Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
bersama sama dengan berbagai macam variasinya pada umumnya dirujuk
sebagai kromatografi planar. Pada kromatografi lapis tipis, fase
diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang
datar yang didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium atau plat
plastik. Meskipun demikian kromatografi planar ini dapat dikatakan
sebagai bentuk terbuka dari kromatografi kolom (Rohman, 2009).
Prinsip KLTKromatografi lapis tipis memiliki prinsip yaitu
pemisahan komponen kimia berdasarkan prinsip adsorbsi dan partisi,
yang ditentukan oleh fase diam (adsorben) dan fase gerak (eluen),
dimana ada interaksi antara permukaan fase diam dengan gugus fungsi
senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah berinteraksi
dengan fasa geraknya. Interaksi antara adsorben dengan eluen sangat
menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan
komponen secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan
jumlah larutan umpan (feed). Semakin dekat kepolaran antara senyawa
dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak
tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip like dissolved like
(Underwood. 1988).Penjerap (Fase Diam) Penjerap yang paling sering
digunakan pada Kromatografi Lapis Tipis adalah silika gel dan
serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi desorpsi (suatu
mekanisme perpindahan solut dari fase diam ke fase gerak atau
sebaliknya) yang utama pada Kromatografi Lapis Tipis adalah partisi
dan adsorbsi (Rohman, 2009). Jarak migrasi senyawa pada plat silika
gel tergantung pada polaritasnya. Senyawa yang paling polar
bergerak naik dengan jarak paling dekat dari titik awal penotolan,
sedangkan senyawa dengan polaritas paling kecil bergerak paling
jauh dari titik awal penotolan tersebut. Silika gel merupakan
penjerap polar yang paling sering digunakan, meskipun demikian
silika gel juga banyak dijumpai dalam bentuk yang termodifikasi
(Watson, 2009). Untuk membantu visualisasi maka selama proses
pembuatan plat Kromatografi Lapis Tipis ditambahkan zat yang
berfluorosensi. Secara umum plat Kromatografi Lapis Tipis yang
telah didesain dengan penambahan zat yang berfluorosensi dapat
diamati dibawah sinar ultraviolet. Sebagian besar analit akan
tampil sebagai bercak yang berwarna gelap dengan dasar yang dapat
berfluorosensi. Sebelum digunakan plat Kromatografi Lapis Tipis
biasanya diaktifkan dengan pemanasan pada suhu diatas 100oC selama
kurang lebih setengah jam atau lebih, guna untuk menghilangkan
molekul air yang terjerap pada plat Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
Plat Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yang telah kering biasanya
disimpan dalam desikator untuk menjaga agar tetap kering dan
bersih.
Gambar 4. Permukaan Silika Gel(Mulja dan Suharman, 2005).Fase
Gerak Fase gerak pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dipilih dari
pustaka, sistem yang paling sederhana adalah dengan menggunakan
campuran 2 pelarut organik sehingga pemisahan dapat terjadi secara
optimal. Pada saat pemilihan fase gerak, maka fase gerak harus
mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena Kromatografi Lapis
Tipis (KLT) merupakan teknik pemisahan yang sangat sensitif. Daya
elusi dari fase gerak yang dipilih harus dapat memberikan harga Rf
analit diantara 0,2 0,8 guna untuk memaksimalkan pemisahan. Untuk
pemisahan dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT), maka
polaritas fase gerak akan menentukan nilai Rf dari analit (Rohman,
2009). Semakin polar suatu pelarut atau campuran pelarut maka akan
semakin jauh pelarut tersebut menggerakkan senyawa polar naik dari
titik awal penotolan. Jika senyawa non polar yang sedang
dianalisis, maka tidak akan ada peningkatan yang nyata dalam jarak
migrasi dengan peningkatan polaritas pada fase gerak (Watson,
2009).
