This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

1180 F. KOENIG

obtained by Z U C K E R with green leaf disks from the cocklebur plant, floating on sucrose solution43'4<i, suggest that the rate of inactivation increases in darkness, we feel that in the case of the mustard seedling the data (e. g. Fig. 1) indicate that the r e -mediated increase of PAL is due to an increase of enzyme synthesis rather than to a decrease of the rate of PAL inactivation. It is difficult to settle this question with more direct experiments since chase experiments with pulse-labelled PAL have led to results which are difficult to interpret46.

From this paper it is evident that the regulation of enzyme levels in organized plant tissues is com-

plex, and that multiple mechanisms exist for con-trolling the level of a particular enzyme in a parti-cular organ. Obviously there is no single or simple mechanism which controls the levels of an enzyme in all instances. As in the case of mammalian tissues 2

we are led to the conclusion that control of the level of a particular enzyme may be exerted at any point at which control can be potentially exerted, and this will depend upon the enzyme and the tissue involved.

Supported bv Deutsche Forschungsgemeinschaft ( S F B 4 6 ) . W e t h a n k K . P E T E R a n d H . J . H E I M f o r collaboration in some of the experiments and Dr. P. SCHOPFER for stimulating discussions.

Konzentration einiger Lipide in den Chloroplasten von Zea mays und Antirrhinum majus

Concentration of Some Lipids in the Chloroplasts of Zea mays and Antirrhinum majus

F R I E D E R I K E K O E N I G

Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung (Erwin-Baur-Institut), Abteilung Menke Köln-Vogelsang

(Z. Naturforsdi. 26 b, 1180—1187 [1971] ; eingegangen am 25. Juni 1971)

Chloroplasten Lipide Stroma-containing chloroplasts from Zea mays and Antirrhinum majus were isolated in aqueous

medium. The average dry weight of chloroplasts from Zea mays is 2 7 - 1 0 _ 1 2 g , that of Antirrhinum majus 30 -10~ 1 2 g. Water freed chloroplasts consist up to 49 or 45 percent respectively of lamellar system. The lipid content of the lamellar system of Zea mays is 49 percent, that of Antirrhinum majus 45 percent. A chloroplast of Zea mays contains on the average 920 -10® chlorophyll mole-cules, 220-10® carotenoid molecules, 2000-10® molecules of galactolipids, 190-10® molecules of sulpholipid, 260-10® phosphatide molecules and 64-10® molecules of lipophilic quinones. In ad-dition to phosphatidylglycerol also phosphatidylinositol and phosphatidylcholine were found. It is very probable that besides vitamin K t the homologeous compound lacking one methylgroup is pre-sent in the chloroplasts. In contrast to the literature only 62 percent of the total leaf galactolipids are found in the chloroplasts.

Bei den ersten Versuchen, Chloroplasten zu iso-lieren stand der Gesichtspunkt im Vordergrund, Präparate zu erhalten, die nicht durch andere Zell-bestandteile verunreinigt waren. Daher wurden Prä-parate, deren Chlorophyllgehalt möglichst hoch war und sich bei fortgesetzter Fraktionierung nicht mehr steigern ließ, als rein angesehen. Erst als T R E B S T ,

T S U J I M O T O und A R N O N 2 zeigten, daß das Stroma bei der Isolierung der Chloroplasten leicht austritt und beim fraktionierten Zentrifugieren im Über-

Sonderdruckanforderungen an F. KOENIG, Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung (Erwin-Baur-Institut), Ab-teilung Menke, D-5000 Köln 30.

1 W. MENKE, Hoppe Seyler's Z. physiol. Chem. 257, 43 [1938] ; 263, 100 [1940],

stand bleibt, wurde klar, daß ein hoher Chlorophyll-gehalt nicht ohne weiteres als Kriterium für die Reinheit eines Chloroplastenpräparates angesehen werden kann. Heute weiß man, daß bei den ersten Isolierungsversuchen vorwiegend stromafreie Chloro-plasten erhalten wurden. Auch in neueren Veröffent-lichungen ist es häufig nicht ersichtlich, ob sich die Angaben auf Chloroplasten oder auf ihr Lamellar-system beziehen. Um Stromaverluste zu vermeiden, verwendeten B E H R E N S und T H A L A C K E R 3 , H E B E R 4

2 A . V . TREBST, H . Y . TSUJIMOTO U. D . I. ARNON, Nature [London] 182 ,351 [1958].

3 M . BEHRENS U. R . THALACKER, Naturwissenschaften 4 4 , 621 [1957].

4 U. HEBER, Ber. dtsch. bot. Ges. 70, 371 [1957].

KONZENTRATION VON LIPIDEN IN CHLOROPLASTEN 1181

und S T O C K I N G 5 organische Flüssigkeiten als Isolie-rungsmedien. Dabei muß eine Extraktion von Lipi-den in Kauf genommen werden. Deswegen be-stimmte N I C K E L 6 bei seinem Versuch, die Zusam-mensetzung der Chloroplasten zu ermitteln, die Lipide in stromafreien Chloroplasten, die in wäßri-gem Medium isoliert worden waren, und die Menge des Stromas aus Chloroplasten, die er mit Hilfe von organischen Lösungsmitteln erhalten hatte. Indem er die Analysendaten auf die Zahl der Chloropla-sten in der untersuchten Probe bezog, konnte er durch Kombination der Ergebnisse die Zusammen-setzung der Chloroplasten berechnen. Mögen audi die von N I C K E L 6 ermittelten Werte nicht frei von Fehlern sein, so kommen sie sicher der Zusammen-setzung der Chloroplasten in der lebenden Zelle näher als die bis dahin veröffentlichten Angaben. In der Folgezeit gelang es, auch in wäßrigen Medien stromahaltige Chloroplasten in einer für eingehen-dere chemische Analysen ausreichenden Menge zu i s o l i e r e n A u f diese Weise isolierte Chloroplasten haben den Vorteil, daß man am gleichen Präparat die chemische Zusammensetzung und Stoffwechsel-reaktionen untersuchen kann. Die im folgenden zur Analyse verwendeten Chloroplasten wurden daher im wäßrigen Medium isoliert.

