Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim … · Član diplomske komisije: doc. dr. Bojan Doljak, mag. farm . Samo Jakovac: ... 4.2.9. Sinteza 2-(2-(5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

SAMO JAKOVAC

SINTEZA TRIPTAMINSKIH DERIVATOV S PROTIMIKROBNIM

DELOVANJEM IN Z ZAVIRALNIM DELOVANJEM NA

BAKTERIJSKO GLIKOZILTRANSFERAZO

SYNTHESIS OF TRYPTAMINE DERIVATIVES WITH

ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND INHIBITORY EFFECT ON

BACTERIAL GLYCOSYLTRANSFERASE

DIPLOMSKA NALOGA

Ljubljana, 2014

Samo Jakovac: Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim delovanjem in z

zaviralnim delovanjem na bakterijsko glikoziltransferazo

- I -

Diplomsko delo sem opravil na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani, pod

mentorstvom izr. prof. dr. Marka Anderluha, mag. farm. Spektroskopske meritve so

opravili na Fakulteti za farmacijo, Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo in na

Institutu Jožef Stefan v Ljubljani.

Zahvala

Iskreno se zahvaljujem mentorju izr. prof. Marku Anderluhu za pomoč, svetovanje in vso

posredovano znanje pri izdelavi diplomske naloge. Zahvaljujem se tudi vsem prijateljem,

družini in kolegom s Fakultete za farmacijo, ki me podpirajo in so mi vedno stali ob strani.

Izjava

Izjavljam, da sem diplomsko nalogo izdelal samostojno pod mentorstvom izr. prof. dr.

Marka Anderluha, mag. farm.

Ljubljana, 2014 Samo Jakovac

Predsednik diplomske komisije: izr. prof. dr. Iztok Grabnar, mag. farm.

Član diplomske komisije: izr. prof. dr. Marko Anderluh, mag. farm.

Član diplomske komisije: doc. dr. Bojan Doljak, mag. farm



- II -

Kazalo vsebine

1. UVOD ................................................................................................................. 1

1.1. ANTIBIOTIKI ..................................................................................................... 1

1.2. ODPORNOST NA PROTIMIKROBNE UČINKOVINE ............................... 1

1.3. BAKTERIJE ........................................................................................................ 2 1.3.1. Bakterijska celična stena............................................................................................................ 3 1.3.2. Biosinteza peptidoglikana .......................................................................................................... 3 1.3.3. Po Gramu pozitivne bakterije .................................................................................................... 5 1.3.4. Po Gramu negativne bakterije ................................................................................................... 6

1.4. PENICILIN VEZOČI PROTEINI (PBP) ......................................................... 7

1.5. REAKCIJA S TRANSPEPTIDAZO ................................................................. 8

1.6. REAKCIJA Z GLIKOZILTRANSFERAZO ................................................... 8 1.6.1. Naravni zaviralci glikoziltransferaze ....................................................................................... 10 1.6.2. Sintezni zaviralci glikoziltransferaze ....................................................................................... 12

2. NAČRT DELA ................................................................................................. 16

3. MATERIALI IN METODE ........................................................................... 19

4. EKSPERIMENTALNO DELO ..................................................................... 21

4.1. Reakcijske sheme: ............................................................................................. 21

4.2. Sintezni postopki in rezultati analiz ................................................................. 24 4.2.1. Sinteza 2-(2-(1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (1) ........................................................................ 24 4.2.2. Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1-il)metil)benzonitrila (2) ............................ 25 4.2.3. Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1-il)metil)-N'-hidroksibenzimidamid (3) ...... 26 4.2.4. Sinteza 4-((3-(2-aminoetil)-1H-indol-1-il)metil)-N'-hidroksibenzimidamida (4) .................................... 27 4.2.5. Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1-il)metil)-N'-

((etoksikarbonil)oksi)benzimidamida (5) ................................................................................................. 29 4.2.6. Sinteza 2-(2-(1-(4-(5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il)benzil)-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-

diona (6) ................................................................................................................................................... 30 4.2.7. Sinteza 3-(4-((3-(2-aminoetil)-1H-indol-1-il)metil)fenil)-1,2,4-oksadiazol-5(4H)-ona (7) ..................... 31 4.2.8. Sinteza amino(4-((3-(2-aminoetil)-1H-indol-1-il)metil)fenil)metaniminijevega acetata (8) .................... 32 4.2.9. Sinteza 2-(2-(5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (9) ....................................................... 33 4.2.10. Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-5-metoksi-1H-indol-1-il)metil)benzonitrila (10) .... 34 4.2.11. Sinteza 4-((3-(2-aminoetil)-5-metoksi-1H-indol-1-il)metil)benzonitrila (11) .................................... 35 4.2.12. Sinteza 2-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (12).............. 37 4.2.13. Sinteza 2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etanamina (13) ......................................... 38 4.2.14. Sinteza 1,2-bis(1-(terc-butoksi)karbonil)-3-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-

il)etil)gvanidina (14) ........................................................................................................................... 39 4.2.15. Sinteza 1-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)gvanidina (15) .............................. 40 4.2.16. Sinteza 2-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (16) ............ 42 4.2.17. Sinteza 2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etanamina (17) ....................................... 43 4.2.18. Sinteza 1,2-bis(1-(terc-butoksi)karbonil)-3-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-

il)etil)gvanidina (18) ........................................................................................................................... 44 4.2.19. Sinteza 1-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)gvanidina (19) ............................. 45



- III -

5. RAZPRAVA ..................................................................................................... 47

5.1. Zaščita primarne amino skupine v obliki ftalimida ................................................... 47

5.2. Alkiliranje indolnega dušika triptamina/5-metoksitriptamina ................................ 48

5.3. Odstranitev ftalimidne zaščitne skupine ..................................................................... 49

5.4. 5-stopenjska pretvorba nitrila preko amidoksima in 5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-

oksadiazola do amidina s katalitskim hidrogeniranjem. ........................................................ 50

5.5. Sinteza bis-Boc gvanidina na primarni amino skupini alkiliranega 5-

metoksitriptamina ...................................................................................................................... 52

5.6. Odstranitev Boc zaščitne skupine ................................................................................ 52

6. BIOLOŠKO TESTIRANJE ........................................................................... 53

6.1. Testiranje citotoksičnosti ............................................................................................. 53

6.2. Protimikrobna učinkovitost: in vitro testiranje .......................................................... 56

7. SKLEP .............................................................................................................. 58

8. LITERATURA ................................................................................................ 61



- IV -

Kazalo slik

Slika 1: Struktura prokariontske celice (povzeto po 14) ___________________________ 3

Slika 2: Trodimenzionalni pogled peptidoglikana pri Gram+ bakteriji Staphylococcus

aureus (povzeto po 10) _____________________________________________________ 4

Slika 3: Zadnje stopnje biosinteze peptidoglikana ________________________________ 5

Slika 4: Struktura Gram+ bakterije ___________________________________________ 6

Slika 5: Struktura Gram- bakterije ___________________________________________ 6

Slika 6: reakcija z glikoziltransferazo (povzeto po 6) _____________________________ 9

Slika 7: Moenomicin A z označenimi za vezavo na PBP pomembnimi strukturnimi elementi

(povzeto po 17) __________________________________________________________ 12

Slika 8 : Levo, strukturi spojin 5 in 5b; desno, računalniški model sidranja spojine 5b v

rentgensko strukturo moenomicina vezanega na glikoziltransferazo iz S. aureus PBP2 __ 14

Slika 9: Spojina vodnica __________________________________________________ 16

Slika 10: Spojina vodnica z vključenimi strukturnimi spremembami ________________ 16

Slika 11: Končne spojine za testiranje učinkovitosti zaviranja encima glikoziltransferaze in

testiranja citotoksičnosti ___________________________________________________ 18

Slika 12: Mehanizem zaščite primarne amino skupine v obliki ftalimida _____________ 48

Slika 13: Alkiliranje indolnega dušika triptamina/5-metoksitriptamina ______________ 49

Slika 14: Mehanizem odstranitve ftalimidne zaščitne skupine ______________________ 50

Slika 15: Mehanizem sinteze bis-Boc gvanidina na primarni amino skupini __________ 52

Kazalo preglednic

Preglednica 1: Rezultati testiranja citotoksičnosti na celičnih kulturah PBMC in

HEK-293 .............................................................................................................................. 54

Preglednica 2: Rezultati in vitro testiranja (RA, IC50 in MIC vrednosti) končnih spojin ... 57

Kazalo grafov

Graf 1: Prikaz odstotka metabolne aktivnosti PBMC celične kulture po dodatku testiranih

spojin ................................................................................................................................... 55



- V -

Povzetek

V današnjem času predstavljajo vedno večji problem rezistentne bakterije, ki resno

ogrožajo zdravje ljudi. Razširjenost in neprimerna uporaba antibiotikov je ustvarila močan

evolucijski pritisk na nastanek bakterij, ki so bodisi naravno odporne proti antibiotikom ali

pa imajo možnost za pridobitev odpornosti. Bakterijske infekcije so v razvitem svetu še

vedno velik vzrok umrljivosti, zato je nujno potreben napredek na področju sinteze novih

protimikrobnih zdravil. V zadnjem času se odkrivajo nove učinkovine z drugačnimi

mehanizmi delovanja, kot jih imajo spojine na tržišču. Razlog je predvsem v tem, ker

bakterije postajajo multirezistentne. Kot zadnjo linijo obrambe na multirezistentne seve

imamo trenutno na voljo le nekaj protimikrobnih učinkovin. Veliko pozornosti se posveča

učinkovinam, ki neposredno vplivajo na sintezo celične stene. Peptidoglikan v celični steni

predstavlja pomembno tarčo, saj lahko njegovo sintezo blokiramo z inhibicijo več različnih

encimov. V zadnjih stopnjah sinteze peptidoglikana sodelujeta glikoziltransferazna in

transpeptidazna domena penicilin vezočih proteinov. V okviru diplomskega dela smo

načrtovali in sintetizirali inhibitorje bakterijske glikoziltransferaze. Encim

glikoziltransferaza polimerizira glikansko verigo z uporabo substrata lipida II. Poznamo

dve glavni skupini inhibitorjev bakterijske glikoziltransferaze. V prvi so spojine, ki se

vežejo na substrat in prepoznajo strukturne elemente v lipidu II in nastajajočem

peptidoglikanu, v drugi pa spojine, ki se vežejo na glikoziltransferazo. Načrtovali in

sintetizirali smo derivate triptamina in 5-metoksitriptamina, ki zavirajo glikoziltransferazo

predvidoma z vezavo na lipid II. Za identifikacijo spojin smo uporabljali različne metode:

npr. NMR, IR, in MS, za preverjanje čistosti spojin pa HPLC. Spojine smo poslali tudi na

testiranje citotoksičnosti in protimikrobne učinkovitosti. Rezultati testiranj so pokazali, da

imajo nekatere spojine dobro protimikrobno učinkovitost in nizko stopnjo citotoksičnosti.



- VI -

Abstract

Nowadays resistant bacteria represents a growing problem which seriously affects human

health. Prevalence and inappropriate use of antibiotics has created a strong evolutionary

pressure on the emergence of bacteria that are either naturally resistant to antibiotics or

have the possibility to acquire resistance. In the developed world bacterial infections are

still a major cause of death. This is why the progress in the synthesis of new antimicrobial

agents is urgently needed. Recently new active substances with different mechanisms of

action are being discovered in comparison to the compounds on the market. The main

reason is that bacteria are acquiring multidrug resistance. As a last line of defense for

multidrug resistant strains, only a few antimicrobial agents are currently available. A lot of

attention is devoted to agents that directly affects cell wall synthesis. Peptidoglycan in the

cell wall is an important target, because it can be blocked by inhibiting the synthesis of

several different enzymes. Glycosyltransferase and transpeptidase domain of penicillin-

binding proteins participate in the final stages of peptidoglycan synthesis. Within the

framework of the thesis, we planned and synthesized inhibitors of bacterial

glycosyltransferase. Enzyme glycosyltransferase polymerizes the glycan chain using the

lipid II substrate. There are two main groups of inhibitors of bacterial glycoslytransferase.

In the first one are compounds which bind to the substrate by identifying the structural

elements within lipid II and emerging peptidogylcan. In the second one are compounds

which bind to glycosyltransferase. We planned and synthesized derivatives of tryptamine

and 5-methoxytryptamine, which presumably inhibit glycosyltranferase by binding to lipid

II. Various methods for identification such us NMR, IR and MS were used. The purity of

the compounds was identified with HPLC. The compounds were also sent for testing

cytotoxicity and antimicrobial effectiveness. The test results have shown that some of the

compounds have good antimicrobial activity and a low level of cytotoxicity.



- VII -

Seznam okrajšav

AUC Ang. area under curve/ploščina pod krivuljo

B baza

Boc t-butiloksi karbonilna skupina

c koncentracija

CDCl3 devteriran kloroform

CD3OD devteriran metanol

CFU Ang. colony forming units

CH2Cl2 diklorometan

CH3CN acetonitril

CF3COOH trifluoroocetna kislina

Cs2CO3 cezijev karbonat

Ctrl kontrola

d dublet

D-Ala D-alanin

dd dublet dubleta

ddd dublet dublet dubleta

DKM diklorometan

D-Lac D-laktoza

DMF N,N-dimetilformamid

DMSO dimetilsulfoksid

DMSO-d6 devteriran dimetilsulfoksid

DNK deoksiribonukleinska kislina

dt dublet tripleta

ekv. ekvivalent

Et3N trietilamin

EtOH etanol

EtOAc etilacetat

FDA Ang. Food and Drug Administration



- VIII -

FtsW protein odgovoren za delitev bakterijske celice

GlcNAc N-acetilglukozamin

Gram- po Gramu negativne bakterije

Gram+ po Gramu pozitivne bakterije

GlcNAc N-acetilglukozamin

h ura

HEK-293 human embryonic kidney 293 cels/humane embriološke ledvične celice

HMW PBP penicilin vezoči proteini z visoko molekulsko maso

HPLC Angl. high presure liquid cromatography/tekočinska kromatografija visoke

ločljivosti

HRMS masna spektrometrija visoke ločljivosti

IC50 koncentracija inhibitorja, ki zmanjša hitrost encimske reakcije na polovico

IR infrardeča spektroskopija

J sklopitvena konstanta

L-Ala L-alanin

Lipid I undekaprenil-pirofosforil-MurNAc-pentapeptid

Lipid II undekaprenil-pirofosforil-MurNAc-(pentapeptid)-GlcNAc

LPS lipopolisaharidi

m multiplet

M molarnost (mol/l)

MeOH metanol

MF mobilna faza

MIC minimalna inhibitorna koncentracija

MRSA na meticilin odporen Staphylococcus aureus

MraY UDP-N-acetilmuramoil-pentapeptid fosfotransferaza

MS masna spektrometrija

MurA UDP-N-acetilglukozamin enolpiruviltransferaza

MurB UDP-N-acetilenolpiruvilglukozamin reduktaza

MurC UDP-N-acetilmuramat L-alanin ligaza

MurD UDP-N-acetilmuramoil-L-alanin-D-glutamat ligaza



- IX -

MurE UDP-N-acetilmuramoil-L-alanin-D-glutamat-meso-diaminopimelat ligaza

MurF UDP-N-acetilmuramoil-L-alanin-D-glutamoil-meso-diaminopimelat-D-

alanin-D-alanin ligaza

MurG N-acetilglukozamin transferaza

MGT monofunkcionalna glikoziltransferaza

MurNAc N-acetilmuraminska kislina

nm nanometer

NMR jedrska magnetna resonanca

PBMC Ang. peripheral blood mononuclear cells/mononuklearne

celice periferne krvi

PBP Ang. penicillin binding proteins/penicilin vezoči proteini

Pd/C paladij na ogljiku

PES fenazin etosulfat

RA rezidualna aktivnost

Rf retencijski faktor

s singlet

t triplet

Ttal temperatura tališča

TEA trietilamin

TLC tankoplastna kromatografija

Tg temperatura steklastega prehoda

TG transglikozilazni(a), npr. domena

TMS tetrametilsilan

TP transpeptidazni(a), npr. domena

UDP uridin difosfat

VRE na vankomicin odporni enterokoki

kemijski premik

λ valovna dolžina

η izkoristek



- 1 -

1. UVOD

1.1. ANTIBIOTIKI

Boj proti bakterijskim okužbam je zadnjih 70 let velika zgodba o uspehu farmacije, vendar

ne vemo, koliko časa bo trajala. Bakterije, kot so npr. Staphylococcus aureus povzročajo

strokovnjakom veliko skrbi, ker so sposobne pridobiti odpornost proti antibiotikom.

