baisogaloje laikomų

40 kiaulių .

Tyrimų metodai

DNR skyrimas iš plaukų

Kiaulių miostatino geno padauginimas polimeraz÷s grandin÷s reakcijos metodu (PGR);

Kiaulių miostatino geno variantų identifikavimas restrikcinių fragmentų ilgio

polimorfiškumo tyrimo metodu (RFIP).

Miostatino geno variantų frakcionavimas horizontalios elektroforez÷s metodu agaroz÷s

gelyje bei gelio dažymas etidžio bromidu; analiz÷ Herolab video dokumentavimo sistema.

Kiaulių produktyvumo ir produkcijos kokyb÷s požymių duomenų baz÷s suformavimas.

Miostatino geno įtakos kiaulių produktyvumo ir produkcijos kokyb÷s savyb÷ms

įvertinimas.

14

2.2. Kiaulių fenotipinių požymių duomenų baz÷s

Buvo surinkti duomenys ir suformuota kiaulių sekančių požymių duomenų baz÷:

Pen÷jimosi savyb÷s –

amžius skerdimo metu, d.; amžius esant 100 kg mas÷s, d.; priesvoris per parą, g.; suvartota

pašarų per pen÷jimosi laikotarpį; pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio.

M÷sin÷s savyb÷s –

šiltos skerdienos mas÷, kg; skerdienos pusel÷s ilgis, cm; bekono pusel÷s ilgis, cm; nugaros

raumens plotas, cm²; kumpio mas÷, kg; lašinių storis ties 6-7 šonkauliu, mm; lašinių storis ties

10 šonkauliu, mm; lašinių storis už paskutinio šonkaulio, mm; lašinių storis ties paskutiniu

juosmens slanksteliu; lašinių storis taške Fat1, mm; lašinių storis taške Fat2, mm; raumeninis

storis taške Fat2, mm; raumeningumas, %.

2.3. DNR skyrimas iš plauko svogūn÷lio ląstelių

Nukerpami 4-5 plaukų svogūn÷liai ir patalpinami į m÷gintuv÷lius. Paruošiamas lizavimo

mišinys (DTT -7,5 µl, Chelex- 200µl, Protenaze K (20mg/ml)- 10.7µl). M÷gintuv÷lio turinys

užpilamas lizavimo mišiniu (vienam pavyzdžiui imama 218,2µl paruošto mišinio).

M÷gintuv÷liai 30s. maišomi maišykl÷s „Vortex" pagalba. Centrifuguojami l0 s 13500

aps./min. greičiu. Pavyzdžiai 30 min. inkubuojami 56°C temperatūroje. Po inkubacijos m÷giniai

(po 10µm) pakaitinami 94°C temperatūroje (inaktyvuojami - amplifikatoriuje) bei paliekami

nakčiai.

2.4. DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas

Genomin÷s DNR kiekis ir grynumas nustatomas spektrofotometrinio metodo pagalba.

Tam tikslui paruošiamas l00 µl skiestos DNR tirpalas: imama l0 µl koncentruotos DNR ir

skiedžiama 90µl distiliuotu vandeniu. DNR kiekis nustatomas išmatuojant skiesto tirpalo

optinį tankį (OD) prie 260nm bangos ilgio. Kai OD = 1, tai l ml tirpalo yra 50ug dvigrand÷s

DNR.

DNR kokyb÷ įvertinama išmatavus skiesto tirpalo optinius tankius prie 260 ir 280 nm

bangos ilgių. Švarumą rodo santykis OD260/OD280. Švarių DNR tirpalų santykis yra 1.8-2.0.

Jei tirpale yra baltymų ar fenolio priemaišų, šis santykis bus mažesnis nei nurodyta. Baltymų

15

koncentracija neturi viršyti 0.5 mg/ml ribos. Jei tirpale priemaišų yra daugiau, reikia atlikti

pakartotinį genomin÷s DNR valymą.

.

2.5. Polimerazin÷ grandinin÷ reakcija (PGR)

Polimerazin÷ grandinin÷ reakcija yra metodas, pavadintas pagal DNR polimerazę,

fermentą, vykdantį DNR replikaciją ląstel÷je. Tai yra nukleino rūgščių sintez÷s in vitro

metodas, kuriuo laboratoriniame m÷gintuv÷lyje gali būti specifiškai padauginti (amplifikuoti)

atskiri DNR fragmentai. PGR metodas yra labai jautrus, tod÷l padauginti pasirinkta DNR

atkarpa gali sudaryti netgi vieną milijoninę bendro DNR pavyzdžio dalį. Tai reiškia, kad,

naudojant PGR galima amplifikuoti net ir vienintelį pasirinktą geną.