Für die Entwicklung von Vorstellungen über die molekulare Struktur und über ihre Beziehung zur Stöchiometrie der photochemischen und enzymati-schen Reaktionen sollte man die Zahl der Moleküle kennen, die in einem Chloroplasten vorkommen. Deswegen wurden die Analysendaten auf die Zahl der in der untersuchten Probe enthaltenen Chloro-plasten bezogen. Die Schwierigkeiten, die bei der Verwendung dieser Bezugsgröße auftreten, wurden grundsätzlich von L Ü R S S E N 7 überwunden. Im An-schluß an die Untersuchungen von L Ü R S S E N 7 wird in der vorliegenden Arbeit über die Konzentration einiger Lipide in den Chloroplasten von Zea mays und Antirrhinum ma jus berichtet.

Material und Methoden

Anzucht der Pflanzen: Zea mays, Sorte Velox, wurde in Sand bei 25 °C in einem stark abgeschatteten Ge-wächshaus angezogen. Diese Kulturbedingungen wur-den gewählt, um die Bildung von Stärke, die die Trok-

5 R . STOCKING. Plant Physio l . 3 4 , 5 6 [ 1 9 5 9 ] . 6 H . NICKEL, Flora [ J e n a ] , A b t . A , 1 5 9 , 2 3 3 [ 1 9 6 8 ] . 7 K. LÜRSSEN, Z. Naturforsch. 25 b, 1113 [1970].

kengewichtsbestimmung von Chloroplasten und Lamel-larsystem verfälscht, möglichst zu verhindern. Antirrhi-num majus Sippe 50 wurde im Gewächshaus, im Winter unter Zusatzbeleuchtung, angezogen. Die Außenbedin-gungen schwankten hier stärker als bei Mais. Dies be-dingt eine breitere Streuung der Analysenergebnisse.

Isolierung, Zählung, Volumen- und Gewichtsbestim-mung der Plastiden, sowie Isolierung und Gewichtsbe-stimmung des Lamellarsystems erfolgten nach den von L Ü R S S E N 7 beschriebenen Methoden. Während die Chloroplasten von Antirrhinum majus in dem angege-benen 0,1 M Phosphatpuffer gezählt wurden, wurde zur Zählung der Chloroplasten von Zea mays die zur Iso-lierung der Chloroplasten verwendete Tris-Puffer-hal-tige Saccharoselösung verwendet. Die Trockengewichts-bestimmung der Plastiden wurde nur nach der ersten der von L Ü R S S E N 7 angegebenen Methoden durchge-führt. Die Differenz zwischen den Größen Trocken-gewicht/Chloroplast und Lamellarsystem/Chloroplast wird als Stroma bezeichnet.

Gewinnung des Lipidgemisches: Zur Entfernung eines möglichst großen Teils der Saccharose aus der Piastidensuspension wurden die Plastiden nach der Zählung 40 min bei 40000 g abzentrifugiert. Zur Be-stimmung der Galaktolipide und des Sulpholipids wurde das Sediment mit Methanol und Äther extra-hiert. Nach der Methode von W U T H I E R 8 wurde der Extrakt von wasserlöslichen Bestandteilen befreit. Das auf diese Weise isolierte Lipidgemisch ist ätherlöslich. Es wurde nach Trocknung im Vakuum gewogen. Zur Bestimmung der Phospholipide wurde das Sediment mit siedendem Äthanol, wie von R O T S C H 9 beschrieben, am Rückfluß gekocht und anschließend filtriert. Der Rückstand der Extraktion wurde mit Methanol und Äther nachextrahiert. Der so erhaltene Lipidextrakt wurde ebenfalls nach der Methode von W U T H I E R 8 ge-reinigt und anschließend gewogen. Zur Bestimmung der Plastidenchinone wurde bei der Isolierung der Chloroplasten dem letzten Waschpuffer eine gerade so große Menge an 2.6-Dichlorphenolindophenol zugesetzt, daß der Überstand nach der Ultrazentrifugation noch schwach hellblau war. Auf diese Weise wurden die Plastidenchinone mit Ausnahme des Tocochiuons in ihre oxydierte Form übergeführt. Das Sediment wurde in Aceton aufgeschlämmt und kurze Zeit stehen gelas-sen, dann filtriert und der Rückstand der Extraktion mit Aceton-Petroläther (Sdp. 50 — 70 °C)-Gemischen nachextrahiert. Die Lipide wurden in Petroläther über-geführt, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, auf ein bestimmtes Volumen eingeengt und anschlie-ßend dünnschichtchromatographisch getrennt. Die Ex-traktion der Lipide aus Lamellarsystem und gefrier-getrockneten Blättern erfolgte nach den obigen Anga-ben. Zur Bestimmung der Chinone wurde dem in dest. Wasser suspendierten Lamellarsystem ebenfalls 2.6-Di-chlorphenolindophenol zugesetzt. Extrahiert wurde das feuchte Sediment. Galaktolipide und Sulpholipid wur-

8 R . E . WUTHIER, J. L i p i d Res . 7 , 5 5 8 [ 1 9 6 6 ] . 9 E. ROTSCH, Dissertation, Köln 1965.

1182 F. KOENIG

den mit dem gleichen Ergebnis aus nicht getrockneten Chloroplasten und gefriergetrocknetem Lamellarsystem bestimmt. Das Gleiche gilt für die Chlorophyllbestim-mungen. Die Carotinoide wurden aus frischen Blättern extrahiert.

