RESOLUCIÓN OIV-OENO 370-2012 DIRECTRICES PARA ...1.3.1 Rendimiento al término de la fermentación en mostos ricos en azúcares. Resistencia al estrés durante la fermentación 1.3.2

Certificado conforme Izmir, 22 de junio de 2012

El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general

Federico CASTELLUCCI

© OIV 2012 1

RESOLUCIÓN OIV-OENO 370-2012

DIRECTRICES PARA LA CARACTERIZACIÓN DE LEVADURAS DE VINO DEL GÉNERO

SACCHAROMYCES AISLADAS DE AMBIENTES VITIVINÍCOLAS

LA ASAMBLEA GENERAL

Visto el artículo 2, párrafo 2 IV del Acuerdo del 3 de abril de 2001, por el que se crea la

Organización Internacional de la Viña y el Vino,

Visto el Plan Estratégico de la OIV,

Por propuesta del grupo de expertos “Microbiología”,

DECIDE aprobar las siguientes directrices relativas a los criterios de caracterización de

levaduras Saccharomyces en ambientes vitivinícolas:




© OIV 2012 2

Directrices para la caracterización de levaduras de vino del género Saccharomyces aisladas de ambientes vitivinícolas INTRODUCCIÓN

1. CARACTERÍSTICAS QUE INFLUYEN EN EL PROCESO DE VINIFICACIÓN

1.1 CARACTERÍSTICAS TECNOLÓGICAS GENERALES

1.1.1 Poder fermentativo

1.1.2 Vigor fermentativo y cinética de la fermentación a diferentes temperaturas

1.1.3 Resistencia al SO2 (tolerancia)

1.1.4 Resistencia al cobre

1.1.5 Factor killer, fenotipos K y N

1.1.6 Modo de crecimiento en medio líquido

1.1.7 Producción de espuma

1.2 CARACTERÍSTICAS TECNOLÓGICAS NECESARIAS PARA LA VINIFICACIÓN EN BLANCO 1.2.1 Capacidad para fermentar mostos altamente clarificados con bajos niveles de NFA

1.3 CARACTERÍSTICAS TECNOLÓGICAS NECESARIAS PARA LA VINIFICACIÓN EN

TINTO 1.3.1 Rendimiento al término de la fermentación en mostos ricos en azúcares. Resistencia al

estrés durante la fermentación

1.3.2 Autolisis y liberación de polisacáridos de la pared celular de la levadura

1.3.3 Producción de polialcoholes

1.3.4 Baja adsorción de antocianos en las paredes celulares

1.3.5 Producción de acetaldehído y ácido pirúvico para potenciar la producción de vitisina

1.3.6 Cepas con actividad hidroxicinamato descarboxilasa para favorecer la formación de

piranoantocianos vinilfenólicos

1.3.7 Actividad β-glucosidasa

2 CARACTERÍSTICAS QUE INFLUYEN EN LA CALIDAD ORGANOLÉPTICA DEL VINO

2.1 Producción de acidez volátil

2.2 Producción de glicerol

2.3 Producción de alcoholes superiores

2.4 Producción de acetaldehído

2.5 Producción de ésteres

2.6 Producción de compuestos azufrados volátiles (sulfuro de hidrógeno y mercaptanos)

2.7 Actividad sobre el ácido málico

2.8 Actividades enzimáticas

3 CARACTERÍSTICAS QUE INFLUYEN EN LA SALUBRIDAD DEL VINO

3.1 Producción de carbamato de etilo

3.2 Producción de aminas biógenas

3.3 Actividad de las levaduras sobre la ocratoxina A

3.4 Producción de metanol

En cada párrafo de las secciones 1 y 2, los criterios estándar de caracterización de la levadura de




© OIV 2012 3

vino (S. cerevisiae) indican, cuando es preciso, el estilo tecnológico del vino. INTRODUCCIÓN

No hay duda de que las principales técnicas enológicas han ido evolucionando

vertiginosamente en las últimas décadas, debido a una mayor demanda de calidad y seguridad

del vino y de higiene de las condiciones de producción.

A lo largo de los años, se han desarrollado nuevas biotecnologías para explicar la

importancia de los microorganismos y sus efectos en las características sensoriales del vino. La

mayor parte de los productores de vino utilizan levaduras como cultivos iniciadores, según

varios criterios que también garantizan el control del proceso de fermentación alcohólica.

Durante muchos años, se han seleccionado estos cultivos iniciadores dando preferencia

a las levaduras del género Saccharomyces entre la microflora natural de la uva, teniendo en

cuenta sus características, más adecuadas, y especialmente su alta tolerancia al alcohol. En la

actualidad, existen razones enológicas fundamentales que destacan la importancia de indicar el

origen geográfico y/o zona de aislamiento y/u origen de la variedad de uva de la cepas de

levadura utilizadas como cultivos iniciadores.

El género Saccharomyces y algunas de sus especies (S. cerevisiae, S. bayanus)

resultan ideales para efectuar la fermentación alcohólica, debido a una adaptación evolutiva a

las altas concentraciones de azúcar del mosto y su posterior conversión en etanol, dióxido de

carbono y numerosos compuestos de interés desde el punto de vista organoléptico. La

variación entre y dentro de la especie brinda la posibilidad de ampliar la caracterización de

cepas, siendo algunas de ellas de gran utilidad en ambientes industriales.

El progreso en las técnicas analíticas de investigación de los compuestos químicos en

las fermentaciones de mosto de uva permite avances constantes en la comprensión de la

funcionalidad de la cepa bajo diferentes condiciones de fermentación. Todo esto, sin olvidar

que la biología molecular no ha sido indiferente a los objetivos que la industria ha establecido

para la enología moderna, e incluirá un uso específico de las tecnologías “ómicas” (genómica,

transcriptómica, proteómica o metabolómica).

En este sentido, la comprensión del genoma completo de algunas especies de

Saccharomyces y las funciones específicas de miles de genes posibilitará nuevos avances

científicos, especialmente sobre su fisiología y funcionalidad durante la fermentación. Toda la

investigación sobre las levaduras como una entidad compleja evidentemente hará más fáciles

los estudios sobre caracterización y supondrá grandes aportes a la enología moderna con la

aplicación de nuevas cepas de levaduras seleccionadas.

Además, los criterios de selección expuestos a continuación se concentran

principalmente en las selecciones de levaduras Saccharomyces, teniendo en cuenta que existe

un creciente interés en aislar, caracterizar y usar levaduras pertenecientes al grupo de no-

Saccharomyces, que constituyen gran parte de la flora natural de levaduras en las uvas, y

tienen un papel activo al comienzo de las fermentaciones alcohólicas. A pesar de que a

menudo influyen en la capacidad de fermentación y el vino resultante posee un aroma y un

gusto de connotación negativa, algunas de estas levaduras también añaden compuestos

aromáticos evaluados positivamente que enriquecen la complejidad del vino. Las líneas

directrices para la selección de levaduras de vino no-Saccharomyces se presentarán en otra

resolución específica.

Esta resolución se refiere a las levaduras del género Saccharomyces y sus respectivos híbridos,

y contiene una recopilación de criterios de caracterización de levaduras que son de utilidad en




© OIV 2012 4

el proceso de aislamiento y caracterización las levaduras de vino para una producción vinícola

orientada a la calidad. Se agrupan en criterios tecnológicos, organolépticos y también aquellos

que tienen un impacto en la salud humana. Según la expresión de diferentes características de

las variedades de uva, o de diferentes estilos de vinos, estos criterios podrían adquirir diversa

importancia para cada uno de los distintos mostos, es por ello que no son de carácter

obligatorio. Como los estilos de vino cambian con el tiempo, la lista actual debe considerarse

como una lista abierta, susceptible de cambios en el futuro.

Durante el proceso de caracterización, las pruebas de algunos criterios implican el uso de

medios de crecimiento complejos o sintéticos. Estos medios son de utilidad para obtener las

primeras informaciones sobre las propiedades de la levadura, sin embargo, se deben

considerar únicamente como indicadores, ya que la cepa de levadura puede reaccionar de

manera distinta en el mosto de uva durante la fermentación. De este modo, también se deben

llevar a cabo experimentos en los mostos.

El proceso de elaboración de levaduras secas activas (como nutrición, secado) podría influir en

el rendimiento de la levadura, por lo que también se deben llevar a cabo experimentos con

levaduras secas.

La caracterización de levaduras incluye los aspectos de la producción de vinos de alta calidad,

así como también el cumplimiento de la legislación en términos de seguridad alimentaria. Los

criterios relevantes para los aspectos de seguridad no se indican de manera especial, ya que la

legislación nacional y/o internacional podría diferir entre los estados miembros. La persona o

compañía seleccionadora está, por tanto, obligada a tomar en cuenta estos requisitos legales.

Las líneas directrices se pueden aplicar igualmente para analizar cultivos de levaduras secas.

Es necesario seguir las instrucciones del fabricante a la hora de reactivar e inocular levaduras

secas.

