Lezione 2 Il Sistema AB0

Il sistema eritrocitario AB0

Il sistema eritrocitario AB0

• Biochimica

• Genetica

• Espressione

• Gruppi principali e loro varianti: nomenclatura

• Anticorpi diretti verso gli antigeni AB0

• Metodiche

• Significato clinico

• Biochimica

La storia: Karl Landsteiner

• 1901: Mescolando sangue e siero di pazienti diverso identificò i gruppi AB0.

http://www.nobelpreis.org/castellano/medizin/images/landsteiner.jpg

Daniels 2002

- gli antigeni ABH e Lewis sono composti da carboidrati

- l’espressione e la distinzione degli antigeni H, A, B e Lewis dipende dalla natura del monosaccaride terminale immunodominante

- La presenza di uno specifico zucchero è determinata dall’azione di uno specifico enzima (transferasi) codificato a livello genico

- le catene di oligosaccaridi possono legarsi a polipeptidi per formare glicoproteine, a ceramidi per formare glicosfingolipidi e a lipidi per formare glicolipidi

- i complessi oligosaccaridici sono parte integrante della membrana eritrocitaria, delle cellule epiteliali ed endoteliali e possono essere riscontrati in vari tipi di secrezioni umane

La molecola di base su cui vengono “costruiti” gli antigeni A, B e H è detta “Precursore”

Galattosio

N-acetilglucosammina

Glucosio

Galattosio Sostanza

Precursore

Globulo Rosso

Precursore = catena oligosaccaridica legata sia a glicosfingolipidi (GR) o a glicoproteine (secrezioni).

Mediante l’aggiunta di uno zucchero alla sostanza precursore viene ottenuto l’antigene H.

Questa è la base su cui si costruiscono gli antigeni A e B.

I geni A e B codificano per enzimi che aggiungono uno zucchero immunodominante all’antigene H.

Formazione dell’antigene H

Glucosio

Galattosio


Galattosio

Antigene H

Globulo Rosso

Fucosio

Il gene H codifica per un enzima che aggiunge uno zucchero (Fucosio) allo zucchero terminale della sostanza precursore. La struttura biochimica costituisce l’ Antigene H. (l’allele h è amorfo.)

Formazione dell’antigene A

Fucosio

Glucosio

Galattosio


Galattosio

Globulo Rosso

N-acetylgalattosammina

Il gene A codifica per un enzima che aggiunge GalNAc (N-Acetil-D galattosammina) allo zucchero terminale dell’ Antigene H

Formazione dell’antigene B

Glucosio

Galattosio

N-acetiglucosammina

Galattosio

Globulo Rosso

FucosioGalattosio

Il gene B codifica per un enzima che

aggiunge D-Galattoso

allo zucchero terminale dell’ Antigene H.

L’ antigene H si trova solo sui GR in presenza del genotipo HH e Hh ma NON nel genotipo hh (rarissimo).

L’ antigene A si trova nei GR in presenza dei genotipi Hh, HH, e A/A, A/0 o A/B.

L’ antigene B si trova nei GR in presenza dei genotipi Hh, HH, e B/B, B/0 o A/B.

Tratto da: F. Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news 2006

Tratto da: AABB Technical Manual. 15th Edition 2005

• Genetica


Localizzazione cromosomica dei gruppi sanguigni

Genetica degli antigeni ABO

1. H gene – H e h alleli (h è amorfo). Si trova sul cromosoma 19.

2. AB0 geni – alleli A, B e 0. Si trovano sul cromosoma 9.

1. Se gene – Se e se alleli (se è amorfo); l’allele Se è presente nell’80 % della popolazione. Si trova sul cromosoma 19.

