LABOR-FORSCHUNGSEINHEITEN DER UNIVERSITÄTSKLINIK FÜR

Universitätsklinik für Frauenheilkunde | 143

LABOR-FORSCHUNGSEINHEITEN

DER UNIVERSITÄTSKLINIK FÜR

FRAUENHEILKUNDE

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Forschungslaboratorium

144 | Universitätsklinik für Frauenheilkunde

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MOLEKULARE

ONKOLOGIE

L E I T U N G :

Robert Zeillinger Dr. phil, Assoc. Prof. Dan Cacsire Castillo-Tong Ph. D., Assoc. Prof. Lukas Hefl er M. D., Assoc. Prof.Clemens Tempfer M. D., Assoc. Prof.

A D M I N I S T R A T I O N :

Barbara Holzer MTA

T E C H N . A S S I S T E N T I N N E N :

Grazyna DudekBarbara Holzer MTAIngrid Schiebel MTAEva Schuster MTAAndrea Wolf MTA

P O S T - D O C S :

Gudrun Hager Ph. D.Dietmar Pils Ph. D.Soleman Sasgary Ph. D.

D I S S E R T A N T I N N E N :

Veronika Auner (N094) M.Sc.Robert Eifl er (N094) M.Sc.Judith Lind (N094) M.Sc.Eva Obermayr Ph. D.

W I S S . M I T A R B E I T E R I N N E N :

Christoph Grimm M. D.Robert Königsberg M. D.Stefan Polterauer M. D.Veronika Seebacher M. D.Dietrich Wolf M. D.Gustav Nowotny

v.l.n.r.: Dan Cacsire Castillo-Tong, Soleman Sasgary, Eva Schuster, Marina

Rochel, Andrea Wolf, Barbara Holzer, Robert Zeillinger, Robert Königsber-

ger, Ingrid Schiebel, Grazyna Dudek, Gudrun Hager, Eva Obermayr, Sabine

Wohlfart, Robert Eifl er

EU - PROJEKTOVCAD: OVARIAN CANCER – DIAGNOSIS OF A SILENT KILLER(Ongoing )

The FP6 EU project was originally planned for 36 months but was extended for 54 month (till June 2010). The annual consortium meeting was organized by Robert Zeillinger and Dan Cacsire Castillo-Tong in Leuven together with the local project partner Prof. Ignace Vergote. Scientifi c results were presented by all partners. Scientifi c and fi nancial reports for the third period were approved by EC. Work package 2 of the project is in charge of recruiting patients and collecting biological materials necessary for the various tasks. At the end of 2008, 299 patients were included in the project from which tumor tissues, blood and ascites were collected Table 1 summarizes the histopathological data of the samples. One of the tasks for our group is to defi ne a gene expression sig-nature from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and fi nd gene sets for the prediction of responsiveness of ovarian cancer patients to platinum-based chemotherapy. We broa-dened the microarray analysis from 27 samples in 2008 to 48 samples. Models including different gene-sets were built (e.g. one with 25 genes derived from an uncorrelated shrunken centroids-approach, Fig. 1) and validation is ongoing.


Principal component analysis (PCA) using a gene-set of 25 genes showing

the different gene expression characteristics of responders (blue), non-

responders (red) and four patients which cannot be classifi ed with certainty

using clinical data (brown).

Table 1. Characteristics of tumors and patients

PARAMETERS PATIENTS %

FIGO Stage

II 17 6

III 211 70

IV 45 15

Missing data 27 9

Lymph node involvement

N0 61 21

N1 149 50

Nx 54 18

Missing data 35 12

Metastatic disease

M0 140 47

M1 46 15

Mx 55 18

Missing data 59 20

Histology

Serous 253 84

Mixed epithelial 13 4

Endometrioid 15 5

Undifferentiated 9 3

Clear cell 3 1

Mucinous 4 1

Missing data 3 1

Grading

G1 12 4

G2 60 20

G3 199 66

Gx 1 0

Missing data 28 9

Ascites

No ascites 30 10

< 500ml 85 28

≥ 500ml 84 28

Missing data 100 1

Peritoneal carcinomatosis

Absent 84 28

Present 163 54

Missing data 53 18

The cooperation with other project partners revealed a new genetic alteration, an amplifi cation of a region on chromo-some 3 that is present in metastases of ovarian cancer and also in tumor cells in ascites (Figure 2).

FISH showing the amplifi cation on chromosome 3 in tumor cells.

Assoziation von fünf häufi gen Polymorphismen in den Genen für Interleukin-1 und -6 und CIN (beendet)

M I T A R B E I T E R : Grimm C Natter C Schuster E Wolf A Zeillinger R

Die proinfl ammatorischen Zytokine Interleukin (IL)-1 und IL-6 modulieren die Immunantwort bei Infektion, Infl amma-tion und Gewebstrauma. Einerseits dürften IL-1 und IL-6 einen entscheidenden stimulierenden Einfl uss auf die Ent-stehung der zervikalen intraepithelialen Neoplasie (CIN) und des Zervixkarzinoms haben. Andererseits wird insbesondere IL-6 eine wichtige Rolle in der Viruselimination und somit der Verhinderung einer CIN bzw. eines Zervixkarzinoms zuge-sprochen. In dieser Fall-Kontroll-Studie werden vier IL-1 und ein IL-6 Genpolymorphismus bei insgesamt 412 Frauen eva-luiert (n=203 Frauen mit CIN; n=209 Frauen ohne CIN). Die Analyse der Genpolymorphismen (IL1A -889, IL1B +3953, IL1B -511, IL1RN VNTR, IL6 -174) erfolgt mittels Polymerase Chain Reaction (PCR) und Pyrosequencing. Die statistische Auswertung erfolgt mittels Chi-Quadrat-Tests und T-Tests bzw. multivariater Regressionsmodelle. In der vorliegenden Studie wird der Zusammenhang zwischen fünf IL-1 bzw. IL-6 Genpolymorphismen und dem Risiko für das Vorliegen einer CIN untersucht. Ziel ist die Identifi kation von Frauen mit einem erhöhten Risiko für die Entstehung einer CIN und in weiterer Folge eines Zervixkarzinoms. Dadurch könnte eine individuellere Beratung und Therapie der Frauen erfolgen.


Die prognostische Bedeutung von PELP-1 bei Patientinnen mit Ovarialkarzinom

M I T A R B E I T E R : Grimm C Polterauer S Seebacher V Rahhal J Dudek G Horvat R1

Zeillinger R

1 Klinisches Institut für Pathologie, Medizinische Universität Wien

Proline-, glutamic acid-, and leucine-rich Protein (PELP1) ist ein Co-Regulator nukleärer Rezeptoren. Neben seiner Funktion als Co-Regulator des Östrogenrezeptors inter-agiert PELP1 mit zahlreichen Schlüsselenzymen der Zell-progression. Die Überexpression von PELP1 wird in 60% aller Ovarialkarzinome beschrieben und ist mit einer Tu-morprogression assoziiert. Mehrere in vitro Studien weisen darauf hin, dass PELP1 eine entscheidende Rolle in der Proliferation und dem Überleben von Ovarialkarzinomzel-len einnehmen dürfte. In der vorliegenden Studie wurde die Assoziation zwischen PELP1 Überexpression und der Prognose von Frauen mit Ovarialkarzinom evaluiert. Acht-zig Patientinnen mit epithelialem Ovarialkarzinom (EOC) werden in die vorliegende Studie inkludiert. Die PELP1, Östrogenrezeptor(ER)-alpha und -beta Färbung erfolgt mit-tels indirekter Immunhistochemie auf Tissue Arrays. Die statistische Auswertung erfolgt mittels Chi-Quadrat-Tests und T-Tests bzw. univariater Kaplan-Maier Kurven und mul-tivariater Cox-Regressionsmodelle. Ziel ist die Identifi kation und Risikostratifi zierung von Patientinnen mit einer beson-ders schlechten Prognose und Identifi kation von möglichen therapeutischen Ansätzen.

Die prognostische Bedeutung von BAG-4 und verwandten Proteinen bei Patientinnen mit Ovarialkarzinom

M I T A R B E I T E R : Polterauer S Grimm C Seebacher V Rahhal J Dudek G Horvat R1

Zeillinger R


Das epitheliale Ovarialkarzinom (EOK) entsteht durch ma-ligne Transformation des ovariellen Epithels. Es konnte gezeigt werden, dass Alterationen in der Regulation von apoptotischen Mechanismen die Karzinogenese und Tu-morprogression beim EOK unterstützen. Apoptose kann einerseits durch intrazelluläre Signale andererseits durch

extrazelluläre Faktoren - hauptsächlich durch bax/Bcl-2 Komplex Vermittlung und Membranrezeptoren - induziert werden. Die antiapoptotische Onkogenfamilie Bcl-2 (b-cell lymphoma gene-2) ist beteiligt an der malignen Zelltrans-formation bei mehreren Arten von soliden Tumoren und spielt bei der Entwicklung des EOK eine Schlüsselrolle. Die Proteinfamilien Bcl-2, BAG (Bcl-2-associated anthanoge-ne), Bcl-x und hsp (heat shock protein) interagieren direkt miteinander und regulieren das Zellüberleben. BAG und hsp Proteine dienen als (Co-)Chaperone und unterstützen die Bildung der Sekundärstruktur von Proteinen wie Bcl-2.Achtzig Patientinnen mit epithelialem Ovarialkarzinom werden in die vorliegende Studie inkludiert. Die BAG-1,-3,-4, BCL-2 und BCL-x Färbung erfolgt mittels indirekter Immunhistochemie auf Tissue Arrays. Die statistische Auswertung erfolgt mittels Chi-Quadrat-Tests und T-Tests bzw. univariater Kaplan-Maier Kurven und multivariater Cox-Regressionsmodelle. Ziel ist die Identifi kation und Risikostratifi zierung von Patientinnen mit einer besonders schlechten Prognose und Identifi kation von möglichen the-rapeutischen Ansätzen.

Die prognostische Bedeutung von TLR-4 bei Patientinnen mit Ovarialkarzinom

M I T A R B E I T E R : Grimm C Polterauer S Seebacher V Rahhal J Dudek G Horvat R1

Zeillinger R


Infl ammatorische Prozesse fördern die Karzinogenese durch DNA-Schäden, Stimulation der Angiogenese und Zellproliferation und der Unterdrückung antiapoptotischer Mechanismen und dürften in der Pathogenese des Ovari-alkarzinoms eine Rolle spielen. Toll like Rezeptor(TLR)-4 ist ein transmembranöses Protein, das einen wichtigen Stellenwert in der Infl ammationskaskade hat. TLR-4 wird in epithelialen Ovarialkarzinomzellen ubiquitär exprimiert und zeigte bei Expression von MyD88 eine Induktion der Zellproliferation und erhöhte Produktion von Zytokinen und Chemokinen. Die Aktivierung von TLR-4 in epithelia-len Ovarialkarzinomzellen dürfte somit einerseits direkt das Überleben von Karzinomzellen fördern und zur Tumorpro-gression beitragen, andererseits zu einer Regulation der Immunantwort in der unmittelbaren Umgebung des Tumors führen. Achtzig Patientinnen mit epithelialem Ovarialkarzi-nom werden in die vorliegende Studie inkludiert. Die TLR-4 Färbung erfolgt mittels indirekter Immunhistochemie auf Tissue Arrays. Die statistische Auswertung erfolgt mittels Chi-Quadrat-Tests und T-Tests bzw. univariater Kaplan-Mai-


er Kurven und multivariater Cox-Regressionsmodelle. Ziel ist die Identifi kation und Risikostratifi zierung von Patientin-nen mit einer besonders schlechten Prognose und Identifi -kation von möglichen therapeutischen Ansätzen.