Chlorophyll wurde in den meisten Fällen im Metha-nolextrakt von frischem oder gefriergetrocknetem Ma-terial bestimmt. Nur in Verbindung mit den Chinon-analysen wurde 80-proz. Aceton zur Extraktion des Chlorophylls aus Lamellarsystem und Chloroplasten verwendet. Zur Berechnung der Chlorophyllmengen wurden Koeffizienten, die auf M A C K I N N E Y 10 zurück-gehen, benutzt. Die verwendeten Formeln lauten:

Bei Verwendung von Methanol

Summe von Chlorophyll a und b

2,55 • 1(T 2 • E65o + 0,40 • IO" 2 • #6 6 5 (mg/ml).

Chlorophyll a 1,65 • IO" 2 • £6 6 3 - 0,83 • IO" 2 • £6 5 0 (mg/ml).

Chlorophyll b 3,38 • IO" 2 • £6 5 0 - 1,25 • IO" 2 • £6 6 5 (mg/ml).

Bei Verwendung von 80-proz. Aceton

Summe von Chlorophyll a und b

20,2 -£6 4 5 + 8,02 -£6 6 3 (mg/Z) oder

i o o * * , ( m g / / ) .

Chlorophyll a E 6 6 8 - 0,203 -EM 5 ,

78,63 1 S / j '

Chlorophyll b

£ M 5 ~ 4 0 3 J T ' ~ ( m g / / ) -

Die Carotinoide wurden nach der Methode von H A G E R und M E Y E R - B E R T E N R A T H 11 bestimmt. Die ad-sorptionschromatographische Trennung der Pigmente erfolgte an Dünnschichten mit einem Gemisch von Ben-zin (Sdp. 1 0 0 - 1 4 0 °C) , Aceton und Chloroform (50/50/40) als Laufmittel. Der Berechnung der Caro-tinoidmengen wurden die von H A G E R 11 angegebenen Koeffizienten zugrunde gelegt. Da Chlorophyll und Carotinoide in Blättern nur in den Chloroplasten vor-kommen, wurden, um Verluste an Carotinoiden bei der Isolierung der Chloroplasten auszuschließen, die Caro-tinoide in Blättern bestimmt und über den Chlorophyll-gehalt auf Chloroplasten umgerechnet.

Bei der quantitativen Bestimmung der Plastiden-chinone und -Hydrochinone wurde versucht, die von L I C H T E N T H A L E R 12 angegebene auf der Dünnschicht-

10 G. MACKINNEY, J. biol. Chemistry 140, 315 [1941]. 11 A . HAGER U. T . MEYER-BERTENRATH, Planta 6 9 , 1 9 8

[1966]. 1 2 H . K . LICHTENTHALER, Ber . dtsch. bot . Ges . 8 2 , 4 8 3

[1969]. 1 3 R . BARR U. F . L . CRANE, Plant Physiol . 4 2 , 1 2 5 5 [ 1 9 6 7 ] ,

Chromatographie basierende Methode zu reproduzieren. Bei Verwendung verschiedener Petroläther (Sdp. 50 bis 70 °C)-Diäthyläther-Gemische als Laufmittel wur-den folgende Chinonfraktionen gefunden: 1. Eine Pla-stochinonfraktion, von L I C H T E N T H A L E R 12 als Plasto-chinon 45 bezeichnet, bei der es sich wohl um Plasto-chinon A 45 und Plastochinon B 45 handeln dürfte, wobei nach B A R R und C R A N E 13 das molare Verhältnis von Plastochinon A zu Plastochinon B bei Zea mays 17 : 1 ist. Die Menge dieser Fraktion im Lipidgemisch wurde wie von L I C H T E N T H A L E R 12 angegeben bestimmt. 2. Eine Naphthochinonfraktion, bei der es sich sicher auch, aber keineswegs nur um Vitamin Ki handelt. Dem Spektrum (Abb. 1) nach zu urteilen ist in dieser Fraktion, die sowohl aus Zea mays wie aus Antirrhi-num majus isoliert werden konnte, das von M C K E N N A , H E N N I N G E R und C R A N E 14 gefundene, als Desmethyl-Vitamin Ki bezeichnete Naphthochinon enthalten. Vit-amin Ki und Desmethyl-Vitamin Kj unterscheiden sich in ihren chromatographischen Eigenschaften nur

logf

0.6

0.4

0.2

Abb. 1. Absorptionsspektrum der Naphthochinonfraktion, ( ) oxydiert, (••••) nach Reduktion mit KBH4 .

wenig 15. Die Naphthochinonfraktion wurde mit Ätha-nol aus dem Kieselgel extrahiert. Die Bestimmung er-folgte in äthanolischer Lösung bei 269 mp. Als Refe-renz diente ein Äthanolextrakt aus der gleichen Menge Kieselgel H. Die Berechnung erfolgte mittels einer Eichkurve für Vitamin Kx („Serva" Vitamin Ki rein, zu-sätzlich durch Dünnschichtchromatographie gereinigt). 3. Ein Tocopherol, das als solches durch seine Oxydier-barkeit zu Tocochinon identifiziert werden konnte. Seine Bestimmung erfolgte, wie von L I C H T E N T H A L E R 1 2

angegeben, nach der Methode von E M M E R I E und E N G E L 16. Zur Aufstellung der Eichkurve diente a-Toco-pherol. Dieses wurde aus DL-a-Tocopherolacetat für bio-chemische Zwecke (Merck) durch Verseifung und dünn-schichtchromatographische Reinigung gewonnen. 4. Eine

1 4 M . M C K E N N A , M . D . HENNINGER u. F . L . CRANE, Nature [London] 203, 524 [1964].

1 5 M . D . HENNINGER, R . BARR U. F. L . CRANE, Plant Physiol . 41, 696 [1966].

1 6 A . EMMERIE u. C. ENGEL, Z . Vitaminforsch. 1 3 , 2 5 9 [ 1 9 4 3 ] .