Stato di secretore

• Il gene Se codifica per la presenza dell’antigene H nelle secrezioni biologiche, quindi la eventuale presenza dell’antigene A e/o B nelle secrezioni oltre alla presenza dei rispettivi geni (A e B), dipende dalla presenza del gene Se e dell’antigene H

Gene Se (SeSe o Sese)

Antigene H nelle secrezioni

antigene A

antigene B

Gene se (sese) Nessun antigene A, B o H presente nelle secrezioni

e/o



Genotipo Fenotipo

00 0

A0

AA

A

B0

BB

B

AB AB

Generazione parentale: omozigoti

1° Generazione: eterozigoti

Accoppiamento con eterozigoti A0 / B0

2° Generazione: eterozigoti


P1: Padre fenotipo A Madre Fenotipo A

Esempio 1

F1: Figlio 1 fenotipo 0 Figlio 2 Fenotipo A

Genotipi?

P1: Padre fenotipo A Madre fenotipo A

genotipo A0 genotipo A0

Esempio 1

F1: Figlio 1 fenotipo 0 Figlio 2 fenotipo A

genotipo 00 genotipo AA o A0

Genotipi?

P1: Padre fenotipo AB Madre fenotipo A

Esempio 2

F1: Figlio 1 fenotipo 0 Figlio 2 fenotipo A

Genotipi?

• Espressione

Gruppo O Gruppo A

Molti Antigeni H Pochi Antigeni H A

A A

AA

La grande maggioranza (ma non tutti) degli antigeni H nel gruppo A e B vengono trasformati in antigeni A o B

Maggiori quantità di H

Minoriquantità di H

O > A2 > B > A2B > A1 > A1B

Fenotipo Bombay (Oh)

• Dipende da un genotipo hh– I globuli rossi sono privi di antigeni H e quindi

anche degli antigeni A e B… c’è solo la sostanza precursore

– Descritto per la prima volta a Bombay, India– I GR NON sono agglutinati da anti-A, Anti-B o Anti-H

(Ulex europaeus - lectina)– Il Siero ha attività anti-A, anti-B e anti-H; agglutina

quindi tutti i gruppi ABO.

• Che gruppo ABO usereste per trasfondere questi pazienti ?

Antigeni A e B :Una funzione ?

• Sconosciuta !

• Soggetti AB più resistenti al colera

• Lo stato di secretore conferisce ulteriore protezione

• Soggetti 0 più resistenti alla malaria

• Forse rimasti per pressione selettiva positiva

Espressione antigeni AB0

• Membrana eritrocitaria• Tessuti

– endotelio vasi sanguigni– epitelio degli organi di secrezione ed

escrezione• Secrezioni (quando presente Se)

– saliva– succhi gastrici– liquido seminale– fluidi di cisti ovariche– Latte– Urine

• Gruppi principali e loro varianti


Sottogruppi ABO

• I sottogruppi ABO differiscono nella quantità di

antigene presente sulla membrana dei GR:

hanno meno antigene

• Sono il risultato della presenza di trasferasi

meno efficienti nell’aggiungere gli zuccheri

immunodominanti alla sostanza H

• I sottogruppi di A sono più frequenti di quelli di B

Sottogruppi di A: A1 e A2

• I due principali sottogruppi di A sono: A1 e A2

– Entrambi reagiscono “fortemente” con anti-A

– Per distinguere A1 da A2 si può utilizzare la lectina Dolichos

biflorus (anti-A1)

– La Lectina anti-H reagisce fortemente con le emazie A2

(meno antigeni A sul GR)– 80% degli individui di gruppo A o AB sono di suttogruppo

A1, 20% are A2 and A2B

– Circa 1/10 dei soggetti A2 hanno anticorpi anti A1 che

generano una discrepanza nella prova indiretta con A1

– Risoluzione: La prova indiretta con emazie A2 è negativa, la

reazione con la lectina anti- A1 è negativa.