Polymorphismen im Gen des C-reaktiven Proteins und Prognose beim Zervixkarzinom

M I T A R B E I T E R : Polterauer S Grimm C Seebacher V Schuster E Wolf A Zeillinger R Tempfer C Reinthaller A Hefl er LA

Das C-reaktive Protein (CRP) stellt das wichtigste Akute-Phase-Protein dar und wird in der klinischen Praxis als unspezifi scher Entzündungsparameter verwendet. Es besteht ein erwiesener Zusammenhang zwischen Ent-zündung, Karzinogenese und Tumorwachstum. Mehrere rezente Studien zeigen, dass erhöhte CRP-Serumspiegel bei fortgeschrittenem Tumorstadium von gynäkologischen Malignomen vorkommen und als unabhängiger Prognose-parameter für das Überleben dienen. Mutationen im CRP-Gen können die Höhe der CRP-Serumspiegel beeinfl ussen. Allerdings ist derzeit noch unklar, ob die Entzündungsre-aktion und die Erhöhung der CRP-Serumspiegel als Ursa-che oder als Folge des Tumorwachstums zu werten sind. Die vier CRP-Genpolymorphismen CRP1919 (rs1417938), CRP2667 (rs1800947), CRP3872 (rs1205) und CRP5237 (rs2808630) wurden bei 178 Patientinnen mit Zervixkar-zinom evaluiert. Die Überlebensanalysen erfolgen mit-tels univariaten Kaplan Meier Analysen und multivariaten Cox-Regressionsmodellen, ebenso werden die vier CRP-Polymorphismen mit klinisch-pathologischen Parametern korreliert.

Polymorphismen im Gen des C-reaktiven Proteins und Prognose beim Ovarialkarzinom

M I T A R B E I T E R : Hefl er LA Polterauer S Grimm C Seebacher V Schuster E Wolf A Zeillinger R Tempfer C Reinthaller A

Das C-reaktive Protein (CRP) stellt das wichtigste Akute-Phase-Protein dar und wird in der klinischen Praxis als unspezifi scher Entzündungsparameter verwendet. Es besteht ein erwiesener Zusammenhang zwischen Ent-zündung, Karzinogenese und Tumorwachstum. Mehrere rezente Studien zeigen, dass erhöhte CRP-Serumspiegel bei fortgeschrittenem Tumorstadium von gynäkologischen Malignomen vorkommen und als unabhängiger Prognose-parameter für das Überleben dienen. Mutationen im CRP-Gen können die Höhe der CRP-Serumspiegel beeinfl ussen. Allerdings ist derzeit noch unklar, ob die Entzündungsre-aktion und die Erhöhung der CRP-Serumspiegel als Ursa-che oder als Folge des Tumorwachstums zu werten sind. Die vier CRP-Genpolymorphismen CRP1919 (rs1417938), CRP2667 (rs1800947), CRP3872 (rs1205) und CRP5237 (rs2808630) wurden bei Patientinnen mit epithelialem Ovarialkarzinom evaluiert. Die Überlebensanalysen erfol-gen mittels univariaten Kaplan Meier Analysen und multiva-riaten Cox-Regressionsmodellen, ebenso werden die vier CRP-Polymorphismen mit klinisch-pathologischen Para-metern korreliert.

Farnesyl Thiosalicyl Säureamid (FTA), ein RAS Inhibitor als Target Therapie und Chemo-/ Radiosensitizer von Zervixkarzinom Zellen in vitro

M I T A R B E I T E R : Seebacher V Pils D Grimm C Polterauer S Schiebl I Reinthaller A Zeillinger R

Ras-Protoonkogene codieren Ras Proteine, die als Sig-naltransduktoren eine Vielzahl an zellulären Funktionen, insbesondere Proliferation, Differenzierung und Überleben der Zelle, regulieren. Eine Mutation von Ras-Genen führt zu einer Überexpression von Ras-Proteinen, dadurch zu einem permanenten wachstumsstimulierenden Signal in der Zelle und somit zur Entstehung von Neoplasien. Das zunehmen-de Verständnis der genetischen und molekularbiologischen Vorgänge der Onkogenese führt zur Entwicklung verschie-dener sogenannter Target-Therapien wobei die Aktivierung von Ras ein zentrales Target darstellt. Ein vielversprechen-der Ansatz ist die Entwicklung von Farnesyl Thiosalizyl Säureamid (FTA), einer Substanz die ähnlich der Substanz Farnesyl Thiosalizyl Säure (FTS), die die Bindung von Ras an die Zellmembran und somit dessen Aktivierung kompetitiv und selektiv inhibiert, wodurch weitere Signalkaskaden un-terbunden werden. In zahlreichen Studien konnte die Wirk-samkeit von FTS (und FTA) im in vitro- und Mausmodell für diverse Malignome nachgewiesen werden. Die klinische Anwendung wird derzeit in Phase 1 / 2 Studien bei fort-


geschrittenem Pankreaskarzinom und Nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom geprüft. Zur Effektivität von FTS (bzw. FTA) beim Zervixkarzinom gibt es erstaunlicherweise noch keine Daten, wobei Ras-Mutationen nachweislich bei der Entstehung und Progression des Zervixkarzinoms eine we-sentliche Rolle spielen dürften. In dieser Studie untersuchen wir den Effekt von FTA auf das Wachstum von Zervixkarzinom Zelllinien, sowie die Wirkung von FTA auf das Ansprechen von Zervixkarzinom Zellen auf Chemo- und Strahlentherapie in vitro. Zuerst bestimmen wir die IC50 Werte von FTA in drei Zervixkarzinom Zellli-nien (Caski HPV16-positiv, GH354 HPV18-positiv und HT3 HPV-negativ) mittels Cell Titer Blue. Ein Vorversuch hat für die Panc-1 Zelllinie einen IC50-Wert von 40 µM ergeben, ca. doppelt so hoch wie in der Literatur beschrieben. Um die synergistischen Effekte von FTA und klassischen Che-motherapeutika zu bestimmen, werden wir die Inhibierung der Proliferation durch FTA mit der für die Zelllinien spezifi -schen IC50-Werten gemeinsam mit einer Verdünnungsrei-he der Chemotherapeutika bestimmen.

Cross-talk between p53 and p73 Isoforms in ovarian cancer(Ongoing cooperation project with the Department of Gynecology and Obstetrics, Innsbruck Medical University)

C O L L A B O R A T O R S : Schuster E Wolf A Schiebel I Holzer B Hofstetter G1

Berger A1

Concin N1

Zeillinger R

1 Department of Gynecology and Obstetrics, Innsbruck Medical University

A crucial cross-talk between p53-genefamily members (p53, p73) exists with aggravating and inhibitory effects leading to a fi ne modulation of the process of apoptosis. Si-milar to p73, the tumor suppressor gene p53 is subject to alternative splicing. Aims of this project are to investigate the gene expression of p73 isoforms, the p53 splicing vari-ants and their interactive roles in ovarian cancer progression and also in their responsiveness to chemotherapy. Besides p53DE6 and p53b, we identifi ed novel p53 isoforms p53f, p53d and p53e, arising from alternative splicing of exon 6 and intron 9, respectively (Figure 3). p53 splice variants were present in 18 of 34 ovarian cancer cell lines (52.9%) and 134 of 245 primary ovarian cancers (54.7%). p53d ex-pression was associated with impaired response to prima-ry platinum-based chemotherapy (P=0.032). Also, p53d expression constituted an independent prognostic marker for recurrence-free and overall survival (hazard ratio 1.854, 95% confi dence interval 1.121–3.065, P=0.016; and hazard

ratio 1.937, 95% confi dence interval 1.177–3.186, P=0.009, respectively). p53b expression was associated with adver-se clinicopathologic markers, that is, serous and poorly dif-ferentiated cancers (P=0.002 and P=0.008, respectively), and correlated with worse recurrence-free survival in pati-ents exhibiting functionally active p53 (P=0.049). DN0p73 constituted the main N-terminally truncated p73 isoform and was preferentially found in ovarian cancer cell lines showing functionally active p53, supporting our hypothesis that N-terminally truncated p73 isoforms can alleviate the selection pressure for p53 mutations by the inhibition of p53 protein function. This part of work has been published in Oncogene (2010).

The structure of the human p53 gene, comprising exons 5–10. Besides full-

length p53, we identifi ed various p53 splice variants encoding C-terminally

truncated proteins. Arrows indicate the primers used for variant-specifi c

PCR (exons 5–7; exons 9–10). (b) The gene architecture of the NH2 termi-

nus of the p73 gene. Arrows illustrate the transcriptional start sides of the

p73 isoforms. Also, arrows indicate the primers and probes used for TAp73,

DN0p73 and DNp73 in the real-time RT–PCR. (Gray) noncoding sequence;

(white) coding sequence.

The function of the p53 is highly associated with MDM2. The G-allele of SNP309 in the p53-sensitive P2 promoter of the MDM2 gene is associated with the attenuation of the p53 tumor suppressor pathway. There are evidences that SNP309 is correlated with an earlier age of onset and


increased risk of tmorigenesis. A recent study showed that a weakened p53 pathway, either through a mutant TP53 or the G-allele of SNP309, was associated with a better outcome for patients with ovarian cancer. Thus, we examined this po-lymorphism of MDM2 gene in association with p53 splicing variants and p73 isoforms. Data analysis will be focused on the cross-talk of these three genes and their correlation with chemoresponsiveness of ovarian cancer patients.

Identifi cation and validation of prognosticmarkers for endometrial carcinoma

C O L L A B O R A T O R S : Zhao L Dudek G Pils D Cacsire Castillo-Tong D

Treatments of endometrial carcinomas include surgery, radiation, hormone therapy and chemotherapy. In general, Stage I and II patients will receive surgery or surgery plus radiation, depending on the stage of the tumor and whether it has invaded the myometrium. For Stages III and IV pati-ents, radiation, hormone therapy and chemotherapy will be applied after surgery. Even though the Stage I and II patients have favourable prognosis, there are still patients who will develop recurrent disease. Based on the consideration of eradiating the residual tumours completely, Stage II patients are generally treated with more aggressive radiation therapy in some clinics. In other clinics however, the Stage II patients are under observation after surgery to avoid unnecessary side-effects of the therapies. So far, there is no prognostic marker, which could predict the outcome of stage I and II endometrial cancer. Aim of the project is to defi ne gene expression markers for the prediction of the outcome of endometrial cancer patients, which might have clinical ap-plications. Total RNA was isolated from endometrial tumor tissues, which are histopathologically classifi ed. Microarray technology was applied to defi ne the differentially expressed genes (Table 2). Tumor tissues were immunohistochemically stained with antibodies against several gene products in order to validate their predictive values. Preliminary results were obtained and the analyses of results are going.