Iskanje novih protimikrobnih učinkovin se zato nikoli ne konča. Bakterijske okužbe so v

razvitem svetu še vedno velik vzrok smrtnosti (1).

Antibiotiki so bakterijski metaboliti ali njihovi polsintezni analogi. Učinkujejo tako, da

zavirajo rast in preživetje mikroorganizmov ter v optimalnem primeru niso toksični za

gostitelja. Njihov ključni koncept je selektivna toksičnost. Antibiotiki so v današnjem času

med najpogosteje predpisanimi zdravili, vendar je njihova učinkovitost ogrožena zaradi

pogoste nepravilne uporabe ali zlorabe. V mnogih primerih je učinkovitost naravnih

antibiotikov izboljšana s spreminjanjem prvotne kemijske strukture, kar vodi do širšega

protimikrobnega spektra, večje jakosti, manjše toksičnosti in ugodnih farmakokinetičnih

lastnosti. V skupino protimikrobnih učinkovin spadajo naravni in polsintezni antibiotiki ter

kemoterapevtiki, ki so sinteznega izvora (2).

Antibiotiki delujejo na različna mesta v bakterijski celici. Pogosto učinkujejo tako, da

plazemska membrana postane bolj prepustna za ione in druge male molekule ali pa

inhibirajo biosintezo celične stene. Ostali poznani mehanizmi so inhibicija celičnega

metabolizma, zaviranje sinteze celičnih proteinov ali zaviranje prepisa in podvajanja

nukleinski kislin. V vseh primerih je končni rezultat nepopravljiva poškodba bakterijskih

celic, kar vodi v njihovo smrt (1, 3).

1.2. ODPORNOST NA PROTIMIKROBNE UČINKOVINE

Po sedmih desetletjih množične uporabe antibiotikov ugotavljamo, da bakterijski patogeni

človeškega in živalskega izvora postajajo vedno bolj odporni na številne antibiotike (4).

Odpornost mikroorganizmov je pojav, ko s protimikrobnimi učinkovinami ne moremo več

ubiti ali inhibirati mikroorganizmov. Odpornost je lahko intrinzična (opazna že pred

izpostavljenostjo antibiotiku) ali pridobljena (razvije se po izpostavljenosti antibiotiku).

Odpornost bakterij na toksične učinke protimikrobnih učinkovin se razvije dokaj enostavno

in predstavlja vse večjo nevarnost za javno zdravje (2). Razširjena in včasih neprimerna



- 2 -

uporaba antibiotikov je ustvarila močan evolucijski pritisk na nastanek bakterij, ki so

bodisi naravno odporne proti antibiotikom ali pa imajo možnost za pridobitev odpornosti

(5). Odporni sevi bakterij se najprej pojavijo v bolnišnicah, kjer je selekcijski pritisk

največji, nato pa se razširi v okolico (6). Mnogi izmed običajnih bakterijskih patogenov,

kot so Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis in Streptococcus pneumoniae so

postali odporni. Na meticilin odporni S. aureus, na vankomicin odporni E. faecalis in na

penicilin odporni S. pneumoniae so danes poznani patogeni mikroorganizmi, ki jih je zelo

težko učinkovito zdraviti. Tudi na vankomicin, ki je eden od zadnjih delujočih aktivnih

antibiotikov proti S. aureus in drugim Gram+ bakterijam, že poznamo rezistentne seve

bakterij. Kratkoročne strategije za reševanje problema odpornosti na antibiotike

vključujejo kemijsko spremembo obstoječih antibiotikov, odkritje novih tarč in razvoj

novih vrst antibiotikov (4).

Dejstvo, da se v zadnjih desetletjih število na novo odkritih protimikrobnih učinkovin

zmanjšuje, bi lahko imelo za posledico slabše obvladovanje javnega zdravja (6). Odpornost

se je do danes pojavila že pri vseh razredih antibiotikov v klinični uporabi, prav tako pa je

veliko patogenih mikroorganizmov pridobilo odpornost na več različnih antibiotikov (7).

Mutacije, ki vodijo k odpornosti bakterij, nastanejo z delovanjem številnih mehanizmov.

Ti so lahko posledica točkovnih mutacij, vstavljanja, brisanja, inverzije, podvajanja in

prenosov segmentov genov ali s pridobitvijo tuje DNK od plazmidov, bakteriofagov in

transpozicijskih genetskih elementov. Genetski material, ki kodira to obliko odpornosti, se

pogosto prenaša preko kromosomskih elementov v majhnih krožnih DNK molekul, znanih

kot plazmidi (2).

1.3. BAKTERIJE

Raznolikost mikroorganizmov kot jo poznamo danes, je rezultat skoraj 4 milijarde let

evolucije. Bakterijsko raznolikost lahko opazujemo v mnogih pogledih, vključno z

velikostjo celic, morfologijo, fiziologijo, gibljivostjo, mehanizma delitve celic, patogenosti

in prilagajanja na ekstremne življenjske razmere (8). Prokarionti se razlikujejo od

evkariontov v velikosti in celični strukturi. Večina prokariontov za razliko od evkariontov

ne vsebuje zapletenih notranjih membranskih struktur (9). Prokarionti se razlikujejo po

velikosti celic in so veliki od 0,2 µm do 700 µm v premeru (8). Na osnovi strukture celične

stene bakterije razdelimo na Gram+ in Gram- bakterije. Če pogledamo obliko se bakterije

najpogosteje nahajajo v obliki kokov, bacilov, spirilov, vibrijev ali spirohet. Prokariontske



- 3 -

celice skoraj vedno obdaja kompleksna celična stena, v notranjosti stene pa se nahaja

plazemska membrana (Slika 1). Le-ta služi za ključne metabolične procese, kot so dihanje,

fotosinteza ter sinteza lipidov in drugih sestavin celične stene. Notranjost prokariontske

celice se zdi preprosta, saj ne vsebujejo na

membrano vezanih organelov. Genetski

material se nahaja v obliki kromosoma, ki

običajno od citoplazme ni ločen z membrano.

Ribosomi in inkluzijska telesa so razpršena po

celotnem citoplazemskem matriksu. Mnogi

prokarionti za premikanje uporabljajo

migetalke, poleg tega pa so pogosto obdani s

kapsulo ali plastjo sluzi (9), ki celico varuje

pred izsušitvijo, pomaga loviti hranila in veže

bakterije v skupek (10).

1.3.1. Bakterijska celična stena

Bakterijske celice so obdane s precej zapleteno in togo celično steno in se bistveno

razlikujejo od sesalskih celic, ki so obdane s fleksibilno membrano. Encimi, ki sodelujejo

pri izgradnji celične stene nimajo neposredne povezave s sesalskimi celicami. To

zagotavlja potencialno zanimive tarče za selektivno toksičnost proti bakterijskimi celicami

(2). Celična stena je ena od najpomembnejših struktur bakterije, saj pomaga določiti obliko

celic, zagotovi polprepustno membrano z okoljem, skozi katero lahko prehajajo le želene

snovi in obvaruje celico pred osmolizo. Prepreči tudi prebavo z encimi gostitelja, zaščiti

celice pred strupenimi snovmi in lahko prispeva k patogenosti (9).

1.3.2. Biosinteza peptidoglikana

Peptidoglikan ali murein je zamrežen polimer, ki popolnoma obdaja bakterijsko celico in

preprečuje, da bi celica zaradi visokega znotrajceličnega tlaka počila (11). Ena od njegovih

glavnih nalog je stabilizacija bakterijskih membran pred visokim notranjim osmoznim

tlakom in s tem zagotavljanje preživetja bakterijske celice (7). Sestavljen je v dvo ali

tridimenzionalno ureditev glikanskih sklopov in peptidnih verig, kar vodi v eno ali

večplastno strukturo. Glikanski sklopi so sestavljeni iz linearnih polisaharidnih verig z

zaporedjem N-acetilmuraminske kisline (MurNAc) in N-acetilglukozamina (GlcNAc),

povezanih z β-1,4 glikozidno vezjo (Slika 2). Na D-mlečni kislini molekule MurNAc, se

Slika 1: Struktura prokariontske celice

(povzeto po 14)



- 4 -

nahaja pentapeptid iz L-alanina, D-glutaminske kisline, diamino kisline in D-alanil-D-

alanina (12). V večini Gram+ bakterij je diamino kislina L-lizin, v večini Gram- pa mezo-

diaminopimelinska kislina (10). D-izomerov aminokislin ne najdemo v evkariontskih

proteinih. Prisotnost D-aminokislin ščiti bakterijsko steno pred razgradnjo z večino

peptidaz, ki prepoznajo samo L-izomere aminokislin (9). Prečna povezava nastane s

povezovanjem NH2 skupine na diamino kislini s karboksilno skupino na predzadnjem D-

alaninu, zadnji D-alanin pa se odcepi (12).

Slika 2: Tridimenzionalni pogled peptidoglikana pri Gram+ bakteriji Staphylococcus aureus

(povzeto po 10)

Biosinteza peptidoglikana je dvostopenjski proces. Prva stopnja poteka v citoplazmi, kjer

vrsta specifičnih encimskih reakcij povzroči nastanek monomerne enote GlcNAc-

MurNAc-pentapeptid, ki je povezana z lipidom undekaprenolom preko pirofosfatne

skupine in ga lahko imenujemo predhodnik lipida II. Encimi, ki sodelujejo pri nastajanju

peptidoglikana na citoplazemskem nivoju so MurA, MurB, MurC, MurD, MurE in MurF

(12). Encim MraY je transmembranski protein, ki prenese fosfo-MurNAc-pentapeptid na

undekaprenilpirofosfat, pri tem nastane lipid I. Encim MurG pa se nahaja na notranji strani

membrane in katalizira reakcijo z GlcNAc, pri čemer nastane lipid II (6). Premestitev

lipidnega intermediata preko membrane v zunajcelični prostor (Gram+ bakterije) ali

periplazmo (Gram- bakterije) je katalizirana z encimom flipazo, le-ta še ni popolnoma

raziskana, morda gre za protein odgovoren za celično delitev FtsW. Druga stopnja v

biosintezi peptidoglikana vključuje polimerizacijo glikanske verige, ki jo katalizirajo

encimi glikoziltransferaze, za prečno premreževanje pa skrbi encim transpeptidaza (Slika

3). Natančen mehanizem reakcije z glikoziltransferazo še ni znan (12). Sosednje glikanske



- 5 -

verige so zamrežene s peptidnimi mostički, ki povezujejo amino skupino na stranski verigi

diamino kisline ene peptidne enote s karboksilno skupino na terminalnem D-alaninu druge

peptidne enote (Slika 2) (13). Struktura polipeptidne povezave v peptidoglikanu se od

bakterije do bakterije spreminja, med tem ko vedno vsebuje tetrapeptidno stransko verigo,

ki povezuje sklope polisaharidnih verig (14). Znanih je več kot 100 vrst peptidoglikanov,

raznolikost se kaže predvsem v peptidnih mostičkih (8).

Slika 3: Zadnje stopnje biosinteze peptidoglikana

1.3.3. Po Gramu pozitivne bakterije

Celična stena Gram+ bakterije sestoji iz enojne, 20-80 nm debele homogene plasti

peptidoglikana, ki se nahaja zunaj plazemske membrane. Prečne povezave s peptidnimi

mostički v peptidoglikanu dajejo gosto premreženo strukturo, ki varujejo bakterijo pred

zunanjimi vplivi (9). Stena vsebuje velike količine teihoične kisline, ki je sestavljena iz

izmenično povezanih do 30 enot glicerola ali ribitola in fosfatnih skupin, na

glicerolu/ribitolu pa je pripeta glukoza, D-alanin ali druge molekule (10). Teihoična kislina

je kovalentno vezana na muraminsko kislino v peptidoglikanu (8), če pa je pripeta na lipide

v plazemski membrani, se imenuje lipoteihoična kislina (Slika 4). Teihoična kislina je

negativno nabita in sega do površine peptidoglikana, kar daje Gram+ celični steni



- 6 -

negativni naboj. Funkcija teh molekul še ni popolnoma razjasnjena, vendar pa ima po eni

strani pomembno vlogo pri ohranjanju strukture celične stene, po drugi strani pa verjetno

služijo kot prehod za prenos Ca2+ in Mg2+ ionov v in iz celice (10, 14). Stafilokoki in

večina drugih Gram+ bakterij vsebuje plast proteinov na površini celične stene

peptidoglikana. Ti proteini so vključeni v medsebojno interakcijo z okoljem. Nekateri so

nekovalentno vezani na

peptidoglikan, teihoično kislino ali

druge receptorje, nekateri pa tvorijo

kovalentno povezavo. Primer

kovalentne vezave encima je na

primer M protein v patogenem

streptokoku, ki ima vlogo adhezije na

tkivu gostitelja ter se s tem vmeša in

oteži gostiteljev obrambni

mehanizem (9).

1.3.4. Po Gramu negativne bakterije

Celična stena Gram- bakterije sestoji iz 2-7 nm debele homogene plasti, ki jo pokriva 7-8

nm debela zunanja membrana. Zaradi tanjšega sloja peptidoglikana kot v Gram+ bakteriji

so Gram- bakterije slabše odporne na osmotski tlak. Celična stena Gram- bakterije je

bistveno bolj zapletena kot Gram+ bakterije. Tanek sloj peptidoglikana je omejen na obeh

straneh s periplazmatskim

prostorom in predstavlja

največ 5-10% mase celične

stene, medtem ko

periplazmatski prostor

predstavlja kar 20-40%

celotnega volumna celice.

Celična stena v E. coli je

debela le 2 nm in vsebuje le

eno do dve plasti

peptidoglikana (9).

Slika 4: Struktura Gram+ bakterije (povzeto po 9)

Slika 5: Struktura Gram- bakterije (povzeto po 9)



- 7 -

Peptidoglikan ne vsebuje peptidnih mostičkov, kot v Gram+ bakteriji. Zunanja membrana

se nahaja za plastjo peptidoglikana in je povezana s celico preko Braunovih lipoproteinov.

(Slika 5) Ti majhni lipoproteini so kovalentno povezani s peptidoglikanom, s hidrofobnim

delom pa so sidrani v peptidni dvosloj zunanje membrane. Najbolj nenavadna sestavina

zunanje membrane so lipopolisaharidi (LPS). To so velike kompleksne molekule iz lipidov

in polisaharidov. Lipidni del je sestavljen iz lipida A in je umeščen v membrano, središčni

del in stranska veriga iz polisaharidov pa segata na površino zunanje membrane. LPS

imajo številne pomembne funkcije. Središčni polisaharidi vsebujejo negativno nabite

sladkorje in fosfatne skupine, kar daje celici negativni naboj. LPS prispevajo tudi k

pritrditvi bakterije na podlago in tvorbo biofilma, medtem ko lipid A pomaga stabilizirati

strukturo zunanje membrane. Glavna naloga LPS je preprečevanje prepustnosti žolčnih

kislin, antibiotikov in drugih strupenih snovi, ki lahko ubijejo ali poškodujejo bakterijo.

Stranska veriga se imenuje tudi antigen O, saj pri gostitelju sproži imunski odziv, to je

tvorbo protiteles proti specifični obliki LPS (9). Običajni patogeni za ljudi in druge sesalce

vključujejo vrste Salmonella, Shigella in Escherichia, ki povzročijo črevesne simptome, le-

ti pa so poledica toksičnih zunanjih delov membrane (8). Mnoge bakterije lahko hitro

spreminjajo antigensko naravo stranske verige in na ta način zmanjšajo učinkovitost

obrambe gostitelja. Lipid A je endotoksin, ki se sprosti ob odmrtju bakterije. Za človeški

organizem je toksičen in ga povezujemo s simptomi kot so vročina, razširitev krvnih žil in

strjevanje krvi (14). Če bakterije ali njihovi antigeni zaidejo v krvni obtok, lahko

povzročijo septični šok (9).

1.4. PENICILIN VEZOČI PROTEINI (PBP)

Penicilin vezoči proteini (PBP) so sestavni del bakterijske citoplazemske membrane, ki

katalizirajo končne stopnje biosinteze peptidoglikana in lahko predstavljajo nove tarče za

razvoj antibiotikov (15, 16). Omenjene stopnje vključujejo tri vrste encimskih reakcij z:

glikoziltransferazo, ki polimerizira glikansko verigo z uporabo substrata lipida II,

transpeptidazo, ki navzkrižno poveže glikanske verige in D-alaninkarboksipeptidaza, ki naj

bi imela regulatorno vlogo. PBP lahko razdelimo v dve skupni glede na molekulsko maso

in zaporedje aminokislin v proteinu. PBP z nizko molekulsko maso katalizirajo D-

alaninkarboksipeptidazne reakcije, medtem ko PBP z visoko molekulsko maso katalizirajo

reakcije z glikoziltransferazo in transpeptidazo (16). Slednji se delijo na razred A-PBP in

razred B-PBP. Razred A je vedno sestavljen iz glikoziltransferazne (GT) in



- 8 -

transpeptidazne (TP) domene, medtem ko razred B vsebuje zgolj transpeptidazno domeno.