Komponen KLTDalam Kromatografi lapis tipis terdapat beberapa
komponen yang ditunjukan dalam gambar diatas. Secara umum dalam
perlakuan KLT peralatan yang dibutuhkan adalah wadah (chamber),
penutup wadah (glass), fase diam (adsorben), dan fase gerak
(eluen). Chamber untuk KLT biasanya terbuat dari bahan kaca yang
padat dan rapat agar tidak ada pengaruh dari lingkungan luar
chamber. Lalu terdapat penutup diatasnya juga terbuat dair kaca
yang berfungsi sebagai pelindung bagian atas chamber untuk
meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap
dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia
biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh
pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah
penguapan pelarut (Sastrohamidjojo, 2005).Peralatan dan Preparasi
Teknik kromatografi dapat dilakukan pada pelat yang dilapisi dengan
bahan penyangga. Sebagai pelat dapat digunakan kertas, kaca,
lembaran aluminium, atau fiberglass. Pada kromatografi lapis tipis,
bahan penyangga dilapiskan pada pelat kaca, logam, atau fiberglass.
Bahan penyangga dapat berupa oksida, oksida hidrat atau bentuk
garam. Sebagai bahan penyangga yang populer digunakan pada
kromatografi lapis tipis adalah golongan aluminium oksida, gel
silika, kieselguhr, dan selulosa. Cara preparasinya adalah
mula-mula dengan membuat sluri yaitu mencampur bahan penyangga
dengan aquades. Setelah itu dengan alat khusus sluri dilapiskan
pada permukaan pelat sehingga mempunyai ketebalan yang sama.
Sebelum digunakan lapis tipis harus dipanaskan terlebih dahulu pada
suhu 120oC selama 60 menit untuk aktivasi (Lipsy,2010).Gerakan dan
pemisahan komponen juga tergantung pada jenis pelarut (eluen) yang
diguriakan. Eluen dapat terdiri atas satu macam pelarut atau
campuran dan dua atau lebih pelarut, tetapi makin banyak campuran
pelarut akan sulit menjenuhkan lingkungan pelat. Juga perlu diingat
bahwa campuran pelarut harus saling tidak melarutkan atau bersifat
immisibel, tetapi sampel harus mempunyai kelarutan yang tinggi pada
eluen. Eluen yang mudah menguap dan tidak meninggalkan noda pada
kertas pada umumnya lebih baik digunakan. Contoh beberapa pelarut
yang sering digunakan pada kromatografi lapis tipis adalah: 1.
Untuk pemisahan asam amino digunakan pelarut campuran fenol dan air
(larutan jenuh), campuran n-butanol, asam cuka dan air (4: 1 :5
atau 12:3:5), campuran n-butanol, piridin dan air (1:1:1). 2. Untuk
pemisahan golongan karbohidrat digunakan pelarut campuran dan
etilasetat, piridin, dan air (2 : 1 :2), campuran etilasetat,
propanol dan air (6: 1:3), campuran etilasetat, asam cuka dan air
(3:1:3). Untuk pemisahan asam lemak digunakan campuran n-butanol
dan larutan 1 ,5 M ammonia larutan jenuh (Roy J. 1991).Pemuatan
Sampel dan Aplikasi Sampel (Penotolan Sampel) Sampel sebelum
diaplikasikan pada lapis tipis harus dibuat larutan dahulu. Larutan
sampel kemudian diteteskan pada kertas atau lapis tipis pada salah
satu tepinya dengan jarak kurang lebih 2, 5 cm dan tepi. Tetesan
sampel diusahakan sekecil mungkin, maka sebaiknya menggunakan pipa
kapiler, pipet mikro, atau siring (spet, jarum suntik berukuran
mikro). Sebelum dielusi tetesan sampel dikering anginkan, jika
perlu dapat dikerjakan dengan menghembuskan udara dengan kipas
angin atau alat pengering rambut (hair drier). Yang perlu dijaga
adalah selama pengeringan tidak terjadi perubahan sifat sampel,
oleh karena itu sebaiknya pengeringan dilakukan pada suhu kamar.