Proof of Concept to Enrich Circulating Tumor Cells Using Leukapheresis and Elutriation (fi nished)

C O L L A B O R A T O R S : Eifl er R Lind J Fischer M1

Viktoria Weber2

Dieter Falkenhagen2

Zeillinger R

1 Universitätsklinik für Blutgruppenserologie und Transfusionsmedizin,

Medizinische Universität Wien

2 Donau-Universität Krems

Purpose: To determine the applicability of a sequential pro-cess using leukapheresis, elutriation and fl uorescence-as-sisted cell sorting (FACS) to enrich and isolate circulating tumor cells from a large blood volume increasing their yield. Experimental Design: Mononuclear cells were collected from 10 male healthy donors by circulating 10 L of blood by leukapheresis, to which carboxyfl uorescein succinimidyl ester (CFSE) pre-labeled CaOV-3 tumor cells were spiked at a ratio of 26 to 106 leukocytes. Elutriation separated the spiked leukapheresates by cell size into distinct fractions, and the distribution of leukocytes and tumor cells were quantifi ed by fl ow cytometry analysis with tumor cells clas-sifi ed as CFSE positive, epithelial adhesion molecule (Ep-CAM) positive and CD45 negative events. Enriched tumor cells were then isolated using FACS (CFSE+/EpCAM+/CD45-) or anti-EpCAM coupled immunomagnetic beads, and their recovery and purity determined by fl uorescent microscopy and real-time PCR. Results: Leukapheresis collected 13.6±3.6x109 mononuclear cells with an average effi ciency of 94%. In total, 60 to 80% of spiked tumor cells were pre-enriched in the last elutriation fraction among 1.6±0.6x109 monocytes. Flow cytometry predicted a circu-lating tumor cell purity of 58±21% giving an enrichment of approximately 60,000-fold following leukapheresis, elutria-tion and FACS with CaOV-3 cells identifi ed as EpCAM posi-tive and CD45 negative events. FACS confi rmed this purity, but indicated a recovery of 20% using a 40-fold increase in acquisition rate. Immunomagnetic bead adsorption reco-vered 10±4% of tumor cells with 11±15% purity. Conclusi-on: Elutriation and FACS following leukapheresis are able to enrich and isolate viable tumor cells from a large blood volume suggesting that this system be further evaluated to isolate circulating tumor cells from cancer patients for molecular characterization and diagnostic purposes.

Molekularer Nachweis disseminierter Tumorzellen im Blut von Patientinnen mit gynäkologischen Tumorerkrankungen

M I T A R B E I T E R : Obermayr E Pils D Schiebel I Cacsire Castillo-Tong D Zeillinger R

Im Rahmen des GEN-AU assoziierten Projektes zur Ent-wicklung molekularbiologischer Diagnoseverfahren für Brustkrebs und Krebserkrankungen des weiblichen Geni-taltrakts wurden sechs Gene identifi ziert, die als moleku-lare Marker für den Nachweis von im Blut zirkulierenden Tumorzellen dienen. Diese Gene (CCNE2, EMP2, DKFZ-


p762E1312, MAL2, PPIC und SLC6A8) sind im Blut von 81% Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom stärker exprimiert als in der gesunden Kontrollgruppe und wurden daher in das Markerpanel zur Analyse von zirkulierenden Tumorzellen mit PCR inkludiert. In der Gruppe der primären Mammakarzinompatientinnen wurde eine erhöhte Genex-pression nur in 29% der Fälle festgestellt. Die Genmarker sind nicht nur geeignet für die Analyse von zirkulierenden Tumorzellen bei Brustkrebs, sondern auch bei Ovarial-, Cervix- und Endometriumkarzinom. In den jeweiligen Tu-morgruppen zeigten 19%, 44% und 64% der Patientinnen zum Zeitpunkt der Erstdiagnose eine erhöhte Genexpres-sion im Vergleich zu gesunden Frauen. Neben der Expres-sionsanalyse von CCNE2, EMP2, DKFZp762E1312, MAL2, PPIC und SLC6A8 wurde auch die Expression von Mam-maglobin (hMAM) und epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) im Blut von Brust- und Eierstockkrebspatientin-nen analysiert. Erhöhte hMAM Expression wurde nur beim fortgeschrittenen Brustkrebs gefunden (39%), wogegen Ep-CAM auch in früheren Krankeitsstadien stärker exprimiert war als in der Kontrollgruppe (in 5% der primären und 19% der metastasierten Fälle). Die molekulare Analyse der neu identifi zierten sechs Gene ermöglicht also einen sensitive-ren Nachweis zirkulierender Tumorzellen als herkömmliche Marker wie hMAM oder EpCAM. Daß diese neuen Genmar-ker tatsächlich tumorzellspezifi sch sind wurde weitere Ana-lysen bestätigt: In 30 Brustkrebspatientinnen in klinischer Remission unterschied sich die Expression nicht von ge-sunden Frauen, da durch die vorangegangene erfolgreiche Chemotherapie keine Tumorzellen mehr im Blut vorhanden waren. In isolierten Tumorzellen (Cellect, MMI) einer me-tastasierten Brustkrebspatientin mit immunzytochemisch nachweislich vorhandenen Tumorzellen im Blut wurde ein-deutig eine Expression der Genmarker festgestellt, nicht aber in ihren Zellen hämatopoetischen Ursprungs.

Gene expression signatures of breast tissue before and after cross-sex hormone therapy in Female-To-Male Transsexuals

Collaborators: Bentz EK Pils D Bilban M1

Kaufmann U Hefl er LA Reinthaller A Hefl er-Frischmuth K2

Holzer B Singer CF Zeillinger R Huber JC3

Tempfer CB

1 Clinical Institute for Medical and Chemical Laboratory Diagnostics,

Medical University of Vienna

2 Department of Laboratory Diagnostics4, Wilhelminenspital, Vienna

3 Department of Gynecologic Endocrinology and Reproductive Medicine,

Medical University of Vienna

The effects of long-term androgen therapy on breast tissue are unknown. The aim of this study was to evaluate the gene expression signatures of breast tissue in female-to-male (FtM) transsexuals before and after cross-sex hormo-ne therapy. Five hormone-naïve FtM transsexuals with two years of intramuscular testosterone undecanoate (1000mg every 12 weeks) and oral lynestrenole (5mg daily). Breast tissue biopsies before and after therapy were taken and total RNAs prepared. The Upregulation and downregulati-on of specifi c genes and gene expression signatures were determined using global gene expression arrays covering 28,869 genes. We identifi ed 2,250 differentially expressed genes. 243 (10.8%) probe sets were up-regulated and 2,007 (89.2%) probe sets were down-regulated after cross-sex hormone therapy. Among up-regulated probe sets, genes involved in the ‘Regulation of Biological Processes’ catego-ry were most over-represented with 43/97 (44.3%) anno-tated probe sets. 21 of these probe sets were associated with transcription regulation, e.g. the transcription factor complex activator protein 1 (AP-1) including all three jun genes (c-Jun, JunB, and JunD), two fos genes (c-fos and fosB), and activating transcription factor 3 (ATF3). Among 2,007 down-regulated probe sets, proteins of the ribosome pathway (Figure 4) and of two pathways involved in pro-tein degradation were most signifi cantly down-regulated. We identifi ed eight breast cancer-associated gene expres-sion signatures signifi cantly overlapping with differentially regulated probe sets after cross-sex hormone therapy. Conclusion(s): Cross-sex hormone therapy in FtM transse-xuals leads to the upregulation and downregulation of 243 and 2,007 distinct genes, respectively, and is associated with breast cancer-related gene expression signatures.

Proteins of the ribosome down-regulated after long-term androgen therapy

(marked with red stars).


Nachweis und Verteilung von Östrogen- (ERa, ERb) und Relaxin- (LGR-7, LGR-8) Rezeptoren im Becken-boden von prä- und postmenopausalen Frauen sowie deren Assoziation mit pelviner Organsenkung (POP)

M I T A R B E I T E R : Dietrich W Obermayr E Schiebel I Sasgary S Dudek Gabi Horvat R1

Hanzal E


Die obere Vagina und der Uterus werden vom Verband aus Li-gamentum sacrouterinum und Ligamentum cardinale oberhalb der Levatorplatte des Beckenbodens fi xiert. Bei nahezu 50 % der älteren Frauen kann irgendeine Form der Beckenboden-schwäche festgestellt werden, während bloß 5 % der jüngeren Frauen davon betroffen sind. Hauptrisikofaktoren sind neben dem Alter die Anzahl an vaginalen Geburten, genetische Prä-disposition (besonders Kollagenosen) und Östrogenmangel. Der Uterusprolaps (POP) im Speziellen zeigt einen besonders starken Anstieg in der Postmenopause, was für einen Einfl uß der Hormonmangelzustände spricht. Weiters ist bekannt, daß das Hormon Relaxin für die Lockerung einiger Beckengewebe zur Ermöglichung einer vaginalen Geburt bei Säugetieren ver-antwortlich ist. Es existieren keine systematischen Arbeiten über die Östrogen- bzw. Relaxin-Rezeptorverteilung in mensch-lichen Beckenbodengeweben. Die vorliegende Studie soll die Expression und Verteilung von ERa, ERb, PR, LGR-7 und LGR-8 im pelvinen Bandapparat (Lig. sacrouterinum) bei Frauen mit und ohne POP erforschen. Die Analyse der Genexpression in Gewebsproben von 26 Frauen wurde mittels quantitativer RT-PCR bereits durchgeführt; eine Auswertung erfolgt sobald Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen zur Lo-kalisationsbestimmung und semi-Quantifi zierung vorliegen.

KRAS mutation analysis in ovarian samples using a high sensitivity biochip assay (fi nished)

C O L L A B O R A T O R S : Auner V Kriegshäuser G1

Schuster E Wolf A Cacsire Castillo-Tong D Horvat R2

Reinthaller A Mustea A3

Zeillinger R

1 ViennaLab Diagnostics GmbH

2 Klinisches Institut für Pathologie, MUW

3 Klinik und Poliklinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe,

Universitätsklinikum Greifswald, Universität Greifswald

Background: Mutations in the KRAS gene are one of the most frequent genetic abnormalities in ovarian carcinoma. They are of renewed interest as new epidermal growth fac-tor receptor (EGFR)-targeted therapies are being investiga-ted for use in ovarian carcinoma. As KRAS mutations are associated with poor response and resistance to EGFR-targeting drugs, this study was conducted to obtain more information on the spectrum of KRAS mutations in ovarian carcinoma. Methods: The presence of KRAS mutations in codon 12 and 13 was analyzed in frozen and formalin-fi xed paraffi n-embedded (FFPE) tissue with a low density bio-chip platform. 381 malignant (29 borderline malignancy, 270 primary carcinomas, and 82 recurrent carcinomas) and 22 benign tissue samples from a total of 394 patients were examined. KRAS mutational status of each sample was correlated with dignity, FIGO stage, grade, histology, and survival. Results: KRAS mutations were found in 60 (15%) samples with 58 samples deriving from malignant tis-sue and 2 samples deriving from benign tissue. In 55 (92%) samples codon 12 was found to be mutated. Frozen and FFPE samples concurred with respect to KRAS mutation status. Conclusion: KRAS mutation is a common event in ovarian cancer primarily in carcinomas of lower grade, lo-wer FIGO stage, and mucinous histotype. The KRAS mu-tational status is no prognostic factor for patients treated with standard therapy. However, in line with experience from colorectal cancer and non-small-cell-lung cancer (NSCLC), it may be important for prediction of response to EGFR-targeted therapies. The results of the project were published in BMC Cancer. 2009.