V nekaterih bakterijah se nahaja tudi nizkomolekularna monofunkcionalna

glikoziltransferaza (MGT) (15, 17). Skupina bifunkcionalnih A-PBP z visoko molekulsko

maso (HMW) je povezana z membrano in se nahaja tako v Gram+ kot Gram- bakterijah.

HMW PBP so molekule z več domenami in so sestavljene iz kratke N-terminalne

citoplazemske regije, transmembranske regije in C-terminalne periplazemske regije. N-

terminalna domena vsebuje GT aktivnost, medtem ko C-terminalna domena vsebuje TP

aktivnost (4, 18).

1.5. REAKCIJA S TRANSPEPTIDAZO

Raeakcija s transpeptidazo poteče na račun prekinitve D-alanil-D-alanil povezave v

pentapeptidu. Nastane serinski ester med peptidom in encimom, sočasno se terminalni D-

alanin sprosti s pentapeptida, to pa se doseže s prenosom stranske peptidne verige na

amino skupino v diamino kislini drugega peptida. Ker reakcija vključuje prekinitev D-

alanin-D-alanin povezave, je razvrščena v s skupino DD-transpeptidaz (13).

β-laktamski antibiotiki, kot so penicilini, cefalosporini in karbapenemi so specifični

inhibitorji transpeptidaze in D-alaninkarboksipeptidaze, saj vsebujejo strukturno podobnost

s substratom. Tvorijo kovalentno povezavo z aktivnim mestom – serinom v transpeptidazni

domeni. To preprečuje premeževanje peptidnih verig v peptidoglikanu, kar vodi do celične

smrti. Streptococcus pneumoniae, pomemben povzročitelj obolenja zgornjih dihalnih poti

pri človeku, vsebuje kar šest PBP, med njimi so trije iz razreda A, dva iz razreda B in eden

iz razreda nizkomolekularnih proteinov (6, 16).

1.6. REAKCIJA Z GLIKOZILTRANSFERAZO

Pojav odpornosti proti antibiotikom je spodbudilo prizadevanja raziskovalcev v smeri

pridobivanja strukturnih informacij za encime v biosintezi peptidoglikana in odkrivanje

novih inhibitorjev posameznega encima. Pomemben napredek je bil dosežen za večino

znotrajceličnih encimov in več vrst zunajceličnih penicilin vezavnih proteinov. Za skupino

encimov bakterijske glikoziltransferaze, ki katalizirajo polimerizacijo verig v

peptidoglikanu, je napredek potekal izjemno počasi. Reakcija transglikozilacije tako ostaja

»črna skrinjica« v na splošno dobro raziskani biosintezi bakterijskega peptidoglikana.

Upamo, da bo natančno poznavanje pomembnih bakterijskih encimov in procesov sčasoma

pripeljalo do odkritja novih antibiotikov (7).



- 9 -

Celovitost celične stene je bistvena za preživetje bakterije in je odvisna od pravilnega

delovanje bakterijskih glikoziltransferaz. V biosintezi peptidoglikana se zdi

glikoziltransferaza dobra tarča, saj ne poznamo humanih homologov teh encimov, poleg

tega pa se nahajajo zunaj celične membrane (7). Hitro širjenje odpornosti na β-laktamske

antibiotike in druge antibiotike, ki imajo tarčo v celični steni (kot so glikopeptidi), poziva k

razvoju novih antibiotikov. Aktivnost glikoziltransferaze predstavlja zaradi pomembne

vloge v biosintezi peptidoglikana novo terapevtsko tarčo, poleg tega pa je zaradi nahajanja

izven celične membrane lahko dostopna majhnim molekulam (12). Zunajcelična lokacija

ima prednost iz dveh razlogov: kot potencialne inhibitorje lahko testiramo večji nabor

spojin, ker za učinkovitost ni potreben prodor v celico. Nadalje je za razvoj odpornosti

možnih manj različnih mehanizmov (7).

Neposredni predhodnik peptidoglikana je lipid II (undekaprenil-pirofosforil-MurNAc-

(pentapeptid)-GlcNAc) (6). Gre za disaharid s peptidno skupino, ki je vezan na prenašalec

undekaprenil lipid (C55H89) s pirofosfatnim mostom (13). Bakterijska glikoziltransferaza iz

razreda glikoziltransferaz (EC 2.4) katalizira premik pirofosfatne skupine lipida II na 4-

hidroksi skupino N-acetilglukozamina v rastoči glikanski verigi, pri čemer se prenašalec

undekaprenil pirofosfat sprosti (13, 19). Tako lipid II kot rastoča peptidoglikanska veriga

sta pritrjena na citoplazemsko membrano preko hidorfobnega dela (17) (Slika 6).

Slika 6: Reakcija z glikoziltransferazo (povzeto po 6)

Struktura glikoziltransferaze je sestavljena iz 9 alfa-vijačnic, ki sestavljajo dva režnja, med

katerima se nahaja katalitična špranja (6). Le-ta lahko sprejme do šest sladkornih enot.

Razdeljena je na dve podstrani, donorsko mesto za podaljševanje verige in akceptorsko

mesto za vezavo substrata lipida II. Na obrobju encimske špranje se nahajata dva

glutamata, ki sta za katalitično reakcijo izrednega pomena (20).



- 10 -

Raziskave o načinu delovanja glikoziltransferaze in razvoj učinkovite metode za njeno

testiranje sta bili v preteklosti ovirani. Raziskave študija glikoziltransferaz ovira

pridobivanje in ravnanje s substratom lipidom II. Metoda za izolacijo lipida II je zaradi

njegove nizke vsebnosti v bakterijah in strukturne kompleksnosti izjemno težavna. Razvoj

izboljšanih testnih sistemov za spremljanje transglikozilacije je zato v zadnjem času postal

predmet številnih raziskav. Z razvojem kemijske in kemijsko-encimske sinteze

prekurzorjev lipida II je omogočena vzpostavitev učinkovitih encimskih testov za

spremljanje transglikozilacije (4).

1.6.1. Naravni zaviralci glikoziltransferaze

Obstajata dve glavni skupini naravnih inhibitorjev bakterijske glikoziltransferaze. V prvi

so spojine, ki se vežejo na substrat in prepoznajo strukturne elemente v lipidu II in

nastajajočem peptidoglikanu, v drugi pa spojine, ki se vežejo na glikoziltransferazo (7).

1.6.1.1. Naravni zaviralci, ki se vežejo na substrat

Število in strukturna raznolikost znanih ali domnevnih spojin, ki se vežejo na substrat in s

tem blokirajo glikoziltransferazo, je izredno velika, kar pomeni, da je vezava na substrat

evolucijsko uspešna strategija za blokiranje tega koraka biosinteze peptidoglikana (7).

Vankomicin je prvi odkriti primer spojine, ki uničuje bakterije s ciljanjem na lipid II.

Izolirali so ga iz zemeljske bakterije Amycolatopsis orientalis leta 1956. Ugotovili so, da se

veže na D-Ala-D-Ala v pentapeptidu preko 5 vodikovih vezi in s tem blokira biosintezo

celične stene. Po enakem mehanizmu se na lipid II veže antibiotik teikoplanin (5).

Negativna lastnost takšne vezave je le v spremembi specifičnega substrata za pojav

odpornih sevov bakterij (17). V zadnjem času so dokazali, da je lipid II tarča tudi drugih

naravnih spojin, vključno z lantobiotiki, manopeptimicini in ramoplaninom, ki delujejo z

različnimi mehanizmi (5).

Najstarejši in najbolj intenzivno raziskan policiklični peptidni lantibiotik je nisin.

Proizvajajo ga nekateri sevi Lactococcus lactis. Sestavljen je iz 34 aminokislin in ima

celokupno pozitivni naboj. Zaradi močnega baktericidnega učinka in nizke toksičnosti, se

nisin uporablja kot naravni konzervans v prehranski industriji z oznako E234. Sprva so

mislili, da se nisin podobno kot vankomicin veže na lipid II in zavira glikoziltransferazo,

vendar so kasneje ugotovili, da uporablja lipid II kot »docking molekulo« in nato ciljano z



- 11 -

visoko učinkovitostjo tvori pore v celični steni. Pri mnogih sevih bakterij povzroči

takojšnjo smrt že pri nanomolarnih koncentracijah (5, 17, 21).

Ramoplanin je glikolipodepsipeptidni antibiotik, ki se uporablja za zdravljenje infekcij

gastrointestinalnega trakta povzročenih z Clostridium difficile. FDA ga je odobril, vendar

se lahko uporablja zgolj peroralno, saj je v plazmi nestabilen. Izredno je aktiven proti

Gram+ bakterijam, vključno z MRSA in VRE. Odkrili so, da se na lipid II veže v obliki

dimera (17, 22).

Vezalci na substrat imajo številne prednosti pred tistimi spojinami, ki blokirajo encime.

Značilno je, da blokirajo več stopenj v biosintezi peptidoglikana in/ali delujejo na več

zaviralnih mehanizmov v molekuli. Tako lahko na primer vankomicin z vezavo na D-Ala-

D-Ala blokira tako reakcijo z glikoziltransferazo kot sledečo reakcijo transpeptidacije.

Poleg tega se nekateri analogi vankomicina vežejo tako na substrat kot na encim (7). Po 50

letih klinične uporabe vankomicina proti Gram+ bakterijam, odpornih na druge

antibitotike, je ta dolgoletna uporaba npr. v enterokokih povzročila zamenjavo

terminalnega D-Ala-D-Ala z D-Ala-D-Lac, kar je zmanjšalo jakost vezave vankomicina z

njegovo osnovno tarčo za 1000 x. Omenjeno je močan razlog za iskanje alternativnih

antibiotikov, ki bi jih uporabljali za zdravljenje življenjsko ogrožajočih infekcij (6).

Vezalci na substrat imajo tudi nekatere pomanjkljivosti. So velike in relativno polarne

molekule, kar pomeni, da so z izjemo ramoplanina peroralno neuporabne in ne morejo

predreti zunanje membrane Gram- bakterije. Potrebno jih je aplicirati parenteralno, njihov

spekter aktivnosti pa je omejen na Gram+ bakterije. Vseeno pa sta bila vankomicin in

teikoplanin desetletja zelo pomembni učinkovini in sta še vedno v klinični uporabi (7).

1.6.1.2. Naravni zaviralci, ki se vežejo na glikoziltransferazo

Drugi način inhibicije procesa glikoziltransferaze je neposredna interakcija s TG domeno v

več različnih PBP in MTG. Ciljanje TG encimov je zahteven pristop, saj njihova vloga in

porazdelitev v različnih vrstah bakterij ni povsem pojasnjena (17). Edine znane naravne

spojine, ki inhibirajo GT domeno pripadajo družini antibiotikov, imenovanih moenomicini.

So naravni produkti iz družine fosfoglikolipidnih antibiotikov, ki jih proizvaja bakterija

Streptomyces ghanaensis. Strukturno so si zelo podobni in se s skupnim imenom imenujejo

Flavomicin® (6). Najpomembnejši član te družine je moenomicin A, ki je izredno močan

inhibitor. Njegovo delovanje proti Gram+ bakterijam je 10-1000 x močnejše od



- 12 -

vankomicina. Minimalna inhibitorna koncentracija je v območju od 0,01 do 0,1 µg/mL (7,

23).

Moenomicin zavira rast bakterij z blokiranjem transglikozilazne aktivnosti razreda A PBP,

ki so glavni sodelujoči encimi v biosintezi bakterijske celične stene (24). Klinična

uporabnost moenomicina A je zaradi slabe biološke uporabnosti in visoke stopnje vezave

na serumske proteine ovirana, zato se trenutno uporablja le kot pospeševalec rasti v krmi

za živali (23, 24). Transglikozilacija je večinoma katalizirana z razredom A

bifunkcionalnih PBP. Ugotovili so, da je za vezavo moenomicina A najbolj pomembna

transmembranska domena bifunkcionalnih PBP (24).

Moenomicin vsebuje tri strukturno različna področja: pentasaharid, fosfoglicerat in

izoprenilno verigo s 25 C atomi, imenovano moenocinil, po katerem je moenomicin dobil

tudi ime (Slika 7). Študije so pokazale, da je za vezavo na PBP potrebna tako hidrofobna

veriga kot fosfogliceratni del (23). Prav tako pa so za aktivnost nujno potrebni trije

moenomicinski obroči: C, E in F (17).

Slika 7: Moenomicin A z označenimi za vezavo na PBP pomembnimi strukturnimi elementi

(povzeto po 17)

Kljub dolgotrajni uporabi odpornost nanj še ni opisana. Ugotovili so tudi, da zaradi

odpravljanja patogenih Gram+ bakterij učinkovito prispeva k nadzorovanju širjenja

odpornosti (6).

1.6.2. Sintezni zaviralci glikoziltransferaze

Opisanih je nekaj poskusov priprave sintetičnih in polsintetičnih inhibitorjev

glikoziltransferaze. Tako kot naravni zaviralci, se sintetični prav tako delijo na spojine, ki

se vežejo na substrat in na spojine, ki se vežejo direktno na encim (7).



- 13 -

1.6.2.1. Sintezni zaviralci, ki se vežejo na substrat

Nekaj časa sta bila vankomicin in teikoplanin edina razpoložljiva antibiotika za zdravljenje

okužb z MRSA. S pojavom na vankomicin odpornih mikroorganizmov, so bili sintetizirani

novi hidrofobni glikopeptidni derivati: dalbavancin, oritavancin in telavancin, ki so

trenutno v kliničnih študijah. Obstajajo dokazi, da lahko glikopeptidi s hidrofobno

komponento poleg vezave na prekurzorje peptidoglikana vstopajo v interakcijo tudi z

glikoziltransferazo (7, 17).

Hidrofobni N-alkilirani glikopeptidi imajo močno antibakterijsko delovanje proti številnim

na vankomicin rezistentnim sevom. Najmočnejši glikopeptid oritavancin je bil v fazi III

kliničnega preizkušanja, vendar se je razvoj začasno ustavil zaradi težav v proizvodnem

procesu (17). Nato ga je novembra leta 2013 FDA označil kot antibiotik za zdravljenje

infekcijskih bolezni kože (25). Dalbavancin je bil od leta 2007 do 2013 v fazi III

kliničnega preizkušanja za odrasle z zapletenimi kožnimi infekcijami, novembra leta 2013

pa je bil registriran (26, 27). Telavancin je dobil dovoljenje FDA v septembru 2009 za

zdravljenje infekcijskih bolezni kože, v juniju 2013 pa za zdravljenje z bolnišnico

povezane pljučnice (17, 28).

Oritavancin in telavancin v primerjavi z vankomicinom vsebujeta dodatno hidrofobno

verigo. Pojavilo se je vprašanje zakaj sta tako zelo učinkovita proti na vankomicin

odpornim bakterijam. Prva hipoteza je, da imata sposobnost dimerizacije, kar izboljša

vezavo na lipid II, druga pa da hidrofobna veriga deluje kot membransko sidro in približa

molekulo v tesnejši stik z lipidom II. Ta dva učinka naj bi odpravila težavo s spremenjenim

substratom D-Ala-D-Lac in izboljšala učinkovitost proti na vankomicin odpornim

bakterijam (17).

V zadnjem času so začeli z raziskovanjem majhnih molekul, ki se vežejo na lipid II in

prišli do zanimivega odkritja triptaminskih derivatov. V članku je opisano odkritje novih

inhibitorjev glikoziltransferaze s pomočjo virtualnega rešetanja majhnih molekul iz

knjižnice National Cancer Institute. Izbranim spojinam so testirali sposobnost in vitro

inhibicije glikoziltransferaze, izolirane iz Escherichie coli PBP1b v prisotnosti lipida II. Za

odkritje aktivnega mesta in sidranje spojin iz knjižnice so uporabili program eHiTS 6.0

(20).



- 14 -

Virtualno rešetanje je temeljilo na strukturi S. aureus PBP2 v kompleksu z moenomicinom.

Metodo so uporabili za določitev inhibitorjev GT, s tem so tudi zmanjšali število spojin, ki

bi jim bilo potrebno neposredno določiti aktivnost z in vitro testom (20).