240 260 280 2 [mu]—*

KONZENTRATION VON LIPIDEN IN CHLOROPLASTEN 1183

Benzochinonfraktion, bei der es sich nach L I C H T E N -T H A L E R 12 um a-Tooochinon handelt. Sie wurde als a-Tocochinon berechnet. Es ist nicht sicher, daß diese Fraktion wirklich nur aus a-Tocochinon besteht. Nach B A R R und C R A N E 13 kommen nämlich in Zea mays auch Plastochinon C und Plastochinon D vor. Es ist anzu-nehmen, daß sie sich in der tocochinonhaltigen Fraktion befinden. Plastohydrochinone traten nicht auf. Es scheint, daß sie durch 2.6-Dichlorphenolindophenol quantitativ zu den entsprechenden Chinonen oxydiert worden sind. Die Menge aller Plastidenchinone im Lipidgemisch wurde nicht über das Trockengewicht von Lamellarsystem und Chloroplasten, sondern über die Summe von Chlorophyll a und b im untersuchten Prä-parat als Bezugsgröße berechnet.

Die quantitative Bestimmung der Galaktolipide er-folgte nach der Methode von H E I N Z 17. Als Laufmittel bei der Dünnschichtchromatographie wurde eine Mi-schung von Chloroform, Methanol, Essigsäureäthylester und 3-proz. Ammoniak (50/25/25/1 — 1,5) verwendet. Die Farbentwicklung von Galaktolipiden mit Anthron in schwefelsaurer Lösung erfolgte durch 15 min langes Erhitzen bei 86 °C. Lediglich zur Prüfung des Gemi-sches auf evtl. vorhandene zuckerhaltige Abbaupro-dukte der Lipide wurden Vergleichschromatogramme mit 4-proz. Diphenylamin-Anilin-Phosphorsäure in Äthanol besprüht.

Die Menge des Sulpholipids im Lipidgemisch wurde nach der von R A D U N Z 18 beschriebenen Methode er-mittelt.

Die quantitative Bestimmung der phosphorhaltigen Lipide wurde im wesentlichen nach der von D E B U C H 1 9

angegebenen Methode durchgeführt. Die Trennung der drei in Chloroplasten vorkommenden Phospholipide gelang durch eindimensionale Dünnschichtchromatogra-phie an MN Kieselgel N-HR/DC, mittlere Korngröße 20 — 4 0 ^ (Macherey, Nagel & Co., Düren) mit einer Mischung von Chloroform, Methanol und Eisessig (65/25/16) als Laufmittel. Durch Jaddampf werden die meisten Komponenten des Lipidgemisches sichtbar gemacht. Zur Lokalisierung der Phosphatide wurde je-weils ein Vergleichschromatogramm mit dem Phospha-tid-Reagens nach D I T T M E R und L E S T E R 20 besprüht. Vor dem Abschaben der mit Jod sichtbar gemachten Phos-pholipidflecken wurde die Schicht mit Wasser ange-feuchtet. Phosphatidylglycerol (Mol.-Gew. 740), Phos-phatidylinositol (Mol.-Gew. 845) und Phosphatidyl-cholin (Mol.-Gew. 745) wurden durch ihre 7?/-Werte und durch Cochromatographie mit authentischen Sub-stanzen identifiziert21, Lecithin außerdem durch sein Verhalten bei der Ionenaustauscherchromatographie22. Zur Kontrolle der über die Dünnschichtchromatogra-phie bestimmten Werte wurde der Phosphorgehalt des

17 E. HEINZ, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 144, 333 [1967].

18 A. RADUNZ, Hoppe Seyler's Z. physiol. Chem. 350, 411 [1969].

1 9 H . DEBUCH, W . MERTENS U. M . WINTERFELD, H o p p e Sey-ler's Z. physiol. Chem. 349, 896 [1968],

ätherlöslichen Lipidgemisches bestimmt und in Phos-phatidylglycerol umgerechnet.

Die für die Berechnung der Molekulargewichte not-wendigen Angaben über die Fettsäuren-Zusammen-setzung der Phosphatide, Galaktolipide und des Sulpho-lipids wurden unveröffentlichten Ergebnissen von A. R A D U N Z an Antirrhinum majus entnommen.

Ergebnisse

Die Analysenergebnisse sind in den Tabn. 1 — 6 zusammengestellt. Damit die Daten möglichst viel-seitig verwendet werden können, wurden als Bezugs-größen das Trockengewicht von Lipiden, Lamellar-system und Chloroplasten gewählt (Tabn. 2 und 5 ) . Außerdem wurden die Analysenwerte auf die Zahl der in der Probe enthaltenen Chloroplasten bezogen (Tabn. 1 und 4 ) . Um die Beurteilung der Genauig-keit der Ergebnisse zu ermöglichen, wurden die mittleren Fehler der Mittelwerte berechnet und in

[g • 1012/ [Moleküle/ Chloroplast] Chloroplast]

1 0 - 6

Trockengewicht 27 ± 1 —

Lamellarsystem 12,8 ± 0 , 5 —

Stroma 14 ± 1 —

Lipidgemisch 6,0 ± 0 , 4 —

Chlorophyll a 1.15 ± 0 , 0 2 780 Chlorophyll b 0,22 ± 0 , 0 1 150 /3-Carotin 0,068 ± 0,004 74 Lutein 0,080 ± 0 , 0 0 3 85 Violaxanthin 0,041 ± 0 , 0 0 2 42 Neoxanthin 0,022 ± 0 , 0 0 1 22 Plastochinon 45 0,033 ± 0 , 0 0 1 27 Tocochinon (als a-Toco- 0,0038 ± 0,0003 5

chinon berechnet) Tocopherol (als a-Toco- 0,0117 ± 0,0005 16

pherol berechnet) Naphthochinonfraktion 0,012 ± 0 , 0 0 1 16

(als Vitamin Ki berechnet) Monogalaktosyldiglycerid 1,6 ± 0 , 1 1200 Digalaktosyl digly cerid 1,19 ± 0 , 0 6 769 Sulphochinovosyl- 0,26 ± 0 , 0 1 190

diglycerid Phosphatidylglycerol 0,25 ± 0 , 0 2 200 Phosphatidylinositol 0,040 ± 0 , 0 0 5 29 Phosphatidyl chol in 0,038 ± 0 , 0 0 3 31

Mittleres Volumen der Chloroplasten in p 3 54 ± 3

Tab. 1. Mittlere Zusammensetzung der Chloroplasten von Zea mays.