1. CARACTERÍSTICAS QUE INFLUYEN EN LA VINIFICACIÓN 1.1. CARACTERÍSTICAS TECNOLÓGICAS GENERALES 1.1.1 PODER FERMENTATIVO 1.1.1.1 Ámbito de aplicación Criterio estándar para cepas con capacidad de fermentación 1.1.1.2 Fundamento Determinar la cantidad máxima de azúcar que una levadura es capaz de fermentar en un medio rico. 1.1.1.3 Equipo - Esterilizador - Balanza analítica, precisión de 0,1 g - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer de 100 ml con válvula Müller 1.1.1.4 Reactivos y materiales - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 250 g·l

–1 (levaduras para vinificación en blanco) o 300g l

-1 (para cepas de levadura

utilizadas para vinificación en tinto, especialmente en zonas cálidas). Para determinar el comportamiento




© OIV 2012 5

general y comparable de una cepa, se utiliza, en su lugar, un medio sintético de composición similar (véase el Anexo 1 para los medios sintéticos). - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24h en medio YEPD. 1.1.1.5 Procedimiento Las poblaciones de células de levadura se obtienen a través de tres pases sucesivos en un medio líquido durante 48 horas hasta obtener 10

8UFC ml

-1. El volumen del medio utilizado es de 5 ml y la cantidad de

inóculo transferido en cada paso es de 100 µl. A continuación, se transfiere 1 ml de inóculo de levadura a un

matraz Erlenmeyer de 100 ml que contiene 50 ml del medio de fermentación con 250 g·l–1

de azúcar. Sellar el matraz con una válvula Müller. La microvinificación se controla por análisis gravimétrico a 25 ºC. Las levaduras para vinificación deben lograr la fermentación completa de los mostos que contienen 200-250 g/l de azúcar (aproximadamente 11,5-14,5 % v/v de etanol). 1.1.1.6 Cálculos

Poder fermentativo = 2,5 · peso 1.1.1.7 Bibliografía 1. Kunkee, R. E.; Goswell, R. W. Table wines. In: Alcoholic beverages. Ed. A. H. Rose. Academia Press, London, 1977, pp. 315-386. 2. Vaughan-Martini, A.; Martín, A. Determination of ethanol production. In: The yeasts. A taxonomic study. Eds. C. P. Kurtzman, J. W. Fell, Elsevier, 1998, p 107. 1.1.2 VIGOR FERMENTATIVO Y CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN A DETERMINADAS TEMPERATURAS 1.1.2.1 Ámbito de aplicación Criterio estándar para levaduras para vinificación 1.1.2.2 Fundamento El vigor fermentativo, entendido como la velocidad a la que la levadura inicia la fermentación, se expresa en gramos de CO2 producidos de 2 a 3 días después del comienzo de la fermentación. La cinética de la fermentación se controla utilizando una curva (gramos de CO2 producidos o gramos de azúcar fermentado / tiempo) para seleccionar las cepas que muestran un rápido inicio de la fermentación, sin picos debidos a las variaciones de la temperatura y buen rendimiento al término de la fermentación. Una buena cinética de la fermentación se traduce en un menor consumo de energía debido al control de la temperatura. La temperatura es uno de los factores que varían entre los procesos de vinificación. Influye en la producción de acidez volátil y de metabolitos durante la fermentación, así como en la viabilidad de la levadura. 1.1.2.3 Equipo - Esterilizador - Balanza analítica, precisión de 0,1 g - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer de 100 ml con válvula Müller 1.1.2.4. Reactivos y materiales - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 250 g·l

–1. Puede utilizarse en su lugar un medio sintético de composición similar

(Anexo 1). - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24h en el medio YEPD para obtener el cultivo madre. 1.1.2.5 Procedimiento Los cultivos de levadura que se deben analizar se obtienen al inocular 100 µl de cultivo madre en 5 ml de




© OIV 2012 6

medio fresco. Se debe incubar durante 48 horas con 3 pases sucesivos. El medio definitivo para el cultivo debe contener 10

8 UFC ml

-1. La concentración de levadura en el momento de la inoculación en el medio

debe ser aproximadamente de 106 células vivas ml

-1.

La microvinificación se controla por análisis gravimétrico, tal como se describe en 1.1.1.5, pero a diferentes temperaturas de fermentación (15 ºC, 20 ºC, 25 ºC y 30 ºC). Para cada temperatura se traza una curva que muestra las variaciones de CO2 liberado al día, lo que permite estudiar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de fermentación. 1.1.2.6 Cálculos Utilizando las curvas se estudian los siguientes parámetros para cada cepa: longitud de la fase latente (retardo), pendiente de la curva en la fase logarítmica, longitud de la fase estacionaria, y longitud y pendiente de la curva en la fase final. El rango óptimo de la cepa de muestra se halla comparando las curvas obtenidas a diferentes temperaturas. 1.1.2.7 Bibliografía 1. Boned, F.; Colomo, B.; Suárez, J. A. Selección de levaduras vínicas en la D. O. Bierzo. Vitivinicultura, 1992, 3, 37. 2. Calderón, F.; Gutiérrez-Granda, M. J., Suárez-Lepe, J. A. Isolation, identification and physiological characterization of indigenous yeast of Chardonnay grapes from Somontano. Am. J. Enol. Vitic. 1994, 45, 368. 3. Suárez-Lepe, J. A. Levaduras vínicas. Funcionalidad y uso en bodega. Ed Mundiprensa, Madrid, 1997, 23-24. 1.1.3 RESISTENCIA AL SO2 1.1.3.1 Ámbito de aplicación Criterio estándar para levaduras para vinificación 1.1.3.2 Fundamento El dióxido de azufre (SO2) es un antioxidante y un agente bacteriostático utilizado en la vinificación para evitar la oxidación, obtener estabilidad microbiológica y caracterizar levaduras fermentativas en fermentaciones espontáneas. Las cepas que garantizan una fermentación completa cuando las concentraciones de dióxido de azufre libre y dióxido de azufre total son superiores a 30 mg·l

-1 y 50 mg·l

-1,

respectivamente, son adecuadas para la caracterización de levaduras para vinificación. Algunos autores (Ribérau-Gayon, et al. 2003 ), recomiendan concentraciones de dióxido de azufre mayores, de hasta 100-150 ml

-1.

1.1.3.3 Equipo - Esterilizador - Balanza analítica, precisión de 0,1 g - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Placas Petri esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer de 100 ml con válvula Müller 1.1.3.4 Reactivos y materiales 1.1.3.4.1 - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 212 g·l


(Anexo 1).El pH se ajusta a 3,5 con ácido tartárico. - Metabisulfito de potasio - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24h en medio YEPD. Las poblaciones de levaduras se precultivan al inocular 100 µl de cultivo madre en 5 ml de medio fresco. Se




© OIV 2012 7

debe incubar durante 48 horas con 3 pases sucesivos. El medio definitivo para el cultivo debe contener 108

UFC ml-1

. La concentración de levadura en el momento de la inoculación en el medio debe ser aproximadamente de 10

6 células vivas ml

-1.

1.1.3.4.2 - Medio compuesto de mosto de uva agarizado esterilizado. Es posible utilizar un medio sintético de composición similar (Anexo 1). Se incorpora la misma cantidad de mosto de uva, esterilizado en autoclave a 100°C durante 20 minutos, que de solución acuosa esterilizada, con agar al 4%. El pH final del medio es 3,5. - Metabisulfito de potasio - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24h en medio YEPD.

1.1.3.5 Procedimiento 1.1.3.5.1 Se tratan 50 ml de mosto esterilizado (pH 3,5) con metabisulfito de potasio a un nivel de 50 mg·l

–1 de SO2

total. Se prepara un caldo de control sin metabisulfito de potasio. Se inoculan ambos caldos con 1 ml del cultivo sincronizado de la cepa seleccionada. Se controla la producción diaria de CO2 durante la fermentación y se trazan las curvas de crecimiento. Se calcula el poder fermentativo. Se compara el poder fermentativo de la levadura en presencia y ausencia de SO2. Se analizan las desviaciones de la curva en presencia de SO2. Se recomienda vivamente estudiar la influencia de una mayor concentración de SO2 y de la temperatura. 1.1.3.5.2 Se incorporan al medio cantidades variables de solución esterilizada que contiene dióxido de azufre, como metabisulfito de potasio, en función de las dosis de dióxido de azufre probadas, que van de 50 a 300 ppm. El mismo medio sin dióxido de azufre constituye el control positivo. Las cepas crecen durante 24 h en medio YEPD, tras lo cual se inocularán en el medio a una concentración de unas 10

4 células/ml. Tras incubación a

26°C durante 48 h, se compara el crecimiento de la levadura (positivo/negativo) a las diferentes concentraciones respecto al control positivo. El grado de resistencia de la levadura al dióxido de azufre corresponde a la dosis máxima a la que la levadura muestra un crecimiento significativo. 1.1.3.6 Bibliografía 1. Morata, A.; Calderón, F.; Colomo, B.; González, M. C., Uthurry, C.; Varela, F.; Yeramian, N.; Suárez, J. A. Primeros criterios de selección de levaduras para la vinificación en tinto. Semana Vitivinícola. 2005, 3057, 806-809 2. Compendio de métodos internacionales de análisis de los vinos y los mostos. OIV. MA-F-AS323-04-DIOSOU 3. Ribérau-Gayon P., Dubordieu D., Donèche B, Lonvaud A. Trattato di enologia, Vol. I.. Edagricole, Bologna, 2003, 193-220. 4. Romano P., Fiore C., Capece A. Metodi per la caratterizzazione fenotipica di lieviti vinari In: Microbiologia del vino. Eds. Vincenzini M., Romano P., Farris G.A. Casa Editrice Ambrosiana - Milán, Italia, 2005 435-450. 1.1.4 RESISTENCIA AL COBRE 1.1.4.1 Ámbito de aplicación Criterio estándar para levaduras para vinificación 1.1.4.2 Fundamento El cobre aparece en el mosto y el vino como consecuencia del uso de compuestos que contienen cobre durante el control de plagas en el viñedo. Las altas concentraciones de cobre en el mosto tienen efectos tóxicos en el crecimiento y la actividad fermentativa de las células de levadura. Aun así, estas últimas han desarrollado algunos mecanismos de defensa. 1.1.4.3 Equipo - Esterilizador




© OIV 2012 8

- Balanza analítica, precisión de 0,1 g - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Placas Petri esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer de 100 ml con válvula Müller 1.1.4.4 Reactivos y materiales 1.1.4.4.1 - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 212 g·l


(Anexo 1). - Sulfato de cobre - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24h en medio YEPD para obtener el cultivo madre. Las poblaciones de levaduras se precultivan al inocular 100 µl de cultivo madre en 5 ml de medio fresco. Se debe incubar durante 48 horas con 3 pases sucesivos. El medio definitivo para el cultivo debe contener 10

8

UFC ml-1

. La concentración de levadura en el momento de la inoculación en el medio debe ser aproximadamente de 10

6 células vivas ml

-1.