ABC transporter gene expression in benignand malignant ovarian tissue (fi nished)

M I T A R B E I T E R : Auner V Sehouli J1

Oskay-Oezcelik G1

Horvat R2

Speiser P Zeillinger R

1 Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe,

Charité Campus Virchow-Klinikum, Berlin

2 Klinisches Institut für Pathologie, MUW

Objective: ATP-binding Cassette (ABC) transporters are thought to cause multiple drug resistance (MDR) in various carcinomas. Gene expression data from individual trans-porters in ovarian cancer tissue is contradictory and also scarce for some of them. RNA levels of a panel of ABC transporters were collected and analyzed to get a more detailed overview which transporters are of importance in resistance to chemotherapeutic agents in ovarian carcino-ma. Methods: Real-time PCR was used to determine RNA expression levels of 9 ABC transporters in 50 benign tissue


samples and 50 recurrent ovarian cancer samples. Ge-nes exhibiting a signifi cant difference between those two groups were further evaluated in 50 primary cancer samp-les. Data were analyzed with receiver operating characte-ristic (ROC) curves and multiple Wilcoxon–Mann–Whitney U-tests with Shaffer correction. Results: Gene expression of four transporters (ABCC1, ABCC2, ABCC3, and ABCB3) was signifi cantly elevated in recurrent cancer lesions compared to benign tissue. Expression levels of these 4 ABC transporters were further analyzed in primary ovari-an cancer lesions. A signifi cant difference between prima-ry and recurrent tumor tissue was found in all four genes (Figure 5). Changes in gene expression between benign samples and primary lesions were minor and not relevant. Conclusions: Four of the examined ABC transporters are likely to play a role in the MDR of ovarian carcinoma. Gene expression of these transporters seems only up regulated through chemotherapy. The thesis that MDR in ovarian cancer is acquired through therapy itself and not present ab initio is supported by these fi ndings. The results of the project were published in Gynecol Oncol 2009.

ROC-curves of genes with an AUC > 0.8 for expression levels of benign

tissue vs. recurrent carcinoma.

Implementation of a single cell sorting process for real-time PCR without pre-amplifi cation (closed)

C O L L A B O R A T O R S : Auner V Tveito S1

Fodstad O1

Plaschke-Schluetter A2

Zeillinger R

1 Department of Tumor Biology, Rikshospitalet-Radiumhospitalet

Medical Center, Oslo, Norway

2 Molecular Machines, Switzerland

Im Rahmen eines Stipendiums des Forskningsrådet hat-te Auner Veronika die Möglichkeit 5 Monate (Jänner- Juni 2009) am Radiumhospitalet in Oslo in der Arbeitsgruppe Tumorbiologie zu arbeiten. Der Hauptzweck ihres Aufent-haltes war eine Einschulung in die Bedienung des Cellector, einem Gerät für die Akquirierung von lebenden Einzelzellen aus Suspension. So können Tumorzellen aus Aszites oder Blut isoliert und ohne Background analysiert werden (Figure 6). Eine genaue Einschulung in die Bedienung des Gerätes, aber auch downstream Applikationen wie der Untersuchung von Nukleinsäuren (z.B.: Genexpression, und Mutationsana-lysen) von Einzelzellen, wurde durchgeführt. Ein Teil ihrer Arbeit wurde beim “7th International Symposium on Minimal Residual Cancer” Athen 16-19.9.2009 präsentiert.

Picture showing the selection of single cells in suspension with CellEctor.

Aim: The molecular analysis of single cells from patient ma-terial is of increasing interest in cellular diagnostics and pa-tient profi ling. It is a prerequisite for tailoring treatment in cancer personalized medicine. The CellEctor (MMI, Glatt-brugg, Switzerland) is an automated instrument for reco-gnition and aspiration of single cells under visual control. We established a quick and easy protocol for the isolation and realtime PCR of single cells without initial RNA am-plifi cation. Materials and Methods: Paramagnetic beads (Dynal, Oslo, Norway) coated with EpCAM antibody were used for immunomagnetic enrichment of breast cancer cell line SKBR3 cells. This procedure mimics the clean up of cancer cells from any biological single cell suspension and demonstrates that the method can be applied to patient samples. Under the microscope antibody binding can be identifi ed by a corona of the magnetic beads. 23 single cells were picked with the CellEctor system and individually deposited into 5µL lysis buffer. This was immediately follo-wed by cDNA synthesis. Realtime RT-PCR was conducted for TBP (TATA box-binding protein) and/or mammaglobin. Also parallels of 2, 3, and 4 cells were picked into 5µL lysis


buffer respectively and treated with the same procedure. Results: 18 samples (78%) of the 23 single cells were po-sitive with realtime RT-PCR. Ct values varied between 34 and 44. Realtime RT-PCR of all samples containing more than 1 cell was successful. Ct values ranged from 34 to 37. Conclusions: The CellEctor is a system for the aspiration and deposition of single cells under visual control by the operator. This guarantees a 100% pure cell population. We established a simple, robust and quick method suitable for realtime PCR analysis of single cells. Our method is appli-cable to any single cell suspension including patient mate-rials such as blood, bone marrow, disaggregated lymph no-des, or malignant effusions. In about 80% of samples gene expression from a single cell could be detected without any prior amplifi cation. Using two or more cells PCR was always successful. Thus the CellEctor technology has the potential to become a break through tool making simple and stable downstream applications for single cells possible.

Copy number change and expression of cyclin E1 (CCNE1) in 201 ovarian cancer samples (fi nished)

C O L L A B O R A T O R S : Pils D Auner V Sasgary S Svoboda M1

Cacsire Castillo-Tong D Zeillinger R

1 Institut für Pathophysiologie, MUW

Frequencies of CCNE1 copy numbers in 201

advanced stage ovarian cancer tissues.

It was shown that the copy number and expression of Cyclin E (CCNE1) is predictive for survival [Farley et al. 2003, Canc. Res. 63:1235] and for chemoresistance [Etemadmoghadam et al. 2009, Clin Cancer Res 15:1417] in advanced ovarian cancer. We analysed the copy number and the expression

of CCNE1 in 201 ovarian cancer samples (177 of serous type; 9 FIGO II, 151 FIGO III, and 29 FIGO IV; 7 Grade 1, 41 Grade 2, and 138 Grade 3; 29 resistant and 162 sensitive to fi rst line chemotherapy; 151 adjuvant, 16 intraperitone-al, and 25 neoadjuvant chemotherapy). The copy number was determined by real time qPCR compared to the internal standard RNase P employing 20 ng total genomic DNA. Ex-pression was determined by qRT-PCR from 20 ng cDNA with the Assay-On-demand probe Hs00233356_m1 calibrated to the house keeping genes (ACTB, TOP1, UBC, and YWHAZ). In Figure 7, the frequencies of CCNE1 copy numbers across all 201 samples are shown. The Pearson correlation of copy number and expression was 0.542 (P = 1 x 10-16).Interestingly neither the copy number nor the expression of CCNE1 – the former dichotomized at the 75 percenti-le – had signifi cant univariate impact on overall survival or predicted resistance to chemotherapy. But corrected for all relevant clinical and histopathologic parameters a multivariable Cox regression model revealed a signifi cant better prognosis for patients with higher copy numbers (HR 0.130, P=0.009, dichotomized at the 75 percentile) and higher expression (albeit the latter only signifi cant with the 1000 bootstrap sample: HR 0.765, P=0.044).

Internationales Tumorbankprojekt TOC – Tumor Bank Ovarian Cancer

M I T A R B E I T E R : Schiebel I Grimm C Zeillinger R

Gemeinsam mit der Klinischen Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe ist die Arbeitsgruppe Partner der internationalen Tumorbank „TOC“ (tumor bank ovarian cancer). Diese Tumor-bank ist an der Charité Universitätsmedizin Berlin angesiedelt. Zum Jahr 2009 wurde Gewebeproben von 7 Patientinnen, Blutproben von 14 Patientinnen, und Aszitesproben von 7 Pati-entinnen von unserer Arbeitsgruppe eingebracht. R. Zeillinger ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von TOC.


SONSTIGE VORTR ÄGE UND PR ÄSENTATIONEN

Auner V7th International Symposium on Minimal Residual Cancer„Implementation of a single cell sorting process for real-time PCR without pre-amplifi cation“Athens, Greece, 16.09 - 19.09.2009

Cacsire Castillo-Tong D4th Workshop on Trends in Translational Cancer Research in Europe, turning knowledge into better prevention, prog-nosis and therapiesBergen, Norway, 28.09 - 29.09.2009

Eifl er RobertPhD Symposium of the Medical University of Vienna„Proof of Concept to Enrich Circulating Tumor Cells Using Leukapheresis and Elutriation“Vienna, Austria, 30.06.2009

XXXVI Annual meeting European Society for Artifi cial Organs (ESAO 2009)„Proof of Concept to Enrich Circulating Tumor Cells Using Leukapheresis and Elutriation“Compiègne, France, 02. - 05.09.2009

Obermayr E7th International Symposium on Minimal Residual Cancer„Molecular Markers for tumor cell dissemination in female cancers“ Athens, Greece 16.09 - 19.09.2009

Zeillinger RIII International Congress of Molecular Medicine (chair)Istanbul, Turkey 06. - 09.05.2009

Kick-off Meeting: Translational research networkTOC scientifi c board meetingBerlin, Germany 21. - 23.06.2009

European network for translational research in ovarian cancer (EUTROC)London, UK 16. - 18.07.2009

22nd European Congress of PathologyFlorence, Italy 05. - 10.09.2009

Vorbereitungstreffen für EU FP7 ProjekteBerlin, Germany 11. - 13.09.2009

7th International Symposium on Minimal Residual CancerAthens, Greece 16. - 20.09.2009

Vorbereitungstreffen für EU FP7 ProjekteLeipzig, Germany 25.09.2009

4th Workshop on Trends in Translational Cancer Research in Europe, turning knowledge into better prevention, prog-nosis and therapiesBergen, Norway 28. - 29.09.2009

Molecular Pathology Essentials Principals and PracticeKopenhagen, Danmark 01. - 03.10.2009

Jahrestagung der Arbeitsgemeinschaft für Gen-DiagnostikPotsdam, Germany 08. - 11.10.2009

KONGRESSORGANISATION

Cacsire Castillo-Tong D, Zeillinger RCoorganizersDrug resistance in ovarian cancerModena, Italy 19. - 20.02.2009

OrganizersOVCAD 3rd annual consortium meetingLeuven, Belgium 16. - 17.04.2009

FORTBILDUNG

Auner VMedical English Workshop IScientifi c Writing, MUWWien, 02.09. – 23.9.2009

Cacsire Castillo-Tong DBIO-NET Transnational Training„Project Development and Proposal Preparation in FP7 Food, Agriculture, and Biotechnology“ (FFG and BIO-NET)Vienna, 25. – 26.6.2009