2.5.1. Kiaulių miostatino geno MYF5 (PGR-RFIP) tyrimo metodika

MYF-5 geno pradmenys:

Pirminis (5‘ CTCCGAATTAGTGTGGCTTC-3‘)

Atvirkštinis (5‘ –GTTCTTTCGGGACCAGACAGGCCTC-3‘)

Mišinys PGR reakcijai:

PGR komponentai: Vienai reakcijai atlikti (µl)

Geros kokyb÷s dejonizuotas vanduo ddH2O 2,75

Buferis 10xPCR (be MgCl2) 2,5

MgCl2 (konc. 50mM) 1,5

dNTP miksas (2mM) 2,5

Pirminis pradmuo (darbin÷ konc. 10pmol) 2,5

Atvirkštinis pradmuo (darbin÷ konc. 10pmol) 2,5

BSA 0,25

Taq polymeraz÷ (1vnt./µl) aktyvumo 0,5

PGR atliekama automatiniame amplifikatoriuje GeneAmp ® PGR sitema 2700, AB Applied

Biosystems.

16

PGR režimas:

95 OC, 5 min (pirmin÷ denatūracija)

94 OC, 45s (denatūracija),

60 OC 1 min (oligonukleotidų prisijungimas),

72 OC 1 min (DNR grandin÷l÷s sintez÷).

72 OC, Sintez÷s užbaigimui 10 min. Laikyti: 4 OC

Reakcija atliekama 35 ciklus

MYF-5 geno variantų ištyrimas

PGR produktas – 322 bp

DNR fragmentų dydis po karpymo restrikciniu fermentu HinfI, 370C per naktį.

A (alelis) -322 bp.

B (alelis) - 170 bp, 143 bp.

A B 322bp ��� 170bp ��� 143bp ���

2.6. Statistin÷ duomenų analiz÷

Kiaulių miostatino alelių ir genotipų dažnumai tirtoje grup÷je, faktinis ir

prognozuojamas heterozigotiškumas tirtuose lokusuose buvo apskaičiuoti R – statistiniu

paketu.

Vertinant miostatino geno įtaką kiaulienos kiekybiniams ir kokybiniams rodikliams

buvo atlikta vienfaktorin÷ dispersin÷ analiz÷ Vienfaktorin÷s analiz÷s būdu buvo įvertinta

atskirų genų ir agreguotų genotipų įtaka fenotipiniams požymiams.

17

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR APTARIMAS

3.1. Kiaulių miostatino geno polimorfizmo ištyrimas

Viso buvo paimta 40 kiaulių m÷ginių, iš kurių buvo išskirta DNR, nustatyta jos

koncentracija bei švarumas. Tiriamas genas buvo padaugintas polimerazin÷s grandinin÷s

reakcijos metodu, o aleliai identifikuoti skaldant gautus PGR produktus karpymo fermentu ...

Kiaulių miostatino geno rasti 2 skirtingi aleliai (1 lentel÷, 1,paveikslas).

1 lentel÷. Rastas MYF5 geno alelių skaičius tirtoje kiaulių grup÷je

Lokusas Alelių skaičius

MYF5 2

1 paveikslas.Miostatinas (MYF – 5):1-markeris, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 – PGR ; 3, 9, 11, 19 - AA genotipas;5, 7, 13, 15, 17 – AB genotipas.

Įvertinus faktinį ir teorinį heterozigotiškumą visoje tirtoje gyvulių grup÷je faktinis

heterozigotiškumas buvo rastas didesnis, nei teorinis, kas rodo pakankamą genetin÷s

įvairov÷s kiekį tirtame lokuse, nors skirtumas n÷ra statistiškai reikšmingas. (2 lentel÷).