2 0 J . C . DITTMER U. R . L . LESTER, J . L ip id R e s . 5 , 1 2 6 [1964].

21 Phosphatidylglycerol und Phosphatidylcholin wurden freundlicherweise von Dr. A. RADUNZ, Phosphatidylinositol von Frau Prof. H. DEBUCH zur Verfügung gestellt.

22 B. W. NICHOLS U. A. T. JAMES, Fette, Seifen einschl. An-strichmittel 66, 1003 [1964].

1 1 8 4 F. KOENIG

[g/100g [g/100g [g/100g Lipide] Lamellarsystem] Chloroplasten]

Lamellarsystem — 100 49 ± 1 Stroma — — 51 ± 1 Lipidgemisch 100 45 ± 1 22,8 ± 0,7 Chlorophvll a 19,8 ± 0,7 9,0 ± 0,2 4,4 ± 0,2 Chlorophyll b 3,8 ± 0,2 1,7 -1- 0,1 0,83 ± 0 , 0 5 /S-Carotin 1,18 ± 0 , 0 5 0,53 ± 0 , 0 2 0,26 ± 0 , 0 1 Lutein 1,39 ± 0 , 0 3 0,625 ± 0,007 0,306 ± 0,007 Violaxanthin 0,71 ± 0 , 0 3 0,32 ± 0 , 0 1 0,157 ± 0,00(5 Neoxanthin 0,384 ± 0,009 0,173 ± 0,004 0,084 ± 0,003 Plastochinon 45 0,56 ± 0 , 0 2 0,254 ± 0,006 0,124 ± 0,004 Tocochinon (als a-Tocochinon berechnet) 0,067 ± 0,005 0,030 ± 0.002 0,014 ± 0,001 Tocopherol (als a-Tocopherol berechnet) 0,202 ± 0,006 0,091 ± 0.002 0,045 ± 0.001 Naphthochinonfraktion (als Vitamin K i berechnet) 0,20 ± 0 , 0 2 0,092 ± 0,007 0,045 ± 0,004 Monogalaktosyldiglycerid 26,9 ± 0,4 12,4 ± 0,4 6,0 ± 0,2 Digalaktosyldiglycerid 20,5 ± 0,5 9,3 ± 0,1 4,6 ± 0,1 Sulphochinovosyldiglycerid 4,5 ± 0,1 2,00 ± 0 , 0 5 0,99 ± 0 , 0 1 Phosphatidylglycerol 4,22 ± 0 , 0 9 1,90 ± 0 , 0 6 0,93 ± 0 , 0 4 Phosphatidylinositol 0,67 ± 0 , 0 8 0,30 ± 0 , 0 4 0,15 ± 0 , 0 2 Phosphatidylcholin 0,64 ± 0 , 0 3 0,29 ± 0 , 0 1 0,142 ± 0,000

Tab. 2. Zusammensetzung der ätherlöslichen Lipide, des getrockneten Lamellarsystems und der wasserfreien Chloroplasten von Zea mays. Da nicht alle Analysen am selben Präparat durchgeführt werden konnten und die Qualität des untersuchten Materials etwas schwankte, erhält man, wenn man die einzelnen Spalten der Tabellen ineinander umrechnet, z. T. Werte, die

nur innerhalb der Fehlergrenzen übereinstimmen.

[g/100g Blätter]

[g/100g Lipide]

Lipidgemisch 11 100 Chlorophyll a 1,20 ± 0 , 0 2 10,9 Chlorophyll b 0,20 ± 0 , 0 1 1.8 ^-Carotin 0,069 ± 0,002 0,63 Lutein 0,082 ± 0 , 0 0 1 0,75 Violaxanthin 0,042 ± 0,002 0,38 Neoxanthin 0,0227 ± 0,0005 0,21 Monogalaktosyldiglycerid 2,62 ± 0 , 0 3 23,8 Digalaktosyldiglycerid 1,90 ± 0 , 0 3 17,3 Sulphochinovosyldiglycerid 0,42 ± 0 , 0 1 3,8

Tab. 3. Zusammensetzung der getrockneten Blätter von Zea mays.

[g * 1012/ [Moleküle/ Chloroplast] Chloroplast]

10"6

Trockengewicht 30 ± 3 —

Lamellarsystem 13,6 ± 0,5 —

Stroma 16 4 - 3 —

Lipidgemisch 6,2 ± 0,2 —

Chlorophyll a 1,11 ± 0 , 0 4 748 Chlorophyll b 0,53 ± 0 , 0 5 350 /3-Carotin 0,084 ± 0,003 94 Lutein 0,120 ± 0,006 127 Violaxanthin 0,040 ± 0,002 40 Neoxanthin 0,041 + 0,002 41 Monogalaktosyldiglycerid 1,43 ± 0 , 0 6 1110 Digalaktosyldiglycerid 1,11 ± 0 . 0 4 717 Sulphochinovosyldiglycerid 0,30 ± 0 , 0 3 220

Mittleres Volumen der Chloroplasten in p 3 58 ± 2

Tab. 4. Mittlere Zusammensetzung der Chloroplasten von Antirrhinum majus.