S programom eHiTS so dobili 30 najvišje uvrščenih spojin, ki so jih biokemično testirali.

Ugotovili so, da je 9 spojin netopnih, zato so le preostalih 21 testirali s flourescenčno

metodo. Topne spojine so testirali in vitro pri koncentracijah 0,2 in 1 mM na

glikoziltransferazi izolirani iz E. coli PBP1b (20).

Spojine, ki so bile učinkovite pri flourescenčnem testu, so testirali tudi z radioaktivnim

testom. Najučinkovitejše je glikoziltransferazo zavirala spojina 5 s kemijskim imenom 2-

[1-[(2-klorofenil)metil]-2-metil-5-metilsulfanilindol-3-il]etanamin z IC50 59 mM.

Nadaljevali so z iskanjem spojine z dvodimenzionalno podobnostjo spojini 5 in prišli do

spojine 5b, ki je bila približno 2 krat močnejša od spojine 5 z IC50 29 mM (20).

Program eHiTS je predvidel vezavo spojine 5b kot je prikazano na sliki 8. Model

prikazuje, da spojina 5b delno prekriva obroča C in E kokristaliziranega moenomicina,

zasidrana je celo globlje zaradi dodatne hidrofobne povezave. Moenomicin zaradi svojega

hidrofilnega značaja ne tvori hidrofobnih interakcij (20).

Slika 8 : Levo, strukturi spojin 5 in 5b; desno, računalniški model sidranja spojine 5b v

rentgensko strukturo moenomicina vezanega na glikoziltransferazo iz S. aureus PBP2. Spojina 5b

je turkizne barve, obroči moenomicina so vijolične barve. Z rumeno barvo so označene hidrofobne

interakcije, s črtanima črtama pa vodikove vezi med 5b in Asp156 (povzeto po 20).



- 15 -

Dokazali so, da imata spojini 5 in 5b protimikrobno aktivnost proti več pomembnim

Gram+ patogenom. Določanje MIC vrednosti proti različnim patogenom je pripeljalo do

obetavnih rezultatov, saj je bil bila MIC npr. za kulturo MRSA zelo nizka (4-8 mg/mL),

medtem ko sta bila inhibitorja proti Gram- bakterijam (npr. E. coli) manj učinkovita.

Najverjetneje je to posledica vplivanja E. coli na črpanje inhibitorjev iz periplazme in

slabša prepustnost zunanje plazemske membrane. S testom preživetja bakterij so dokazali,

da deluje spojina 5b tudi baktericidno, saj so ob dodatku 4 kratne koncentracije MIC

zaznali takojšen upad števila živih celic, po dveh urah pa je število živih celic močno

upadlo (20).

Ugotovili so, da je amino skupina na spojini 5b bistvena za inhibiranje glikoziltransferaze,

saj domnevno vstopa v interakcijo s pirofosfatno skupino na lipidu II. Domnevajo, da ima

spojina 5b dva različna mehanizma delovanja. Poleg zaviranja glikoziltransferaze preko

vezave na lipid II, naj bi delovala tudi preko depolarizacije in motenj v delovanju

plazemske membrane (20).

Objava omenjenega članka je osnova za moje diplomsko delo, saj smo poskušali

sintetizirati analoge spojine 5b s še boljšimi MIC in nizko stopnjo citotoksičnosti.



- 16 -

2. NAČRT DELA

V okviru diplomske naloge se bomo usmerili na načrtovanje, sintezo in biološko

vrednotenje inhibitorjev bakterijske glikoziltransferaze. Inhibitorje bomo načrtovali s

pomočjo predhodno opisanega članka avtorjev Derouaux s sod. (20), v katerem je opisano,

da se lahko ustrezno N-substituirani 3-metil-5-metiltiotriptamini vežejo na lipid II in s tem

zaviralno učinkujejo na bakterijsko glikoziltransferazo, kar predstavlja osnovo njihovega

protibakterijskega delovanja. Zaradi zmerne citotoksičnosti objavljenih spojin je bil naš

načrt za zmanjšanje citotoksičnosti sprememba funkcionalnih skupin na spojini vodnici

(Slika 9). Obenem smo želeli povečati ali vsaj ohraniti protimikrobno delovanje in

zaviralno delovanje na bakterijsko glikoziltransferazo.

Slika 9: Spojina vodnica

Spojini vodnici bomo sistematično zamenjali funkcionalne skupine:

Slika 10: Spojina vodnica z vključenimi strukturnimi spremembami



- 17 -

Na mestu R1 bomo –SMe skupino zamenjali z –OMe ali –H. Prisotnost metiltio skupine

sicer vodi do največje aktivnosti, ampak je njena slabost domnevna velika citotoksičnost. S

stališča zmanjšanja citotoksičnosti bo predvidoma bolj primerna popolna odstranitev

funkcionalne skupine z mesta R1 ali uvedba metoksi skupine, ki je bioizosterna zamenjava

za metiltio skupino. Vpliv na citotoksičnost metoksi skupine do sedaj še ni bil raziskan.

Na mestu R2 bomo poleg aminske skupine uvedli tudi gvanidinsko skupino. Ugotovili so

namreč, da so bazične skupine na mestu R2 nujno potrebne za vezavo na lipid II. Na

Katedri za farmacevtsko kemijo so tudi ugotovili, da so gvanidini primernejši od aminov.

Iz predhodnih rezultatov testiranj predvidevajo, da je gvanidin boljši ligand za vezavo na

fosfatno skupino lipida II, saj se z njim poveže preko treh dodatnih vodikovih vezi, kar

prispeva k celotni vezavni entalpiji. Sintetizirali bomo aminske in gvanidinske derivate ter

s tem poskušali potrditi omenjeno hipotezo o boljši primernosti gvanidinov.

Metilno skupino na mestu R3 bomo odstranili. Raziskava vpliva odstranitve metilne

skupine zaenkrat še ni znana.

Na mestu R4 in R5 bomo poskušali raziskati vpliv različnih substituentov. Znano je, da

halogeni na aromatskih obročih lahko prispevajo k citotoksičnosti, zato bomo namesto

dikloro derivata uvedli difluoro derivat in 4-ciano derivat. Slednjega bomo nato z

večstopenjsko sintezo preko nitrilne in amidoksimske skupine pretvorili v ciklični

karbamat, le-tega pa razcepili do končne amidinske skupine. Vpliv teh skupin za vezavo na

lipid II še ni bil raziskan.

Obseg načrtovanega dela je bistveno bolj sistematičen in večji, kot je možno sklepati iz

načrta dela diplomske naloge. Načrtovane spojine so del več diplomskih nalog in

doktorskih disertacij. V mojo diplomsko nalogo je vključenih 8 končnih spojin. Šest spojin

je aminskih, 2 pa gvanidinska derivata. Poleg tega so od 8 spojin 4 spojine dikloro in

difluoro derivati, ostale pa imajo na R4 mestu naslednje skupine: nitrilno, amidoksimsko,

amidinsko in 5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazolni obroč.

Sintentizirane spojine bomo poslali na testiranje inhibicije glikoziltransferaze. Določili

bodo rezidualno aktivnost, to je preostali delež aktivnosti encima po učinkovanju

inhibitorja ter v primeru močnega učinka tudi IC50. Protibakterijski učinek bomo vrednotili

z minimalno inhibitorno koncentracijo (MIC), to je koncentracija, ki prepreči razvoj 99%

ali več vseh bakterij (2). Testirali bomo tudi citotoksičnost končnih spojin. Ugotoviti



- 18 -

namreč želimo, če zamenjane funkcionalne skupine v spojini vodnici prispevajo k

zmanjšanju citotoksičnosti.

Slika 11: Končne spojine za testiranje učinkovitosti zaviranja encima glikoziltransferaze in

testiranja citotoksičnosti



- 19 -

3. MATERIALI IN METODE

reagenti in topila

Uporabljali smo kemikalije in topila proizvajalcev Sigma-Aldrich, Merck, Fluka, in Acros

Organics.

programska oprema

Za risanje struktur, reakcijskih shem in računanje stehiometrijskih razmerij smo uporabljali

programski paket ChemBioDraw Ultra 13.0 ponudnika CambridgeSoft.

kromatografske metode

Za izvedbo tankoplastne kromatografije smo uporabljali plošče Kiselgel 60 F254

izdelovalca Merck z 0,20 mm nanosom silikagela na aluminjastem nosilcu in dodanim

fluorescenčnim indikatorjem. Za detekcijo lis smo uporabljali UV svetilko (λ=254 nm) in

orositveni reagent ninhidrin.

Za čiščenje produktov s kolonsko kromatografijo smo uporabljali silikagel proizvajalca

Merck velikosti 0,040 do 0,063 mm za kolonsko ''flash'' kromatografijo. Uporabljali smo

tudi avtomatiziran preparativni kromatografski sistem IsoleraTM One proizvajalca Biotage.

jedrska magnetna resonanca

NMR spektre so posneli na spektrometru Bruker Avance DPX 300 s TMS kot internim

standardom na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo in Bruker Avance DPX 400 s

TMS kot internim standardom na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani. Vzorce smo

raztapljali v CDCl3, DMSO-d6, in CD3OD. Za procesiranje FID oblike spektrov smo

uporabljali program MestReC proizvajalca MESTRECLAB RESEARCH SL in

ACD/NMR Processor proizvajalca Advanced Chemistry Development.

masna spektrometrija

MS spektre so posneli na spektrometru Q-TOF Premier z ESI metodo ionizacije na

Institutu Jožef Stefan v Ljubljani.

infrardeča spektroskopija

IR spektre so posneli na spektrofotometrih Perkin Elmer 1600 FT-IR in Nicolet Nexus FT-

IR na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani.



- 20 -

določanje tališča

Tališča smo določali na mikroskopu Leica z ogrevalno mizico in so nekorigirana.

tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC)

HPLC analize so bile opravljene na instrumentu Agilent Technologies HP 1100 z G1365

UV-VIS detektorjem (220 in 254 nm) na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani.

Uporabili smo kolono Luna C18 (4.6 × 250 mm) pri pretoku 1mL/min. Elucijsko topilo je

predstavljala mešanica 0,1% trifluoroocetne kisline v vodi (A) in acetonitrila ali metanola

(B).



- 21 -

4. EKSPERIMENTALNO DELO

4.1. Reakcijske sheme:

Sinteza 4-amidinofenilnega derivata triptamina

Zaščita 5-metoksitriptamina s ftalanhidridom



- 22 -

Alkiliranje indolnega dušika 5-metoksitriptamina z različno substituiranimi benzilbromidi

R1 R2 SPOJINA

-H -CN 10

-Cl -Cl 12

-F -F 16

Odščita ftalimidne zaščite s hidrazinolizo

R1 R2 SPOJINA

-H -CN 11

-Cl -Cl 13

-F -F 17



- 23 -

Sinteza dveh različno substituiranih gvanidinov (nukleofilna substitucija med N,N'-

di(tercbutoksikarbonil)-S-metilizotiosečnino in 5-metoksitriptaminom)

R1 R2 SPOJINA

-Cl -Cl 14

-F -F 18

Odščita Boc zaščite z acidolizo

R1 R2 SPOJINA

-Cl -Cl 15

-F -F 19



- 24 -

4.2. Sintezni postopki in rezultati analiz

4.2.1. Sinteza 2-(2-(1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (1)

Izhodno spojino 0 (6,08 g, 38 mmol) in ftalanhidrid (6,00 g, 40,4 mmol) raztopimo v 35

mL brezvodnega toluena in segrevamo čez noč pri temperaturi 115°C (ob refluksu).

Toluen uparimo na rotavaporju in trden preostanek kristaliziramo iz mešanice topil

etilacetat/heksan na naslednji način: trden preostanek raztopimo v 50 mL etilacaetata in 50

mL heksana. Bučko vpnemo v kaloto in počasi segrevamo, postopoma dodajamo etilacetat,

dokler se ves ostanek v bučki raztopi (skupno 88 mL etilacetata). Po popolni raztopitvi

vzorca dodamo par mL heksana oziroma do zatemnitve. Bučko postavimo v ledeno kopel,

da se izločijo kristali spojine. Kristale odnučamo in matičnico uparimo na rotavaporju na

polovico začetne količine. Ponovno postavimo v ledeno kopel in izpadle kristale še enkrat

odnučamo.

Opis: rumeni kristali

η : 9,73 g (88,2%)

Rf : EtOAc/heksan = 1/1, 0,65

1H NMR (300MHz, CDCl3): δ= 3,19 (t, 2H, J = 7,8 Hz, -CH2CH2N-), 4,04 (t, 2H, J = 7,8

Hz, -CH2CH2N-), 7,11-7,17 (dt, 2H, J1 = 10,4 Hz , J2 = 2,3 Hz , C(5)H-indol + C(6)H-

indol), 7,18-7,24 (dt, 1H, J1 = 8,0 Hz, J2 = 1,3 Hz, C(7)H-indol) 7,37 (d, 1H, J = 8,0 Hz,

C(2)H-indol), 7,69-7,73 (m, 2H, C(3)ftalimid + C(6)ftalimid), 7,76 (d, 1H, J = 8,0 Hz,

C(4)H-indol), 7,84-7,87 (m, 2H, C(4)ftalimid + C(5)ftalimid) , 8,06 (s, 1H, -NH) ppm.



- 25 -

13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ = 23.86, 38.19, 78.60, 78.93, 79.25, 110.54, 111.41,

117.94, 118.31, 120.95, 122.88, 122.95, 127.00, 131.60, 134.30, 136.18, 167.76 ppm.

IR ν(max) = 3354, 3056, 2945, 2919, 2860, 2363, 2344, 1769, 1706, 1617, 1457, 1428,

1396, 1358, 1341, 1328, 1288, 1234, 1188, 1169, 1105, 1087, 1056, 1009, 992, 868, 819,

790, 745, 714, 615, 599, 554, 543, 530, 505, 430 cm-1.

4.2.2. Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1-

il)metil)benzonitrila (2)

V suspenzijo NaH (0,37 g, 60% wt. v parafinskem olju, 9,42 mmol) v 20 mL brezvodnega

DMF po kapljicah dodajamo raztopino izhodne spojine 0 (2,29 g, 7,85 mmol) v 20 mL

brezvodnega DMF. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri sobni temperaturi 30 minut oz.

dokler ne zaznamo prehoda reakcijske zmesi iz rumene v temno rjavo barvo. Nato vanjo

dodamo α-bromo-p-tolunitril (2,00 g, 10,20 mmol) raztopljen v 10 mL brezvodnega DMF.

Reakcijsko zmes pustimo mešati pri 55°C čez noč. Za izvedbo same reakcije so potrebni

brezvodni pogoji, zato reakcijo izvajamo pod argonovo atmosfero. Po poteku reakcije

reakcijsko zmes ohladimo na sobno temperaturo, topilo odparimo na rotavaporju,

zaostanek pa raztopimo v 50 ml EtOAc. Prenesemo v lij ločnik in spiramo organsko fazo s

3 x 20 ml destilirane vode, 1 x 20 ml nasičene raztopine NaHCO3 in 1 x 20 ml nasičene

raztopine NaCl. Organsko fazo sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na

rotavaporju odparimo topilo. Sledi prekristalizacija iz EtOH (105 ml). Preostanek surovega

produkta iz matičnice čistimo s kolonsko kromatografijo na avtomatskem

kromatografskem sistemu Isolera One z gradientom mobilne faze EtOAc/heksan (29).



- 26 -

Opis: rumena amorfna snov

η : 2,70 g (84,9%)



Hz, -CH2CH2N-), 5,34 (s, 2H, -NCH2C6H4C-), 7,03 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,12 (d, 2H, J =

8,4 Hz, C(2)H-C6H4-R + C(6)H-C6H4-R), 7,14-7,20 (m, 3H, C(5)H-indol + C(6)H-indol) +

C(7)H-indol), 7,56 (d, 2H, J = 8,4 Hz, C(3)H-C6H4-R + C(5)H-C6H4-R), 7,73-7,75 (m, 2H,

C(3)ftalimid + C(6)ftalimid), 7,76-7,78 (dd, 1H, J1 = 8,4 Hz , J2 = 1,2 Hz, C(4)H-indol),

7,83-7,85 (m, 2H, C(4)ftalimid + C(5)ftalimid) ppm.

13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ = 23.53, 38.16, 48.34, 109.94, 109.99, 111.03,

118.49, 118.67, 118.90, 121.51, 122.98, 126.93 , 127.46 , 127.70, 131.52 , 132.39, 134.34,

135.94, 144.15, 167.77 ppm.