Untuk tujuan kuantitasi, tidak hanya harus menjaga area sampel yang
kecil, tetapi volume sampel yang diaplikasikan kepada plat harus
diketahui secara akurat. Penotol sampel secara mekanik dapat
diperoleh secara komersil dan dapat menotolkan sejumlah tertentu
sampel secara akurat pada posisi yang telah ditentukan (Mulja dan
Suharman, 2005).Pengembangan Pengembangan pelarut biasanya
dilakukan dengan cara menaik (ascending), yang mana ujung lempeng
dicelupkan ke dalam pelarut pengembang. Untuk menghasilkan
reprodusibilitas kromatografi yang baik, wadah fase gerak harus
dijenuhkan dengan uap fase gerak. Plat dicelupkan dalam fase gerak
yang dipilih kira kira 0,5 cm. Bejana diusahakan jangan sampai
bocor. Untuk meyakinkan bahwa bejana kromatografi telah jenuh, maka
dinding dalam bejana dapat dilapisi dengan lembaran kertas saring
yang ujungnya direndam dalam fase gerak. Ada tiga macam teknik
elusi, yaitu pengembangan secara ascending, descending, dan radial
atau horizontal.
(Sastrohamidjojo, 2005).Ada pun metoda pengembangannya ada dua
cara, yaitu metode satu arah (one way direction) dan metoda dua
arah (two ways direction). Pada metoda satu arah, lapis tipis
dikembangkan melalui satu sisinya di mana sampel dimuatkan.
Sedangkan pada metoda dua arah, lapis tipis yang telah
dikembangkan, dilakukan pengembangan sekali lagi melalui tepi
siku-siku lapis tipis.
Metoda pengembangan Metoda pengembangan satu arah dua
arahPengembangan dikerjakan di dalam suatu tangki atau bejana dan
kaca sepaya tampak dan luar, dan ditutup sehingga ruang di dalam
tangki akan jenuh dengan uap eluen. Kejenuhan ruangan termasuk
faktor keberhasilan pemisahan (Sastrohamidjojo, 2005).
Penggunaan KLT1. Potong plat sesuai ukuran. Disesuaikan juga
dengan jumlah sampel yang ingin dipisahkan. Misalnya jika ingin
menguji 3 sampel, kira-kira menggunakan plat selebar 3cm2. Buat
garis dasar (base line) di bagian bawah, dan garis akhir di bagian
atas sebagai penanda posisi awal dan posisi akhir sekitar.
Disesuaikan juga dengan batas pelarut (eluen) dalam chamber.3.
Menggunakan pipa kapiler, totolkan sampel cairan yang telah
disiapkan sejajar, tepat di atas base line. Jika sampel padat,
larutkan pada pelarut tertentu. Keringkan totolan.4. Dengan pipet
yang berbeda, masukkan masing-masing eluen ke dalam chamber dan
campurkan.5. Tempatkan plat pada chamber berisi eluen. Base line
jangan sampai tercelup oleh ulen. Tutuplah chamber.6. Tunggu eluen
mengelusi sampel sampai mencapai garis akhir, di sana pemisahan
akan terlihat.7. Setelah mencapai garis akhir, angkat plat dengan
pinset, keringkan dan ukur jarak spot. Jika spot tidak kelihatan,
amati pada lampu UV. Jika masih tak terlihat, semprot dengan
pewarna tertentu seperti kalium kromat atau ninhidrin.Untuk lebih
jelasnya, perhatikan gambar di bawah ini:(Firdaus.
2011).Visualisasi Hasil Setelah perrnukaan eluen mencapai batas
yang ditentukan, lapis tipis diambil (diangkat) dan dikeluarkan
dari dalam tangki, kemudian dikeringkan pada suhu kamar sampai
semua eluen menguap. Tempat komponen yang memisah dapat diketahui
dengan visualisasi. Ada beberapa teknik visualisasi yang dapat
dikerjakan tergantung pada jenis dan sifat komponen yang
dipisahkan. Visualisasi secara fisik dapat dilakukan dengan sinar
ultra violet atau dengan pengeringan pada suhu tinggi. Visualisasi
dengan penyinaran atau dengan pengeringan menyebabkan timbulnya
warna pada komponen.Visualisasi dapat pula secara kimiawi yang
dapat dilakukan dengan nyemprotkan suatu larutan atau senyawa yang
dapat mengadakan reaksi dengan komponen sehingga timbul wama.