18

2 lentel÷. Faktinis ir teorinis heterozigotiškumas tirtame geno lokuse

Lokusas H faktinis H teorinis χ

2 – kriterijaus reikšm÷

(P – reikšm÷)

MYF5 0,550 0,439 2,57 (p=0,276)

Kiaulių MYF5 geno A alelis rastas 0,675 dažniu, o B alelis 0,325 dažniu; AA genotipą

tur÷jo 40 proc. tirtų kiaulių, AB genotipą 22 proc. o BB genotipą 5 proc. (3 lentel÷).

3 lentel÷. MYF5 genotipų ir alelių dažniai

MYF5 N Dazniai Aleliai Dazniai

AA 16 0,400 A 0,675

AB 22 0,550 B 0,325

BB 2 0,050

40 1 1

Siekiant įvertinti MYF5, geno įtaką m÷sin÷ms savyb÷ms buvo suformuota sekančių

fenotipinių požymių duomenų baz÷ - šiltos skerdenos mas÷, skerdenos pusel÷s ilgis, bekono

pusel÷s ilgis, nugaros raumens plotas, kūno mas÷, lašinių storis ties 6-7 šonkauliu, lašinių

storis ties 10 šonkauliu, lašinių storis ties paskutiniu juosmens slaksteliu, lašinių storis taške

Fat1, lašinių storis taške Fat2, raumens storis taške Fat2, raumeningumas.

Buvo paskaičiuoti fenotipiniai rodikliai pagal MYF5 geno homo ir heterozigotinius

genotipus (4 lentel÷). Kiaulių miostatino geno MYF5 B alelis didina šiltos skerdenos masę,

skerdenos pusel÷s ilgį, bekono pusel÷s ilgį, nugaros raumens plotą ir raumeningumą.

Geriausius m÷sines savybes tur÷jo MYF5 geno BB genotipo kiaul÷s (4 lentel÷).

19

4 lentel÷. MYF5 geno įtaka kiaulių m÷sin÷ms savyb÷ms

Genotipa

s n

Šiltos

skerdenos

mas÷, kg

Skerdenos

pusel÷s ilgis, cm

Bekono

pusel÷s ilgis,

cm

Nugaros

raumens

plotas, cm²

Kumpio

mas÷, kg

Lašinių storis ties

6-7 šonkauliu,

mm

AA 16 75,04±

0,230 a

99,2±

0,503

78,06±

0,423

39,53±

0,981

11,77±

0,059

18,13±

0,890 A

AB 22 75,47±

0,041 b

99,13±

0,331

78,32±

0,357

37,51±

1,136

11,66±

0,071

20,8±

1,093 B

BB 2 75,50±

0,000

100,50±

0,500

79,50±

0,500

41,70±

2,900

11,81±

0,210

18,15±

1,000

a,b – vidurkiai, lentel÷s stulpelyje pažym÷ti skirtingomis raid÷mis, statistiškai patikimai skiriasi tarpusavyje

(p<0,05)

A,B – tarp vidurkių, lentel÷s stulpelyje pažym÷tųi skirtingomis raid÷mis, nustatyta statistiškai patikimo skirtumo

tendencija (0,1<p<0,05)

4 lentel÷ (tęsinys). MYF5 geno įtaka kiaulių m÷sin÷ms savyb÷ms

Genotip

as n

Lašinių storis

ties 10

šonkauliu, mm

Lašinių storis už

paskutinio šonkaulio,

mm

Lašinių storis

taške Fat2, mm

Raumens storis

taške Fat2, mm

Raumeningumas,

%

AA 16 16,88±

1,210

17,38±

0,916

15,63±

0,926 A

44,88±

1,661

54,54±

0,953 A

AB 22 19,53±

1,143

19,8±

1,050

18,05±

1,012 B

43,05±

1,494

52,18±

0,989 B

BB 2 16,15±

1,000

17,65±

0,500

13,50±

1,500

43,00±

0,000

55,55±

0,550

a,b – vidurkiai, lentel÷s stulpelyje pažym÷ti skirtingomis raid÷mis, statistiškai patikimai skiriasi tarpusavyje

(p<0,05)

A,B – tarp vidurkių, lentel÷s stulpelyje pažym÷tųi skirtingomis raid÷mis, nustatyta statistiškai patikimo skirtumo

tendencija (0,1<p<0,05)

Siekiant įvertinti MYF5, geno įtaką pen÷jimosi rodikliams buvo suformuota sekančių

fenotipinių požymių duomenų baz÷ – amžius skerdimo metu, amžius esant 100 kg mas÷s,

priesvoris per parą, suvartota pašarų per pen÷jimosi laikotarpį, pašarų sąnaudos 1 kg

priesvorio.