IR ν(max) = 3462, 3057, 2926, 2859, 2363, 2344, 2228, 1769, 1711, 1610, 1479, 1468,

1432, 1401, 1375, 1361, 1332, 1263, 1238, 1178, 1111, 1090, 1076, 1011, 994, 872, 851,

821, 789, 734, 727, 714, 687, 553, 530, 510, 426 cm-1.

4.2.3. Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1-il)metil)-N'-

hidroksibenzimidamid (3)

V suho 50 mL bučko zatehtamo hidroksilamonijev klorid (NH2OHxHCl, 0,26 g, 3,70

mmol) in ga raztopimo v 35 mL brezvodnega etanola. Dodamo trietilamin (Et3N, 0,52 mL)

in mešamo pri sobni temperaturi 15 minut oz. dokler se vse popolnoma raztopi. Dodamo



- 27 -

izhodno spojino 2 (0,50 g, 1,23 mmol) in mešamo čez noč pri 60°C pod refluksom. Za

izvedbo same reakcije so potrebni brezvodni pogoji, zato dodamo klorkalcijevo cevko.

Reakcijsko zmes ohladimo na ledeni kopeli. Oborino odfiltriramo s pomočjo teflonskega

filtra (velikost por 0,45 m) in presesalne erlenmajerice.

Opis: svetlo rumena amorfna snov

η : 0,43 g (80,0%)



Hz, -CH2CH2N-), 4,81 (s, 1H, -OH), 5,30 (s, 2H, -NCH2C6H4C-), 7,03 (s, 1H, C(2)H-

indol), 7,09-7,16 (t, 3H, J = 8,0 Hz C(5)H-indol + C(6)H-indol + C(7)H-indol), 7,18-7,23

(t, 2H, J = 8,0 Hz C(2)H-C7H7N2O + C(6)H-C7H7N2O), 7,53-7,55 (d, 2H, J = 8,0 Hz,

C(3)H-C7H7N2O + C(5)H-C7H7N2O), 7,70-7,73 (m, 2H, C(3)ftalimid + C(6)ftalimid),

7,74-7,77 (d, 1H, J = 8,3 Hz, C(4)H-indol), 7,83-7,86 (m, 2H, C(4)H-ftalimid + C(5)H-

ftalimid) ppm.

4.2.4. Sinteza 4-((3-(2-aminoetil)-1H-indol-1-il)metil)-N'-hidroksibenzimidamida

(4)

V 50 mL bučko zatehtamo izhodno spojino 3 (0,30 g, 0,68 mmol), dodamo 35 mL etanola

ter segrevamo na vodni kopeli dokler se vse ne raztopi. Postopoma po kapljicah dodamo

hidrazinhidrat (0,17 mL, 3,42 mmol) in segrevamo 12 ur pri 90°C pod refluksom.



- 28 -

Naslednji dan s TLC analizo preverimo, če je reakcija potekla. Ohladimo na sobno

temperaturo, z rotavaporjem koncentriramo reakcijsko zmes in z 1 molarno vodno

raztopino NaOH naalkalimo do pH 12-13. Vodno fazo nato 3 x ekstrahiramo s 25 mL

EtOAc. Združimo organske faze, sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na

rotavaporju odparimo topilo. Spojino pretvorimo še v hidroklorid, zaostanek po zadnjem

rotavapiranju raztopimo v 5 ml absolutnega EtOH, dodamo 2 ekv. 1M HCl/EtOH (1,3 mL)

katero smo pripravili in situ. Raztopino ohladimo na ledeni kopeli in trituriramo z EtOEt

dokler izpada bela oborina. S pomočjo EtOEt zmanjšamo topnost spojine v etanolu.

Filtriramo s pomočjo teflonskega filtra in presesalne erlenmajerice ter na rotavaporju

sušimo do suhega preostanka.

Opis: bela amorfna snov

η : 0,19 g (78,8%)

Rf : DKM/MeOH = 9/1+1% TEA, 0,04

Ttal : 169 – 176°C

1H NMR (300MHz, DMSO-d6): δ= 2,76-2,83 (m, 4H, -CH2CH2N-), 5,36 (s, 2H, -

NCH2C6H4-), 5,73 (s, 2H, -CH2CH2NH2 -), 6,97-7,02 (dt, J1 = 7,2 Hz, J2 = 1,1 Hz, 1H,

C(5)H-indol), 7,05-7,10 (dt, J1 = 7,2 Hz, J2 = 1,1 Hz ,1H, C(6)H-indol), 7,17 (d, 2H, J =

8,1 Hz, C(2)H-C7H7N2O + C(6)H-C7H7N2O), 7,29 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,39 (d, 1H, J =

8,1 Hz, C(7)H-indol), 7,54 (d, 1H, J = 8,1 Hz, C(4)H-indol), 7,58 (d, 2H, J = 8,1 Hz,

C(3)H-C7H7N2O + C(5)H-C7H7N2O), 9,57 (s, 2H, -Ph-C(=NOH)-NH2) ppm.

13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 22.88, 48.48, 109.99, 110.15, 118.66, 118.97,

121.59, 124.42, 127.14, 127.40, 127.48, 128.27, 135.99, 143.83, 159.03 ppm.

IR ν(max) = 3403, 3047, 1664, 1612, 1466, 1438, 1417, 1357, 1334, 1254, 1178, 1151,

1015, 943, 825, 780, 747, 670, 428 cm-1.

MS m/z (TOF MS ES+): 309,2 (MH+)

HRMS: izračunano (za C18H21N4O) 309,1715; izmerjeno 309,1718 (1,0 ppm).

HPLC: kolona Luna C18 (4.6 × 250 mm), mobilna faza: 10-90% MeOH v 0,1% TFA, λ =

254 nm, AUC = 1079 mAU*s, AUC [%] = 93,0



- 29 -

4.2.5. Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-1H-indol-1-il)metil)-N'-

((etoksikarbonil)oksi)benzimidamida (5)

V 40 mL brezvodnega CH2Cl2 raztopimo izhodno spojino 3 (0,80 g, 1,82 mmol) in

dodamo trietilamin (0,51 mL). Raztopino ohladimo na ledeni kopeli in počasi dokapavamo

etilkloroformat ter mešamo 40 minut. Reakcijsko zmes spiramo z 1 x 20 mL vode in 2 x 20

mL nasičene raztopine NaHCO3. Organsko fazo sušimo z Na2SO4, filtriramo in uparimo na

rotavaporju.

Opis: svetlo rumena amorfna snov

η : 0,85 g (91,3%)

Rf : DKM/MeOH= 20/1, 0,62

1H NMR (300MHz, CDCl3): δ= 1,38 (t, 3H, J = 7,2 Hz, -OCH2CH3), 3,18 (t, 2H, J = 7,7

Hz, -CH2CH2N-), 4,03 (t, 2H, J = 7,7 Hz, -CH2CH2N-), 4,34 (k, 2H, J = 7,2 Hz, -

OCH2CH3), 5,05 (s, 2H, -Ph-C(=NOH)-NH2), 5,30 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 7,01 (s, 1H,

C(2)H-indol), 7,10-7,15 (m, 3H, C(2)H-C6H4R + C(6)H-C6H4-R + C(5)H-indol), 7,16-7,18

(m, 2H, C(6)H-indol + C(7)H-indol), 7,60 (d, 2H, J = 8,5 Hz, C(3)H-C6H4-R + C(5)H-

C6H4R), 7,71-7,73 (m, 2H, C(3)H-ftalimid + C(6)H-ftalimid), 7,76 (d, 1H, J = 1,9 Hz,

C(4)H-indol), 7,82-7,85 (m, 2H, C(4)H-ftalimid + C(5)H-ftalimid) ppm.



- 30 -

4.2.6. Sinteza 2-(2-(1-(4-(5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il)benzil)-1H-indol-

3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (6)

Izhodno spojine 5 (0,85 g, 1,67 mmol) raztopimo v 35 mL brezvodnega toluena. Raztopino

segrevamo 48 ur pri 110°C ob refluksu. Za izvedbo same reakcije so potrebni brezvodni

pogoji, zato reakcijo izvajamo pod argonovo atmosfero. Topilo uparimo na rotavaporju.

Čistost produkta preverimo s TLC. Spojino 6 prekristaliziramo iz etanola. Produkt

raztopimo v manjši količini etanola (27 mL) in segrevamo ob vrenju do popolne raztopitve.

Raztopino ohlajamo na ledeni kopeli, dokler ne izpadejo kristali čiste spojine 6. Kristale

odnučamo in posušimo.

Opis: intenzivno rumeni kristali

η : 0,64 g (82,1%)

Rf : DKM/MeOH = 9/1, 0,53


Hz, -CH2CH2N-), 5,35 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 7,04 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,13-7,20 (m, 5H,

C(2)H-C6H4R + C(6)H-C6H4-R + C(5)H-indol + (6)H-indol + C(7)H-indol), 7,65-7,76 (m,

5H, C6H4-ftalimid + C(4)H-indol), 7,83-7,86 (m, 2H, C(3)H-C6H4R + C(5)H-C6H4-R)

ppm.



- 31 -

4.2.7. Sinteza 3-(4-((3-(2-aminoetil)-1H-indol-1-il)metil)fenil)-1,2,4-oksadiazol-

5(4H)-ona (7)

V 50 mL bučko zatehtamo izhodno spojino 6 (0,30 g, 0,65 mmol) in jo raztopimo v 35 mL

etanola ter segrevamo na vodni kopeli dokler se vse raztopi. Postopoma po kapljicah

dodamo hidrazin hidrat (0,16 mL, 3,23 mmol) in segrevamo čez noč pri 90°C pod

refluksom. Naslednji dan s TLC analizo preverimo, če je reakcija potekla. Ohladimo na

sobno temperaturo in z rotavaporjem koncentriramo reakcijsko zmes in z 1 molarno vodno



rotavaporju odparimo topilo. Ugotovimo da spojina 7 ni dobro topna v EtOAc, zato vodno

fazo uparimo in izvedemo reverznofazno kolonsko kromatografijo Isolera One z mobilno

fazo H2O + 0,1% CF3COOH/MeOH.

Opis: svetlo rumeni kristali

η : 0,18 g (81,0%)

Rf : DKM/M = 4/1 + 1%TEA, 0,18

Mobilna faza za kolonsko kromatografijo:

A: H2O + 0,1% CF3COOH

B: MeOH (graduiran pretok 10% B/90% A – 80% B/20% A)

Ttal : 203 – 209°C

1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ= 3,02 (t, 2H, J = 6,4 Hz, -CH2CH2N-), 3,11 (t, 2H, -

CH2CH2N-), 5,48 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 7,07 (t, 1H, J = 7,4 Hz, C(5)H-indol), 7,14 (t, 1H,



- 32 -

J = 7,4 Hz, C(6)H-indol), 7,38 (d, 2H, J = 7,9 Hz, C(2)H-C6H4R + C(6)H-C6H4-R), 7,42

(m, 2H, C(2)H-indol + C(7)H-indol), 7,61 (d, 1H, J = 7,8 Hz, C(4)H-indol), 7,75 (d, 2H, J

= 7,4 Hz, C(3)H-C6H4R + C(5)H-C6H4-R), 7,82 (s, 3H, NH3+), 12,97 (s, 1H, -NH) ppm.

13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 23.52, 49.10, 110.17, 110.69, 119.06, 119.49,

122.15, 122.81, 126.79, 127.73, 127.93, 128.26, 136.59, 143.10, 157.62, 160.46 ppm.

IR ν(max) = 3448, 3152, 3075, 2952, 2477, 2363, 2344, 1778, 1660, 1616, 1558, 1520,

1467, 1449, 1435, 1406, 1371, 1334, 1250, 1242, 1190, 1149, 1017, 986, 950, 892, 844,

803, 769, 737, 722, 700, 664, 564, 497, 429 cm-1.


HRMS: izračunano (za C19H19N4O2) 335,1508; izmerjeno 335,1506 (-0,6 ppm).


254 nm, AUC = 2543 mAU*s, AUC [%] = 99,1

4.2.8. Sinteza amino(4-((3-(2-aminoetil)-1H-indol-1-il)metil)fenil)

metaniminijevega acetata (8)

Izhodno spojino 7 (0,25 g, 7,47 mmol) raztopimo v 20 mL brezvodnega etanola in 8 mL

brezvodne ocetne kisline. Iz dvovratne bučke z vodno črpalko izsesamo zrak in prepihamo

z argonom. Dodamo približno 10% masnega deleža katalizatorja Pd/C (25 mg). Ponovno

izsesamo zrak iz reakcijske zmesi in nastavimo reakcijsko zmes pod vodikovo atmosfero.

Mešamo pri sobni temperaturi na magnetnem mešalu 4 ure oz. dokler ne zaznamo popolne

pretvorbe izhodne spojine v končno spojino 8. Reakcijsko zmes nato filtriramo s pomočjo

teflonskega filtra in presesalne erlenmajerice. Matičnici s produktom uparimo topilo na



- 33 -

rotavaporju. Preostanek po sušenju trituriramo z EtOEt dokler večina ocetne kisline preide

v EtOEt. Topilo s kapalko previdno odstranimo, kristale pa posušimo na rotavaporju.

Opis: svetlo sivi kristali

η : 0,26 g (98,9%)

Rf : MeOH : H2O : CH3CN = 1 : 1 : 3, 0,04

Ttal : 167 – 171°C

1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ= 3,00 (d, 2H, J = 6,1 Hz, -CH2CH2N-), 3,06 (d, 2H, J

= 6,1 Hz, -CH2CH2N-), 5,50 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 7,05 (t, 1H, J = 6,5 Hz, C(5)H-indol),

7,12 (t, 1H, J = 6,5 Hz, C(6)H-indol), 7,38 (d, 2H, J = 8,0 Hz,C(2)H-C6H4R + C(6)H-

C6H4-R), 7,43 (s, 2H, C(2)H-indol + C(7)H-indol), 7,60 (d, 1H, J = 7,2 Hz, C(4)H-indol),

7,72 (d, 2H, J = 7,1 Hz, C(3)H-C6H4R + C(5)H-C6H4-R) ppm.

13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 23.05, 24.28, 48.49, 110.12, 110.53, 118.63, 118.90,

121.52, 127.03, 127.29, 127.59, 127.97, 128.08, 135.99, 143.85, 165.76, 174.24 ppm.

IR ν(max) = 3338, 3102, 2346, 1671, 1617, 1560, 1498, 1466, 1438, 1413, 1250, 1189,

1133, 1014, 950, 926, 844, 797, 733, 687, 652, 518, 463, 424 cm-1.


HRMS: izračunano (za C18H21N4) 293,1766; izmerjeno 293,1764 (-0,7 ppm).


254 nm, AUC = 1017 mAU*s, AUC [%] = 96,8.

4.2.9. Sinteza 2-(2-(5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona (9)



- 34 -

Izhodno spojino 0.1 (1,06 g, 5,59 mmol) in ftalanhidrid (0,88 g, 6,01 mmol) raztopimo v

55 mL brezvodnega toluena in segrevamo čez noč pri temperaturi 115°C ob refluksu.

Toluen uparimo na rotavaporju. Reakcija poteče kvantitativno, zato izoliramo čist produkt

in ni potrebno izvajati kolonske kromatografije ali prekristalizacije iz mešanice topil

etilacetat/heksan (29).

Opis: rjava amorfna snov

η : 1,78 g (99,5%)


1H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 3,15 (dt, 2H, J1 = 7,8 Hz, J2 = 0,8 Hz, -CH2CH2N-), 3,89

(s, 3H, -OCH3) 4,02 (t, 2H, J = 7,8 Hz, -CH2CH2N-), 6,86 (ddd, 1H, J1 = 8,8 Hz, J2 = 2,5

Hz, J3 = 0,5 Hz C(6)H-indol), 7,11 (dd, 1H, J1 = 2,5 Hz, J2 = 0,5 Hz, C(4)H-indol), 7,20 (d,

1H, J = 2,5 Hz, C(2)H-indol), 7,26 (dd, 1H, J1 = 8,8 Hz, J2 = 0,5 Hz, C(7)H-indol), 7,72-

7,74 (m, 2H, C(3)H-ftalimid + C(6)H-ftalimid), 7,85-7,87 (m, 2H, C(4)H-ftalimid +

C(5)H-ftalimid), 7,95 (s, 1H, -NH) ppm.

