Upload
vananh
View
259
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Jednodimenzijske tehnike
90x
nakvizicija
Osnovne višepulsne jednodimenzijske tehnike
Tehnika primjena
J modulirana spinska jeka ili APT (Attached proton Editiranje spektara heterojezgri (13C) premaJ-modulirana spinska jeka ili APT (Attached proton test)
Editiranje spektara heterojezgri (13C) prema multiplicitetu
INEPT (Insensitive nuclei enhanced by polarisation transfer)
pojačavanje signala jezgri s malim (13C) pomoću prijenosa polarizacije sa jezgri s velikim (1H, 19F). Editiranje spektara heterojezgri prema multiplicitetu.
DEPT (Distortionless enhancement by polarisation transfer)
pojačavanje signala jezgri s malim (13C) pomoću prijenosa polarizacije sa jezgri s velikim . Editiranje spektara heterojezgri prema multiplicitetu. Robusniji od p j g p p jINEPT-a. Nema informacija o kvarternim 13C
DEPT-Q Isto kao DEPT ali sadrži kvarterne 13C
pojačavanje signala jezgri s malim (13C) pomoću PENDANT
j j g j g ( )prijenosa polarizacije sa jezgri s velikim (1H, 19F). Editiranje spektara heterojezgri prema multiplicitetu. Sadrži informacije o kvarternim 13C
CH3
OOH
O
OH
CH3
O
O
OH
OOH
Tehnike dvostruke rezonancije
a) Spregnuti spektar s NOE rasprezanje
b) Raspregnuti spektar bez NOE rasprezanje
c) Raspregnuti spektar s NOE (rf) lj i j j d ij ličit
RasprezanjeRasprezanjepolje primjenjeno s dvije različite snage-power gated
-pinen
d) R ti kt
CDCl3
d) Raspregnuti spektar s NOE-power gated
c) Raspregnuti spektar bez NOENOE
b) Spregnuti spektar s NOE
a) Spregnuti spektar bez NOE
CH3
OOH
O
OH
OH
APT spektar
(Aceton)(Aceton)
INEPTINEPT
x x ±y
x x y1H
x x13C
x x = 1/4J
Refokusirani INEPT
x x ±y1H
x
Rasprezanje
13Cx x x
p j
AX
Povećanje osjetljivosti!
X 13C 15N 29Si 31P
IINEPT = I0(H/X)
I I (1 + /2 )
IINEPT 3.98 9.87 5.03 2.47
INOE 2.99 -3.94 -1.52 2.24INOE = I0 (1 + H/2X) INOE
DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)
x
x ±y1H
13Cx x
= 1/2J
C
= 180J Faza i intenzitet signala ugljikovih atoma ovisi o kutu Slično kao i kod INEPT-a, no s tom razlikom što se kod DEPT-a editiranje postiže različitim
kutem , a ne vrijednostima
= 180J
Stoga je i učinkovitost editiranja veća za DEPT
DEPT-45 DEPT-90 DEPT-135
XH + + +XH2 + 0 -XH + 0 +XH3 + 0 +
DEPT eksperiment
CH i CH3 gore, CH2 dolje
DEPT eksperiment
3 g , 2 j
Pojavljuju se samo CH skupine
Svi protonirani ugljici se pojavljuju nema kavarternihpojavljuju, nema kavarternih
Normalni 13C spektarspektar
Opća shema za sakupljanje 2D podataka
Broj eksperimentap
1eć
enje
t 1Po
ve
Homonuklearna korelacijaCOSY (COrrelation SectroscopY)COSY (COrrelation SectroscopY)
t1 tt1 t2
Spinski sustav AX AX AX
IA=IX=1/2
CH3
O
O
OH
OOH
TOCSY (TOt l C l ti S t Y)TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY)t
t1
tm
Spin-locky
Postoje korelacije među spinovima unutar spinskog sustava, bez obzira da li su j j p p g ,međusobno spregnuti
Ako postoje neprekinuti lanac spinova A-B-C-D, TOCSY slijed će prenositi magnetizaciju od spina A na spinove B, C, Dmagnetizaciju od spina A na spinove B, C, D
Homonuklearna križna polarizacija (HOHAHA) tm - vrijeme mješanja ili spin-lock ili izotropno mješanje, potrebno za prijenos
magnetizacije unutar spinskog sustava tj svi spinovi dijele koherencijumagnetizacije unutar spinskog sustava, tj svi spinovi dijele koherenciju Vrijeme tm je u ms što omogućava višestupanjski prijenos koherenacije za vrijeme tm primjenjuje se rf polje ili pulsevi uzduž osi y koji zaključavaju spinove
uzduž te osi i kreiraju homonuklearnu spinsku jeku Homonuklearnom spinskom jekom sprege nastavljaju evoluirati, što znači da su na
