Upload
lenhu
View
227
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Molekulárna biológia a jej využitie v laboratórnej diagnostike na OKM
FNsP Skalica a.s.
Kos S., Kóňová L., Vašková M.,
1993
Bakteriológia – Priama diagnostika-kultivácia, mikroskopia, detekcia bakt. Ag
2006
Serológia – Nepriama diagnostika -detekcia prítomnosti protilátok
2011
Molekulárno – biolog. metódy (PCR)
Priama diagnostika-detekcia nukleovej kyseliny
Klinika
Hemokultúty
Infekcie dýchacích ciest
Infekcie urogenitálneho traktu
Črevné infekcie
Baktérie
Vírusy
Parazity
Baktérie (chlamýdie trachomatis)
Vírusy (HPV)
Parazity
Štruktúra OKM FNsP Skalica, a.s.
Štruktúra DNA2 polynukleotidové reťazce tvorené
nukleotidmi
5C monosacharid –pentóza (deoxy – ribóza)
Kys. trihydrogénfosforečná H3PO4
Báza -Purínová (A,G) alebo
Pyrimidínová (C,T)
Neamplifikačné
Amplifikačné
Dôkaz
nukleových kys.
DNA/RNA
Metódy:
Hybridizácia
Kvantitatívne:
RealTime PCR
Kvalitatívne:
PCR, microarray sys.
NEAMPLIFIKAČNÉ
Hybridizácia
Dôkaz DNA/RNA vo vzorke bez
predchádzajúcej amplifikácie
cieľovej /target/ nukleovej kys.
Využíva značené hybridizačné sondy
(DNA/RNA)
SONDA = oligonukleotid, komplementárny k špecifickej (hľadanej) sekvencii NKväzba cez H mostíky
AMPLIFIKAČNÉI. Kvalitatívne (PCR)
II. Kvantitatívne (Real-time PCR)
I. Kvalitatívne
PCR – polymerázová reťazová reakcia
- amplifikácia špecifickej sekvencie DNA (druhovo špecifický úsek)
- vyžaduje predchádzajúcu izoláciu cieľovej DNA zo vzorky
1. Izolácia DNA
2. PCR
-Denaturácia
- Anelácia primerov
- Elongácia
3. Analýza produktu
Izolácia DNA zo vzorky biolog. materiálu
Zdrojom templátovej DNA:
Krv EDTA, BAL, iné telové tekutiny, tkanivo
NEVYHNUTNOSŤ odstrániť porfyrínové zlúč. (hemoglob., hematín) – inhibujú PCR
Pozor na výtery obsahujúce krv!
Cieľ:– získať dostatočné množstvo DNA vo vyhovujúcej kvalite
– Množstvo: od ng – po μg
Reakčná zmes – Master mix
Primery- krátke oligonukleotidy, komplementárne k cieľovej
sekvencii ssDNA - Špecifita reakcie: 20-30 nukleotidov
Nukleotidy- vo forme trifosf. (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
Polymeráza- Taq
Pufor - obsahujúci Mg2+ ióny, pre optim.aktivitu Taq poly
Optimálna konc. Mg2+ 1-2 mmol/l
Princíp PCR
• uvoľnenie H mostíkov ( teplota pri počte G-C párov)
• oddelenie vlákien templátovej DNA 2 ssDNA
1. Denaturácia
teplota 90-95oC
/94oC 1 min., príp. 95oC 30s/
• naviazanie primerov ku komplementárnej sekvencii templátovej ssDNA
2. Anelácia primerov
teplota 40-72oC
/~60oC/
• syntéza nového komplementárneho vlákna od 3´OH konca primera pomocou Taq polymerázypodľa templátovej ssDNA vznikne dsDNA amplikón
3. Elongácia
teplota 60-75oC
/72oC/
1 východisková ds DNA35 cyklov 236 kópií
PCR prebieha v termocykleri – umožňuje automaticky naprogramovať teplotný režim a počet cyklov
Optimálny počet cyklov závisí od konc. jednotlivých zložiek reakcie, v rozsahu 25-35 cyklov (1-4 hod)
Analýza produktu amplifikácie
Detekcia ELFO (ds amplikóny):
Separácia fragmentov v jednosmernom elekt. poli od – k + podľa ich molekulovej hmotnosti
• Agarózový gél ( Et-Br, UV)
• Polyakrylamidový gél (PAGE) – jemná separácia, umožňuje detekovať rozdiel dĺžky 1 bp, na separáciu malých fragmentov
Fluorescencia
• Využitie v Real-time PCR
Kontaminácie PCR
Separovať priestory pre izoláciu DNA, prípravu PCR a analýzu produktu !