Workshop: „Research for SME“ in 7. EU-RahmenprogrammVienna, 24.09.2009

One-day WorkshopRNA Sequencing – taking RNA studies to the next levelSOLID Traning CentreDarmstadt, Germany 10.12.2009

Pils DOne-day WorkshopRNA Sequencing – taking RNA studies to the next levelSOLID Traning CentreDarmstadt, Germany 10.12.2009


DISSERTATIONEN

Auner VeronikaMolecular markers for detection of resistance to chemotherapy.Ph.D. Studium N094Auner V, Kriegshäuser G, Tong D, Horvat R, Reinthaller A, Mustea A, Zeillinger RKras mutation analysis in ovarian samples using a high sensitivity biochip assay.BMC Cancer. 2009 Apr 9; 9:111. IF: 3.087 Eifl er RobertDevelopment and biocompatibility evaluation of a pre-enrichment system to facilitate the isolation of circulating tumor cells.Ph.D. Studium N094

Obermayr Eva (fi nished in June Juni 2009)Molecular markers for tumor cell dissemination in female cancers.Lebensmittel- u. Biotechnologie

EDITOR ( JOURNALE)

Zeillinger RThe Open Breast Cancer JournalBentham Science Publishers Ltd. (USA)

PREISE UND PATENTE

Zeillinger R, Obermayr E, Cacsire DEuropäische Patentanmeldung EP09170444 „Novel Tumor marker determination“

AUSL ANDSAUFENTHALTE

Auner VStipendium: Forskningsrådet Jänner - Juni 2009Department of Tumor BiologyRikshospitalet-Radiumhospitalet Medical CenterOslo, Norwegen

SONSTIGES

Cacsire Castillo-Tong DMitglied der Nord-Ostdeutsche Gesellschaft für Gynäkologische Onkologie (NOGGO)

Zeillinger RMITGLIED:

„TOC“ (tumor bank ovarian cancer); Charité Berlin.

(Deutschland)

für Gynäkologische Onkologie (NOGGO)

DELEGIERTER:

gie) der OEGGG (Österreichischen Gesellschaft für Gynä-kologie und Geburtshilfe) in der GIG (Gynecologic Inter Group)

GUTACHTERTÄTIGKEIT FÜR:

la recherche et de l’enseignement supérieur)


REPRODUCTIVE

BIOLOGY UNIT

W I S S E N S C H A F T L I C H E M I T A R B E I T E R :

Mag. Dr. Martin Knöfl er ao. Univ. Prof. Mag. Dr. Jürgen Pollheimer Postdoc (Drittmittel, seit 1.11.2009)Mag. Dr. Romana Schäfer Postdoc (MUW, bis 28.2.2009)Mag. Stefan Sonderegger Dissertant (Drittmittel)Dipl. Ing. Kasia Biadasiewicz Dissertantin (Drittmittel)Leila Saleh MTA(Klinik)Peter Haslinger MTA (MUW)Sandra Haider MTA (MUW, 50%)Gudrun Meinhardt MTA (MUW, 50%, seit 1.9.2009)Nicole Prutsch MTA (MUW 75%)

v.l.n.r.: Gudrun Meinhardt, Leila Saleh, Nicole Prutsch, Peter Haslinger, Ka-

tharzyna Biadasiewicz, Martin Knöfl er, Stefan Sonderegger, Sandra Haider,

Jürgen Pollheimer

Ä R Z T L I C H E M I T A R B E I T E R :

Dr. Hanns Helmer ao. Univ. Prof.Dr. Kora Hirtenlehner-Ferber ao. Univ. Prof.Dr. Ambros Huber ao. Univ. Prof.Dr. Christian Egarter ao. Univ. Prof. Dr. Lubomir Petricevic

SONSTIGE PUBLIK ATIONEN / PUBLIZIERTE ABSTR ACTS

Klein K, Mailath-Pokorny M, Haslinger P, Knöfl er M, Kautzky-Willer A, Worda CTCF7L2-polymorphism and gestational diabetesGEBURTSHILFE UND FRAUENHEILKUNDE. 2009; 69(5): 447-447. P56

Haslinger P, Sonderegger S, Otten J, Biadasiewicz K, Knöfl er MThe role of AKT isoforms in human trophoblast migrationPlacenta. 2009; 30(9) 739-822. A.35

Biadasiewicz K, Sonderegger S, Haider S, Haslinger P, Knöfl er MThe regulatory role of AP2α in human extravillous trophoblast invasionPlacenta. 2009; 30(9) 739-822. A.13

KONGRESSBESUCHE E INLADUNGEN ZU VORTRÄGEN

Knöfl er MSignaling Pathways Controlling Human Trophoblast Invasion.Plenary lecture2009 SGI Annual MeetingGlasgow, Scotland, 18.03.2009

Sonderegger SThe role of Wnt-dependent signalling cascadesin human trophoblast invasion.University of Louvain Medical School,Brussels, 13.10.2009

Sonderegger S The Human Placental Trophoblast: plasticity and controlled invasiveness.University of Veterinary Medicine Vienna,Institute for Virology and BiomedicineVienna, 09.12.2009

KONGRESSORGANISATION

Knöfl er MOrganisation und Vorsitz des IFPA Award Committees zur Auswahl des IFPA Award Winners 2009 15th IFPA meetingAdfelaide, Australia, 06. - 09.10.2009


FORTBILDUNG

Biadasiewicz KThe role of Ap2a transcription factor in normal and pathological invasion of human trophoblastsInstitut für Krebsforschung, 28.01.2009

Haslinger PThe role of Akt-proteins in trophoblast migrationInstitut für Krebsforschung, 14.01.2009

Haslinger PWorkshop RNA BasicsFortbildung für Biomedizinische AnalytikerInnenFH Campus Wien16. - 17.02.2009

Haslinger PInnovative MikroskopiertechnikenMaster-Lehrgang Biomedizinische AnalytikFH Campus Wien27.06.2009

DISSERTATIONEN

Sonderegger SThema: Wnt-signaling in early human trophoblast invasionEinreichung: Dezember 2009

Biadasiwiecz KThema: The role of AP-2 proteins in trophoblast invasionLaufend

EDITOR

Knöfl er MPlacentaEditorial Board Membership (IF 2,775) IFnorm: 8,325

PREISE

Biadasiewicz KThe Y. W. Loke New Investigator Travel Award 200913th Meeting of the International Federation of Placental Associations Adelaide, Australien, 06.10 - 09.10.2009

SONSTIGES

Knöfl er MAdminstrative Leitung der Forschungsfl ächen der UFK

Koordination und Supervision der Reproductive Biology Groups der UFK

Beauftragter für biologische Sicherheit der UFK, Ablage von Checklisten für das gentechnische Arbeiten der einzelnen Forschungsgruppen der Klinik

Reviewing Tätigkeit:

th IFPA meeting

Mitglied der Österreichischen Biochemischen Gesellschaft, der European Placental Group, der International Federation of Placental Association (IFPA), des IFPA Award Commit-tees und des Editorial Boards des Journals Placenta (Verlag Elsevier)

Chairman des IFPA Award Committees

Auschreibung und Auswahl des jährlichen Gewinnersdes weltweit größten Placenta-Awards

Betreuung von Mediziner Diplomarbeiten im neuen Curriculum, laufend

The role of AKT signalling in invasive trophoblastsEinreichung: November 2009

Growth-factor mediated regulation of the uPA/uPAR/PAI system in human trophoblast


Evaluation of Tert-transformed human endometrial stromal cells as a model for in vitro decidualization

toren der normalen und pathologischen Trophoblastenin-vasion: mmunhistochemische Untersuchung von Placen-ta accreta, increta und percreta

Haslinger PBetreung des Praktikum für Studierende der Akademie für den medizinisch technischen Laboratoriumsdienst (Biome-dizinische Analytik): Parapatics Katja 04.05. - 19.06.2009

Akademische Weiterbildung, berufsbegleitend

Nicole PrutschMaster-Lehrgang Biomedizinische Analytik (2008-2010)FH-Campus Wien

Leila SalehMaster-Lehrgang Biomedizinische Analytik (2008-2010)FH-Campus Wien

Haslinger PDiplomstudium VeterinärmedizinVeterinärmedizinische Universität Wien

Sandra HaiderMolekularbiologie, UNI Wien

Gudrun MeinhardtMolekularbiologie, UNI Wien

WISSENSCHAF TLICHEPROJEKTE

Regulatory factors controlling extravillous trophoblast differentiationIn diesem durch den Fonds zur Förderung der wissen-schaftlichen Forschung unterstützten Projekt P17894-B14 untersuchten wir die Funktion verschiedener Genen, ins-besondere die Rolle von WNT Liganden, in der invasiven Differenzierung des humanen Trophoblasten.

Mitarbeiter:

Sonderegger S, Meinhardt G, Knöfl er M

Kurzbeschreibung

WNT, wingless, sind soluble Moleküle, die eine wichtige Funktion bei der embryonalen Entwicklung aber auch Tu-

morgenese spielen. WNT Proteine üben ihre Funktion durch ß-catenin-mediierte Aktivierung von LEF-1/TCF-Faktoren im Kern von Zielzellen aus. In unserer ersten Arbeit zur dieser Thematik konnte J. Pollheimer zeigen, dass die Aktivierung des kanonischen WNT Signaltransduktionsweges zu einer vermehrten Invasion von Trophoblasten führt und dass es bei Molenschwangerschaften, die durch Hyperproliferation und Invasion gekennzeichnet sind, zur verstärkten Aktivie-rung des WNT Pathways kommt (Pollheimer et al., 2006). Im Rahmen seiner Dissertationen untersuchte nun S. Son-dergger die Expression und Verteilung aller WNT Liganden sowie deren Rezeptoren (Proteine der Frizzled, FZD, Familie) in der Plazenta und den verschiedenen trophoblastären Mo-dellsystemen (Sonderegger et al., 2007). Er konnte weiters feststellen, dass bestimmte WNT Liganden der Plazenta das kanonische WNT signalling antagonisieren können. Weiters wurde der Mechanismus der WNT-abhängigen Aktivierung von AKT und die Mechanismen der WNT-vermittelten Invasi-on studiert. Es konnte gezeigt werden, dass WNT-3A durch 2 unabhängige Signalwege (kanonisches WNT signalling und AKT) zur Induktion der MMP-2 führt, die duch Abbau von Matrix eine wichtige Rolle in der Trophoblasteninvasion spielt (Sonderegger et al., 2008). G. Meinhardt widmet sich der spezifi schen Rolle des TCF-4 mittels shRNAmir-mediierten knock-down und Chromatin-IP, um letztlich alle Zielgene des kanonischen WNT signallings in Trophoblasten zu identifi zie-ren. Im Rahmen dieses Projektes wurden auch ausgedehnte DNA chip Analysen durchgeführt um neue Gene, die Tropho-blasteninvasion regulieren, zu bestimmen. In Kollaboration mit dem KIMCL (M. Bilban) wurden die Genexpressionspro-fi le sämtlicher trophoblastärer Modellsysteme miteinander verglichen, und eine bestimmtes Gen, Hämoxygenase-1 (HO-1), das während der Trophoblasteninvasion abgeschal-ten wird, mittels funktioneller Studien charakterisiert. Es zeigte sich, dass die mittels induzierbarem TET-ON System überexprimierte HO-1 zu vermehrter Proliferation und abge-schwächter Invasion führt (Bilban et al., 2008).