kraju vremena tm kemijski pomaci odstranjeni dok sprege ostaju aktivnej m j p j p g j Zahtjev da jezgre osjećaju ista lokalna polja za vrijeme mješanja da bi se omogućio
prijenos zove se i Hartman-Hahn uvjet, odnosno vrijedi AB1A =XB1X
TOCSY
COSY
TOCSY
CH3
O
O
OH
OH
HETCORHETCOR
CH3
O
O
OH
OH
W0 = prijelaz od nula kvanta
W1 = prijelaz od jednog kvanta
W2 = prijelaz od dva kvanta
W0 i W2 imaju istodobnu promjenu 0 2 j p joba spina
kvantno su zabranjeni jer ∆M≠1kvantno su zabranjeni jer ∆M≠1
W0 i W2 predstavljaju puteve križnerelaksacije
Interakcije kroz prostor- križna relaksacija (NOESY, ROESY)
COSY
1. Skalarne interakcije
1. Skalarne interakcije, dipolarne interakcije, NOESYkemijska izmjena
2 Vrijeme miješanja2. Vrijeme miješanja,
3. Prijenos magnetizacije kroz prostor
NOESY spektar azitromicina
NOESY vs. ROESY
NOESY
ROESY
Protokol za određivanje ili potvrdu strukture molekula
postupak tehnika informacija
1H kt 1D k ij ki i k t t i t li1H spektar 1D kemijski pomaci, konstante sprega, integrali
1H-1H korelacija COSY povezanost protona preko sprega (asignacija)j p p p p g ( g j )
13C spektar s DEPT, APT, broj atoma C i multipletnost (C, CH, CH2, CH3)često nepotrebno ako se koriste inverzne 2Deditiranjem PENDANT često nepotrebno ako se koriste inverzne 2D tehnike s editiranjem
spektri hetero-jezgri 1D kemijski pomaci i homo-/hetero-nuklearne p j g(31P, 19F..) 1D j p
konstante sprega
1H-13C korelacija kroz HMQC HSQC asignacija atoma C i H, multipletnost iz HSQC jednu kemijsku vezu HMQC, HSQC spektra s editiranjem
1H-13C korelacija kroz HMBC povezanost atoma C i H kroz više veza, jviše kemijskih veza HMBC p ,
povezanost preko hetero-atoma, identifikacijastrukturnih fragmenata
korelacija kroz prostorkorelacija kroz prostor preko NOE efekta 1D ili 2D
NOESY, ROESYstereokemija: konfiguracija i konformacija
NMR kt k ij č t t jNMR spektroskopija u čvrstom stanju
13C NMR spektar u otopini
13C NMR spektar u čvrstom stanjuj
Interakcije ovisne o položaju u prostoru Interakcije ovisne o položaju u prostoru
2 21 2 21 3cos 1 sin cos 22iso CSA θ η θ φ
Dipolarne interakcije
1H 1H ≈ 40 kHz – 120 kHzH, H 40 kHz 120 kHz13C, 1H ≈ 3 kHz – 30 kHz
Utjecaj anizotropije kemijskog pomaka (CSA) na NMR spektre u čvrstom stanjuspektre u čvrstom stanju
Anizotropija kemijskog pomaka
Sferna simetrija
Zrcalna simetrija
Osovinska i t ijsimetrija
Čarobni trik...
(3cos2θ - 1) = 0 kada je θ = 54.74°
b k č d č k ili d beskonačno dugačak cilindar
E. R. Andrew i I. J. Lowe
MASagic ngle pinningM A SCP-MAS
• dipolarne interakcije1H, 1H ≈ 40 kHz – 120 kHz
MAS
13C, 1H ≈ 3 kHz – 30 kHz
Efekt MAS-a na 13C spektar
Analiza svojstava krutine – solvati (lizinopril)
A. Amorfni oblikB. Kristal anhidratC. Kristal dihidratD D2O otopinaD. D2O otopinaE. D20 otopina
Analiza svojstava krutine – polimorfi
sulfatiazolflufenamska kiselina
Strukturna analiza – L-tirozin hidroklorid
a) MAS-J-HMQCa) MAS-J-HMQC
b) dipolarni HETCOR
O
O CH3
Sprega tekućinske kromatografije i NMR-aSprega tekućinske kromatografije i NMR aLC-NMR
Sprega tekućinske kromatografije i NMR-a
NMR s SGI ili PC (windows)
HPLC s PC
Načini izvedbe LC-NMR-a
Kontinuirani protok (on-flow) Izvedivo za 1H i 19F (osjetljivost) Izvedivo za H i F (osjetljivost) Za uzorke nepoznatih kromatografskih svojstava Labilni spojevi (razgradnja, izomerizacija)
Zaustavljeni protok u vremenskim intervalima (time-slice) Loše odvojive komponente u smjesi Slaba ili nikakva UV kromofora Slaba ili nikakva UV kromofora Slabo definirana retencijska vremena
Zaustavljeni protok (stopped-flow) Poznata retencijska vremena komponenata u smjesi Poznate UV kromofore