1.1.4.4.2 - Medio compuesto de mosto de uva agarizado esterilizado. Se incorpora la misma cantidad de mosto de uva, esterilizado en autoclave a 100°C durante 20 minutos, que de solución acuosa esterilizada, con agar al 4%. El pH final del medio es 3.5. También es posible utilizar un medio sintético de composición similar (Anexo 1). -Sulfato de cobre - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24hen medio YEPD. 1.1.4.5 Procedimiento La resistencia al cobre de las cepas de levadura se evalúa por microvinificaciones realizadas siguiendo los procedimientos descritos en la sección 1.1.5 y utilizando mosto de uva que contiene diferentes niveles de sulfato de cobre para lograr concentraciones de cobre de 20 a 500 μmol/l. Se realizan microvinificaciones en ausencia de sulfato de cobre como pruebas de control. Tras la inoculación, los matraces se sellan con una válvula Müller y se pesan a diario para conocer la pérdida de peso provocada por la evolución del CO2. Una concentración de cobre que provoca una reducción significativa de la evolución del CO2 en comparación con la prueba de control indica el nivel de resistencia al cobre de la cepa de levadura objeto del ensayo. La resistencia al cobre también puede determinarse por ensayo en placa, tal como se describe en el párrafo 1.3.5.2. Las dosis de cobre, añadidas como sulfato de cobre, van de 20 al 500 μmol/l, en comparación con el control sin el compuesto antimicrobiano. 1.1.4.6 Bibliografía 1. Romano P., Fiore C., Capece A. Metodi per la caratterizzazione fenotipica di lieviti vinari In: Microbiologia del vino. Eds. Vincenzini M., Romano P., Farris G.A. Casa Editrice Ambrosiana - Milán, Italia, 2005. 435-450. 1.1.5 FACTOR KILLER, FENOTIPOS K y N 1.1.5.1 Ámbito de aplicación Criterio estándar de caracterización de levaduras para vinificación. 1.1.5.2 Fundamento Las levaduras killer pueden crecer en detrimento de otras levaduras en determinadas condiciones de vinificación. Las cepas pueden producir la toxina killer (fenotipo M+R+) y son resistentes a la misma. Se ha sugerido que utilizar cepas killer puede potenciar la implantación de la levadura en la vinificación. Sin




© OIV 2012 9

embargo, la toxina killer se tampona en condiciones de vinificación comparada con la toxicidad in vitro. Esto es especialmente cierto en el caso de los vinos tintos. 1.1.5.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización celular - Placas de petri 1.1.5.4 Reactivos y materiales 1.1.5.4.1 - Medio sólido para el cultivo de levadura (YEPD) tamponada - Azul de metileno - Cepas de levadura de fenotipo sensible (S) y killer (K2) 1.1.5.4.2 - Medio sintético de agar de dextrosa de patata (PDA), tamponado a pH 5,6. - Azul de bromofenol 1.1.5.5 Procedimiento 1.1.5.5.1 Crecimiento en medio sólido que contenga azul de metileno y esté tamponado de la cepa a verificar sobre un césped de cepa sensible (fenotipo “S”) sobre el que se siembra una estría de la cepa a verificar. Del mismo modo se siembra otra estría de la cepa a seleccionar sobre un césped de una cepa killer (K2). 1.1.5.5.2 Se inocula un loopful de levaduras probadas en un medio PDA, tras lo cual las placas se incuban a 26°C durante 3-5 días. Las cepas de levadura que forman colonias azul-violeta se consideran cepas killer, mientras que las cepas que forman colonias grises se consideran cepas sensibles. La actividad killer puede evaluarse también por difusión en agar en placa. En detalle, la sensibilidad de la levadura a la toxina killer se evalúa distribuyendo unas 10

5 células de la levadura cuya sensibilidad se desea

probar sobre placas que contienen 25 ml de medio azul de bajo pH (agar YEPD incorporado con un 0,003% (w/v) de azul de metileno, tamponado a pH 4,5 con citrato/fosfato 0,1 M). Tras distribuir la cepa sensible, se prueba la actividad killer inoculando en líquido (una gota que contenga 108 células/ml) o sólido (distribución) la cepa killer sobre la cepa sensible. Las placas se incuban a 25°C durante 4-5 días. La actividad killer se mide en función de la presencia y la dimensión de la zona de inhibición.

1.1.5.6 Bibliografía 1. Suárez-Lepe, J. A. Levaduras vínicas. Funcionalidad y uso en bodega. Ed Mundiprensa, Madrid, 1997, 71-92. 2. Rosini, G. The occurrence of killer characters in yeasts. Can. J. Microbiol., 1983, 29, 1462–1464. 1.1.6 MODO DE CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO

1.1.6.1 Ámbito de aplicación Criterio estándar para la caracterización de levaduras para vinificación 1.1.6.2 Fundamento El modo de crecimiento de las levaduras durante la fermentación es una importante característica tecnológica en tanto que puede afectar a la gestión del proceso fermentativo. En efecto, las células de levadura pueden mostrar distintos modos de crecimiento (por ejemplo, células individuales o agregadas) en función de la hidrofobicidad de la pared celular. En general, se precisa un crecimiento disperso y una rápida sedimentación en las cepas de levadura de vino seleccionadas para el proceso de vinificación estándar.




© OIV 2012 10

1.1.6.3 Equipo - Autoclave - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para cultivo - Espectrofotómetro - Vortex 1.1.6.4 Reactivos y materiales - Medio líquido YEPD 1.1.6.5 Procedimiento Tras incubación en YEPD a 25°C durante 3 días, se mide la densidad óptica de los cultivos de células de levadura a 620 nm justo después de un fuerte agitado (D0) y transcurridos 10 minutos (D1). Los valores del ratio R = D1x100/D0 permiten identificar las cepas de levadura no floculentas (R = 100%) o ligeramente floculentas (R entre el 70 y el 100%) 1.1.6.6 Bibliografía 1. Romano P., Fiore C., Capece A. Metodi per la caratterizzazione fenotipica di lieviti vinari In: Microbiologia del vino. Eds. Vincenzini M., Romano P., Farris G.A. Casa Editrice Ambrosiana - Milán, Italia, 2005. 435-450. 1.1.7 PRODUCCIÓN DE ESPUMA 1.1.7.1 Ámbito de aplicación Criterio estándar para levaduras para vinificación

1.1.7.2 Fundamento La formación de espuma por las levaduras es una característica dependiente de la cepa y se produce durante fermentación del vino en función de la hidrofobicidad de la pared celular. La ausencia de producción de espuma o la baja formación de espuma en las fermentaciones del vino se consideran un rasgo positivo. 1.1.7.3 Equipo - Autoclave - Cabina de flujo laminar

- Membranas de filtración esterilizadas 0,2 m - Balanza analítica - Tubo graduado (50 ml) - Luz infrarroja 1.1.7.4 Reactivos y materiales - Medio sintético (Palmieri et al., 1996) 1.1.7.5 Procedimiento La capacidad de las levaduras para producir espuma se evalúa por medición de la flotación. El medio sintético se inocula a una concentración de 0,2 mg (peso seco celular)/ml y, seguidamente, se introduce en un tubo graduado con la parte superior conectada con un recipiente de vidrio capaz de contener la espuma. Se insufla un flujo de aire (6-7 ml/s) en el fondo del cilindro. Para evaluar la capacidad de la cepa de levadura para producir espuma, se mide la concentración de células al comienzo (Cp), tras la formación de espuma (Cr) y dentro de la espuma (Cs) secando las muestras (1 ml cada una) por luz infrarroja hasta lograr un peso constante. La capacidad de la cepa de levadura para producir espuma se calcula según la fórmula siguiente:

Flot% = (Cp - Cr )/Cs x 100




© OIV 2012 11

1.1.7.6 Bibliografía 1. Palmieri M.C., Greenhalf W., Laluce C. Efficient flotation of yeast cells grown in batch culture. Biotechnology and Bioengineering, 1996, 50: 248-256. 2. Romano P., Fiore C., Capece A. Metodi per la caratterizzazione fenotipica di lieviti vinari In: Microbiologia del vino. Eds. Vincenzini M., Romano P., Farris G.A. Casa Editrice Ambrosiana - Milán, Italia, 2005. 435-450. 1.2. CARACTERÍSTICAS TECNOLÓGICAS PARA LA VINIFICACIÓN DE VINOS BLANCOS 1.2.1 CAPACIDAD PARA FERMENTAR MOSTOS ALTAMENTE CLARIFICADOS CON BAJOS NIVELES DE NITRÓGENO ASIMILABLE 1.2.1.1 Ámbito de aplicación Producción de vinos blancos jóvenes utilizando variedades con un aroma neutro. 1.2.1.2 Fundamento Para mejorar el aroma del vino cuando se utilizan variedades de uva con un aroma neutral, suelen emplearse levaduras que producen ésteres durante la fermentación. La producción de estos compuestos aromáticos puede potenciarse utilizando mostos altamente clarificados. Sin embargo, esto puede provocar interrupciones en la fermentación. Se deben caracterizar las cepas capaces de fermentar con concentraciones cercanas a 100 mg·l

–1 de nitrógeno asimilable.

1.2.1.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer de 100 ml con válvula Müller 1.2.1.4 Reactivos y materiales - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 212 g·l–1. El NAL / NDL se ajusta a 100 mg·l

–1. Puede utilizarse en su lugar un medio

sintético de composición similar (Anexo 1). - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24hen medio YEPD. 1.2.1.5 Procedimiento Se controla la cinética de la fermentación en condiciones de vinificación a pequeña escala y con bajas concentraciones conocidas de NAL / NDL. Al existir un riesgo de interrupción de la fermentación, la fase final debe estudiarse en las curvas. 1.2.1.6 Bibliografía 1. Suárez-Lepe, J. A. Levaduras vínicas. Funcionalidad y uso en bodega. Ed Mundiprensa, Madrid, 1997, 28-40. 1.3 CARACTERÍSTICAS TECNOLÓGICAS PARA LA VINIFICACIÓN EN TINTO 1.3.1 RENDIMIENTO AL TÉRMINO DE LA FERMENTACIÓN EN MOSTOS RICOS EN AZÚCARES. RESISTENCIA AL ESTRÉS DURANTE LA FERMENTACIÓN 1.3.1.1 Ámbito de aplicación Criterio para la caracterización de cepas diseñadas para producir vinos tintos con un alto contenido en alcohol.