Pollheimer J, Loregger T, Sonderegger S, Saleh L, Bauer S, Bilban M, Czerwenka K, Husslein P, Knöfl er MActivation of the Canonical Wingless (Wnt) / T-cell factor (TCF) Signalling Pathway promotes Invasive Differentiation of Human Trophoblast. Am J Pathol. 2006 168(4): 1134-47

Sonderegger S, Husslein H, Leisser C, Knöfl er MComplex Expression Pattern of Wnt Ligands and Frizzled Receptors in Human Placenta and its Trophoblast Sub-types. Placenta. 2007 28: S. 97-102.

Sonderegger S, Sabri A, Leisser C, Knöfl er MWNT controls MMP-2 expression through the canonical WNT pathway and AKT signaling in invasive human tropho-blast. Endocrinology. 2010 Jan; 151(1): 211-20.

Bilban M, Haslinger P, Prast J, Klinglmüller F, Woelfel T, Hai-der S, Otterbein L, Desoye G, Hiden U, Wagner O, Knöfl er M


Gene expression profi ling and functional studies identify heme oxygenase-1 as a novel regulator of invasive tro-phoblast differentiation. Endocrinology. 2009 Feb; 150(2): 1000-13.

The role of AKT signalling in invasive trophoblast differentiation of the human placentaIn diesem von der Herzfelderschen Familienstiftung geför-derten Projekt (APP00323OFF) untersuchen wir die Rolle von Akt Proteinen während der invasiven Trophoblastendif-ferenzierung.

Mitarbeiter:

Haslinger P, Sonderegger S, Knöfl er M

Kurzbeschreibung

AKT Proteine spielen eine wichtige Rolle bei Überlebens-fähigkeit, Adhäsion und Migrationsverhalten von Zellen. Frühere Publikationen weisen darauf hin, dass Wachstums-faktoren, die die Invasivität des Trophoblasten erhöhen, etwa EGF oder IGF-II, ihre Wirkung via Phosphorylierung und Aktivierung von AKT entfalten. Die Bedeutung der ver-schiedenen AKT Isoformen (AKT1,2,3) ist jedoch unklar. Bislang haben wir daher die Expression der verschiedenen AKT Proteine in den unterschiedlichen Trophoblast-Modell-systemen festgelegt. Um zunächst die funktionelle Rolle der AKT Isoformen zu studieren wurde mittels shRNA die Expression von AKT1,2,3 in Zellkultur ausgeschalten. Wir studieren im Moment die Eigenschaften dieser AKT-nega-tiven Zellen bezüglich Proliferation, Migration und Apopto-se. Erste Ergebnisse zeigen, dass die Isoformen AKT1 und AKT3 eine wichtige Rolle in der EGF-vermittelten Tropho-blastenmigration besitzen. AKT3 scheint zusätzlich Effekte auf die Proliferation der Zellen auszuüben.

Analyses of critical regulators involved in invasive trophoblast differentiationIn diesem vom Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung gefördertern Projekt (375-B13, Herta Firnberg Nachwuchsstelle) untersuchen wir die Mechanismen der partiellen, epithelialen zur mesenchymalen Umwandlung (EMT) des invasiven Trophoblasten zu Grunde liegen.

Mitarbeiter:

Leisser C, Knöfl er M

Kurzbeschreibung

EMT ist ein kritischer Prozess in der Embryonalentwicklung sowie bei Tumorgenese. Epitheliale Zellen nehmen hier-bei mesenchymale Eigenschaften an, die ihnen erlauben Zell-Zell Kontakte zu minimieren und die Invasion in die umgebende extrazelluläre Matrix zu erhöhen. Unser Labor

hat seit langem Hinweise, dass der Prozess der EMT bei Trophoblasteninvasion teilweise vollzogen wird, molekulare Details sind hierzu allerdings kaum bekannt. Im Rahmen erster Untersuchungen konnten wir feststellen, dass kri-tische Regulatoren der EMT, wie der Transkriptionsfaktor Snail, während der Differenzierung spezifi sch in die Zellker-ne invasiver Trophoblasten rekrutiert wird. Auf Basis dieser preliminären Experimente wurde nun einen Herta-Firnberg Nachwuchsstelle für C. Leisser im Labor etabliert, die er-laubt detaillierte molekulare Studien zur EMT des Tropho-blasten durchzuführen. So sollen beispielsweise verschie-dene dominant-positive und negative Snail-Proteine in den verschiedenen trophoblastären Modellsystemen exprimiert werden und die Auswirkung auf EMT, Proliferation und In-vasion getestet werden.

The role of AP-2 factors in normal and pathological trophoblast invasion of the human placentaIn diesem von der Nationalbank (P-12487) geförderten Pro-jekt untersuchen wir die Rolle des Transkriptionsfaktors AP-2 in der invasiven Differenzierung des humanen Tropho-blasten.

Mitarbeiter:

Biadasiewcz K, Sonderegger S, Knöfl er M

Kurzbeschreibung

Die Proteine AP-2α, β und g spielen eine wichtige Rolle bei der Hormonproduktion des Synzytiotrophoblasten. In vor-angegangenen Arbeiten konnten wir zeigen, dass vor allem AP-2α für die koordinierte Produktion der beiden Unterein-heiten des hCG, hCGα und hCGβ verantwortlich ist (Knöfl er et al., 2000; Knöfl er et al., 2004). Immunhistochemische Untersuchungen zeigten allerdings auch, dass alle 3 Pro-teine in invasiven Trophoblasten produziert werden. Dies lässt auch zusätzlich Funktion in der Trophoblasteninvasi-on schließen. Zurzeit studiert K. Biadasiewicz im Rahmen ihrer Dissertation die Effekte des siRNA-mediierten knock-downs der AP-2α mRNA Expression in verschiedenen Tro-phoblastenmodellsystemen, um optimale Voraussetzungen für weitere funktionelle Studien zu etablieren. Sie konnte bislang zeigen, dass AP-2α-defi ziente Trophoblasten weni-ger stark migrieren, vor allem unter EGF Stimulation. Real-time PCR Daten zeigten weiters, dass kritische Gene der Invasion wie hCG oder MMP-2 in knock-down Zellen weni-ger stark produziert werden.

Knöfl er M, Saleh L, Bauer S, Vasicek R, Griesinger G, Strohmer H, Helmer H, Husslein PPromoter-Elements and Transcription Factors involved in Differentiation-dependent Human Chorionic Gonadotro-phin-a mRNA Expression of Term Villous Trophoblasts. En-docrinology. 2000; 141: 3737-48


Knöfl er M, Saleh L, Bauer S, Galos B, Rotheneder H, Husslein P, Helmer (2004) Transcriptional Regulation of the Human Chorionic Gonadotrophin {beta} Gene during Villous Trophoblast Dif-ferentiation. Endocrinology. 2004; 145: 1685-1694.

Expression und Funktion des Kollagen XVIII / Endostatin im humanen TrophoblastenIn diesem von der Nationalbank (P-11772) geförderten Pro-jekt untersuchen wir die Rolle des Kollagen XVIII / Endo-statin bei Präeklampsie und während der Trophoblastendif-ferenzierung.

Mitarbeiter:

Pollheimer J, Haider S, Hirtenlehner-Ferber K, Knöfl er M

Kurzbeschreibung

Endostatin ist das C-terminale Spaltprodukt von Kollagen XVIII und wurde als potenter Inhibitor des Angiogenese und des Tumorwachstums beschrieben. Wir fanden in diesem Projekt, dass Kollagen XVIII in großen Mengen in den Pla-zentazotten sowie in der Dezidua produziert wird. Interes-santerweise konnten wir auch eine lokale Produktion des Angiogenese-inhibitors Endostatin in der Dezidua feststel-len (Pollheimer et al., 2004). Da dieses Spaltprodukt von Kollagen XVIII Migration und Invasion von Zellen hemmt, kommt es als potentieller Regulator der Trophoblastenin-vasion in Frage. In seiner Dissertation zur Erlangung des PhD untersuchte J. Pollheimer die veränderte Migration des Trophoblasten auf molekularer und zellbiologischer Ebene. Hierzu wurden Methodiken der RT-PCR, Western blotting, Immunhistochemie sowie funktionelle Experimente in den verschiedenen Trophoblastenzellsystemen (Explan-tatsystem, isolierte Trophoblasten, trophoblast-ähnliche Zellinien) durchgeführt. Er konnte zeigen, dass Endostatin die Invasion des Trophoblasten dosis-abhängig reprimiert sowie die Insulin-like growth factor (IGF)-abhängige Inva-sion hemmt. Die Blockierung der migrations-assoziierten Kinase Akt dürfte dabei eine Schlüsselrolle spielen (Poll-heimer et al., 2008). Außerdem wird Endostatin durch Trophoblasten-spezifi sche Proteasen vom Kollagen XVIII abgespalten (Pollheimer et al, 2005). Hierbei dürften vor allem die Matrix-Metalloproteinasen 2,3, und 9 eine Rolle spielen. Zusätzlich könnten veränderte Serumspiegel von Endostatin bei der Pathogenese der Präeklampsie beteiligt sein. Wir konnten bereits zeigen, dass Endostatin tatsäch-lich vermehrt im Serum von präeklamptischen Patientinnen auftritt (Hirtenlehner et al., 2003).

Hirtenlehner K, Pollheimer J, Lichtenberger C, Wolschek M F, Zeisler H, Husslein P, Knöfl er MElevated Serum Concentrations of the Angiogenesis Inhi-bitor Endostatin in Preeclamptic Women. J Soc Gynecol Investig 2003, 10: 412-417

Pollheimer J, Bauer S, Huber A, Husslein P, Aplin J D, Knöfl er MExpression Pattern of Collagen XVIII and its Cleavage Pro-duct, the Angiogenesis Inhibitor Endostatin, at the Fetal-Maternal Interface. Placenta 2004, 25: 770-9. Pollheimer J, Husslein P and Knöfl er MInvasive trophoblasts generate regulatory Collagen XVIII cleavage products. Placenta 2005 26 Suppl A: S. 42-5

Pollheimer J, Prast J, Knöfl er MEndostatin impairs trophoblast migration and invasion by inhibiting Akt signalling. 2008, in preparation

Die mögliche therapeutische Wirkung des humanen Chorion Gonadotrophin (hCG) in der EndometrioseIn diesem Projekt untersuchen wir die biologischen Effekte des Schwangerschaftshormons hCG auf endometriotische Zellen.