N. siti antigenici sulla superficie degli eritrociti

Gruppo A1

8 - 12 x 105

Gruppo A1B 5 - 9 x 105

Gruppo A2B 1 x 105

Gruppo A2 1 - 4 x 105

Gestione trasfusionale dei soggetti A2

• Gli anticorpi anti A1 prodotti da un soggetto A2 sono nella stragrande maggioranza dei casi NON clinicamente significativi (anticorpi freddi)

• Ad un soggetto A2 si possono quindi trasfondere emazie A1

Altri sottogruppi A

• Vi sono altri sottogruppi anche se molto più rari:– Aint (intermediate), A3, Ax, Am, Aend, Ael, Abantu

• Le emazie A3 danno una reazione a campi misti quando cimentati con anti-A policlonali, possono contenere anti-A1

• I gruppi Ax, Am, Ael danno una reazione diretta perfettamente negativa, la presenza dell’antigene è sospettata dalla completa assenza di reazione sierica con le emazie A. – Non è noto come queste emazie vengano tollerate in

caso di trasfusione a soggetto 0.

Sottogruppi B

• I sottogruppi B sono ancora più rari degli A

• Si differenziano per il tipo di reazione con i rispettivi sieri anti-B, anti-A,B, anti-H

• Quelli noti sono: B3, Bx, Bm, and Bel



Qualche problema con la nomenclatura…

AB0 e Lewis: uno stretto legame

• Sistema Lewsi: Ag Lea e Leb

• Risultano dalla azione di una glicosiltrasferasi codificata da un allele Le che aggiunge uno zucchero ad una catena precursore

• Lea è prodotto quando Le è ereditato con alleli sese (soggetti non secretori)

• Leb quando Le è ereditato con almeno un allele Se (secretori)

• Se si eredita l’allele amorfo le, non si produrrà alcun antigene Lewis Le(a-b-)

• Lea e Leb non sono antigeni antitetici ma risultano dalla interazione di alleli ereditati indipendentemente

• Gli antigeni Lewis non sono intrinseci alla membrana dei globuli rossi ma sono espressisu glicosfingolipidi adsorbiti dal plasma sulla membrana


• Anticorpi diretti verso gli antigeni AB0

Gli Anticorpi “Regolari”: la regola di Landsteiner

• Soggetti normali e sani possiedono NATURALMENTE

gli anticorpi anti-A o anti-B diretti contro gli antigeni A o

B che è assente sui loro Globuli Rossi

• In altre parole NON richiedono una esposizione

(trasfusione o gravidanza) ad emazie estranee

• NON sono presenti alla nascità, e perciò si pensa

siano stimolati da antigeni ambientali (probabilmente

batterici) a cui siamo tutti esposti

Anticorpi anti-A / anti-B• Le IgM sono predominanti negli individui di Gruppo

A e di gruppo B– Anti-A– Anti-B

• IgG (con una minoranza di IgM) è l’anticorpo predominante negli individui di gruppo 0– Anti-A,B ( con alcuni anti-A e anti-B)

• Reagiscono a Temperatura Ambiente• Attivano facilmente il complemento ( sopratutto le

IgM)• Sono ad alto titolo (grado di reazione 4+)

Anticorpi AB0: evoluzione con l’età

• Di solito compaiono dopo 3-6 mesi di vita

– Ma i neonati possono acquisire passivamente le IgG materne: NON SI DEVE FARE la PROVA INDIRETTA (sierica) nel sangue dei neonati

• Titolo stabile a 5-6 anni

• Declinano nell’anziano

Anti-A1

• Individui di gruppo O e B presentano anti-A nel loro siero• Tuttavia gli anti-A possono essere divisi in due categorie

distinte: anti-A e anti-A1

• Infatti l’antigene A è presente in due forme A1 e A2 • Anti-A1 agglutina solo l’antigene A1 non l’ A2 • L’anti-A agglutina entrambi; non esiste un anti-A2. • Una piccola parte dei soggetti A2 può sviluppare

anti-A1

• In questo caso si è di fronte ad una “discrepanza” alla tipizzazione

• Gli Anti-A1 sviluppati dagli A2 non danno pressochè mai luogo a conseguenze cliniche in caso di trasfusione con sangue A1