© OIV 2012 12

1.3.1.2 Fundamento Determinar la cantidad máxima de azúcar que una levadura es capaz de fermentar en un medio rico. Al producir vinos tintos, en especial en zonas cálidas y con una alta calidad polifenólica, los requisitos de concentración de azúcar pueden generar vinos que contienen un 14,5-15,5 % v/v de alcohol. El estrés en la levadura crea dificultades al término de la fermentación, principalmente debidas a la falta de nutrientes esenciales y a la sinergia tóxica causada por el etanol. Sucede con frecuencia durante las últimas fases de la fermentación de vinos tintos con alto contenido en azúcar. Este proceso puede reproducirse en el laboratorio añadiendo ácidos grasos saturados de cadena corta (C10). Estos compuestos endurecen las membranas biológicas, creando una situación, como la observada en las lentas fases finales de fermentación, en que la levadura tiene dificultades para obtener nutrientes. 1.3.1.3 Equipo - Esterilizador - Balanza analítica, precisión de 0,1 g - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer de 100 ml con válvula Müller 1.3.1.4 Reactivos y materiales - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 212 g·l


(Anexo 1). - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24h en medio YEPD. - Ácido n-decanoico 1.3.1.5 Procedimiento La fermentación en condiciones de vinificación a pequeña escala y con altas concentraciones de ácido n-decanoico (150-200 mg·l

–1) se controla por análisis gravimétrico. Se estudia la cinética utilizando cepas de

control. 1.3.1.6 Bibliografía 1. Morata, A.; Calderón, F.; Colomo, B.; González, M. C.; Suberviola, J.; Suárez, J. A. Mejora de la cinética fermentativa en la vinificación en tinto: Levaduras resistentes a estrés fermentativo. Tecnología del vino, 2004, 15, 39-45. 1.3.2 AUTOLISIS Y LIBERACIÓN DE POLISACÁRIDOS DE LA PARED CELULAR DE LA LEVADURA 1.3.2.1 Ámbito de aplicación Criterio para la caracterización de cepas para producir vinos tintos envejecidos sobre lías mediante la liberación de polisacáridos. 1.3.2.2 Fundamento El uso de levaduras seleccionadas para producir vinos tintos sobre lías aumenta los niveles de autolisis y la liberación de polisacáridos. En los vinos, los polisacáridos mejoran la estabilidad coloidal y el color. 1.3.2.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer - Biorreactor - Secador por congelación - Agitador orbital




© OIV 2012 13

- Centrifuga - Equipo HPLC-IR - Columna para cromatografía por exclusión de tamaño 1.3.2.4 Reactivos y materiales - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 212 g·l–1. Puede utilizarse en su lugar un medio sintético de composición similar para criar las levaduras (Anexo 1). - Modelo de medio para ensayo de autolisis (solución tamponada con alcohol-agua) - Eluyente: NaNO3 (0,1 M) - Etanol 96 % v/v - HCl concentrado - Kit de ensayo enzimático para la determinación del glicerol. 1.3.2.5 Procedimiento Los polisacáridos contenidos en los autolisados de levadura se extraen por precipitación en un medio ácido no polar (etanol: HCl). Se lava con etanol y se centrifuga a 9.000 rpm. Se retira el sobrenadante. A continuación, la muestra se mezcla con NaNO3 0,1 M, se filtra (0,45 µm) y se almacena refrigerada hasta el análisis por HPLC-IR. Se seleccionan las levaduras que liberan altas cantidades de polisacáridos en un breve espacio de tiempo. 1.3.2.6 Bibliografía 1. Suárez-Lepe, J. A.; Morata, A.; Calderón, F.; Somolinos, S.; González, M.C.; Colomo, B. Utilización de levaduras seleccionadas en la crianza sobre lías de vinos tintos. Nuevo método de crianza sobre lías. Tecnología del vino, 2005, 26, 57 -61 2. Suárez-Lepe, J. A.; Morata, A.; Calderón, F.; Somolinos, S.; González, M.C.; Colomo, B. Utilización de levaduras seleccionadas en la crianza sobre lías de vinos tintos. Nuevo método de crianza sobre lías. Alimentación, Equipos y Tecnología, 2005, 207, 39-43. 1.3.3 PRODUCCIÓN DE ALCOHOLES DULCES 1.3.3.1 Ámbito de aplicación Criterio para la caracterización de cepas para producir vinos tintos. 1.3.3.2 Fundamento Los 2,3-butanodioles son los principales polialcoholes de fermentación en los vinos después del glicerol. Pese a presentar una concentración menor, pueden desempeñar un papel complementario al glicerol en la mejora de la estructura y la dulzura. 1.3.3.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer de 100 ml con válvula Müller - Equipo GC-FID 1.3.3.4 Reactivos y materiales - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 212 g·l–1. Puede utilizarse en su lugar un medio sintético de composición similar (Anexo 1). - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24hen medio YEPD. 1.3.3.5 Procedimiento Se mide la producción de 2,3-butanodioles durante la fermentación a pequeña escala utilizando una única




© OIV 2012 14

cepa de levadura en condiciones isotérmicas (25 ºC). Método de análisis: cromatografía gaseosa con detección por ionización de llama (GC-FID). Se seleccionan las cepas que producen 1 g·l

–1 o más.

1.3.4 ADSORCIÓN DE ANTOCIANOS EN LAS PAREDES CELULARES 1.3.4.1 Ámbito de aplicación Criterio para la caracterización de cepas diseñadas para producir vinos tintos, en particular en regiones cuyas condiciones climáticas cálidas provocan una baja síntesis de los antocianos. 1.3.4.2 Fundamento Los antocianos son adsorbidos en gran medida por paredes celulares de la levadura durante la fermentación y la maceración, en función de la naturaleza polar de los antocianos y la estructura de la pared celular. Deben seleccionarse las levaduras con un bajo nivel de adsorción de antocianos en las paredes celulares para minimizar la pérdida de antocianos y la posible influencia en el color del vino. 1.3.4.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Centrifuga - Equipo HPLC-DAD-MS - Columna HPLC de fase reversa C18 1.3.4.4 Reactivos y materiales - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24hen medio YEPD. - Uva de vino tinto aplastada o medio modelo con extractos de antociano. - Metanol - Ácido fórmico - Agua Milli-Q 1.3.4.5 Procedimiento Se fermenta un mosto de uva de vino tinto o un medio modelo que contenga un extracto de antociano utilizando una única cepa de levadura en condiciones de fermentación estándares a pequeña escala. La biomasa de levadura se obtiene por centrifugado. Se extraen, se cuantifican y se identifican por HPLC-PDA los antocianos adsorbidos por las paredes celulares. La adsorción de antocianos por las paredes celulares de la levadura varía del 2% al 6%. 1.3.4.6 Bibliografía 1. Morata, A.; Gómez-Cordovés, M. C.; Suberviola, J.; Bartolomé, B.; Colomo, B.; Suárez, J. A. Adsorption of anthocyanins by yeast cell walls during the fermentation of red wines. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 4084-4088. 2. Morata, A.; Gómez-Cordovés, M. C.; Colomo, B.; Suárez, J. A. Cell wall anthocyanin adsorption by different Saccharomyces strains during the fermentation of Vitis vinifera L. cv Graciano grapes. Eur. Food Res. Technol. 2005, 220, 341-346. 1.3.5 PRODUCCIÓN ÓPTIMA DE ACETALDEHÍDO Y ÁCIDO PIRÚVICO PARA POTENCIAR LA PRODUCCIÓN DE VITISINAS 1.3.5.1 Ámbito de aplicación Criterio para la caracterización de cepas diseñadas para producir vinos tintos, en particular aquellos envejecidos en madera, utilizando piranoantocianos altamente estables.




© OIV 2012 15

1.3.5.2 Fundamento Las vitisinas son pigmentos altamente estables. Pueden soportar el dióxido de azufre, la hidratación y las reacciones de oxidación. Las vitisinas no están presentes en la uva pero se producen durante la fermentación fruto de reacciones de condensación que implican a ciertos metabolitos (acetaldehído y ácido pirúvico). Estructuralmente, las vitisinas pertenecen al grupo de los piranoantocianos. El uso de las levaduras seleccionadas, que producen acetaldehído y ácido pirúvico a niveles óptimos, potencia la producción de estos pigmentos altamente estables durante la fermentación. 1.3.5.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Equipo HPLC-DAD-MS - Columna HPLC de fase reversa C18 1.3.5.4 Reactivos y materiales - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24h en medio YEPD. - Uva tinta prensada fresca o medio modelo con extractos de antociano. También es posible utilizar medios sintéticos de composición similar (Anexo 1) - Metanol - Ácido fórmico - Agua Milli-Q 1.3.5.5 Procedimiento Se inocula un mosto tinto con una cepa precultivada de levadura y se controla la fermentación en condiciones de vinificación a pequeña escala. La formación de vitisinas se estudia por HPLC-PDA y HPLC-ESI-MS. El ensayo se realiza por triplicado para aumentar la fiabilidad. Se seleccionan las cepas que potencian la formación de piranoantocianos. 1.3.5.6 Bibliografía 1. Morata, A.; Gómez-Cordovés, M. C.; Colomo, B.; Suárez, J. A. Pyruvic acid and acetaldehyde production by different strains of Saccharomyces cerevisiae: Relationship with vitisin A and B formation in red wines. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 7402-7409 2. Morata, A.; Calderón, F.; González, M. C.; Gómez-Cordovés, M. C.; Suárez, J. A. Formation of the highly stable pyranoanthocyanins (vitisins A and B) in red wines by the addition of pyruvic acid and acetaldehyde. Food. Chem. 2007, 100, 1144-1152. 3. Morata, A.; Calderón, F.; González, M. C.; Colomo, B.; Suárez, J. A. Formación de vitisinas durante la fermentación de vinos tintos. Tecnología del vino, 2004, 21, 61-65. 1.3.6 CEPAS CON ACTIVIDAD HIDROXICINAMATO DESCARBOXILASA Y FORMACIÓN DE PIRANOANTOCIANOS VINILFENÓLICOS 1.3.6.1 Ámbito de aplicación Criterio para la caracterización de cepas diseñadas para producir vinos tintos, en particular aquellos envejecidos en madera, utilizando piranoantocianos altamente estables. 1.3.6.2 Fundamento Los derivados del antociano vinilfenólico son pigmentos de tipo piranoantociano. Tienen propiedades similares a las vitisinas. No se encuentran en la uva, sino que se producen durante la fermentación por reacciones de condensación en la que participan vinilfenoles, formados a partir de ácidos hidroxicinámicos. Éstos son producidos por cepas positivas en actividad hidroxicinamato descarboxilasa de Saccharomyces. Las cepas de levadura positivas en actividad hidroxicinamato descarboxilasa potencian la producción de estos pigmentos altamente estables durante la fermentación.