4.2.10. Sinteza 4-((3-(2-(1,3-dioksoizoindolin-2-il)etil)-5-metoksi-1H-indol-1-

il)metil)benzonitrila (10)

V suspenzijo NaH (83 mg, 60% wt. v parafinskem olju, 2,06 mmol) v 7 mL brezvodnega

DMF po kapljicah dodamo raztopino izhodne spojine 9 (0,55 g, 1,72 mmol) v 7 mL





- 35 -

dodamo α-bromo-p-tolunitril (0,51 g, 2,58 mmol) raztopljen v 6 mL brezvodnega DMF.

Reakcijsko zmes pustimo mešati pri 55°C čez noč. Za izvedbo same reakcije so potrebni

brezvodni pogoji, zato reakcijo izvajamo pod argonovo atmosfero. Po poteku reakcije

reakcijsko zmes ohladimo na sobno temperaturo, topilo odparimo na rotavaporju,




rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko kromatografijo (Isolera One) z

mobilno fazo toluen/EtOAc (graduirano 4-34% EtOAc) (29).

Opis: rjava amorfna snov

η : 0,62 g (83,5%)

Rf : toluen/EtOAc = 5/1, 0,34

1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ= 3,03 (t, 2H, J = 7,2 Hz, -CH2CH2N-), 3,71 (s, 3H, -

OCH3), 3,87 (t, 2H, J = 7,2 Hz, -CH2CH2N-), 5,41 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 6,70 (dd, 1H, J1

= 8,8 Hz, J2 = 2,3 Hz, C(6)H-indol), 7,04 (dd, 1H, J1 = 12,6 Hz, J2 = 2,3 Hz, C(7)H-indol),

7,16-7,22 (m, 3H, C(2)H-C6H4R + C(6)H-C6H4-R + C(4)H-indol), 7,28 (s, 1H, C(2)H-

indol), 7,72 (d, 2H, J = 8,4 Hz, C(3)H-C6H4R + C(5)H-C6H4-R), 7,81-7,87 (m, 4H; C6H4-

ftalimid) ppm.

4.2.11. Sinteza 4-((3-(2-aminoetil)-5-metoksi-1H-indol-1-il)metil)benzonitrila (11)

V 50 mL bučko zatehtamo izhodno spojino 10 (0,62 g, 1,43 mmol) in jo raztopimo v 35

mL etanola ter segrevamo na vodni kopeli dokler se vse ne raztopi. Postopoma po



- 36 -

kapljicah dodamo hidrazin hidrat (0,45 mL, 14,32 mmol) in segrevamo čez noč pri 90°C

pod refluksom. Naslednji dan s TLC analizo preverimo, če je reakcija potekla. Ohladimo

na sobno temperaturo in z rotavaporjem koncentriramo reakcijsko zmes in z 1 molarno

vodno raztopino NaOH naalkalimo do pH 12-13. Vodno fazo nato 3 x ekstrahiramo s 25

mL EtOAc. Združimo organske faze, sušimo z Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na

rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko kromatografijo (Isolera One,

stacionarna faza KP-NH) z mobilno fazo DKM/MeOH (graduirano 0,5-4% MeOH).

Spojino pretvorimo še v hidroklorid. Očiščen produkt s kolonsko kromatografijo raztopimo

v 7 ml absolutnega EtOH, po kapljicah dodamo 2 ekv. 1M HCl/EtOH (1,7 mL) katero smo

predhodno pripravili in situ. Raztopino ohladimo na ledeni kopeli in trituriramo z EtOEt

dokler izpada rjava oborina. S pomočjo EtOEt zmanjšamo topnost spojine v etanolu.

Filtriramo s teflonskim filtrom in presesalno erlenmajerico ter na rotavaporju sušimo do

suhega preostanka (29).

Opis: siva amorfna spojina

η : 0,11 g (23,5%)

Rf : DKM/MeOH=9/1+1%TEA, 0,32

Tg : 214 – 223°C

1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ= 2,97 (t, 2H, J = 6,4 Hz, -CH2CH2N-), 3,07 (t, 2H, J =

6,4 Hz, -CH2CH2N-), 3,78 (s, 3H, -OCH3), 5,46 (s, 2H, -NCH2C6H4-), 6,77 (dd, 1H, J1 =

8,7 Hz, J2 = 2,5 Hz, C(6)H-indol), 7,11 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(4)H-indol), 7,27-7,31 (m, 3H,

C(2)H-C6H4R + C(6)H-C6H4-R + C(7)H-indol), 7,37 (s, 1H, C(2)H-indol) 7,79 (d, 2H, J =

8,7 Hz, C(3)H-C6H4R + C(5)H-C6H4-R), 7,87 (s, 3H, -NH3+) ppm.

13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 22.96, 48.64, 55.43, 100.63, 109.32, 109.99, 110,92,

111.61, 118.69, 127.65, 127.84, 131.24, 132.44, 144.14, 153.54 ppm.

IR ν(max) = 3422, 2924, 2364, 2345, 2229, 1994, 1610, 1490, 1458, 1438, 1352, 1317,

1271, 1230, 1187, 1118, 1046, 950, 905, 819, 788, 646, 552 cm-1.


HRMS: izračunano (za C19H20N3O) 306,1606; izmerjeno 306,1607 (0,3 ppm).


254 nm, AUC = 988 mAU*s, AUC [%] = 100,0.



- 37 -

4.2.12. Sinteza 2-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-

1,3-diona (12)

V suspenzijo NaH (83 mg, 60% wt. v parafinskem olju, 2,06 mmol) v 7 mL brezvodnega

DMF po kapljicah dodajamo raztopino izhodne spojine 9 (0,55 g, 1,72 mmol) v 7 mL



dodamo 3,4-diklorobenzilbromida (0,54 g, 2,23 mmol) raztopljenega v 6 mL brezvodnega

DMF. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri 55°C čez noč. Za izvedbo same reakcije so

potrebni brezvodni pogoji, zato reakcijo izvajamo pod argonovo atmosfero. Po poteku

reakcije reakcijsko zmes ohladimo na sobno temperaturo, topilo odparimo na rotavaporju,




rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko kromatografijo Isolera One z

mobilno fazo toluen/EtOAc (graduirano 4-34% EtOAc) (29).

Opis: rumena amorfna spojina

η : 0,63 g (76,3%)


1H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 3,15 (t, 2H, J = 7,5 Hz, -CH2CH2N-), 3,87 (s, 3H, -

OCH3), 4,02 (t, 2H, J = 7,5 Hz, -CH2CH2N-), 5,19 (s, 2H, -NCH2C6H3Cl2), 6,84 (m, 2H,



- 38 -

C(6)H-indol + C(6)H-C6H3Cl2), 7,00 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,06 (d, 1H, J = 8,9 Hz, C(7)H-

indol), 7,18 (d, 1H, J = 2,1 Hz, C(4)H-indol), 7,22 (d, 1H, J = 2,0 Hz, C(2)H-C6H3Cl2),

7,34 (d, 1H, J = 8,4 Hz, C(5)H- C6H3Cl2), 7,72-7,74 (m, 2H, C(3)H-ftalimid + C(6)H-

ftalimid), 7,83-7,85 (m, 2H, C(4)H-ftalimid + C(5)H-ftalimid) ppm.

4.2.13. Sinteza 2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etanamina (13)

V 50 mL bučko zatehtamo izhodno spojino 12 (0,61 g, 1,28 mmol), dodamo 35 mL etanola

ter segrevamo na vodni kopeli dokler se vse ne raztopi. Postopoma po kapljicah dodamo

hidrazin hidrat (0,31 mL, 6,38 mmol) in segrevamo čez noč pri 90°C pod refluksom.

Naslednji dan s TLC analizo preverimo, če je reakcija potekla. Ohladimo na sobno

temperaturo in z rotavaporjem koncentriramo reakcijsko zmes in z 1 molarno vodno



rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko kromatografijo (Isolera One,

stacionarna faza KP-NH) z mobilno fazo DKM/MeOH (graduirano 0,5-3% MeOH).

Spojino pretvorimo še v hidroklorid. Očiščen produkt s kolonsko kromatografijo raztopimo

v 7 ml absolutnega EtOH, po kapljicah dodamo 2 ekv. 1M HCl/EtOH (1,7 mL) katero smo

predhodno pripravili in situ. Raztopino ohladimo na ledeni kopeli in trituriramo z EtOEt

dokler izpada rjava oborina. S pomočjo EtOEt zmanjšamo topnost spojine v etanolu.

Filtriramo s teflonskim filtrom in presesalno erlenmajerico ter na rotavaporju sušimo do

suhega preostanka (29).



- 39 -

Opis: svetlo rjavi kristali

η : 0,15 g (31,3%)

Rf : DKM/MeOH=9/1+1%TEA, 0,30

Ttal : 186 – 190°C

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ= 2,73 (t, 2H, J = 6,7 Hz, -CH2CH2NH-), 2,81 (t, 2H, J

= 6,7 Hz, -CH2CH2N-), 3,76 (s, 3H, -OCH3), 5,33 (s, 2H, -NCH2C6H3Cl2), 6,74 (dd, 1H, J1

= 8,5 Hz, J2 = 2,3 Hz, C(6)H-indol), 7,03 (d, 1H, J = 2,3 Hz, C(2)H-C6H3Cl2), 7,09 (dd,

1H, J1 = 8,5 Hz, J2 = 2,3 Hz, C(6)H-C6H3Cl2), 7,29 (m, 2H, J = 9,4 Hz, C(2)H-indol +

C(5)H-C6H3Cl2), 7,44 (d, 1H, J = 2,3 Hz, C(4)H-indol), 7,56 (d, 1H, J = 8,5 Hz, C(7)H-

indol) ppm.

13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 22.94, 47.85, 55.45, 100.67, 109.53, 110.91, 111.61,

127.35, 127.61, 127.90, 128.99, 130.69, 131.02, 131.15, 139.60, 153.54 ppm.

IR ν(max) = 3855, 3423, 2921, 2366, 2346, 1607, 1491, 1400, 1314, 1271, 1231, 1116,

1048, 1029, 830, 794, 670 cm-1.


HRMS: izračunano (za C18H19N2OCl2) 349,0874; izmerjeno 349,0879 (1,4 ppm).


254 nm, AUC = 735 mAU*s, AUC [%] = 96,8.

4.2.14. Sinteza 1,2-bis(1-(terc-butoksi)karbonil)-3-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-

metoksi-1H-indol-3-il)etil)gvanidina (14)

V bučko natehtamo spojino 13 (0,10 g, 0,26 mmol) in jo raztopimo v 5 ml DMF. Dodamo

ji N,N'-di-(terc-butoksikarbonil)-S-metilizotiosečnino (75 mg, 0,26 mmol), Et3N (0,11 ml,



- 40 -

0,78 mmol) in HgCl2 (71 mg, 0,26 mmol) v navedenem zaporedju. Reakcijsko zmes

pustimo mešati pri sobni temperaturi čez noč. Po poteku reakcije najprej s pomočjo

presesalne erlenmajerice odfiltriramo neraztopljeno sol Hg(SMe)Cl, ki nastane pri reakciji.

Filtratu na rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko »flash« kromatografijo

z mobilno fazo EtOAc/heksan=1/3 (29).

Opis: svetlo rjava amorfna spojina

η: 0,13 g (85,4%)

Rf: EtOAc/heksan=1/3, 0,41

1H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 1,47 (s, 9H, -NHCOOC(CH3)3, 1,53 (s, 9H,

=NCOOC(CH3)3), 3,03 (t, 2H, J = 6,7 Hz, -CH2CH2N-), 3,78 (k, 2H, J = 6,7 Hz, -

CH2CH2NH-), 3,88 (s, 3H, -OCH3), 5,21 (s, 2H, -NCH2C6H3Cl2), 6,86 (dd, 1H, J1 = 8,5

Hz, J2 = 2,2 Hz, C(6)H-indol), 6,89 (dd, 1H, J1 = 8,5 Hz, J2 = 2,2 Hz, C(6)H-C6H3Cl2),

7,01 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,06-7,08 (m, 2H, C(2)H-C6H3Cl2 + C(5)H-C6H3Cl2), 7,26 (d,

1H, J = 2,2 Hz, C(4)H-indol), 7,35 (d, 1H, J = 8,5 Hz, C(7)H-indol), 8,46 (t, 1H, J = 4,5

Hz, -CH2CH2NH-), 11,51 (s, 1H, -NHBoc) ppm.

4.2.15. Sinteza 1-(2-(1-(3,4-diklorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)gvanidina

(15)

V bučko natehtamo spojino 14 (0,10 g, 0,17 mmol) in jo raztopimo v 5 ml brezvodnega

DKM. Bučko zatesnimo s septumom ter prepihamo sistem z argonom. Z iglo previdno po

kapljicah dodamo 1 ml 97% CF3COOH. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri sobni

temperaturi čez noč. Ko reakcija poteče, odparimo topilo na rotavaporju. Spojino

pretvorimo še v hidroklorid. Zaostanek po rotavapiranju raztopimo v 3 ml absolutnega



- 41 -

EtOH, dodamo 3 ekv. 1M HCl/EtOH, katero smo predhodno pripravili in situ. Ponovno

odparimo topilo. Olje, ki ga dobimo po koncu rotavapiranja trituriramo z 10 ml EtOEt

dokler izpada rumena oborina, katero sušimo 1 h na membranski črpalki (29).

Opis: rumena amorfna spojina

η: 69 mg (94,9%)

Rf: DKM/MeOH=20/1, 0,07

1H NMR (400MHz, CD3OD): δ= 3,04 (t, 2H, J = 7,0 Hz, -CH2CH2N-), 3,53 (k, 2H, J =

7,0 Hz, -CH2CH2NH-), 3,85 (s, 3H, -OCH3), 5,33 (s, 2H, -NCH2C6H3Cl2), 6,83 (dd, 1H, J1

= 8,6 Hz, J2 = 2,2 Hz, C(6)H-indol), 7,05 (dd, 1H, J1 = 8,3 Hz, J2 = 2,2 Hz, C(6)H-

C6H3Cl2), 7,09 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(2)H-C6H3Cl2), 7,18-7,21 (m, 2H, C(2)H-indol +

C(5)H-C6H3Cl2), 7,27 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(4)H-indol), 7,45 (d, 1H, J = 8,6 Hz, C(7)H-

indol) ppm.

13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 16.10, 21.95, 62.66, 63.47, 67.08, 69.09, 76.03,

77.04, 111.39, 112,38, 112.47, 112.85, 118.34, 119.15, 136.98, 138.02, 138.47, 139.23,

139.90, 141.81 ppm.


HRMS: izračunano (za C19H21N4OCl2) 391,1092; izmerjeno 391,1107 (3,8 ppm).



- 42 -

4.2.16. Sinteza 2-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-

1,3-diona (16)

V bučko natehtamo izhodno spojino 9 (0,50 g, 1,56 mmol) ter Cs2CO3 (1,27 g, 3,91

mmol). Suspendiramo ju v 30 ml acetonitrila. Dodamo 1,2 ekv. 3,4-difluorobenzilbromida

(0,24 ml, 1,87 mmol). Reakcijsko zmes pustimo mešati pri 55°C čez noč. Po poteku

reakcije reakcijsko zmes ohladimo na sobno temperaturo in odfiltriramo neraztopljeno sol.

Filtratu odparimo topilo na rotavaporju. Zaostanek raztopimo v 50 ml EtOEt. Prenesemo v

lij ločnik in spiramo organsko fazo s 3 x 25 ml destilirane vode, z 1 x 25 ml nasičene

raztopine NaHCO3 in z 1 x 25 ml nasičene raztopine NaCl. Organsko fazo sušimo z

Na2SO4, odfiltriramo sušilno sredstvo in na rotavaporju odparimo topilo. Spojino 16

prekristaliziramo iz etanola. Produkt raztopimo v 50 mL etanola in segrevamo ob vrenju do

popolne raztopitve. Raztopino ohlajamo na ledeni kopeli, dokler ne izpade oborina spojine

16. Oborino odnučamo in posušimo (29).

Opis: bela amorfna spojina

η: 0,49 g (67,7%)


1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 3,15 (t, 2H, J = 7,3 Hz, -CH2CH2N-), 3,88 (s, 3H, -

OCH3), 4,03 (t, 2H, J = 7,7 Hz, -CH2CH2N-), 5,19 (s, 2H, -NCH2C6H3F2), 6,79-6,89 (m,

3H, C(6)H-indol + C(2)H-C6H3F2 + C(6)H-C6H3F2), 7,00 (s, 1H, C(2)H-indol), 7,04-7,11

(m, 2H, C(4)-indol + C(5)H- C6H3F2), 7,18 (d, 1H, C(7)H-indol), 7,71-7,74 (m, 2H,



- 43 -

C(3)H-ftalimid + C(6)H-ftalimid), 7,83-7,85 (m, 2H, C(4)H-ftalimid + C(5)H-ftalimid)

ppm.