den Tabellen angegeben. Wenn es erforderlich war, wurde das Fehlerfortpflanzungsgesetz angewendet. Es sei darauf hingewiesen, daß in die mittleren Fehler die eigentlichen Analysenfehler und die Va-riabilität des Materials eingehen. Beim Vergleich der Resultate muß man berücksichtigen, daß es sich bei Zea mays und Antirrhinum majus nicht nur um zwei systematisch entfernt stehende Arten handelt, sondern daß sich die verwendeten Blätter auch in ihrem Alter unterscheiden. Außerdem wurden die Pflanzen bei verschiedener Beleuchtungsstärke und Temperatur kultiviert. Bei Antirrhinum majus wur-den ausgewachsene dunkelgrüne Laubblätter von ungefähr sieben Wochen alten Pflanzen, die bei nor-malem Tageslicht oder im Winter unter Zusatz-beleuchtung angezogen worden waren, untersucht. Demgegenüber wurden von Zea mays zehn bis elf Tage alte, im schwachen Tageslicht gewachsene Keimpflanzen analysiert. Die Blätter hatten noch nicht ihre endgültige Größe erreicht. So werden viel-leicht eine Reihe von Abweichungen der Analysen-daten der vorliegenden Arbeit von Angaben in der Literatur verständlich.

Trotz dieser Verschiedenheiten stimmen die bei-den Pflanzen darin überein, daß ihre Chloroplasten zu etwa gleichen Teilen Lamellarsystem und Stroma enthalten. Ferner ist der Lipidgehalt des Lamellar-systems in beiden Pflanzen mit 4 5 % bei Zea mays

KONZENTRATION VON LIPIDEN IN CHLOROPLASTEN 1185

[g/100 g Lipide] [g/100 g Lamellarsystem] [g/100 g Chloroplasten]

Lamellarsystem — 100 45 ± 5 Stroma — — 55 Lipidgemisch 100 4ti ± 2 21 ± 2 Chlorophyll a 18,0 ± 0 , 5 8,2 ± 0,4 3,7 ± 0 , 4 Chlorophyll b 8,5 ± 0 , 8 3,9 ± 0,4 1,8 ± 0 , 2 /^-Carotin 1,35 ± 0,07 0,62 ± 0 , 0 2 0,28 ± 0,03 Lutein 1,9 ± 0 , 1 0,88 ± 0 , 0 3 0,40 ± 0,04 Violaxanthin 0.64 ± 0,03 0,293 ± 0,009 0,13 ± 0,01 Neoxanthin 0,65 4- 0,03 0,299 ± 0,008 0,14 ± 0,02 Monogalaktosyldiglycerid 23,2 ± 0 , 5 10,7 ± 0,5 4,9 ± 0 , 5 Digalaktosy 1 digly cerid 18,1 ± 0 , 3 8,4 ± 0,4 3,8 ± 0 , 4 Sulphochinovosyldiglycerid 4,8 ± 0 , 4 2,2 ± 0,2 1,0 ± 0 , 1

Tab. 5. Zusammensetzung der ätherlöslichen Lipide, des ge:rockneten Lamellarsystems und der wasserfreien Chloroplasten von Antirrhinum majus.

[g • 106/cm2 BlattflächeJ [g/100 g Blätter] [g/100 g Lipide]

Trockengewi cht Lipidgemisch Chlorophyll a Chlorophyll b /^-Carotin Lutein Violaxanthin Neoxanthin Monogalaktosyldiglycerid Digalaktosyldiglycerid Sulphochinovosyldiglycerid

1930 ± 90 100 230 ± 10 11,6

30 ± 2 1,40 14 ± 1 0,56

1,96 ± 0,06 0,087 2,8 ± 0,1 0,123 0,91 ± 0,04 0,041 0,94 ± 0,03 0,042

59 ± 4 2.82 47 ± 3 2,26 10,0 ± 0,5 0,48

± 0,3 100 ± 0 , 0 5 11,9 ± 0 , 6 ± 0,06 4,9 ± 0 , 5 ± 0,003 0,75 ± 0,03 ± 0,005 1,03 ± 0,05 ± 0,002 0,35 ± 0,01 ± 0,001 0,36 ± 0,01 ± 0,09 24,4 ± 0 , 6 ± 0,06 19,5 ± 0 , 5 ± 0,01 4,0 + 0 , 1

Tab. 6. Zusammensetzung der getrockneten Blätter von Antirrhinum majus. Die Menge an Trockengewicht und Lipidkompo-nenten je Quadratzentimeter Fläche der Blätter von Antirrhinum majus wurde für Pflanzen mit einem sehr hohen Chlorophyll-

gehalt bestimmt, während die übrigen Analysen auch an chlorophyllärmerem Material durchgeführt wurden.

und 4 6 % bei Antirrhinum majus innerhalb der Feh-lergrenzen gleich. Demgegenüber bestehen signifi-kante Unterschiede im mittleren Volumen und Trok-kengewicht der Chloroplasten beider Arten. Außer-dem unterscheiden sich ihre Größenverteilungen. Bei Zea streuen die Chloroplastenvolumina stärker als bei Antirrhinum. Sehr unterschiedlich ist das Ver-hältnis von Chlorophyll a/Chlorophyll b, was sicher z. T. mit den schon erwähnten Anzuchtbedingungen und dem Entwicklungsstadium der Pflanzen zusam-menhängt 7 . Geringer sind die Unterschiede im Caro-tinoidgehalt. Im übrigen sei darauf hingewiesen, daß die Unterschiede je nach Bezugsgröße stärker oder schwächer hervortreten.

Verglichen mit den meisten Literaturanga-b e n 2 3 - 2 6 ' 1 3 ist der Gehalt der Mais-Chloroplasten

23 H. K. LICHTENTHALER, Planta 81,140 [1968]. 2 4 R . BARR, L . MAGREE u. F . L . CRANE, A m e r . J. Bot. 5 4 , 3 6 5

[1967]. 2 5 H . K . LICHTENTHALER U. R . B . PARK, Nature [ L o n d o n ]

1 9 8 , 1 0 7 0 [ 1 9 6 3 ] ; H . K . LICHTENTHALER U. M . TEVINI, Z . Naturforsch. 24 b, 764 [1969].

an Plastochinon und Tocochinon gering. Doch fin-det L I C H T E N T H A L E R 23 bei Schattenpflanzen und bei Keimpflanzen ähnlich niedrige Werte.