20

Buvo paskaičiuoti fenotipiniai rodikliai pagal MYF5 geno homo ir heterozigotinius

genotipus. Mažiausias amžius esant 100 kg mas÷s buvo kiaulių, turinčių MYF5 geno BB

genotipą, mažiausias suvartotas pašarų per pen÷jimosi laikotarpį kiekis bei mažiausios pašarų

sąnaudos 1 kg priesvorio buvo kiaulių su MYF5 geno genotipu AA (5 lentel÷).

5 lentel÷. MYF5 geno įtaka kiaulių pen÷jimosi savyb÷ms

Genotipas n

Amžius

skerdimo

metu,d.

Amžius esant 100

kg mas÷s, d.

Priesvoris per

parą,

g

Suvartota pašarų

per pen÷jimosi

laikotarpį

Pašarų sanaudos 1

kg priesvorio

AA 16 173,63±3,519 A 179,77±3,859 747,8±23,372 a 177,33±2,244 a 2,67±0,039 a

AB 22 181,50±2,878 B 187,47±2,939 686,93±16,687 b 183,32±1,426 b 2,78±0,023 b

BB 2 167,00±10,00 174,08±10,67 712,38±67,381 182,85±0,25 2,81±0,025

a,b – vidurkiai, lentel÷s stulpelyje pažym÷ti skirtingomis raid÷mis, statistiškai patikimai skiriasi tarpusavyje (p<0,05) A,B – tarp vidurkių, lentel÷s stulpelyje pažym÷tųi skirtingomis raid÷mis, nustatyta statistiškai patikimo skirtumo tendencija (0,1<p<0,05)

Liesos m÷sos svoris galvijų, kiaulių ir kitų gyvulių organizme priklauso nuo miofibrilių

skaičiaus. Kiaul÷s, turinčios daugiau raumeninių skaidulų greičiau auga ir turi didesnę

raumeninę masę. Mutacija, suardanti normalią baltymų veiklą miostatino gene nulemia

dvigubo raumeningumo fenotipą (Pas, 1999). Miostatinas priklauso augimo faktoriaus β

šeimai ir yra ekspresuojamas skeleto raumenyse tiek embrioniniu, tiek poembrioniniu

laikotarpiais. Miostatinas užkerta kelią besaikei mioblastų diferenciacijai. Esant funkcijos

praradimo mutacijai miostatinas gali gaminti papildomas raumenų skaidulas, d÷l ko

susiformuoja raumenų hiperplazija (Guimaraesa, 2007).

Koduojanti miostatino seka apima 1128 bp (McPherron and Lee, 1998). Dvi šio geno

iššifruotos sekos buvo rastos kiaulių raumenyse bei pieno liaukose - 800 ir 1500 ilgio

(Sonstegard et al., 1998). Šis genas sudarytas iš trijų egzonų , kurių ilgiai 373, 374 ir 381 bp

atitinkamai. Aktyvi baltymo forma apima 376 amino rūgštis (Stratil and Kopečny, 1999) . Kai

kurie geno pakitimai buvo aptikti, tačiau jų paplitimas labai nedidelis. Tai reiškia, kad kiaulių

tarpe miostatino genas daug stabilesnis nei galvijų tarpe (Stratil and Kopečny, 1999). Geno

stabilumą dar kartą patvirtina ir tai, kad didelio raumeningumo kiaul÷ms retai pasireiškia

21

raumenų hiperplazija. Tačiau joms būdinga raumenų hipertrofija, ypač Pjetr÷nų ir Belgijos

landrasų veisl÷ms. Remiantis atliktais tyrimais teigiama, jog Jorkšyrų veisl÷s kiaul÷s geba

geriau sintetinti baltymus raumenyse (Ezewke ir Martin, 1975), tod÷l jos raumeningesn÷s nei

to paties amžiaus ir svorio kitų veislių kiaul÷s.