Mitarbeiter: Saleh L, Huber A, Knöfl er M

Kurzbeschreibung

Jüngste klinische Daten wiesen darauf hin, dass die Behand-lung von endometriotischen Frauen mit hCG zu einer ver-besserten Schmerzsymptomatik führt (Huber et al., 2004) In diesem Projekt studieren wir daher in vitro die möglichen therapeutischen Effekte des hCG auf stromale Zellen, die aus endometriotischen Läsionen und Zysten gewonnen wurden. Bislang konnten wir zeigen, dass hCG die Entzündungs-ab-hängige Aktivierung des infl ammatorischen Transkriptionsfak-tors NFkappaB und die damit verbundene mRNA Produktion und Freisetzung bestimmter Zytokine wie TNF oder IL-1 redu-ziert (Huber et al., 2007). Vorbehandlung endometriotischer Zellen mit hCG blockiert nach Stimulierung der Kulturen mit Zytokinen den Abbau des Inhibitors IkappaB-alpha und damit die Translokation und Aktivierung von NFkappaB im Zellkern. Die therapeutischen Effekte des hCG könnten daher zumin-dest teilweise auf die anti-infl ammatorische Wirkung des hCG zurückzuführen sein. Zurzeit studiert L. Saleh die Effekte des hCG auf die Expression des Monocyte chemotactic protein -1 (MCP-1), das eine Rolle bei der Rekrutierung von Monozyten und in der Aufrechterhaltung der Endometriose spielt.

Huber AV, Huber JC, Kolbus A, Imhof M, Nagele F,Loizou D, Kaufmann U, Singer CFSystemic HCG treatment in patients with endometriosis: a new perspective for a painful disease. Wien Klin. Wochen-schr. 2004 Dec 30; 116(24): 839-43.

Huber AV, Saleh L, Prast J, Haslinger P, Knöfl er MHuman chorionic gonadotrophin attenuates NFкB activati-on and cytokine expression of endometriotic stromal cells. Mol Hum Reprod. 2007 Aug; 13(8): 595-604.


Die Funktion des Notch Signalling bei der TrophoblasteninvasionIn diesem Projekt untersuchen wir die Funktion des Notch signalling in der Regulation der Trophoblasteninvasion.

Mitarbeiter:

Haider S, Knöfl er M

Notch signalling ist ein wichtiger Signalweg, der Entwick-lung, Differenzierung und Wachstum der Zellen steuert. S. Haider konnte zeigen, dass mehrere Notch Rezeptoren sowie entsprechende Notch Liganden in der humanen Plazenta produziert werden. Eine Blockierung des Notch Signallings mittels chemischer Inhibition erhöhte die Tro-phoblasteninvasion mit nur geringen Effekten auf das Wachstum. In Folge gilt es die genaue Funktion der ein-zelnen Rezeptoren und Liganden festzulegen sowie Notch signalling in primären Trophoblastenzellen zu manipulieren. Das Projekt liegt zur Zeit zur Begutachtung beim FWF.

Die Rolle des hCG in der LymphangiogeneseIn diesem Projekt untersuchen wir den Einfl uss von hCG auf die Lymphangiogenese während der Frühschwangerschaft.

Mitarbeiter:

Haslinger P, Knöfl er M

Kurzbeschreibung:

Das Trophoblastenhormon human chorionic gonadotropin (hCG) hat eine Vielzahl von Funktionen im menschlichen Uterus. Unter anderem wurde gezeigt, dass hCG in den Pro-zess der Angiogenese involviert ist. hCG kann in HUVECs, Endothelzellen aus dem Endometrium und der Plazenta An-giogenese induzieren. Der funktionelle Rezeptor des hCGs, der LH-Rezeptor, wird auf den uterine Endothelzellen expri-miert, somit kann das hCG direkt auf das Migrationsverhal-ten und der in vitro Tube Formation einwirken. Zusätzlich wurde in in vivo Experimenten nachgewiesen, dass hCG die Expression des Vascular Endothelial Growth Factors (VEGF) in den Endometriumszellen und/oder in den Trophoblasten anschaltet. Aber nicht nur das Blutgefäßsystem unterläuft einem Remodeling-Prozess sondern auch das Lymphgefäß-system wird während der Schwangerschaft massiv im Pla-zentabett induziert . Wir konnten in den ersten Experimenten einen positiven Einfl uss von hCG auf das Migrationsverhalten und in vitro Tube Formation von primären lymphatischen Endothelzellen (LEC) feststellen, sowie zeigen, dass der LH-Rezeptor in primären LECs exprimiert wird. Auf Basis dieser Ergebnisse soll nun genauer beschrieben werden, wie die Lymphangiogenese durch hCG beeinfl usst wird. Dazu wer-den mittels siRNA-Technologie die beiden Rezeptoren (für hCG und VEGF) reprimiert bzw. wird mittels phospho-spe-zifi schen Antikörpern die Aktivierung der entsprechenden Signalkaskaden überprüft. Der biologische Nachweis wird mittels etablierter Angiogenese-Assays durchgeführt.


GYNÄKOLOGISCHE

ENDOKRINOLOGIE

L E I T U N G

ao. Univ. Prof. Mag. Dr. Christian Schneeberger Univ. Doz. Dr. Andrea Kolbus Dr. Iveta Yotova

M I T A R B E I T E R

ao. Univ. Prof. Dr. Walter TschugguelMag. Dr. Mario MairhoferDr. Ping QuanDr. Aulona GabaUlrike BeerMichela ParthBarbara WidmarLadislaus Szabo

L AUFENDE PROJEKTE (RUNNING PROJECTS)

EU-PROJEKT CRYSTAL

Das von der EU im 6. Rahmenprogramm geförderte For-schungsprojekt CRYSTAL (Cryopreservation of Stem Cells for Therapeutical Application) wurde 2009 weitergeführt und läuft noch bis 31. Jänner 2010. Im Rahmen dieses Pro-jektes werden neue Methoden zur Qualitätskontrolle von Stammzellen etabliert und der Prozess der Kryokonservie-

rung von verschiedenen Stammzelltypen optimiert. An der Universitätsklinik für Frauenheilkunde liegt der Schwer-punkt auf hämatopoietischen Vorläuferzellen, die aus Na-belschnurblut isoliert werden. Standardisierte Protokolle für die Serum-freie Expansion von erythroiden Vorstufen und unreiferen, multi-potenten Zellen wurden entwickelt.

Scanning electron microscopy image of an erythroid progenitor cell. Please

note the rough surface with villous structures. SEM analysis was performed

by CRYSTAL partner IBMT.


Erythroid progenitor cells were expanded from 4 different cord blood sam-

ples and stained at day 14 post isolation.

Mit Hilfe dieser Protokolle wird der Einfl uss von Kurzzeit- und Langzeit-Kryokonservierung auf Viabilität, Proliferation und Differenzierung der Stammzellen untersucht. Das gut charakterisierte erythroide Kulturmodell wird auch ver-wendet, um Serum-freie Einfriermedien zu testen und die Einsatzmöglichkeiten für therapeutische Anwendungen zu untersuchen. Weitere Informationen sind unter www.crys-tal.eu zu fi nden.

M I T A R B E I T E R :

Kolbus A, Mairhofer M, Beer U, ParthM

EU-PROJEKT HYPERLAB

HIGH YIELD AND

PERFORMANCE

STEM CELL LAB

Das von der EU im 7. Rahmenprogramm geförderte For-schungsprojekt HYPERLAB (High Yield and Performance Stem Cell Lab, FP7 - 223011) wurde im September 2009 gestartet. Der Schwerpunkt dieses Projektes liegt auf der Optimierung von gegenwärtigen Stammzell-Kultivierungs-methoden. Innovative neue Techniken (Pipet Robots, Pipe-Based Bioreactors) werden an die besonderen Anforde-

rungen der Stammzell-Kultivierung adaptiert und sollen so den Arbeitsaufwand für die Kultivierung reduzieren und ein High-Throughput-Screening von unterschiedlichen Medien und Wachstumsfaktoren ermöglichen. An der Universitäts-klinik für Frauenheilkunde sollen in Zusammenarbeit mit den Projektpartnern bestehende Protokolle zur Expansion von CD34-positiven hämatopoietischen Stammzellen aus Nabelschnurblut etabliert und verbessert werden. Weitere Informationen sind unter www.hyperlab.eu zu fi nden.


Kolbus A, Mairhofer M

Endometriosis, a Sequel Diseased Eutopic Endometrium(Endometriose, eine Folge kranken eutopen Endometriums)

Endometriosis is a common benign estrogen dependent chronic gynecological disorder associated with pelvic pain and infertility. It is characterized by the presence of uteri-ne endometrial tissue outside of normal environment. The prevalence of pelvic endometriosis approaches 6–10% of general female population in the reproductive age. How ute-rine endometrial tissue following retrograde menstruation is able to migrate towards and to invade extrauterine sites is presently unclear. However, signalling pathways involved in regulation of proliferation and migration can be differentially regulated in ectopic lesions and eutiopic endometrium from patients with endometriosis, compared to the control he-althy population. As a model system we use primary cultures of stromal-epithelial cells obtained from tissue samples iso-lated from healthy women and patients with endometriosis from eutopic sites (uterus) and ectopic lesions (ovary).

Immunofl uorescence staining of primary endometrial cell cultures for a

stromal cell marker (Vimentin, red), an epithelial cell markers (Cytocera-

tin7, green) and DAPI (blue)

Immunofl uorescence staining of primary endometrial cell cultures for the

focal adhesion protein Paxilin (green) and F-Actin/Phalloidin (red)


The project aims to investigate the molecular mechanisms involved in the establishment of endometriosis and in par-ticular:i) Regulation of cell migration and the role

of Raf-1/ROCKII signalling pathway.ii) To analyze the role of MAPK pathway,

as regulator of cell proliferation in endometriosisiii) To investigate the role of Raf-1/ROCKII signalling

pathway in regulation of cell proliferationin our in vitro cell system


Yotova I, Quan P, Beer U, Tschugguel W

The role of Dexamethasone-regulated genes in human erythropoiesis.

Glucocorticoide werden in der Klinik häufi g zur Behandlung von sogenannten aplastischen Anämien eingesetzt. Als Wirkungs-mechanismus wird meist die Immunsuppression angenommen, die zu einer Normalisierung der Blutbildung beiträgt. Neuere Forschungsergebnisse zeigen aber, dass Glucocorticoide in vitro direkt auf erythroide Zellen wirken und deren Prolifera-tion anregen und die terminale Differenzierung hemmen. Bei der Analyse der Auswirkungen des Glucocorticoides Dexame-thason auf die Genexpression von erythroiden Vorläuferzellen der Maus wurden Gene identifi ziert, die entweder nur durch Dexamethason reguliert werden oder die komplexer Regulation durch die Kombination der Wachstumsfaktoren Erythropoietin und Stem Cell Factor (SCF) mit Dexamethason unterliegen (A. Kolbus, M. vonLindern, H. Beug, unpublished data). In Pilot-studien konnte für eine Auswahl dieser Gene gezeigt werden, dass sie in humanen erythroiden Zellen aus Nabelschnurblut gleichartig reguliert werden wie in den Maus-Zellen. Im Rahmen der Diplomarbeit von Michela Parth soll nun die Bedeutung einer ersten Auswahl dieser Dexamethason-regulierten Gene durch siRNA-vermittelten knock-down untersucht werden. Zur Transfektion der Primärzellen verwenden wir die Elektroporati-onsmethode. Eine komplementäre Methode zur Überexpressi-on von einzelnen Genen ist zurzeit in Entwicklung.


Parth M, Mairhofer M, Kolbus A

The raf-1 kinase in human erythropoiesis.