Skladištenje u kapilarnim petljama (loop transfer) Skladištenje u kapilarnim petljama (loop transfer) LC pikovi se skladište u kapilarne petlje
LC-SPE-NMR LC pikovi se skladište u SPE (solid phase extraction) patronama (cartridge)
T h ik ij i l t lTehnike supresije signala otapala
P ić j (NOESY ti “ h d” l i)Prezasićenje (NOESY tip, “shaped” pulsevi)Jedno-, dvo-, i višestruka supresija signala
WET (water suppression enhanced trough T1effects)effects)
WATERGATE (water suppression by gradient-t il d it ti )tailored excitation)
Excitation sculpting (dvostruka pfg spinska-jeka)p g ( p g p j )
Protonski spektri mesalazina u 71% CH3CN i 29% D2OProtonski spektri mesalazina u 71% CH3CN i 29% D2O
a) običan spektar CH3CNHOD
mesalazin
b) prezasićenje CH3CN) p j 3
c) dvostruko prezasićenje CH3CN ) p j 3i HDO
d) Dvostruko prezasićenje CH CN i HDO 13CCH3CN i HDO uz 13C rasprezanje
P t ki kt i l i 71% CH CN i 29% D OProtonski spektri mesalazina u 71% CH3CN i 29% D2O
a) Običan spektar
b) WET višestruka supresijab) WET višestruka supresija otapala
c) 3-9-19 WATERGATE (W3)
d) 3-9-19 WATERGATE (W3)
Tipični LC-NMR spektri kontinuiranoga protoka
1H LC-NMR spektri kontinuiranog protokap
Odvajanje izomera vitamina AOdvajanje izomera vitamina A
Ograničenja LC-NMR-ag j
Količina izorka za NMR limitirana je kromatografijom Količina izorka za NMR limitirana je kromatografijom
S di LC i l l i t t č NMR Samo dio LC signala nalaz ise unutar protočne NMR probe
Količina od samo jednog injektiranja je dostupna za NMR
Nedeuterirana otapala daju jake pozadinske signale
Deuterirana otapala (obično D2O) preskupa su za kromatografiju i onemegućuju opažanje izmjenjivihkromatografiju i onemegućuju opažanje izmjenjivih protona
Rješenje: sprega ekstrakcije na čvrstoj fazi (SPE) Nakon kromatografskog odvajanja za skladištenja pikova u
SPE patronama (cartridge)p ( g ) Patrone se suše u struji dušika za otklanjanje otapala
N d t i t l k i titi d j j k ti Nedeuterirana otapala se mogu koristiti za odvajanje komponenti smjese u LC-u
Oblik LC pika nije bitan za NMR
Deuterirana otapala se mogu koristiti za ispiranje uzoraka s patrona i Deuterirana otapala se mogu koristiti za ispiranje uzoraka s patrona i uvođenje u NMR protočnu probu
Nije potrebna supresija signala otapala
Mogu se opažati izmjenjivi ptoronig p j j p
Manji volumen eluiranja, povećanje S/N
Mogućnost višestrukog skladištenja LC pikova za povećanje koncentracije za NMR
Oblik kromatografskog pika u 1) tehnici LC-NMR i 2) tehnici LC-SPE-NMR
Primjena LC SPE NMR tehnikePrimjena LC-SPE-NMR tehnike
analiza biljnih ekstrakataanaliza maslinovog ulja analiza maslinovog ulja
analiza tropskog voćali t b lit i it analiza metabolita in vitro
analiza organskog sastava tla i sedimenata
analiza onečišćenja i razgradnih produkata u aktivnim farmaceutskim pripravcimaaktivnim farmaceutskim pripravcima
LC2-SPE-NMR za analizu složenih smjesa i onečišćenja s udjelom oko 0 1 %onečišćenja s udjelom oko 0,1 %
Primjer: LC-SPE krio-NMR analiza 7-etiltriptofolaPrimjer: LC SPE krio NMR analiza 7 etiltriptofola
-Prekursor u sintezi etodolaka-Lječenje reumatoidnog artritisa
7-ethyltryptophol Methyl 3-oxopentanoate Methyl ester of Etodolac
7-ethyltryptophol
LC-kromatogram uzorka 7-etiltriptofolaOptimal uvjetikolona: Waters XBridge Phenyl (150 mm 4 6 mm; 3 5 μm)kolona: Waters XBridge Phenyl (150 mm 4.6 mm; 3.5 μm)mobilna faza: metanol-fosfatni pufer (pH 7), gradientna metodaprotok: 1 ml/min temperatura: 25 °C injektirani volumen: 20 µlUV detekcija: 225 nm, 273 nmpočetna masa: 10 mg
onečišćenje 2D8
1H COSY
HSQC
2D8
LC-SPE-krio-NMR sustav