Specialistų grup÷ ištyr÷ 105 skirtingų veislių kaules ir 3‘ polimorfizmą jie aptiko visose

tirtose kiaulių veisl÷se, išskyrus Meishan populiaciją. Ernst ir kolegos (1993) surado

dominuojantį alelinį MYOD geną skirtingose kinų kiaulių veisl÷se (Fengjing, Meishan,

Minzu), tai paaiškina kod÷l šių veislių kiaulių JAV ir Europoje yra tiek mažai.

Pagal mūsų gautus tyrimų rezultatus kiaulių miostatino genas veik÷ tiek m÷sines tiek

pen÷jimosi savybes. Panašius tyrimų rezulatatus gavo ir kiti mokslininkai (Saumillion et

al.,1997; Cieslak et al., 2003; Fausto et al.,2005).

Intensyvios gyvulininkyst÷s sąlygomis, kai pagrindinius reikalavimus diktuoja rinka,

ypač svarbu yra tinkamai pritaikyti selekcijos ir genetikos pasiekimus. Kiaulininkyst÷je

selekcijos procesas labiau nukreiptas į efektyvų heteroz÷s efekto panaudojimą. Pagrindiniais

kiaulių gerinimo būdais išlieka kryžminimas bei linijų selekcija. Elitiniuose veislynuose yra

išvedamos vertingos linijos, kurios dauginamos reprodukciniuose ūkiuose, o iš jų patenka į

pramoninius, kuriose pl÷tojama komercin÷ kiaulininkyst÷ ir auginami hibridai m÷sai.

Laikantis tokios selekcijos sistemos, kiaulininkyst÷je yra siekiama pagerinti kiaulių

pen÷jimosi, m÷sines ir reprodukcines savybes, sukurti bekoninio ir m÷sinio tipo hibridus.

Tačiau pastaruoju metu kiaulių veislininkyst÷je drauge su ekonominiais, iki šiol laikytais

pagrindiniais, selekcionuojamais požymiais vis didesnis d÷mesys kreipiamas į antraeilius –

kokyb÷s ir sveikatos požymius. Manoma, kad ateityje sudarant kiaulių veislininkyst÷s

programas būtina atkreipti d÷mesį į svarbiausių selekcionuojamų požymių biologinius ir

genetinius ryšius, daugiau d÷mesio skirti gaunamos produkcijos kokybei, gyvulių

sveikatingumui bei gerbūvio sąlygoms, o nustatant kiaulių veislinę vertę, taikyti metodus,

kurie apjungtų fenotipo ir genetinę informaciją (Miceikien÷ ir kt., 2007).

22

4. IŠVADOS

1. Kiaulių MYF5 geno A alelis rastas 0,675 dažniu, o B alelis 0,325 dažniu; AA

genotipą tur÷jo 40 proc. tirtų kiaulių, AB genotipą 22 proc. o BB genotipą 5 proc

2. Įvertinus faktinį ir teorinį heterozigotiškumą faktinis heterozigotiškumas buvo

rastas didesnis, nei teorinis, kas rodo pakankamą genetin÷s įvairov÷s kiekį ir

sudaro prielaidas vykdyti gyvulių selekciją pagal miostatino geną.

3. Kiaulių miostatino geno MYF5 B alelis statistiškai reikšmingai didina šiltos

skerdenos masę ir raumeningumą.

4. Geriausius m÷sines savybes tur÷jo MYF5 geno BB genotipo kiaul÷s.

5. Mažiausias amžius esant 100 kg mas÷s buvo kiaulių, turinčių MYF5 geno BB

genotipą.

6. Mažiausios pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio buvo kiaulių su MYF5 geno

genotipu AA.

23

5. SUMMARY

Master's work;

Master: Vaida Palačenkait÷

Topic of Master degree thesis: Polymorphism of pig myostatin gene and it‘s inluence to

meat quantitative and qualitative traits. Tutor: Ilona Miceikien÷

Lithuanian Veterinary Academy, Department of Animal Breeding and Genetics, K.

Janušauskas Laboratory of Animal Genetics.

Master‘s work accomplished in the year 2007 – 2009, volume of Master work 26 pages

original, 5 tables.

Object and tasks of work. Analyse and summarize literature about myostatin gene in pig.

Introduce pig Myf 5 gene research methodology at K. Janušauskas Laboratory of Animal

Genetics, LVA..Investigate Myf 5 gene polymorphism and distribution of different alleles and

genotypes in pigs, create data base of phenotypic traits, investigate myostatin gene

polymorhism influence to pig productive traits.