Aus dem Mausmodell ist bekannt, dass die Kinase raf-1 die Balance zwischen Proliferation und Differenzierung von erythroiden Vorläuferzellen reguliert. Eine analoge Funktion in humanen Zellen wird deshalb vorausgesetzt, Daten dazu

sind allerdings noch nicht vorhanden. Die Entwicklung ei-nes erythroiden Primärkultursystems aus Nabelschnurblut in Kombination mit einer kürzlich etablierten, effi zienten vi-ralen Transduktionsmethoden ermöglicht uns, die Funktion von raf-1 in humanen Zellen zu analysieren.

Terminal differentiation of erythroid progenitor cells in vitro. Expanded ery-

throid cells were terminally differentiated, and aliquots were stained at the

indicated time-points. Brown colour indicates hemoglobinized cells.

Erste Ergebnisse für den knock-down von raf-1 in primären, humanen Erythroblasten zeigen einen ähnlichen Phänotyp zur raf-1 knock-out-Maus. Die etablierten Methoden zur Herstel-lung von shRNA-Vektoren, zur Produktion, Konzentrierung und Titerbestimmung der Lentiviren sollen in weiterer Folge auch für andere Gene, die in der Erythropoiese eine Rolle spielen, angewandt werden. Als Ergänzung zu den oben beschriebe-nen viralen Transduktionsmethoden steht seit kurzer Zeit auch die Methode der siRNA-Elektroporation zur Verfügung.

M I T A R B E I T E R

Mairhofer M, Parth M, Kolbus A

Changes in OCT-4 methylation pattern in Endometriosis.

This project aims to investigate the role of OCT-4 in the establishment of endometriosis. Oct-4 expression was pre-viously reported in the tissue samples from normal endo-metrium. Preliminary data show higher expression in the endometriotic tissue from eutopic and ectopic sites, howe-ver the mechanism of Oct-4 activation is still not clear. The-refore, we will focus on epigenetic mechanisms of Oct-4 regulation and in particular we will investigate the changes in gene methylation and its correlation with the disease.


Yotova I, Mairhofer M, Beer U, Szabo L

Non-genomic effects of estrogen in endometrial stromal cell lines and primary cultures.

The aim of the project is to clarify the function of the non-genomic estrogen action in pathogenesis of endometrio-sis. In particular our goal is:


i) To identify signal transduction pathways regulatedby fast estrogen receptors-mediated signals

ii) To specify estrogen receprors subtypes (classical and non-classical) involved in this regulations.

iii) To provide the molecular mechanisms involved inthe non-genomic estrogen action.


Yotova I, Mairhofer M, Widmar B, Szabo L

Effect of sex steroids on human microvascular endothelial cells (HUMEC),isolated from myometrium.

Angiogenesis, the production of new blood vessels from pre-existing endothelium is subject to a complex control system with proangiogenic and antiangiogenic factors. This process is an important factor in several pathologi-cal processes such as tumor growth, diabetic retinopathy, psoriasis as well as endometriosis. Our project aims to in-vestigate, whether endothelial aromatase is an autocrine inducer of human utherine microvascular endothelial cell proliferation. HUMEC as model for small vessels to compa-re basal and testosterone stimulated expression of aroma-tase, local estradiol production and to reveal its potential implications on cell proliferation are used. In addition to the testosterone associated autocrine estradiol production and action in vascular cells, testosterone may directly take place in the regulation of microvacularization via its cog-nate receptor. However, no information is available about testosterone effects on HUMEC from female reproductive tact. Therefore, we will examine the direct effects of the hormone on HUMEC cell proliferation.


Yotova I, Gaba A, Widmar B

VORTR ÄGE UNDPR ÄSENTATIONENOral presentations

Mairhofer MCord blood: A source of hematopoietic stem /progenitor cells for basic research and therapyInvited Seminar3. November 2009, University of Udine, Italien

Mairhofer M, Kolbus AWP 4 Validation of Banked CellsCRYSTAL Consortium Meeting29. Mai 2009, Wien

Mairhofer M, Kolbus ACulture & quality control of haematopoietic cells on the example of erythroid progenitor cells CRYSTAL Satellite workshop during the 4th Annual Conference of the German Society forStem Cell Research (GSZ), 24. November 2009, Hannover, Deutschland

Kolbus APartner Presentation Medical University of ViennaHYPERLAB Kick-Off Meeting21. Oktober 2009, St. Ingbert, Deutschland

POSTER PRESENTATIONS

Mairhofer M, Beer U, Schulz J, Wouters G, Zimmermann H, Kolbus AValidation of cord blood cells after cryopreservationCRYSTAL Satellite workshop during the 4th Annual Conference of the German Society forStem Cell Research (GSZ), 25. November 2009, Hannover, Deutschland

Yotova I, Bergner O, Quan P, Tschugguel WEndometriosis – The Loss of Control in proliferation Signaling Pathways56th SGI Annual Meeting17. - 21.März 2009, Glasgow, Scotland

Yotova I, Bergner O, Quan P, Tschugguel WCell migration in Endometriosis. Role of Raf-1/ROCKII Signaling Pathway.56th SGI Annual Meeting17. - 21.März 2009, Glasgow, Scotland


Gaba A, Yotova I, Tschugguel W, Ditrich WEffect of Testosteron in Human Uterine Endothelial Microvascular cells. MUW PhD symposium16. - 17. Juni 2009, Wien

Quan P, Szabo L, Tschugguel W, Yotova I Non-genomic effects of estrogen on endometriosis.EMBO conference on nuclear receptors25. - 29. September 2009, Dubrovnik, Croatia

FORTBILDUNG

Schneeberger C Genetik und Krankheitsentstehung: Molekularbiologische & Biochemische GrundlagenMasterstudiengang Präventionsmedizin (Dresden International University)17. Oktober 2009, Dresden, Deutschland

PREISE UND PATENTE

PR IZE 2008Das Austria Wirtschaftsservice (AWS) vergab im Auftrag des Bundesministeriums für Wirtschaft, Familie und Jugend (BM-WFJ) Preise für zwölf anwendungsnahe Forschungsprojekte österreichischer Universitäten mit insgesamt rund 1.000.000 EUR Fördermittel. Unter dem Motto „Vom Reißbrett zum Produkt“ konnten die Forscher/innen damit Prototypen herstellen. Die Auszeichnungen wurden am Abend des 26. Februars 2009 vom Bundesminister für Wissenschaft und Forschung, Johannes Hahn, überreicht. Mit vier prämierten Projekten ist die Medizinische Universität Wien (MUW) klarer Spitzenreiter bei PRIZE 2008. Auf den Plätzen folgen TU Graz und Uni Linz mit jeweils zwei Projekten; die BOKU Wien, Uni Innsbruck, Kunstuni Linz und die Montanuniversität Leoben haben je ein Projekt. Insgesamt wurden in den Jahren 2007 und 2008 sieben Projekte der MUW prämiert. Unter diesen sieben Projekten wurde das Forschungsprojekts „Endometriose-detektionskit„ der Universitätsklinik für Frau-enheilkunde mit 80.000 prämiert. Das Projekt entstand aus einer Zusammenarbeit der Erfi nder Walter Tschugguel, Cristina Rubiolo, Ljubomir Paucz, und Andrea Kolbus. Mit-tels der Fördersumme konnte eine Zusammenarbeit mit der Firma Emergentec hergestellt werden. woraus die gegen-wärtig durchgeführte wissenschaftliche Untersuchung der Frage resultiert, ob im Menstrualblut spezifi sche Endometrio-semarker vorliegen. Die an der Rekrutierung von Patientinnen gemeinsam mit den MUW-Diplomandinnen Almira Kovacevic und Kathrin Lindner beteiligten Kolleginnen und Kollegen der Frauenklinik, die von Iveta Yotova geleitete Endometriose-Forschungsgruppe sowie die logistische und materielle Unter-stützung durch die Firma Emergentec ermöglichen in enger Zusammenarbeit mit der Abteilung für Forschungssupport an der MUW die gegenwärtige Umsetzung des Projekts.

Univ. Doz. Dr. Andrea Kolbus (3. von links)


SONSTIGES

Aufbau eines Qualitätsmanagmentsystems nach EN-ISO 9001:2008 in den Forschungslaborato-rium der Universitätsklinik für Frauenheilkunde

L E I T U N G :

ao. Univ. Prof. Mag. Dr. Christian SchneebergerQualitätsbeauftragter

Im Rahmen der Gesamtzertifi zierung des Allgemeinen Kran-kenhauses Wien und damit verbundener Teile der Medizini-schen Universität Wien wurde im Mai 2009 im gesamten Forschungslaboratorium 5Q der Universitätsklinik für Frau-enheilkunde unter der Leitung von ao. Univ. Prof. Mag. Dr. Christian Schneeberger mit dem Aufbau eines Qualitäts-management-Systems nach der Norm EN-ISO 9001:2008 begonnen. Bis zum Zertifi zierungsaudit am 25. August 2009 entstanden in hervorragender Teamarbeit über 40 QM-Doku-mente und ein QM-System, das zum Auditzeitpunkt bereits gelebt wurde und von den Auditoren mit lobenden Worten bewertet wurde. Das große Ziel der Zertifi zierung nach EN-ISO 9001:2008 konnte mit Bravour erreicht werden. Dr. Christian Schneeberger absolvierte außerdem die Ausbildung zum Qualitätsbeauftragten im Gesundheitswesen (QBfKMU; WIFI Wien, 27.10. -11.12.2009 (80 Lehreinheiten))

Prozesslandschaft des Forschungslaboratoriums 5Q der Universitätsklinik

für Frauenheilkunde


ONCOGENOMICS

L E I T E R :

Univ. Prof. Mag. Dr. Martin SCHREIBER

M T A :

Erika MARTON

D I S S E R T A N T I N :

Katharina TOMEK

SONSTIGE VORTR ÄGE UND PR ÄSENTATIONEN

Micro-RNAs, Micro-Arrays and Breast CancerJahrestagung der ÖGMBTInnsbruck, 20. - 23.09.2009

DISSERTATION

Tomek KTowards improving the sensitivity and specifi city ofp53 diagnosis in human breast cancer

RIGOROSEN (Defensio von Dissertat ionen )

Valiahdi S MActivity and cellular effects of the investigational drug KP46 in primary culture and cell lines of malignant melanomaPrüfungssenat: Sexl V, Schreiber M, Keppler BMedizinische Universität Wien10.06.2009

SONSTIGES

Schreiber M

Sicherheitsvertrauenspersonfür die Forschungsfl ächen der Frauenklinik

Berichterstatter des wissenschaftlichen Ausschusses der Gentechnikkommission für Genanalyse und Gentherapie am Menschen, Bundesministerium für Gesundheit und Frauen

Mitglied des wissenschaftlichen Ausschusses der Gentech-nikkommission für Arbeiten mit GVO im geschlossenen System, Bundesministerium für Gesundheit und Frauen

DissertationsbetreuungMag Katharina TomekThema: Towards improving the sensitivity and specifi city of p53 diagnosis in human breast cancer

Reviewer für BBA Molecular Cell Research, Blood, EMBO Journal, Growth Factors, Journal of Pathology, Mol Cell Biol, Oncogene

Mitglied der Österreichischen Gesellschaft für Molekulare Biowissenschaften und Biotechnologie (ÖGMBT)

Documents

LABOR-FORSCHUNGSEINHEITEN DER UNIVERSITÄTSKLINIK FÜR