Anti-A,B

• Presenti nel siero dei soggetti di gruppo 0

• Reagisce con emazie A, B, ed AB

• Sono prevalentemente IgG (con una piccola quota di IgM)

• Anti-A,B è un singolo anticorpo, non una miscela di anti-A and anti-B

• Metodiche

La determinazione del gruppo AB0 deve necessariamente includere:

•una prova diretta sugli eritrociti con utilizzo di antisieri specifici con anticorpi monoclonali anti-A, anti-B , anti-A,B

•un indagine indiretta sul siero/plasma dello stesso soggetto utilizzando emazie di gruppo noto (A1, A2 e B)

Ciascuna delle due indagini rappresenta il controllo dell’altro.

Basta un campione anticoagulato con EDTA

Tipizzazione AB0

Tipizzazione AB0 risultati attesi

anti-A anti-B Emazie

A1 e A2

Emazie

BgruppoAB0

% Caucasici

% Africani.

1 0 0 + + 0 45 49

2 + 0 0 + A 40 27

3 0 + + 0 B 11 20

4 + + 0 0 AB 4 4

Rezione delle emazie da tipizzare

con:

Reazione del siero del sangue da tipizzare con:

Anti-B Anti-A Anti A,B

GR-A1 GR-A2 GR-B

Discrepanze AB0:Una discrepanza si ha quando la prova diretta

(globulare) non è confermata da una prova indiretta (sierica)

PazientePaziente Anti-AAnti-A Anti-BAnti-B GR AGR A11 GR B GR B

11 4+4+ 1+1+ 00 4+4+

22 00 4+4+ 1+1+ 00

33 4+4+ 4+4+ 1+1+ 00

44 00 3+3+ 00 00

Discrepanze AB0: dovute a 2 situazioni:

• Problemi con i Globuli Rossi– Antigeni con debole/assente reattività – Extra antigeni– Reazioni a campo misto– Trasfusioni recenti con GR non-omogruppo

• Problemi con il Siero– Anticorpi con debole/assente reattività – Extra anticorpi

Che fare?

• Identificare la causa• Escludere innanzitutto un problema

tecnico– Provetta sbagliata/ mal etichettata– Reagente non dispensato

• Primi passi: ripetere il test sullo stesso camione ; richiedere un ulteriore campione; lavare le emazie

• In alcuni casi ci sono delle vere discrepanze legate a fattori globulari (GR) o sierici

Cosa fare con una discrepanza irrisolta e/o in emergenza?

• Escludere un fenotipo Bombay

• Escludere la presenza di un allo-anticorpo freddo potenzialmente significativo (cross match negativo)

• In urgenza trasfondere gruppo 0

Saprò farlo funzionare?

Possono causare tutte reazioni positive (panagglutinazione)

Possibili cause dellediscrepanze di gruppo ABO

Discrepanze nella tipizzazione ABO diretta: risoluzione problemi

FALSI NEGATIVI FALSI POSITIVI

Aggiunti i reattivi ?? Eccessiva centrifugazione

L’emolisi è una reazione positiva !! (Ac freddi anti A-B-H-Lea)

Reagenti/campioni contaminati da batteri

Errato rapporto antisiero/cellule

Sbagliata interpretazione o registrazione

Insufficiente centrifugazione

Incubazione a T > 20-24 °C

Discrepanze nella prova indiretta ABO: risoluzione problemi

• Coaguli di fibrina• Conc. Anomala di proteine, HMW plasma

expanders: formano rouleaux visibili al microscopio; diluire il siero con salina

• Agglutinine a freddo nell’antisiero: reazioni più deboli; preriscaldare l’antisiero

• Immunodeficit (età, patologia, terapia): verificare la diagnosi o l’età

• Nel 1986 è stato clonato il gene del sistema MN

(gene GYPA)