Každý úsek má mať sadu pipiet, ktoré sa neprenášajú
Priestory dekontaminovať UV žiarením
Používať jednorázový spotreb. materiál (rukavice, špičky, mikroskúmavky)
Reagencie deliť na alikvóty, na jedno použite
II. Kvantitatívne amplifikačné metódy
-umožňuje sledovať nárast počtu amplikónov v reálnom čase
- využíva fluorogénne farbivá
- bez potreby postamplifikačnej analýzy
- je možné využiť aj na kvalitatívnu analýzu
Real-Time PCR
OKM FNsP Skalica a.s.
- od novembra 2011 zriadenie PCR laboratória
Vyšetrujeme: od 1.11. 2011Ch. trachomatis – kvalitatívna detekcia metódou Real-time PCRCh. trachomatis je intracelulárna baktéria, ktorá vyvoláva infekcie urogenitálneho
a reprodukčného systému.
Najčastejšie pohlavne prenášané ochorenie vo vyspelých
krajinách. Ak sa nelieči môže spôsobiť u žien neplodnosť.
Odber výterov – suchý dakrónový tampón
Z materiálu: - urogenitálne a rektálne výtery
- výter hrdla
- výtok z oka
- moč 1. porcia
- sekrét z prostaty
Vyšetrujeme: od 1.1. 2012
HPV – vysokorizikové genotypy
16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59Ľudský papilomavírus (HPV), jeho niektoré
genotypy zvyšujú riziko rakoviny krčka maternice.
1. Z materiálu - cervikálne a uretrálne zoškraby
2. Do transportnej pôdy - dodá laboratórium
3. Simultánna kvalitatívna detekcia metódou Real-time PCR
4. Detekcia produktov reakcie - fluorescenčné farbivá
Princíp:
Amplifikácia špecifického úseku DNA s použitím špecifických
primerov.
Detekcia produktov reakcie – fluorescenčné farbivá, ktoré sa
naviažu na amplifikovaný produkt.
Monitorovanie intenzity fluorescencie počas Real-time PCR
umožňuje detekciu akumulovaného produktu bez nutnosti
otvárania reakčnej skúmavky, čo výrazne znižuje možnosť
kontaminácie.
Aplikácie PCR
Diagnostika pôvodcov infekčných ochorení:
! Vírusy (HPV, HBV, HCV, CMV, HIV, HSV1/2, a.i.)
! Baktérie (Ch. trachomatis , B. burgdorferi, T. pallidum,
M. tuberculosis a.i.)
Huby (P. jiroveci), Parazity
Dôkaz mikroorganizmov v
potravinách
Kriminalistika a súdne lekárstvo(genetické odtlačky,
dôkaz paternity)
Diagnostika geneticky podmienených ochorení (fenylketonúria, cystická fibróza, kosáčikovitá anémia a.i.)
Archeológia: určovanie pohlavia, príbuzenských
vzťahov a.i.
Genetika hospodárskych zvierat a rastlín
Taxonómia
Výhody:
Rýchlosť (cca 3 hodiny)
Detekcia ťažko kultivovateľných patogénov(Ch. trachomatis, vírusy...)
Rýchla detekcia patogénov s dlhou kultivačnou dobou(M. tubeculosis...)
Detekcia patogénov, ktorých vitalita a rastové schopnosti sú obmedzené napr. prebiehajúcou ATB liečbou
Detekcia patogénov prítomných vo veľmi malom množstve
citlivosť, špecificita, spoľahlivosť, využitá ako konfirmačná metóda