Kombinasi visualisasi secara kimiawi dan secara fisik sering kali
juga dilakukan, misalnya pada suhu 100oC, maka warna ungu akan
timbul. Berikut contoh tabel reagen yang digunakan untuk
visualisasi ;(Sastrohamidjojo, 2005).Deteksi Bercak pemisahan pada
Kromatografi Lapis Tipis umumya merupakan bercak yang tidak
berwarna. Untuk penentuannya dilakukan secara kimia maupun fisika.
Cara kimia yang biasanya digunakan adalah dengan mereaksikan bercak
dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak
akan tampak secara jelas. Cara fisika yang digunakan untuk
menampakkan bercak adalah dengan fluorosensi dibawah sinar
ultraviolet, bila senyawa yang dianalisis dapat berfluorosensi,
maka akan membuat bercak terlihat lebih jelas. Jika senyawa tidak
dapat berfluorosensi maka fase diam yang akan ditambahkan zat yang
dapat berfluorosensi, dengan demikian bercak akan kelihatan gelap
karena menyerap sinar ultraviolet sedangkan latar belakangnya akan
terlihat berflourosensi.Cara kimiawi mendeteksi bercak antara
lainnya: Menyemprot lempeng Kromatografi Lapis Tipis dengan reagen
yang kromogenik yang akan bereaksi secara kimia dengan seluruh
solut yang mengandung gugus fungsional tertentu sehingga bercak
menjadi berwarna. Kadang kadang dipanaskan terlebih dahulu untuk
mempercepat reaksi pembentukan warna dan meningkatkan intensitas
warna bercak. Melakukan pada permukaan lempeng dengan densitometer,
suatu instrumen yang dapat mengukur intensitas radiasi yang
direfleksikan dari pernukaan lempeng ketika disinari dengan lampu
ultraviolet atau lampu sinar tampak. Solut solut yang mampu
menyerap radiasi sinar akan dicatat sebagai puncak (peak) dalam
pencatat (recoder) (Rohman,2009).UV 254 nmUV 365 nm
Sumber Gambar : PribadiInterpretasi Secara kualitatif dapat
dilakukan dengan menghitung faktor retardasinya. Rf diekspresikan
sebagai rasio jarak tempuh solut dan jarak tempuh larutan pengelusi
pada kertas atau lapis tipis, yaitu:
Untuk mengetahui jenis komponen yang memisah, Rf sampel
dicocokan dengan Rf standar yang dielusi dengan cara yang sama.
Interpretasi secara kuantitatif dilakukan untuk mengetahui jumlah
masing-masing komponen yang memisah. Hal ini dapat dilakukan dengan
mengukur atau menghitung luas noda yang terbentuk, menimbang
potongan masing-masing noda, menganalisis potongan noda secara
kimiawi (Rohman, 2009).
Daftar PustakaFirdaus. 2011. Teknik Dalam Laboratorium Kimia
Organik. Jurusan Kimia UNHAS. Makassar. Hal 78.Lipsy, P. 2010. Thin
Layer Chromatography Characterization of the Active Ingredients in
Excedrin and Anacin, Departement of Chemistry and Chemical Biology,
Stevens Institute of Technology, USA.pp.57-59.Mulja, M dan
Suharman. 2005. Analisis Instrumental. Airlangga University Press.
Surabaya, hal. 32,34.Rohman, A. (2009). Kromatografi Untuk
Analisis. Edisi Ke I. Cetakan I. Graha Ilmu. Hal. 217-220.Roy J.
Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991.Pengantar
Kromatografi. Penerbit ITB. Bandung. Hal 20.Sastrohamidjojo, H.
2005. Kromatografi. Penerbit Liberty Yogyakarta. Yogyakarta.
Hal.45,46,52,53.Underwood, AL dan JR. Day R.A. 1988. Analisa Kimia
Kuantitatif Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta.hal 21.Watson, D,G,.
2009. Analisis Farmasi : buku ajar untuk mahasiswa farmasi dan
praktisi kimia farmasi. Penerjemah: Winny R. Syarief, Edisi kedua.
EGC. Jakarta . hal , 124-127.
8