Außerdem ist bekannt, daß die Plastochinonmenge beim Altern der Blätter zunimmt24 . Da es nicht ge-lang, Vitamin Kx und das vermeintliche Desmethyl-Vitamin K j getrennt zu bestimmen, ist ein Ver-gleich mit den Angaben der Literatur hier nicht mög-lich. Es sei aber bemerkt, daß die Naphthochinon-menge im Lipidgemisch auffallend groß ist. Zur Frage der Lokalisierung der Chinone in den Chloro-plasten ist zu bemerken, daß sie zum Teil in Plasto-globuli abgelagert sein können. Der für die Funk-tion wichtige Anteil ist ins Lamellarsystem einge-baut. Wenn die analysierten Chloroplasten Plasto-globuli enthalten, so befinden sie sich in der Frak-

2 6 F . L . CRANE, M . D . HENNINGER, P. M . W O O D U. R . BARR, in: Biochemistry of Chloroplasts 1, p. 133, Ed. T. W. GOODWIN, Academic Press, London, New York 1966.

1186 F. KOENIG

tion Lamellarsystem27. Ein niedriger Gehalt der Chloroplasten an Plastochinon braucht übrigens kein begrenzender Faktor für die Photosynthese zu sein, da nur etwa ein Zehntel der vorhandenen Chinone am Elektronentransport beteiligt ist2 8 .

Wie schon lange bekannt ist2 9 , ist der Phospha-tidgehalt der Chloroplasten gering. Außer Phospha-tidylglycerol konnte das Vorkommen von Phospha-tidylinositol und Phosphatidylcholin in etwa gleicher Menge nachgewiesen werden. Der Phospholipid gehalt der ätherlöslichen Chloroplastenlipide ist of-fensichtlich jahreszeitlichen Schwankungen unterwor-fen. Die in Tab. 1 und Tab. 2 aufgeführten Werte wurden im Frühjahr ermittelt. Für den Jahresdurch-schnitt ergab sich ein Phospholipidgehalt von 6,1 + 0 ,3% der ätherlöslichen Chloroplastenlipide. Auch der Gehalt der Chloroplasten an Phosphatidyl-glycerol und Sulphochinovosyldiglycerid ist unge-fähr gleich. Phosphatidylglycerol gilt als charakteri-stischer Bestandteil der Thylakoide, während man vom Sulphochinovosyldiglycerid weiß 3 0 , daß es auch außerhalb der Chloroplasten vorkommt. Geht man davon aus, daß Chlorophyll innerhalb der Zelle nur in den Chloroplasten vorkommt und daß sich der Chlorophyllgehalt bei der Isolierung der Chloro-plasten nicht ändert, so kann man aus dem Verhält-nis von Sulpholipid zu Chlorophyll in Blättern und Chloroplasten den Anteil des Sulpholipids, der in den Chloroplasten lokalisiert ist, berechnen. Die Rechnung ergibt, daß sich bei Zea mays 6 3 % und bei Antirrhinum majus 7 5 % in den Chloroplasten be-finden.

Für die Galaktolipide, die unter den farblosen Komponenten des Lipidgemisches mengenmäßig an erster Stelle stehen, wurde zunächst angegeben, daß sie außerhalb der Chloroplasten nicht vorkommen 3 0 . Berechnet man wie beim Sulpholipid den in den Chloroplasten vorhandenen Anteil der Galaktolipide, so erhält man für Antirrhinum majus nur 6 0 % und

27 H. K. LICHTENTHALER, Protoplasma 68, 65 [1969]. 2 8 H . T . W ITT, R . RUMBERG, P . SCHMIDT-MENDE, U . SIGGEL,

B . SKERRA, J . VATER U. J . WEIKARD, A n g e w . Chem. 7 7 , 821 [1965] ; J. AMESZ, Biochim. biophysica Acta [Amster-dam] 7 9 , 257 [1964].

29 W. MENKE u. E. JAKOB, Hoppe Seyler's Z. physiol. Chem. 272, 227 [1942].

30 J. F. G. M. WINTERMANS, Biochim. biophysica Acta [Am-sterdam] 4 4 , 4 9 [I960] .

3 1 P . S . SASTRY U. M . KATES, Biochemistry 3 , 1 2 8 0 [ 1 9 6 4 ] . 3 2 R . E . MCCARTY U. A . T . JAGENDORF, Plant Physiol . 4 0 ,

725 [1965],

für Zea mays 62 Prozent. Diese Berechnung führt nur dann zu einem richtigen Ergebnis, wenn kein Abbau der Galaktolipide während der Isolierung der Chloroplasten stattfindet. Es wurde aber nach-gewiesen, daß in der Zelle Enzyme vorkommen, die Galaktolipide angreifen 3 1 - 3 5 > 1 7 . Wenn im vorlie-genden Fall 40% der Galaktolipide abgebaut worden wären, sollte man erwarten, daß sich beträchtliche Mengen an Abbauprodukten hätten nachweisen las-sen. In den Chloroplastenlipiden von Antirrhinum majus wurden aber nur Spuren, in den Lipiden aus Mais-Chloroplasten überhaupt keine zuckerhaltigen Abbauprodukte gefunden. Es ist jedoch zu berück-sichtigen, daß das Fehlen von zuckerhaltigen Lyso-verbindungen im Lipidgemisch nicht beweist, daß kein Galaktolipidabbau stattgefunden hat. H E L M -