13C NMR (100MHz, CDCl3): δ= 24.33, 38.43, 49.17, 55.81, 100.61, 110.33, 111.57,

112.56, 115.55, 115.73, 117.41, 117.58, 122.44-122.54*, 123.17, 126.53, 128.61, 131.52,

132.13, 133.91, 134.73-134.82*, 148.40-149.34*, 150.87-151.81*, 154.12, 168.38 ppm.

*sklopitev z dvema F atomoma

4.2.17. Sinteza 2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etanamina (17)

V bučko natehtamo spojino 16 (0,40 g, 0,88 mmol) ter jo raztopimo v 30 ml EtOH.

Postopoma po kapljicah dodamo 5 ekv. hidrazina (0,40 mL, 35% wt., 4,34 mmol).

Reakcijsko zmes pustimo mešati čez noč pri 90°C pod refluksom. Po poteku reakcije

vidimo, da nam izpade oborina. To previdno odfiltriramo s pomočjo teflonskega filtra in

presesalne erlenmajerice. Naredimo TLC iz katerega vidimo, da se naša spojina nahaja v

oborini, delno pa tudi v matičnici. Oborino sušimo na membranski črpalki, matičnici pa

odparimo topilo z rotavaporjem. Združimo zaostanek produkta iz oborine z zaostankom

produkta iz matičnice. Raztopimo ga v 50 ml EtOAc, prenesemo v lij ločnik in organsko

fazo spiramo z 1 x 25 ml destilirane vode. Vodno fazo med ekstrakcijo večkrat naalkalimo

z 1M NaOH dokler ne dosežemo pH vodne faze 11-12. Organsko fazo sušimo z Na2SO4,

odfiltriramo sušilno sredstvo in na rotavaporju odparimo topilo. Spojino pretvorimo v sol s

klorovodikovo kislino. Zaostanek po zadnjem rotavapiranju raztopimo v 5 ml absolutnega




- 44 -

odparimo topilo. Olje, ki ga dobimo po koncu rotavapiranja, trituriramo z 10 ml EtOEt

dokler izpada rumena oborina. Sušimo jo 1 h na membranski črpalki (29).


η: 0,25 g (83,0%)

Rf: DKM/MeOH=9/1+1%TEA, 0,36

Ttal : 172 – 177°C

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ= 2,99 (t, 2H, J = 6,8 Hz, -CH2CH2N-), 3,05 (t, 2H, J

= 6,8 Hz, -CH2CH2N-), 3,78 (s, 3H, -OCH3), 5,33 (s, 2H, -NCH2C6H3F2), 6,77 (dd, 1H, J1

= 8,8 Hz, J2 = 2,4 Hz, C(6)H-indol), 7,02-7,05 (m, 1H, C(2)H-C6H3F2), 7,12 (d, 1H, J =

2,2 Hz, C(4)H-indol), 7,27-7,30 (m, 1H, C(6)H-C6H3F2), 7,33 (d, 1H, J = 8,8 Hz, C(7)H-

indol), 7,36-7,41 (m, 2H, C(2)H-indol + C(5)H- C6H3F2), 8,08 (s, 3H, -NH3+) ppm.

13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 22.87, 48.03, 55.44, 100.62, 109.20, 110.93, 111.56,

115.94, 116.11, 117.40, 117.58, 123.74-123.84*, 127.63, 127.85, 131.12, 135.99-136.07*,

147.30-148.08*, 149.73-150.53*, 153.49 ppm.


IR ν(max) = 3422, 3025, 2921, 2690, 2602, 2463, 2371, 2018, 1610, 1582, 1522, 1490,

1451, 1438, 1396, 1342, 1315, 1290, 1270, 1229, 1184, 1118, 1048, 981, 934, 862, 823,

796, 772, 711, 644, 590, 452, 427 cm-1.


HRMS: izračunano (za C18H19N2OF2) 317,1465; izmerjeno 317,1468 (0,9 ppm).


254 nm, AUC = 740 mAU*s, AUC [%] = 95,7.

4.2.18. Sinteza 1,2-bis(1-(terc-butoksi)karbonil)-3-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-

metoksi-1H-indol-3-il)etil)gvanidina (18)



- 45 -


DMF. Dodamo ji N,N'-di-(terc-butoksikarbonil)-S-metilizotiosečnino (0,13 g, 0,44 mmol),

Et3N (0,22 ml, 1,55 mmol) in HgCl2 (0,12 g, 0,44 mmol) v navedenem zaporedju.

Reakcijsko zmes pustimo mešati pri sobni temperaturi čez noč. Po poteku reakcije najprej s

pomočjo presesalne erlenmajerice odfiltriramo neraztopljeno sol Hg(SMe)Cl, ki nastane

pri reakciji. Filtratu na rotavaporju odparimo topilo. Produkt čistimo s kolonsko »flash«

kromatografijo z mobilno fazo EtOAc/heksan=1/3 (29).

Opis: svetlo rumena amorfna spojina

η: 0,16 g (62,7%)

Rf: EtOAc/heksan=1/3, 0,43

1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ= 1,46 (s, 9H, -NHCOOC(CH3)3), 1,53 (s, 9H,

=NCOOC(CH3)3), 3,02 (t, 2H, J = 6,6 Hz, -CH2CH2NH-), 3,78 (k, 2H, J = 6,6 Hz, -

CH2CH2N-), 3,88 (s, 3H, -OCH3), 5,21 (s, 2H, -NCH2C6H3F2), 6,84 (d, 1H, J = 2,2 Hz,

C(6)H-indol), 6,86 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(2)-C6H3F2), 6,90-6,95 (m, 1H, C(6)-C6H3F2), 7,01

(s, 1H, C(2)H-indol), 7,05 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C(4)H-indol), 7,06-7,13 (m, 2H, C(7)H-indol

+ C(5)H-C6H3F2), 8,46 (t, 1H, J = 4,6 Hz, -CH2CH2NH-), 11,52 (s, 1H, -NHBoc) ppm.

13C NMR (100MHz, CDCl3): δ= 24.80, 28.00, 28.31, 40.99, 49.29, 55.86, 79.31, 82.98,

100.62, 110.44, 111.71, 112.48, 115.63, 115.81, 117.48, 117.65, 122.52-122.62*, 126.82,

128.41, 131.66, 134.69-134.77*, 148.42-149.33*, 150.88-151.81*, 153.15, 154.05, 156.12,

163.66 ppm.


4.2.19. Sinteza 1-(2-(1-(3,4-difluorobenzil)-5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)gvanidina

(19)



- 46 -


DKM. Bučko zatesnimo s septumom ter prepihamo sistem z argonom. Z iglo previdno po

kapljicah dodamo 3 ml 97% CF3COOH. Reakcijsko zmes pustimo mešati pri sobni

temperaturi čez noč. Ko reakcija poteče, odparimo topilo na rotavaporju. Spojino

pretvorimo še v hidroklorid. Zaostanek po rotavapiranju raztopimo v 5 ml absolutnega


odparimo topilo. Olje, ki ga dobimo po koncu rotavapiranja, trituriramo z 10 ml EtOEt

dokler izpada rumena oborina. Sušimo jo 1 h na membranski črpalki (29).


η: 0,11 g (95,3%)

Rf: DKM/MeOH=4/1+1%TEA, 0,04

Ttal : 125 – 130°C

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ= 2,89 (t, 2H, J = 7,0 Hz, -CH2CH2N-), 3,42 (t, 2H, J

= 7,0 Hz, -CH2CH2N-), 3,77 (s, 3H, -OCH3), 5,33 (s, 2H, -NCH2C6H3F2), 6,77 (dd, 1H, J1

= 8,8 Hz, J2 = 2,3 Hz, C(6)H-indol), 6,97-7,01 (m, 1H, C(2)H-C6H3F2), 7,06 (d, 1H, J =

2,3 Hz, C(4)H-indol), 7,23-7,29 (m, 1H, C(6)H-C6H3F2), 7,33 (d, 2H, J = 8,8 Hz, C(7)H-

indol + C(2)H-indol), 7,36-7,41 (m, 1H, + C(5)H- C6H3F2), 7,58 (t, 1H, J = 5,5 Hz, -

CH2CH2NH-) ppm.

13C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ= 24.29, 41.29, 47.94, 55.37, 110.56, 110.81, 111.47,

115.94, 116.10, 117.47, 117.63, 123.67-123.77*, 127.41, 128.05, 131.08, 136.17-136.26*,

147.29-148.08*, 149.72-150.53*, 153.42, 156.62 ppm.


IR ν(max) = 3448, 3186, 3012, 2958, 2878, 2373, 1701, 1665, 1637, 1526, 1490, 1457,

1435, 1396, 1348, 1319, 1297, 1260, 1232, 1204, 1178, 1130, 1048, 1034, 974, 897, 872,

835, 803, 793, 721, 648, 598, 526 cm-1.


HRMS: izračunano (za C19H21N4OF2) 359,1683; izmerjeno 359,1688 (1,4 ppm).


254 nm, AUC = 751 mAU*s, AUC [%] = 98,0.



- 47 -

5. RAZPRAVA

Sintetizirali smo 8 končnih spojin, ki smo jih dobili po dveh sinteznih poteh. V prvi smo na

indolni dušik triptamina pripeli p-cianobenzilni fragment in ciano skupino z večstopenjsko

sintezo pretvorili v amidinsko skupino. Reakcijska shema je vsebovala 6 stopenj. V drugi

sintezni poti smo na indolni dušik 5-metoksitriptamina pripeli različno substituirane para

benzilne fragmente, med njimi p-cianobenzilni, 3,4-diklorobenzilni in 3,4-difluorobenzilni

fragment. Spojini s halogenima atomoma smo pretvorili iz aminskih še v gvanidinska

derivata. Ta reakcijska shema je bila sestavljena iz 5 stopenj.

5.1. Zaščita primarne amino skupine v obliki ftalimida

Primarno amino skupino triptamina/5-metoksitriptamina smo zaščitili v obliki imida z

namenom, da reakcija alkiliranja z benzilbromidom poteče selektivno na indolnem dušiku

triptamina. Za zaščito smo uporabili ftalanhidrid, nastala je tako imenovana ftalimidna

zaščitna skupina. Potekla je dvojna reakcija nukleofine substitucije na karbonilno skupino

(30). Primarno amino skupino bi lahko zaščitili tudi z drugimi zaščitnimi skupinami, med

katerimi se najpogosteje uporabljajo karbamatne (terciarni butil karbamati, metil

karbamati, benzil karbamati) in amidne zaščitne skupine (acetamidi, formamidi). Nobena

od navedenih zaščitnih skupin ne zadošča pogoju selektivnosti reakcije s substituiranim

benzilbromidom. Nastali karbamati ali amidi vsebujejo namreč šibko kisli proton na

dušiku, ki se lahko odcepi pri reakciji z močno bazo. V tem primeru bi dobili namesto

želenega še stranski produkt – alkiliran primarni amin. V primeru zaščite s ftalimidom se

temu izognemo, saj nastali imid ne vsebuje prostega protona, ki bi se lahko odcepil.

Lastnosti dobre zaščitne skupine so, da se odstranjuje selektivno, enostavno in z dobrimi

izkoristki pod zelo specifičnimi reakcijskimi pogoji (31). Izkoristek sinteze spojine 1 je

dober (88%). Iz tankoplastne kromatografije smo razbrali, da je ostalo še nekaj

nezreagirane izhodne spojine, ki smo jo odstranili s prekristalizacijo iz kombinacije topil

etilacetat/heksan. Izkoristek sinteze spojine 9 je odličen (99%), reakcija je potekla

kvantitativno, zato prekristalizacije ni bilo potrebno izvesti.



- 48 -

Slika 12: Predviden mehanizem zaščite primarne amino skupine v obliki ftalimida

5.2. Alkiliranje indolnega dušika triptamina/5-metoksitriptamina

Na indolnem dušikovem atomu z močno bazo najprej odcepimo proton. Zaščiteni triptamin

postane s tem boljši nukleofil, ki tako lažje napade primarni C-atom benzilbromida. Poteče

reakcija nukleofilne substitucije, saj gre za zamenjavo dveh nukleofilov. Ogljikov atom

benzilbromida je dober elektrofil, saj ima vezan bromidni ion, ki velja za dobro izstopajočo

skupino. Pri reakciji alkiliranja triptamina smo uporabili dve različni močni bazi in sicer

natrijev hidrid raztopljen v DMF (spojine 2, 10, 12) in cezijev karbonat raztopljen v

acetonitrilu (spojina 16). Pri sintezah spojin 2, 10 in 12 smo ves čas poteka reakcije

zagotavljali brezvodne pogoje z izvajanjem reakcije pod argonovo atmosfero, saj bi nam v

nasprotnem primeru reakcija lahko potekla z vodo. Dobili bi stranske neželene produkte

(npr. primarni alkohol na benzilbromidu), saj je voda tudi nukleofil, ki bi lahko reagirala z

ogljikovim atomom v benzilbromidu. Čeprav je popolnoma brezvodne pogoje težko

doseči, je izkoristek sintez 2, 10 in 12 dober (76 – 85%). Iz tankoplastne kromatografije je

bilo razvidno, da reakcija v vseh treh primerih ni potekla kvantitativno, ostalo je še nekaj

nezreagiranih izhodnih spojin. Če smo opazili slab potek reakcije, smo dodali še 1

ekvivalent NaH, čeprav smo ga že na začetku dodali v prebitku. S tem principom smo

zagotovili boljši izkoristek sinteze. Nečistot in kristalov NaBr se znebimo z ekstrakcijo z

vodno raztopino NaHCO3 in prekristalizacijo iz etanola. Pri sintezi spojine 16 smo

uporabili drugačno bazo – cezijev karbonat. Le-ta je sicer šibkejša baza kot natrijev hidrid,

vendar ima cezijev ion velik kationski radij, s tem pa imajo posledično cezijeve soli nižjo

stopnjo solvatacije. To pomeni, da vežeta tako cezijev ion kot protiion manj molekul vode,



- 49 -

s tem pa se reaktivnost poveča (32). Čeprav v tem primeru ni potrebno zagotavljati

brezvodnih pogojev, smo zabeležili nekoliko slabši izkoristek (68%).

Slika 13: Alkiliranje indolnega dušika triptamina/5-metoksitriptamina

5.3. Odstranitev ftalimidne zaščitne skupine

Ftalimidno zaščito na primarni amino skupini smo odstranili s hidrazinolizo. Reakcija je

polarna nukleofilna adicija s sledečo eliminacijo (30). Zaščito lahko odstranimo tudi z

alkoholno raztopino KOH, vendar je bolj selektivna odstranitev s hidrazinolizo. Reakcijski

zmesi smo uparili topilo in z 1M vodno raztopino naalkalili do pH 12-13 ter ekstrahirali z

etilacetatom. S tem smo dosegli, da je stranski produkt ftalhidrazid ostal v bazični vodni

fazi, odščitena spojina pa je prešla v organsko fazo. Izkoristki sintez 4, 7 in 17 so dobri

(79-83%), sintez 11 in 13 pa precej slabši (24-31%). V slednjih dveh primerih smo iz TLC

zabeležili nepopolno pretvorbo spojin v končno, obenem pa smo verjetno največ produkta

izgubili pri čiščenju s kolonsko kromatografijo. Pri spojinah 4, 7 in 17 čiščenje ni bilo

potrebno. Morda smo še nekoliko bolj povečali izgubo spojin pri pretvorbi v sol s

klorovodikovo kislino. Pri trituraciji smo morda uporabili premajhno količino EtOEt in se

spojini nista popolnoma izoborili ali pa je bila topnost spojin v etanolu prevelika.

Izkoristek reakcij 11 in 13 bi lahko po TLC analizi povečali tudi z dodatkom dodatnih 5

ekvivalentov hidrazin hidrata.



- 50 -

Slika 14: Predviden mehanizem odstranitve ftalimidne zaščitne skupine

5.4. 5-stopenjska pretvorba nitrila preko amidoksima in 5-okso-4,5-

dihidro-1,2,4-oksadiazola do amidina s katalitskim

hidrogeniranjem.

Nitril smo najprej pretvorili v amidoksim s hidroksilamonijevim kloridom v bazičnem

mediju. Gre za reakcijo nukleofilne adicije hidroksilamina na polarno ciano skupino.