© OIV 2012 16

1.3.6.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Equipo HPLC-DAD-MS - Columna HPLC de fase reversa C18 1.3.6.4 Reactivos y materiales - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24h en medio YEPD. - Uva tinta prensada fresca o medio modelo con extractos de antociano. También es posible utilizar medios sintéticos de composición similar (Anexo 1) - Metanol - Ácido fórmico - Agua Milli-Q - Ácido p-coumárico, ácido felúrico y ácido cafeico. 1.3.6.5 Procedimiento Debe inocularse un mosto tinto con una cepa precultivada de levadura, controlando la fermentación en condiciones de vinificación a pequeña escala. La formación de aductos de antocianos vinilfenólicos se estudia por HPLC-PDA y HPLC-ESI-MS. El ensayo se realiza por triplicado para aumentar la fiabilidad. 1.3.6.6 Bibliografía 1. Morata, A.; Calderón, F.; González, M. C.; Colomo, B.; Suárez, J. A. Protección de color y aroma en vinos tintos mediante la formación de derivados vinilfenólicos de antocianos. Tecnología del vino, 2005, 24,32-36 2. Morata, A.; Gómez-Cordovés, M. C.; Calderón, F.; Suárez, J. A. Effects of pH, temperature and SO2 on the formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of Saccharomyces. Int. J. Food Microbiol. 2006, 106, 123-129. 3. Morata, A.; González, C.; Suárez, J. A. Formation of vinylphenolic pyranoanthocyanins by selected yeasts fermenting red grape musts supplemented with hydroxycinnamic acids. Int. J. Food Microbiol. 2007, 116, 144-152.

1.3.7 ACTIVIDAD -GLUCOSIDASA 1.3.7.1 Ámbito de aplicación Criterio para la caracterización de cepas diseñadas para la producción de vinos tintos. 1.3.7.2 Fundamento

Los antocianos se encuentran en forma de glucósidos en la uva. Algunas cepas con actividad -glucosidasa extracelular pueden hidrolizar los antocianos en aglicones que son más inestables. Esto puede

influir en la estabilidad cromática. Para los vinos tintos, se seleccionan las cepas negativas en actividad -glucosidasa. 1.3.7.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo 1.3.7.4 Reactivos y materiales - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24h en medio YEPD. - Tira reactiva API ZYM para actividad enzimática extracelular (bioMérieux SA, Lyón, Francia). 1.3.7.5 Procedimiento

Detección in-vitro de actividad -glucosidasa extracelular. Se utilizan cultivos puros sincronizados que




© OIV 2012 17

contienen 108 CFU·ml–1

(24-48 horas). Se prueba la actividad -glucosidasa en condiciones de vinificación. Método: Tiras reactivas API ZYM (bioMérieux SA, Lyón, Francia). Se seleccionan las cepas negativas en actividad β-glucosidasa. 1.3.7.6 Bibliografía 1. Suárez-Lepe, J. A. Levaduras vínicas. Funcionalidad y uso en bodega. Ed Mundiprensa, Madrid, 1997, 110-111. 2. Delcroix, J.; Gunata, Z.; Sapis, J. C.; Salmon, J. M. ; Bayonave, C. Glycosidase Activities of Three Enological Yeast Strains During Winemaking: Effect on the Terpenol Content of Muscat Wine. Am. J. Enol. Vitic. 1994, 45, 291-296. 2. CARACTERÍSTICAS QUE INLFUYEN EN LA CALIDAD ORGANOLÉPTICA DEL VINO 2.1 PRODUCCIÓN DE ACIDEZ VOLÁTIL 2.1.1 Ámbito de aplicación Criterio estándar para la caracterización de levaduras para vinificación 2.1.2 Fundamento La acidez volátil se expresa como g/l de ácido acético. El ácido acético es un producto derivado de la fermentación que causa defectos en el vino si existen en una concentración elevada. Es un indicador de problemas microbiológicos. La mayoría de las normativas en zonas productoras de vino establecen un límite para la cantidad de acidez volátil en los vinos acabados. Para potenciar la maceración, las temperaturas de fermentación utilizadas suelen ser mayores para los vinos tintos que para los vinos blancos (25-32 ºC). La producción de acidez volátil es directamente proporcional a la temperatura de fermentación. Las cualidades sensoriales de los vinos tintos pueden mejorarse con levaduras capaces de fermentar a estos rangos de temperatura y que presentan una baja producción de acidez volátil. 2.1.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer de 100 ml con válvula Müller - Equipos de destilación al vapor y material de titulación (dosificación) 2.1.4. Reactivos y materiales - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 212 g·l


(Anexo 1). - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24h en medio YEPD. - Reactivos para la determinación del ácido acético [1] 2.1.5 Procedimiento Se mide la acidez volátil producida durante la fermentación a pequeña escala utilizando una cepa de levadura pura en condiciones isotérmicas a temperatura controlada (30-32 ºC). Se seleccionan los valores de temperatura en función de si se trata de vinificación en tinto o en blanco. La concentración de levadura en el momento de la inoculación en el medio dado debe ser de aproximadamente 10

6 células vivas ml

-1

Método de análisis: método de referencia de la OIV, destilación al vapor y titulación ácido-base [1]. Alternativamente, la cantidad de ácido acético producido por las levaduras objeto de la selección pueden determinarse utilizando el método enzimático. Además, el ácido acético puede determinarse por cromatografía líquida (HPLC) con detección UV. El ensayo debe realizarse por triplicado para obtener una mayor significación estadística. Se recomienda estudiar la producción de acidez volátil en relación con la temperatura, según el tipo de vinificación.




© OIV 2012 18

2.1.6 Bibliografía 1. Compendio de métodos internacionales de análisis de los vinos y los mostos. OIV. MA-F-AS313-02-ACIVOL. 2006. 2. Calderón, F.; Gutierrez-Granda, M. J., Suárez-Lepe, J. A. Isolation, identification and physiological characterization of indigenous yeast of Chardonnay grapes from Somontano. Am. J. Enol. Vitic. 1994, 45, 368. 2.2 PRODUCCIÓN DE GLICEROL 2.2.1 Ámbito de aplicación Criterio para la caracterización de cepas diseñadas para producir vinos tintos. 2.2.2 Fundamento El glicerol es un polialcohol. Es el compuesto más abundante en el vino tras el agua y el etanol. El glicerol desempeña un papel destacado en la estructura del vino ya que aumenta su densidad y su dulzura. La cantidad de glicerol producida depende de la concentración inicial de azúcar, las condiciones de fermentación y la cepa de levadura. El uso de cepas superproductoras de glicerol desempeña un papel doble en la mejora de la estructura del vino tinto: por una parte, incrementan la estructura y la densidad, y, por otra, potencia la integración de los taninos, mitigando así la aspereza y astringencia. 2.2.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer de 100 ml con válvula Müller - Espectrofotómetro UV-VIS - Cubetas 2.2.4 Reactivos y materiales - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 212 g·l


(Anexo 1). - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24hen medio YEPD. - Kit de ensayo enzimático para la determinación del glicerol. 2.2.5 Procedimiento Se obtienen muestras de 50 ml para la determinación de glicerol en condiciones de vinificación a pequeña escala, a una temperatura de 25 ºC utilizando levaduras sincronizadas para la inoculación. Tras la fermentación, las muestras se analizan utilizando un kit de ensayo enzimático para determinar el glicerol en los alimentos. Alternativamente, el glicerol puede determinarse por cromatografía líquida (HPLC) con detección IR. El ensayo debe realizarse por triplicado y utilizando una cepa de alto rendimiento para el control. La levaduras del género Saccharomyces suelen producir de 5 a 8 g·l

–1 de glicerol.

2.2.6 Bibliografía 1. Eggstein, M.; Kuhlmann, E. In Methods of enzymatic analysis. Bergmeyer, H. U., Ed.; 3er ed.; Academic Press, Inc.: New York, 1974; Vol IV, pp 1825-1831 2. Compendio de métodos internacionales de análisis de los vinos y los mostos. OIV. MA-F-AS312-05-GLYENZ. 2006 3. Walter, E.; Kohler, P. Ringversuch für dieenzymatische bestimmung von glycerin. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1985, 180, 121-125.