S I N G 3 6 hat nämlich gezeigt, daß bei Einwirkung einer von ihm untersuchten Galaktolipase der Abbau der Galaktosyldiglyceride nicht auf der Stufe der Lysoverbindungen stehen bleibt. Nimmt man an. daß 3 8 % der Galaktolipide bei Zea mays und 4 0 % bei Antirrhinum majus während der Isolierung der Chloroplasten abgebaut werden, so enthielte das ätherlösliche Lipidgemisch von Zea mays 76 ,6%, das von Antirrhinum majus 68 ,8% Galaktolipide. Wenn man zu diesen Werten die übrigen erfaßten Kompo-nenten des Lipidgemisches addiert, so übertrifft der auf diese Weise errechnete Lipidgehalt den wirklich gefundenen. Es scheint somit gesichert, daß ein be-trächtlicher Teil der in der Zelle vorhandenen Galak-tolipide außerhalb der Chloroplasten lokalisiert ist. Ob es sich dabei jedoch im vorliegenden Falle um volle 4 0 % handelt, muß dahingestellt bleiben, da ein Abbau nicht ganz auszuschließen ist. Daß Galakto-lipide auch außerhalb der Chloroplasten vorkom-men, scheint unter anderem aus Ergebnissen von WINTERMANS37 hervorzugehen. Als Hinweis dafür, daß Galaktolipide nicht nur in den Plastiden loka-lisiert sind, kann man auch ansehen, daß nichtgrüne

3 3 E. S . BAMBERGER U. R . B . PARK, Plant Physiol . 4 1 , 1 5 9 1 [1966].

34 E. HEINZ, Z. Naturforsdi. 20 b, 83 [1965] ; Biochim. bio-physica Acta [Amsterdam] 144, 321 [1967].

3 5 J . F . G . M . WINTERMANS, P . J . HELMSING, B . J . J . POLMAN, J. V A N GISBERGEN U. J . COLLARD, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 189 , 95 [1969].

36 P. J. HELMSING, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 178 , 519 [1969].

37 J. F. G. M. WINTERMANS, Colloques internationaux du centre national de la recherche scientifique N ° 119. La photosynthese 1963, 381.

KONZENTRATION VON LIPIDEN IN CHLOROPLASTEN 1187

Gewebe wie der Blütenstand von Brassica cauli-flora 38 , Wurzeln von Antirrhinum majus 3 9 oder die Zwiebel von Narcissus spec. 22 Galaktolipide enthal-ten. Außerdem wurden in etiolierten Euglena-Zellen Galaktolipide gefunden40. Doch ist zu bedenken, daß in diesen Fällen die Galaktolipide möglicher-weise in den Leukoplasten lokalisiert sind. In die-sem Zusammenhang sei erwähnt, daß L Ü R S S E N 7 in isolierten Etioplasten Galaktolipide fand. Da die Galaktolipide Baustoffe des Lamellarsystems sind und da die Leukoplasten im allgemeinen nur wenig Lamellarsystem enthalten, dürfte die Menge der Galaktolipide, die in farblosen Geweben in den Leukoplasten lokalisiert ist, nur gering sein.

Bei der Analyse der Chloroplasten wurden 8 6 % der Lipide einzeln erfaßt. Die verbleibende Differenz von 1 4 % setzt sich aus Verlusten und aus Lipiden zusammen, die nicht bestimmt wurden. Wahrschein-lich enthalten die Chloroplasten außer den angege-benen Lipiden noch geringe Mengen an Paraffi-nen 4 1 , Sterolderivaten42 und Glykolipiden. In Spi-natchloroplasten wurde ein Trigalaktosyldiglycerid gefunden43 . Bei der Dünnschichtchromatographie

3 8 A . ONGUN U. J . B . MUDD, J . biol. Chemistry 2 4 3 , 1 5 5 8 [ 1 9 6 8 ] .

39 Vorliegende Arbeit. 4 0 A . ROSENBERG, J. GOUAUX U. P. MILCH, J. Lipid Res . 7 ,

7 3 3 [ 1 9 6 6 ] . 4 1 P . G . GÜLZ, Phytochem. 7 , 1 0 0 9 [ 1 9 6 8 ] .

der Chloroplastenlipide von Zea mays wTurden ge-legentlich zuckerhaltige Verbindungen beobachtet, die nicht identifiziert werden konnten. Bei diesen Untersuchungen wurden keine Anhaltspunkte dafür gefunden, daß in den Chloroplasten noch größere Mengen von unbekannten Lipiden vorkommen. Es liegt daher nahe, anzunehmen, daß die Lipidverluste bei den präparativen Trennungen etwa 10% betra-gen haben.

Abschließend sei erwähnt, daß sich aus dem Chlorophyllgehalt von Blättern und Chloroplasten berechnen läßt, daß in 1 cm2 des Blattes von Antir-rhinum majus im Mittel 2 7 - I O 6 Chloroplasten ent-halten sind. N I C K E L 6 fand 3 3 - I O 6 Chloroplasten/ cm2. Schon 1 8 8 2 zählte HABERLANDT44 bei höhe-ren Pflanzen je Quadratzentimeter Blattfläche 3 0 bis 5 0 Millionen Chloroplasten.

Herrn Prof. W . M E N K E danke ich für die Anregung zu der vorliegenden Arbeit und seine Unterstützung bei der Durchführung. Ferner möchte ich mich bei Herrn Dr. E . H E I N Z , Herrn Dr. A . R A D U N Z und Herrn Dr. K. L Ü R S S E N für wertvolle Hinweise bedanken.

4 2 W . EICHENBERGER U. W . MENKE, Z . Naturforsdi . 2 1 b , 8 5 9 [1966].

4 3 D . E . WEBSTER U. S . B . CHANG, Plant Physiol . 4 4 , 1 5 2 3 [1969].

44 G. HABERLANDT, Jb. wiss. Bot. 13, 84, 179 [1882],