Research methodology. DNA extraction from hair roots; PGR to amplify MYF5 gene;RFLP

method to identify mutation; Electrophoresis in agarose gel;.Staining with etidium Bromide

Genotyping;.Statistical analysis of data.

Results and conclusions. There were found two alleles for pocine MYF5 gene allele with

frequency 0,675 , B allele with frequency 0,325 ; AA genotype had 40 percent of tested

pigs, AB genotype 22 percent, BB genotype 5 percent. Observed heterozigosity was found

higher than expected what showed enough genetical variation and gave oportunity to use

miostaytin gene as genetic marker in selection programs. Pig myostatin gene MYF5 B allele

statistically significantly increased warm carcas weight and muscularity. The best meat traits

had pigs with genotype BB. Also they had the lowest age while reaching 100 kg. Smallest

feed intake for 1 kg makeweigt had pigs with genotype AA.

24

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Alexandra C. McPherron and Se-Jin Lee. Double muscling in cattle due to mutations in

the myostatin gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997.Vol. 94, pp. 12457-12461.

2. Barata M., Saleri R., Mainardi G.L., Valle D., Giustina A., Tamanini C. Leptin Regulates

GH Gene Expression and Secretion and Nitric Oxide Production in Pig Pituitary Cells.

Endocrinology.2002. V.143(2), P.551-557.

3. Chikuni K., Tanabe R., Muroya S., Fukumoto Y. & Ozawa S. A simple method for

genotyping thr bovine growth hormone gene. Animal Genetics. 1997. 28, 230

4. Cieslak D., Blicharski T., Kapelanski W., Pierzchala M. Investigation of polymorphisms

in the porcine myostatin (GDF8; MSTN)gene. Czech J Anim Sci. 2003. 48: 69 – 75.

5. Curi R.A., Oliveira H.N., Silveira A.C. and Lopes C.R. Effects of polymorphic

microsatellites in the regulatory region of IGF1 and GHR on growth and carcass traits in

beef cattle. Animal Genetics. 2005. Vol. 36. P. 58-62.

6. Ernst C.W., Vaske D.A., Larson R.G., Rothschild M.F. Rapid communication: MspI

restriction fragment length polymorphism at the swine MYOG locus. Czech J Anim

Sci.1993. 71, 3479.

7. Ezekwe, M.O. and R.J. Martin. Cellular characteristics of skeletal muscle in selected

strains of pigs and mice and the unselected controls. 1975. Growth. 39:95.

8. Franco Mauricio M., Antunes Robson C., Silva Heyder D., Goulart Luiz R. Association of

PIT1, GH and GHRH polymorphisms with performance and carcass traits in Landrace

pigs. J. Appl.Genet. 2005. v. 46(2), P.195-200.

9. Fausto Morena da Silva, Guimaraes Simone Eliza Facioni, Lopes Paulo Savio, Pires

Aldrin Vieira, Guimaraes Marta Fonseca Martins, Barbosa da Silva Marcos Vinicius

Gualberto, Schierholt Alexs Sandro, Silva Kleibe de Moraes and Gomide Lucio Alberto

de Miranda. Association of MYF5 gene allelic variants with production traists in pigs.

Genetic and Molecular Biology. 2005. 28, 3, 363 – 369.

10. Hamilton D.N., Ellis M., Miller K.D., McKeith F.K., Parrett D.F. The effect of the

halothane and rendement napole genes on carcass and meat quality characteristics of

pigs. Journal of Animal Science. 2001. N. 78. P. 2862 – 2867.

11. Grochowska R., Zwierschowski L., Snochowski M. and Reklewski Z. Stimulated growth

hormone (GH) release in Friesian cattle with respect to GH genotypes. Reproduction

Nutrition Development. 1999. Vol. 39. P. 171-180.

25

12. Guimaraes Simone, Stahl Chad, Lonergan Steven, Geiger Becky, Rothschild Max.

Myostatin promoter analysis and expression pattern in pigs. Livestock Science. 2007. V.

112, P. 143-150.

13. Jokubka R., Miceikien÷ I. Polymerase chain reaction and restriction fragment length

polymorphism screening for the HAL gene. Proceedings of the Latvian Academy of

Sciences. ISSN 1407-009X. 2001. N. 5/6. P.237-241.