© OIV 2012 19

2.3 PRODUCCIÓN DE ALCOHOLES SUPERIORES 2.3.1 Ámbito de aplicación Criterio para la caracterización de cepas diseñadas para producir vinos tintos. 2.3.2 Principio Los principales alcoholes superiores hallados en el vino son: n-propanol, isobutanol, amil- alcohol activo, isoamil alcohol, 2-feniletanol. Estos alcoholes se producen durante el catabolismo de carbohidratos o por catabolismo del aminoácido correspondiente (treonina, valina, isoleucina, fenilalanina). Son responsables del aroma alcohólico de la fermentación de los vinos. En bajas cantidades, estos compuestos influyen positivamente en el aroma del vino, mientras que a altas concentraciones (>350 mgl

-1) afectan

negativamente el aroma, en particular, el isoamil alcohol. Si se producen vinos blancos jóvenes a partir de cultivares aromáticos, debe seleccionarse el iniciador de levadura que produzca menos alcoholes superiores. Si se producen vinos blancos jóvenes a partir de cultivares neutros, es preciso minimizar la producción de alcoholes superiores (<400 mg l

-1)

La cantidad de alcoholes superiores en los vinos tintos de alta calidad debe limitarse utilizando levaduras seleccionadas que produzcan menos de 300 mg·l

–1 para evitar los aromas de fermentación que esconden

aromas varietales o de la crianza en madera. 2.3.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer de 100 ml con válvula Müller - Equipo GC-FID 2.3.4 Reactivos y materiales - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 212 g·l


(Anexo 1). - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24hen medio YEPD. 2.3.5 Procedimiento Se mide la producción de alcoholes superiores durante la fermentación a pequeña escala utilizando una única cepa de levadura en condiciones isotérmicas (25 ºC). Método de análisis: cromatografía gaseosa con detección por ionización de llama (GC-FID). 2.4 PRODUCCIÓN DE ACETALDEHÍDO 2.4.1 Ámbito de aplicación Criterio estándar para levaduras para vinificación 2.4.2 Fundamento El acetaldehído es un producto de la fermentación alcohólica y representa el 90% de los aldehídos totales del vino. En general, la presencia de altas cantidades de acetaldehído en el vino es negativa, ya que produce un olor amargo y un sabor oxidado y herbáceo cuando la concentración alcanza los 100-125 mgl

-1.

2.4.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer de 100 ml con válvula Müller




© OIV 2012 20

- Equipo GC-FID 2.4.4 Reactivos y materiales - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 212 g·l


(Anexo 1). - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24h en medio YEPD 2.4.5 Procedimiento Se controla la producción de ésteres en condiciones de vinificación a pequeña escala e isotérmicas 25 ºC utilizando levaduras sincronizadas para la inoculación. Método de análisis: GC-FID 2.5 PRODUCCIÓN DE ÉSTERES 2.5.1 Ámbito de aplicación Criterio para la caracterización de cepas diseñadas para producir vinos tintos. 2.5.2 Principio Los ésteres son producidos por las levaduras durante la fermentación alcohólica; estos compuestos aparecen por la condensación de los ácidos acéticos y de los ácidos grasos con etanol u otros alcoholes presentes en el vino. El principal éster del vino es el acetato de etilo, que contribuye principalmente al aroma del vino, confiriéndole el típico olor a vinagre. Unas concentraciones de 50 a 80 mgl

-1 son deseables para el

aroma del vino, aunque si son mayores resultan desagradables. Para mejorar la nariz del vino al utilizar variedades con un aroma neutral, se seleccionan ésteres productores de levadura durante la fermentación, aumentando así los compuestos aromáticos secundarios responsables del carácter afrutado (isoamil acetato, isobutil acetato, etc.). Para mejorar la nariz del vino al utilizar variedades aromáticas ricas en terpenos, se utilizan levaduras que producen un mínimo de compuestos volátiles durante la fermentación. Los compuestos volátiles producidos durante la fermentación suelen ocultar o reducir algunos aromas varietales que resultan cruciales desde el punto de vista sensorial. Las cepas de levadura adecuadas para la vinificación deben producir diferentes cantidades de ésteres en función de la técnica de vinificación. 2.5.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer de 100 ml con válvula Müller - Equipo GC-FID 2.5.4 Reactivos y materiales - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 212 g·l


(Anexo1). - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24hen medio YEPD. 2.5.5 Procedimiento Se controla la producción de ésteres en condiciones de vinificación a pequeña escala e isotérmicas (25 ºC) utilizando levaduras para la inoculación. Método de análisis: GC-FID 2.5.6 Bibliografía 1. Calderón, F.; Gutiérrez-Granda, M. J., Suárez-Lepe, J. A. Isolation, identification and physiological characterization of indigenous yeast of Chardonnay grapes from Somontano. Am. J. Enol. Vitic. 1994, 45, 368.




© OIV 2012 21

2. Morata, A.; Calderón, F.; Colomo, B.; González, M. C., Uthurry, C.; Varela, F.; Yeramian, N.; Suárez, J. A. Primeros criterios de selección de levaduras para la vinificación en tinto. Semana Vitivinícola. 2005, 3057, 806-809. 2.6 PRODUCCIÓN DE COMPUESTOS SULFUROSOS VOLÁTILES (SULFURO DE HIDRÓGENO Y MERCAPTANOS) 2.6.1 Ámbito de aplicación Criterio estándar para la caracterización de levaduras para vinificación. La producción de menores compuestos volátiles se ve potenciada por algunas variedades de uva. 2.6.2 Fundamento Durante la fermentación, es mejor utilizar cepas que producen la menor cantidad de compuestos de H2S y de azufre, como mercaptanos para la caracterización de levaduras para vinificación. Esto se aplica especialmente a los vinos tintos. 2.6.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo y ensayo - Tapas Capoteck - Placas de petri esterilizadas 2.6.4 Reactivos y materiales 2.6.4.1 - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 212 g·l


(Anexo 1). El pH se ajusta a 3.5 con ácido tartárico. - Solución saturada de acetato de plomo. - Tira de celulosa de 10 × 1 cm 2.6.4.2 - Medio sintético Agar BiGGY - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura se sincronizan en un medio YEPD 2.6.5 Procedimiento 2.6.5.1 Se inocula en tubos de ensayo que contienen 5 ml de medio de fermentación con 100 µl de cultivo Se coloca una tira de celulosa empapada en acetato de plomo encima del tubo. Se compara cuantitativamente el H2S producido en condiciones de vinificación a pequeña escala mediante cepas individuales. Método de análisis semi-cuantitativo. El H2S producido reacciona con el acetato de plomo, formando sulfuro de plomo, que aparece como una mancha oscura. La cantidad de sulfuro de plomo es directamente proporcional a la cantidad de H2S liberado. Cuanto más H2S, mayor y más oscura es la mancha. 2.6.5.2 Las cepas de levadura se inoculan (10

8 células/ml) en un medio Agar BiGGY y las placas se incuban a 26°C

durante 24 h. Las cepas de levadura desarrollarán colonias de un color que va del blanco-crema al marrón-negro a medida que aumenta la cantidad de sulfuro de hidrógeno producida. 2.6.6 Bibliografía 1. Morata, A.; Calderón, F.; Colomo, B.; González, M. C., Uthurry, C.; Varela, F.; Yeramian, N.; Suárez, J. A. Primeros criterios de selección de levaduras para la vinificación en tinto. Semana Vitivinícola. 2005, 3057, 806-809.




© OIV 2012 22

2.7 ACTIVIDAD SOBRE EL ÁCIDO MÁLICO Las cepas de levadura poseen la capacidad de degradar o producir ácido málico. En zonas templadas, con mostos de uva de alta acidez y bajo pH, son preferibles las cepas que posean una alta capacidad para degradar el ácido málico. Por el contrario, en presencia de mostos de uva de baja acidez y alto pH que producen vinos con suficiente acidez, son preferibles las cepas de levadura que produzcan ácido málico. 2.7.1 Ámbito de aplicación Producción de vinos blancos con uvas procedentes de regiones cuyas temperaturas son insuficientes para lograr una maduración completa. Producción de vinos blancos con uvas procedentes de regiones cálidas con baja acidez. Criterios para la caracterización de cepas para la producción de vinos tintos. 2.7.2 Fundamento La mayoría de las cepas de Saccharomyces cerevisiae pueden degradar el ácido málico, pero sólo algunas pueden hacerlo en grandes cantidades, contribuyendo así a eliminarlo. Esto puede resultar de especial interés para reducir la acidez en los vinos producidos en regiones donde la maduración es pobre. Algunas cepas de Saccharomyces cerevisiae producen ácido málico como un derivado de la fermentación alcohólica. En los mostos producidos en regiones cálidas, pueden reducirse los niveles de pH y mejorarse la acidez utilizando levaduras capaces de producir grandes cantidades de ácido málico. El uso de cepas que degradan el ácido málico potencia la fermentación maloláctica, fruto de la acción de bacterias. 2.7.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer de 100 ml con válvula Müller - Espectrofotómetro UV-VIS - Cubetas 2.7.4 Reactivos y materiales - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 212 g·l


(Anexo 1). - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24h en medio YEPD. - Kit de ensayo enzimático para la determinación de ácido málico. 2.7.5 Procedimiento Se obtienen muestras de 50 ml para determinar el ácido málico en condiciones de vinificación a pequeña escala e isotérmicas (25 ºC). Tras la fermentación, las muestras se analizan utilizando un kit de ensayo enzimático para determinar el ácido málico en los alimentos. El ensayo debe realizarse por triplicado para aumentar la fiabilidad. 2.7.6 Bibliografía 1. Calderón, F.; Gutiérrez-Granda, M. J., Suárez-Lepe, J. A. Isolation, identification and physiological characterization of indigenous yeast of Chardonnay grapes from Somontano. Am. J. Enol. Vitic. 1994, 45, 368. 2. Suárez-Lepe, J. A. Levaduras vínicas. Funcionalidad y uso en bodega. Ed Mundiprensa, Madrid, 1997, 153-156 3. Mayer, H.; Pause, G. Äpfelsaure-, milchsäure-, und zitronensäure gehalte in Schweizer weinen. Vitis, 1969, 8, 38-49 4. Klopper, W. J.; Angelino, S. A.; Tuning, B.; Vermeire, H. A. Organic acids and glycerol in beer. J. Inst. Brew., 1986, 92, 225-228 5. Compendio de métodos internacionales de análisis de los vinos y los mostos. OIV. MA-F-AS313-11-ALMENZ. 2006




© OIV 2012 23

7. Morata, A.; Calderón, F.; Colomo, B.; González, M. C., Uthurry, C.; Varela, F.; Yeramian, N.; Suárez, J. A. Primeros criterios de selección de levaduras para la vinificación en tinto. Semana Vitivinícola. 2005, 3057, 806-809.