• Le basi molecolari di 28 su 29 sistemi di gruppo

sanguigno sono state definite

• Partendo da tests su DNA genomico, è possibile

predire con un buon grado di accuratezza i fenotipi

dei principali gruppi sanguigni

Biologia molecolare e immunoematologia

Genotipo=AelB1

Fenotipo=AelB

• Significato clinico

Perché il sistema AB0 è importante?• In assenza dell’antigene, sono attesi gli anticorpi corrispondenti• Gli anticorpi sono spesso presenti ad elevato titolo ed avidità,

anche se il soggetto non è stato stimolato immunologicamente• Gli anticorpi sono reattivi a basse temperature ma a differenza

di molti altri anticorpi freddi sono in grado di legarsi al corrispondente Ag anche a 37°C

• Gli antigeni A e B sono presenti in grandi quantità sui globuli rossi

• Sia che siano IgG o IgM , gli anticorpi ABO attivano con efficienza il complemento – Questo significa che la trasfusione di emazie AB0

incompatibili è in grado di causare reazioni emolitiche acute catastrofiche

• La compatibilità AB0 è quindi il fondamento dei test pretrasfusionali

Schema di compatibilità ABO per la trasfusione di emazie “concentrate”

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Blood_Compatibility.svg

Schema di compatibilità ABO per la trasfusione di plasma

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Plasma-donation.svg

E le piastrine?• Trasfondere preferenzialmente omogruppo• Le piastrine esprimono gli Antigeni A e B e

questo può associarsi ad una ridotta sopravvivenza in caso di trasfusione “incompatibile”

• I concentrati piastrinici sono un prodotto con una quantità variabile di plasma (molto in caso di aferesi poco in caso di assemblati da buffy risospesi in soluzione conservant)

• il rischio di emolisi da incompatibilità da plasma 0 pericoloso non va sottovalutato

Gli Zero Pericolosi……• Alcuni rari soggetti di gruppo 0 presentano degli anticorpi

(in genere anti-A) ad alte concentrazioni • La trasfusione anche di pochi millilitri di sangue di questi

soggetto sono capaci di causare una emolisi massiva delle emazie del ricevente

• Questo rischio non è “negligible” in caso di trasfusione di piastrine sospese in plasma O

• Per questo per un utilizzo universale è consigliabile“screenare” la presenza ed il titolo delle emolisine in donatori 0 di piastrine in aferesi: le piastrine di donatori con presenza di anticorpi anti-A o B ad alto titolo e/o con spiccata azione emolitica sono riservate a pazienti di gruppo 0

Sistema AB0 e trapianti

• Anticorpi del sistema AB0 possono:

– essere causa di rigetto di organi solidi (rene, cuore, fegato)

– influenzare negativamente l’attecchimento del midollo osseo trapiantato

Conclusioni• Il sistema AB0 è una base

fondamentale della immunoematologia e della medicina trasfusionale

• Ha una rilevanza anche nel trapianto di organi solidi

• “In immunoematologia poche regole e molte eccezioni…a cominciare dall’ABO”

• Fortunatamente l’utilizzo di antisieri monoclonali e di metodi automatizzati e standardizzati hanno ridotto discrepanze AB0 dovute a fattori interferenti ed alla aspecificità dei sieri policlonali umani usati in passato

Per saperne di più

- Fernanda Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news n. 22 2006

- M. Murphy, D. Pamphilon eds. Practical Transfusion Medicine. Blackwell 2001.

- G. L. Daniels. Human Blood Groups. Blackwell 2002.

- AABB Technical Manual. 15th edition 2005.

- Massimo La Raja. http://immunoematologia.blogspot.com/2009/03/processo-trasfusionale-prova.html

http://immunoematologia.blogspot.com/2009/03/processo-trasfusionale-prova.html




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Lezione 2 Il Sistema AB0