14. Jokubka R., Miceikien÷ I. A missence variation of melanocortin – 4 receptior gene

(MC4R) in Lithuanian White pig breed. Proceedings of the 9th Baltic Animal Breeding

Conference. Sigulda. 2003. P.65-67.

15. Yu, T-P., Tuggle C.K., Schmitz C.B., Rothschild M.F.. Association of PIT1

polymorphism with growth and carcass traits in pigs. J. Anim. Sci. 1995. V. 73, P. 282-

288.

16. Jiang Zhi-Hua, Gibson John P. Genetic polymorphisms in the leptin gene and their

association with fatness in four pig breeds. 1999. Mammalian Genome. V.10, P.191-193.

17. Knorr C., Moser G., Muller E. and Geldermann H. Association of GH gene variants with

performance traits in F-2 generations of European wild boar. Pietrain and Meishan pigs.

Animal Genetics. 1997. Vol. 28. P. 124-128.

18. Kriauzien÷ Janina, Miceikien÷ Ilona, Masiulien÷ Angel÷, Baltr÷nait÷ Lina. HAL geno

įvairov÷ S linijos kiaulių bandoje. Geno įtaka kiaulių reprodukcin÷ms savyb÷ms 2005.

Veterinarija ir Zootechnika. T.30 (52).

19. Leach L.M., Ellis M., Sutton D.S. et al. The growth performance, carcass

characteristics, and meat quality of halothane carrier and negative pigs. Journal of

Animal Science. 1996. N.74. P. 934 – 943.

20. Malevičiut÷ J., Baltr÷nait÷ L., Pečiulaitien÷ N., Miceikien÷ I. Genetinių žymeklių

panaudojimas gyvulių selekcijoje. Ūkininko patar÷jas. 2002. Nr.131 (1425).

21. McPherron A.C., Lee S. Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin

gene. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12457-12461.

22. Miceikien÷ I., Baltr÷nait÷ L., Pečiulaitien÷ N., Kriauzien÷ J. Kiaulių veisimas ir

genetika. Kaunas: Terra Publica. 2007. 58 psl.

23. Pas M.F.W., Soumillion A.,. Harders F. L,. Verburg F. J, Bosch, Galesloot P., The

Meuwissen Influences of Myogenin Genotypes on Birth Weight, Growth Rate, Carcass

Weight, Backfat Thickness, and Lean Weight of Pigs. 1999. J. Anim. Sci.. V.77. P.123-

126.

26

24. Pierzchała Mariusz, Blicharski Tadeusz, Kurył Jolanta. Growth rate and carcass quality in

relation to GH/MspI and GH/HaeII PCR-RFLP polymorhism in pigs. Poland, 2004.

Animal Science Papers and Reports V. 22 N. 1, P. 57-64.

25. Saleri R., Mainardi G.L., Valle D., Giustina A., Tamanini C. Leptin Regulates GH Gene

Expression and Secretion and Nitric Oxide Production in Pig Pituitary Cells.

Endocrinology.2002. V.143(2), P.551-557.

26. Soumillion Ann, Erkens Jo H.F., Lenstra Johannes A., Günther Rettenberger, Pas Marinus

F.W. Genetic variation in porcine myogenin gene locus. 1997. Mammalian Genome. V.8,

N.8, P. 564-568.

27. Sonstegard T.S., Rohrer G.A., Smith T.P.L. Myostatin maps to porcine chromosome 15

by linkage and physical analyses. 1998. Anim. Genet., 29, 19-22.

28. Stasio L. Di., Brugiapaglia A., Destefanis G., Albera A., Sartore S. GH1 as candidate

gene for variability of meat production traits. J. Anim. Breed. Genet. 2003. 120, 358 –

361.

29. Stratil A., Kopečny M. Genomic organization, sequence and polymorphism of the

porcine myostatin (GDF8; MSTN) gene. 1999. Anim. Genet., 30, 468-470.

30. Switonski M. Molecular genetics in beef cattle breding a review. Animal Sciense Papers

and Reports. 2002. Vol. 20. Supplement 1, 7-18.

31. Sun H.,.Taylor C, Robic A.,. Wang L, Rothschild M. F., Tuggle C.K. Mapping of growth

hormone receptor of swine chromosome 18. 1997. Animal Genetics. V. 28, P. 351-353.