2.8 ACTIVIDAD -GLUCOSIDASA PARA POTENCIAR LA LIBERACIÓN DE TERPENOS 2.8.1 Ámbito de aplicación Producción de vinos blancos jóvenes utilizando variedades aromáticas. 2.8.2 Fundamento En la mayoría de variedades aromáticas, suelen existir precursores aromáticos en los que los terpenos se encuentran en forma de glucósidos, lo que reduce su volatilidad. Algunas cepas de Saccharomyces

cerevisiae tienen actividades -glucosidasa y -xilosidasa y pueden utilizarse para optimizar la liberación de terpenos 2.8.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo 2.8.4 Reactivos y materiales - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24h en medio YEPD. - Tira reactiva API ZYM para la actividad enzimática extracelular (bioMérieux SA, Lyón, Francia).

- Determinación cualitativa: Medio YNB (Levadura con base de nitrógeno) agarizado que contenga xilosa como fuente de carbono,

incorporado a una solución específica, como MUX (4-metilumbeliferilo--D-xilosido), para la actividad -D-

xilosidasa. Medio que contenga arbutina como fuente de carbono, incorporado a citrato de amonio férrico,

para la actividad -D-glucosidasa.

- Determinación cuantitativa. La actividad - glucosidasa se determina en un medio que contiene 1,7 g l–1

de Levadura con base de nitrógeno (Difco) (sin aminoácidos ni sulfato de amonio), 5 g l

–1 de sulfato de

amonio, 5 g l–1

de extracto de levadura, 5 g l–1

de peptona, 10 g l –1

de glucosa, pH 5,5. Para la

determinación de la actividad - xilosidasa se emplea le mismo medio, sustituyendo la glucosa por xilosa. La

actividad- glucosidasa se mide utilizando -nitrofenil--D-glucosidasa (-NPG); la actividad -xilosidasa se

mide utilizando -nitrofenil--D-xilosidasa (-NPX) como sustrato. Antes de la inoculación, se cultivan las levaduras desde la víspera en medio GPY (glucosa, 40 g l

-1; peptona, 5 g l

-1; extracto de levadura, 5 g l

-1; pH

5,5) a 25°C en un agitador orbital a 200 rpm.

2.8.5 Procedimiento Detección in vitro de actividad α-glucosidasa extracelular. Se utilizan cultivos puros que contienen 108 CFU·ml

–1 (24-48 horas). La actividad α-glucosidasa se prueba en condiciones de vinificación. Método: tira

reactiva API ZYM. 2.8.5.1 Determinación cualitativa Se inoculan células frescas de cepas de levadura en las placas, que se incuban a 26°C durante 24 h (para

la actividad -D-xilosidasa) o durante 2-4 días en el caso de la actividad -D-glucosidasa.

La actividad -D-xilosidasa se determina por fluorescencia UV. Las colonias de cepa que muestran

fluorescencia se consideran positivas en esta actividad: de hecho, la enzima -D-xilosidasa determina la

hidrólisis de MUX, liberando MU (4-metilumbeliferilo), visualizado por exposición a UV.

Las cepas de levadura positivas en actividad -D-glucosidasa muestran colonias marrones en un medio que

contiene arbutina como fuente de carbono.




© OIV 2012 24

2.8.5.2 Determinación cuantitativa Tras un pre-crecimiento en medio GPY, las cepas de levadura se cultivan en el medio antes indicado a 26°C durante 3 días en un agitador orbital a 200 rpm. La fase superior, cosechada por centrifugación, se añade a

0,2 ml de NPG o NPX; tras 1 h de incubación a 30°C, se mide la absorbancia a 404 nm para determinar

la cantidad de -nitrofenil liberada por la actividad enzimática. Las actividades-D-glucosidasa y -D-

xilosidasa se expresan en moles de NP/h/ml de fase superior.

2.8.6 Bibliografía 1. Suárez-Lepe, J. A. Levaduras vínicas. Funcionalidad y uso en bodega. Ed Mundiprensa, Madrid, 1997, 110-111. 2. Delcroix, J.; Gunata, Z.; Sapis, J. C.; Salmon, J. M. ; Bayonave, C. Glycosidase Activities of Three Enological Yeast Strains During Winemaking: Effect on the Terpenol Content of Muscat Wine. Am. J. Enol. Vitic. 1994, 45, 291-296 3. Manzanares, P., Ramón, D., Querol, A. (Screening of non-Saccharomyces wine yeasts for the production

of -D-xylosidase activity. Int. J. Food Microbiol. 1999, 46, 105-112.

4. Manzanares, P., Rojas, V., Genovés, S., Vallés, S. A preliminary search for anthocyanin--D-glucosidase activity in non-Saccharomyces wine yeasts. Int. J. Food Sci. Technol. 2000, 35, 95-103. 3 CRITERIOS DE SALUBRIDAD DEL VINO 3.1 PRODUCCIÓN DE CARBAMATO DE ETILO POR CEPAS NEGATIVAS PARA LA ENZIMA ARGINASA 3.1.1 Ámbito de aplicación Criterio para la caracterización de cepas diseñadas para producir vinos tintos. 3.1.2 Fundamento El carbamato de etilo (uretano) es un compuesto tóxico que se ha demostrado que puede ser cancerígeno. La aparición de carbamato de etilo en los vinos está relacionada con la actividad microbiana (de las levaduras y las bacterias lácticas) a determinados valores de pH y a determinadas concentraciones de precursores nitrogenados El uso de levaduras caracterizadas es un buen medio para controlar los niveles de este controvertido compuesto. Es importante recordar que algunos países han fijado límites para la concentración de carbamato de etilo en los vinos de importación. 3.1.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer - Equipo GC-MS - Columna capilar - Equipo de extracción de columna - Evaporador rotativo 3.1.4 Reactivos y materiales - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 212 g·l


(Anexo 1). - Diclorometano 3.1.5 Procedimiento En primer lugar, el carbamato de etilo se obtiene por concentración y extracción a partir de 50 ml de la muestra fermentada (producida en condiciones de vinificación a pequeña escala y utilizando una cepa




© OIV 2012 25

seleccionada de levadura), y seguidamente se determina por GC-MS en modo SIM. 3.1.6 Bibliografía 1. Uthurry, C.A.; Varela, F.; Colomo, B.; Suárez Lepe, J. A.; Lombardero, J.; García del Hierro, J. R. Ethyl carbamate concentrations of typical Spanish red wine. Food Chemistry, 2004, 88, 329-336 2. Uthurry, C.A.; Suárez Lepe, J. A.; Lombardero, J.; García del Hierro, J. R. Ethyl carbamate production by selected yeasts and lactic acid bacteria in red wine, Food Chemistry, 2006, 94, 262-270 3.2 PRODUCCIÓN DE HISTAMINA A pH ALTO 3.2.1 Ámbito de aplicación Criterio para la caracterización de cepas diseñadas para producir vinos tintos. 3.2.2 Fundamento Las aminas biogénas, como la etanolamina, la feniletilamina, la metilamina, la agmatina, la histamina, la putrescina, la cadaverina y la tiramina, son bases orgánicas nitrogenadas de bajo peso molecular que pueden estar presentes en el vino, producidas principalmente por la descarboxilación microbiana de aminoácidos. En concentacione elevadas, estos compuestos pueden afectar negativamente la salubridad del vino. Las aminas biogénas son moléculas producidas por el metabolismo del nitrógeno. Pueden producir efectos tóxicos en función de la concentración y la sensibilidad individual. Asimismo, resultan perjudiciales para las personas sensibles a la histamina. De forma más general, pueden causar dolor de cabeza y otros efectos adversos. Además, el etanol presente en el vino fortalece los efectos tóxicos de las aminas biogénicas. Las levaduras participan en la producción de etanolamina, agmatina y feniletilamina, mientras que las levaduras para vinificación son bajas productoras de histamina, la amina más tóxica. En cualquier caso, la capacidad para producir aminas biogénicas debe incluirse entre los criterios de caracterización de levaduras para vinificación. Como para el carbamato de etilo, algunos países imponen límites de concentración de aminas biogénas, en particular de histamina, en las importaciónes/exportaciónes de vinos. 3.2.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer - Equipo HPLC FDA - Columna C18 3.2.4 Reactivos y materiales - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 212 g·l


(Anexo 1). 3.2.5 Procedimiento Se determina la concentración de histamina producida por una levadura seleccionada en condiciones de vinificación estándares a pequeña escala. La detección y la cuantificación se realizan por HPLC FDA previa derivatización con cloruro de dansilo u o-ftaldialdehído (OPA). 3.2.6 Bibliografía 1.Galgano F., Caruso M.,Favati F., Romano P. HPLC determination of agmatine and other amines in wine. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin, 2003, 74, 237-242 2. Caruso M., Fiore C., Contorsi M., Salzano G., Paparella A., Romano P. Formation of biogenic amines as criteria for the selection of wine yeasts. World Journal Microbiol. Biotechnol., 2002, 18, 159-163.




© OIV 2012 26

3. Granchi L., Romano P., Mangani S., Guerrini S., Vicenzini M. Production of biogenic amines by wine microorganisms, Bulletin dell’OIV, 2005, 78, 595-609. 3.3 ACTIVIDAD DE LA LEVADURA SOBRE LA OCRATOXINA A (OTA) 3.3.1 Ámbito de aplicación Criterio estándar para la caracterización de levaduras para vinificación. 3.3.2 Fundamento La ocratoxina A (OTA) es una micotoxina presente en el vino como consecuencia de la actividad metabólica de los mohos presentes en la uva. Dado que la OTA posee propiedades nefrotóxicas, hepatotóxicas y teratogénicas para los humanos y los animales, ha sido clasificada como posible agente cancerígeno para los humanos (Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer, grupo 2B, 1993). Recientemente,

Europa ha fijado el nivel residual máximo de OTA en los vinos en 2 g/l. Algunas levaduras son capaces de reducir el contenido de OTA en el vino, de modo que conviene seleccionar cepas con esta actividad. 3.3.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer con válvula Müller - Balanza analítica, precisión de 0,1 g - Equipo HPLC 3.3.4 Reactivos y materiales Se emplea un medio sintético de fermentación (6,7% de levadura con base de nitrógeno (YNB), 20% de glucosa y 0,1% de fosfato de diamonio, ajustado a pH 3,6 con ácido tartárico). 3.3.5 Procedimiento Se preparan precultivos de levadura en 50 ml de medio sintético de fermentación en un agitador rotativo a 250 rpm durante 24 h a 25 °C. Se inocula una suspensión con una concentración de 1 x 10

6 células/ml en matraces Erlenmeyer de 100 ml

con válvula Müller que contienen medio sintético de fermentación, al que se han incorporado 10µg/l de OTA. Las muestras se incuban sin agitado a 26 °C. Se controla a diario la pérdida de peso hasta que dejan de observarse variaciones. Se transfiere una alícuota de 5 ml del medio de cultivo inoculado con diferentes cepas a un tubo de vidrio y se centrifuga a 4.000 rpm durante 5 min. Se transfiere 1 ml de la capa acuosa, previamente separada de las levaduras, a un vial y se inyecta para realizar un análisis HPLC. La fase sólida (levaduras) se extrae con 5 ml de acetato de etilo en un mezclador Vortex durante 30 s. Se combinan los extractos y se evaporan poco a poco 2 ml de la solución resultante hasta secado con nitrógeno. El residuo se disuelve en 1 ml de agua bidestilada y se inyecta para un análisis HPLC. Se emplea un cromatógrafo de líquidos LaChrom-Merck-Hitachi (Hitachi Ltd., Tokio, Japón), formada por un Gestor de Sistema D-7000, una bomba L-7100, un automuestreador L-7200 y un detector por fluorescencia

L-7485. También se utiliza una columna Spherisorb ODS2 (4,6 mm x 250 mm; 5 m; Waters, Milán, Italia).

El volumen de inyección es de 50 L y el ritmo de flujo es de 1 ml/min. La elución de la OTA se realiza con tampón amoniaco (A) y acetonitrilo (B) como mezcla eluyente, con el siguiente programa: t=0 A 90% isocrático hasta 15 min, t=30 A 75% con gradiente. En estas condiciones cromatográficas, el tiempo de retención para la OTA es de unos 28 min. El detector por fluorescencia se ajusta a 333 y 440 nm para las longitudes de onda de excitación y emisión, respectivamente. Las determinaciones cuantitativas se realizan aplicando un método estándar externo que mide las áreas de pico respecto a las concentraciones. Los gráficos de calibración se construyen inyectando soluciones estándar preparadas en agua bidestilada a cinco niveles de concentración. El límite de detección

(LOD) calculado es de 0,1 g/l, y el límite de cuantificación (LOQ), de 0,2 g/l.




© OIV 2012 27

3.3.6 Bibliografía Angioni A., Caboni, P. Garau A., Farris G.A., Orro D., Budroni M., Cabras P. “In vitro interaction between OTA and different strains of Saccharomyces cerevisiae and Kloeckera apiculata” J Agric Food Chem. 2007, 7, 55(5), 2043-2048. 3.4 PRODUCCIÓN DE METANOL 3.4.1 Ámbito de aplicación Criterio estándar para la caracterización de levaduras para vinificación. 3.4.2 Fundamento El metanol (CH3OH) es el alcohol más simple. Nace de la degradación de las paredes celulares de la uva como resultado de las actividades enzimáticas. Se recomienda caracterizar levaduras que determinen menos de 150 mg/l de metanol. 3.4.3 Equipo - Esterilizador - Cabina de flujo laminar - Pipetas con puntas esterilizadas - Tubos de ensayo para sincronización del cultivo - Matraces Erlenmeyer de 100 ml con válvula Müller - Equipo GC-FID 3.4.4 Reactivos y materiales - El medio de fermentación se prepara diluyendo un mosto de uva concentrado hasta que la concentración de azúcar alcanza los 212 g·l–1. Puede utilizarse en su lugar un medio sintético de composición similar (Anexo 1). - Antes de la inoculación, los cultivos de levadura son incubados durante 24h en medio YEPD. 3.4.5 Procedimiento Se mide la producción de metanol durante la fermentación a pequeña escala utilizando una única cepa de levadura en condiciones isotérmicas con temperatura controlada (25- ºC). Método de análisis: Método de referencia de la OIV, cromatografía gaseosa con detección por ionización de llama (GC-FID). 3.4.6 Bibliografía 1. Compendio de métodos internacionales de análisis de los vinos y los mostos. OIV. MA-F-AS312-03-METHAN. 2006




© OIV 2012 28

ANEXO 1

Medios sintéticos de composición similar al mosto de uva: 1. El medio 1, que se relaciona en el cuadro 1, es un medio en zumo de uva definido químicamente por Henschke y Jiranek (1993), pero con una cantidad menor de aminoácidos para proporcionar una concentración de nitrógeno de 200 mgL

-1, una cantidad mayor de azúcares (230 gL

-1 en vez de 200 gL

-1) y

un quinto de la cantidad de vitaminas. El medio se esteriliza por filtración.

Cuadro 1: Composición del medio sintético 1

Componente Cantidad por litro

Fuentes de carbono

Glucosa 115 g

Fructosa 115 g Ácidos

orgánicos Tartrato ácido de

potasio 5,00 g

Ácido cítrico 0,20 g Ácido L-málico 3,00 g

Sales K2HPO4 1,14 g MgSO4∙7H2O 1,23 g CaCl2∙2H2O 0,44 g MnCl2∙4H2O 198,2 μg ZnCl2 135,5 μg CuCl2 13,6 μg FeCl2 32,0 μg H3BO3 5,7 μg Co(NO)3∙6H2O 29,1 μg NaMoO4∙2H2O 24,2 μg KIO3 10,8 μg

Vitaminas Mioinositol 20 mg Clorhidrato de

piridoxina 0,40 mg

Ácido nicotínico 0,40 mg Pantotenato de

calcio 0,20 mg

Clorhidrato de tiamina

0,10 mg

Ácido p-aminobenzoico

0,04 mg

Riboflavina 0,04 mg Biotina 0,03 mg Ácido fólico 0,04 mg

Aminoácidos Ácido aspártico 89 mg Ácido glutámico 126 mg Alanina 26 mg Arginina 188 mg Asparagina 39 mg Fenilalanina 39 mg Glicina 14 mg Glutamina 51 mg Isoleucina 51 mg Histidina 39 mg Leucina 76 mg Lisina 63 mg Metionina 39 mg Prolina 126 mg Serina 101 mg Tirosina 6,00 mg Treonina 89 mg Triptófano 26 mg Valina 51 mg




© OIV 2012 29

Fuente de nitrógeno

(NH4)2HPO4 100 mg

Lípidos Ergosterol 10 mg Tween 80

® 0,5 mL

pH Entre 3,2 y 3,5




© OIV 2012 30

Cuadro 2: Composición del medio sintético 2

Componentes Cantidad por litro

Carbono

D-Glucosa 133 g

D-Fructosa 67 g

mioinositol 0,5 g

Ácidos

Tartrato de KH 2,5 g

Ácido L-málico 3 g

Ácido cítrico 0,2 g

Sales

K2HPO4 1,14 g

MgSO4.7H20 1,23 g

CaCl2.2H2O 0,44 g

Nitrógeno

(NH4)2HPO4 300 mg

L-Alanina 70 mg

L-Arginina 525 mg

L-Asparagina 105 mg

Ácido L-aspártico 245 mg

L-Cisteína* 7 mg

L-Glutamina 140 mg

Glicina 35 mg

L-Histidina. HCl.H2O

105 mg

L-Isoleucina 140 mg

L-Leucina 210 mg

L-Lisina. HCl 175 mg

L-Metionina 105 mg

L-Fenilalanina 105 mg

L-Prolina 350 mg

L-Serina 280 mg

L-Treonina 245 mg

L-Triptófano 70 mg

L-Tirosina 14 mg

L-Valina 140 mg

Ácido glutámico 350 mg

Elementos traza

FeSO4.7H2O 20 mg

MnSO4.H2O 7,56 mg

ZnCl2

CuCl2. 2H2O

H3BO3

Co(NO3)2.6H2O

Na2MoO4.2H2O

KIO3

Vitaminas

Clorhidrato de piridoxina

2 mg

Ácido nicotínico 4,5 mg

Pantotenato de ca 5 mg

Clorhidrato de tiamina 0,5 mg

PABA.K 0,2 mg

Biotina 0,125 mg

pH 3,5




© OIV 2012 31

Bibliografía Henschke P. and Jiranek V. Yeasts- Metabolism of nitrogen compounds. In: Wine Microbiology and Biotechnology, Ed. Fleet G.H. 1993 Harwood Academic Publishers GmbH, Suiza,Chur, pp. 77-164 Barrajón N., Capece A., Arévalo-Villena M., Briones A., Romano P. (2011) Co-inoculation of different Saccharomyces cerevisiae strains and influence on volatile composition of wines. Food Microbiology, 28: 1080-1086. Costello P.J., Henschke P.A., Markides A.J. (2003) Standardised methodology for testing malolactic bacteria and wine yeast compatibility. Australian Journal of Grape and Wine Research 9: 127-137.

Documents

RESOLUCIÓN OIV-OENO 370-2012 DIRECTRICES PARA ...1.3.1 Rendimiento al término de la fermentación en mostos ricos en azúcares. Resistencia al estrés durante la fermentación 1.3.2