Hidroksilamin mora biti za zagotovitev dobre nukleofilnosti v neprotonirani obliki, zato

reakcijo izvajamo v bazičnem mediju. (33) Iz TLC analize smo razbrali, da je reakcija

potekla skoraj kvantitativno. Produkt amidoksim se iz matičnice izobarja, zato smo ga

prefiltrirali skozi teflonski filter. Matičnici smo uparili topilo in ločevali na kolonski

kromatografiji. Celokupni izkoristek reakcije je dober (80%).

Amidoksim smo v dvostopenjski reakciji pretvorili v 5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-

oksadiazolni derivat. Najprej smo pripeli etil kloroformat na hidroksilno skupino v

amidoksimu. Za nastanek O-aciliranega derivata potrebujemo nizko temperaturo, zato smo

reakcijo izvajali na ledeni kopeli in s tem usmerjali potek reakcije v smer O-aciliranega

derivata. Nastane lahko stranski produkt N-aciliran derivat. Iz tankoplastne kromatografije



- 51 -

je razvidno, da je reakcija potekla kvantitativno že pri 0° C. V reakcijski zmesi smo imeli

prebitni etil kloroformat in trietilamin, ki smo ju odstranili z ekstrakcijo z vodno raztopino

NaHCO3. Ugotovili smo, da se spojina v etilacetatu slabo raztaplja, zato smo za razvijanje

TLC raje uporabili mobilno fazo DKM/MeOH = 20/1. Spojino ni bilo potrebno

prekristalizirati, saj smo že z ekstrakcijo odstranili večino izhodnih reagentov in stranskih

produktov. Izkoristek te stopnje je bil zelo dober (91%).

V naslednji stopnji smo amidoksim z etoksikarbonilnim fragmentom pretvorili v ciklični

karbamat 5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol. Gre za reakcijo ciklizacije in tvorbo

heterocikličnega petčlenskega obroča. Iz TLC analize smo opazili, da je reakcija potekla

skoraj kvantitativno. Produkt je vseboval še izhodne spojine, zato smo ga prekristalizirali

iz etanola. Po raztapljanju v vrelem etanolu smo bučko postavili na led, nato pa še v

zmrzovalnik, da smo še bolj znižali topnost kristalov sintetizirane spojine in s tem povečali

izkoristek reakcije. Iz NMR spektra smo po prekristalizaciji ugotovili, da so kristali spojine

čisti, izkoristek reakcije pa je prav tako dober (82,1%). V četrti stopnji smo ftalimidno

zaščitno skupino odstranili po že opisanem postopku.

V zadnji stopnji reakcije smo ciklični karbamat reducirali s katalitskim hidrogeniranjem.

Uporabili smo katalizator paladij na aktivnem oglju. Lahko bi uporabili tudi druge

kovinske katalizatorje – platina, rutenij ali nikelj. Iz TLC analize smo po dveh urah

izvajanja reakcije ugotovili, da je reakcija končana in začeli z izolacijo. Najprej smo se

lotili filtracije, da smo odstranili katalizator paladij na aktivnem oglju, matičnico smo nato

uparili pri znižanem tlaku. Produkt po sušenju ni bil popolnoma suh, zato smo izvedli

trituriranje z EtOEt in mešali dokler se ni prebitna ocetna kislina raztopila v EtOEt, nato pa

smo mešanici topil odstranili in produkt ponovno posušili. Sintetizirana spojina je namreč

preveč polarna, da bi se raztopila v EtOEt. Redukcija je poteka kvantitativno že pri milih

pogojih (nizek tlak), prav tako pa nismo dobili stranskih produktov. Izkoristek reakcije je

odličen (99%).



- 52 -

5.5. Sinteza bis-Boc gvanidina na primarni amino skupini

alkiliranega 5-metoksitriptamina

Bis-Boc gvanidinski derivat smo pripravili iz aminskega s pomočjo N,N'-di-(terc-

butoksikarbonil)-S-metilizotiosečnino in HgCl2. Gre za reakcijo nukleofine substitucije

med MeS-, ki je dobra izstopajoča skupina, in primarno amino skupino na derivatu 5-

metoksitriptamina. C-atom v bis-Boc tiosečnini je elektrofil in reagira s primarno amino

skupino, ki je dober nukleofil. V reakcijsko zmes dodamo tudi živosrebrov klorid, saj se

Hg2+ dobro veže z izstopajočo skupino MeS-, nastane sol Hg(SMe)Cl. Pri tvorbi omenjene

soli se sproščajo kloridni ioni, ki reagirajo do nastanka klorovodikove kisline. To je

pomembno, saj se lahko Boc zaščita pri znižanju pH odstrani, zato smo pri sintezi uporabili

alkalni medij (topilo trietilamin), ki nevtralizira sproščanje HCl. Z znižanjem pH v kislo

območje bi tudi povzročili, da bi amino skupina prešla v protonirano obliko in s tem

močno zmanjšala svoje nukleofilne lastnosti. (33) Po končani reakciji smo s tankoplastno

kromatografijo ugotovili, da je reakcija potekla skoraj kvantitativno. Pri reakciji je nastala

netopna sol Hg(SMe)Cl, ki smo jo odstranili s filtracijo. Med potekom reakcije je nastalo

nekaj stranskih produktov, zato smo matičnici uparili topilo in ločevali na kolonski

kromatografiji. Izkoristek sintez spojin 14 in 18 je bil razmeroma dober (63-85%).

Slika 15: Mehanizem sinteze bis-Boc gvanidina na primarni amino skupini

5.6. Odstranitev Boc zaščitne skupine

Zaščitno skupino v obliki terciarnih butil karbamatov lahko odstranjujemo na različne

načine, odstraniti jo je mogoče s HCl ali HBr v ledocetu ali s CF3COOH. Boc zaščitna

skupina je obstojna pri pH 4-12, neobstojna pa proti oksidantom, katalitskem hidrogeniraju

in organokovinskim ionom. (30). Pri sintezi smo uporabili reagent CF3COOH, ki odstrani

Boc zaščitno skupino in z gvanidinom tvori sol. Sol s trifluoroocetno kislino smo pretvorili

v sol s klorovodikovo kislino, saj hidrokloridi bolje tvorijo kristale v trdni obliki in so s



- 53 -

tem bolj stabilni. Po rotavapiranju smo dobili olje, ki smo ga s trituracijo pretvorili v

kristale. Z EtOEt smo odstranili morebitne nečistote, izhodne spojine in prebitek topila. Pri

sintezah spojin 15 in 19 smo zabeležili odličen izkoristek (95%).

6. BIOLOŠKO TESTIRANJE

6.1. Testiranje citotoksičnosti

Citotoksičnost določamo s testom sposobnosti preživetja celic. Gre za kolorimetrično

metodo za določanje števila preživelih celic v kulturah PBMC in HEK-293 z merjenjem

aktivnosti celičnih encimov. Barvilo MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-

karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazol) se s z delovanjem celičnih encimov

reducira v vijolično obarvani formazan. Le-ta absorbira svetlobo pri valovni dolžini 490

nm, kar merimo spektrofotometrično. V kombinaciji z MTS se uporablja reagent PES

(fenazin etosulfat), ki omogoča boljšo kemijsko stabilnost raztopine MTS. Redukcija

MTS-formazan poteče z encimom mitohondrijska reduktaza, ki je značilen za metabolno

aktivne celice. Količino nastalega produkta izračunamo iz dobljene absorbance, to pa nam

da podatek o metabolični aktivnosti encimov. Metabolična aktivnost je premosorazmerna s

številom preživelih celic po obdelavi s testirano spojino. Podatki v tabeli so predstavljeni

kot odstotek metabolne aktivnosti. (34, 35, 36)

Test MTS so izvedli na dveh celičnih kulturah. Spojine 4, 7, 8, 11, 13, 17 in 19 so testirali

na celični kulturi PBMC (mononuklearne celice periferne krvi), spojini 15 in 17, ki sta se v

testiranju protimikrobne učinkovitosti izkazali za najbolj učinkoviti pa na celični kulturi



- 54 -

HEK-293 (humane embrionalne ledvične celice). Spojina 15 ni bila testirana na celični

kulturi PBMC, saj je bila sintetizirana zadnja in še ni bila na voljo pred izvedbo testa. Testa

se med seboj razlikujeta zgolj v izbiri celične kulture.

Preglednica 1: Rezultati testiranja citotoksičnosti na celičnih kulturah PBMC in HEK-293

PMBC celična

kultura

HEK-293 celična

kultura

% metabolne aktivnosti

oznaka struktura Ctrl DMSO Ctrl DMSO

Ctrl kontrola 98,67 100,00 98,12 100,00

DMSO kontrola, da topilo ne vpliva na test 100,00 101,35 100,00 101,92

4

90,9 92,1 / /

7

117,1 118,7 / /

8

106,9 108,3 / /

11

92,6 93,9 / /

13

3,5 3,6 / /

15

/ / 91,5 93,3



- 55 -

17

39,0 39,5 33,6 34,2

19

66,3 67,2 / /

Iz grafa in tabele lahko razberemo, da sintetizirane spojine povzročajo različno stopnjo

citotoksičnosti. Izredno toksične so spojine, ki izkazujejo % metabolne aktivnosti pod

40%. Na grafu je meja 40% metabolne aktivnosti predstavljena z rdečo črto. Za zmerno

toksične veljajo spojine, pri katerih je % metabolne aktivnosti med 40 in 80% (na grafu

med rdečo in modro črto). Spojine znotraj intervala 80-95% metabolne aktivnosti so

razmeroma netoksične (na grafu med modro in zeleno črto). Za praktično netoksične pa se

smatrajo tiste, pri katerih je rezultat nad 95% (na grafu nad zeleno črto). Upoštevati

moramo 10% odstopanja, saj metoda ni dovolj občutljiva. Koncentracija testiranih spojin

je bila 8 µg/mL, koncentracija DMSO pa 0,5%.

Graf 1: Prikaz odstotka metabolne aktivnosti PBMC celične kulture po dodatku testiranih spojin



- 56 -

Spojina 13 je izredno toksična, saj je % metabolne aktivnosti 3,6%, le-ta v strukturi

vsebuje dva atoma klora. Nekoliko manj toksična je spojina 17, nahaja se ravno pod mejo

zmerne toksičnosti. Spojina 19 je zmerno toksična, na grafu je med 40 in 80% metabolne

aktivnosti. Omenjeni spojini vsebujeta v strukturi dva atoma fluora. Za spojini 4 in 11

velja, da sta razmeroma netoksični (interval med 80 in 95% metabolne aktivnosti), spojini

7 in 8 pa sta praktično netoksični (nad 95% metabolne aktivnosti). Za spojino 17 smo tudi

na drugi celični kulturi dobili podobno metabolno aktivnost, in sicer da je spojina izredno

toksična, za spojino 15 pa velja, da je razmeroma netoksična. Rezultata metabolične

aktivnosti spojine 17 na dveh celičnih kulturah se razlikujeta za 14%, sklepamo lahko, da

so rezultati med celičnima kulturama primerljivi.

Iz struktur in toksičnosti posameznih spojin lahko sklepamo, da so spojine, ki v svoji

strukturi vsebujejo halogene elemente, precej toksične. Tak rezultat smo tudi pričakovali,

saj je znano, da halogeni elementi povečajo toksičnost spojin. Prav tako so spojine z

gvanidinsko funkcionalno skupino bolj toksične od spojin z amino skupino. Iz rezultatov

testiranja lahko ugotovimo, da so kloridni derivati bolj toksični od fluoridnih. Splošno je

znano, da so fluoridni derivati manj reaktivni od kloridnih, saj je vez C-Cl labilnejša od

vezi C-F in lažje pride do nastanka toksičnih metabolitov. To pa ne velja za spojino 15, ki

je kljub vsebnosti dveh kloridnih atomov in gvanidinske skupine skoraj popolnoma

netoksična. Za potrditev izsledkov bi bilo smiselno testiranje ponoviti še na PBMC celični

kulturi, čeprav se rezultata spojine 17 na dveh celičnih kulturah nista bistveno razlikovala.

6.2. Protimikrobna učinkovitost: in vitro testiranje

Spojine smo poslali na testiranje na encimu glikoziltransferaza iz Escherichie coli PBP1b.

Uporabili so radioaktivni in flourescentni test pri koncentraciji spojin 500 µM.

Učinkovitost testiranih spojin smo izrazili z rezidualno aktivnostjo (RA) in IC50. V prvem

primeru gre za preostali delež aktivnosti encima po učinkovanju inhibitorja. Aktivnost

encima so najbolje inhibirale spojine 19, 13 in 15 v naraščujočem vrstnem redu.

Omenjenim spojinam so testirali še minimalne inhibitorne koncentracije na 4 bakterijskih

kulturah. Preostalim spojinam MIC niso določali, saj so bile rezidualne aktivnosti

previsoke (nad 70%).



- 57 -

Protimikrobno aktivnost so ocenili na treh Gram+ bakterijah (S. Aureus ATCC 25923,

MRSA ATCC 43300, E. Faecium ATCC 19434) in eni Gram- bakteriji (E. Coli ATCC

8739).

Minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) preučevanih vzorcev na bakterijskih kulturah

je bila določena z uporabo kvantitativne metode mikrodilucije v tekočem gojišču v

mikrotitrskih ploščah, ki je zlati standard za določanje MIC. Po inkubaciji bakterij preko

noči so z uporabo sterilne tehnike naredili mikrobiološke suspenzije v Mueller Hinton

bujonu in njegovo motnost standardizirali s pomočjo 0,5 McFarland standarda. Končna

koncentracija pripravljenih bakterijskih kultur je bila 5x10^6 cfu/mL. Za testirane spojine

so naredili serijo razredčitev in jih vnesli v mikrotitrske plošče s 96 vdolbinicami. Vzorce

so razredčevali z 10% vodno raztopino dimetilsulfoksida (DMSO). Dodali so bakterijske

kulture, tako da je bila končna koncentracija bakterij v posamezni vdolbinici 5x10^5

cfu/mL. Kot MIC vrednost je bila sprejeta najnižja koncentracija vzorca, ki še zavira vidno

rast bakterij. Dve vrsti v vsaki mikrotitrski plošči so uporabili za kontrolo. Za določitev

občutljivosti Gram+ in Gram– bakterij je bila v prvi vrsti uporabljena pozitivna kontrola, ki

je vsebovala širokospektralni antibiotik doksaciklin v zaporednem redčenju 200 – 0,05

mg/mL. V drugi vrsti je bilo topilo, ki je služilo kot negativna kontrola. Vsak test so

izvedli trikrat. (34, 37)

Preglednica 2: Rezultati in vitro testiranja (RA, IC50 in MIC vrednosti) končnih spojin

Oznaka Struktura

RA (%)

(pri 500µM)

Flourescentni

test

IC50

MIC (µg/ml)

S. Aureus

ATCC

25923

E. Coli

ATCC

8739

MRSA

ATCC

43300

E. Faecium

ATCC

19434

4

74 / / / / /

7

77 / / / / /



- 58 -

8

96 / / / / /

11

125 / / / / /

13

24 IC50 = 193

± 7 μM 32 64 32 32

15

9,4 IC50 = 50 ±

17 µM 8 16 8 8

17

88 / / / / /

19

28 IC50 > 250

μM 32 32 64 128

Spojina

vodnica

0,5 / 16 256 4 32

Za najmočnejše na flourescenčnem testu so se izkazale spojine 13, 15 in 19, zato so tem

spojinam poleg RA določili tudi IC50 in MIC vrednosti. Najnižje MIC so ugotovili pri

kulturah S. Aureus in meticilin rezistentni S. Aureus. Nekoliko višje MIC so določili pri

kulturi E. Faecium, najslabše pa so testirane spojine zavirale rast Gram- bakteriji E. Coli.

Najbolje je bakterijsko rast inhibirala spojina 15, saj so bile ugotovljene minimalne

inhibitorne koncentracije 8-16 µg/mL, kar je spodbuden rezultat. Izkazala se je za bolj



- 59 -

učinkovito od spojine vodnice, saj so MIC vrednosti nižje pri treh kulturah bakterij,

največja razlika je opazna pri bakteriji E. Coli, kjer spojina 15 že pri 16 x manjši

koncentraciji zavre rast v primerjavi s spojino vodnico. Prav tako je bila IC50 vrednost pri

tej spojini najnižja med testiranimi, znašala je 50 µM, kar je v območju testiranih spojin 5

in 5b iz članka avtorjev Derouaux s sod. (Slika 8) (20)

Nekoliko slabši inhibitor glikoziltransferaze je spojina 13, ugotovljena MIC vrednost pa je

znašala 32-64 µg/mL, kar je tudi obetaven rezultat. Iz obeh rezultatov lahko sklepamo, da

so najbolj učinkovite spojine, ki vsebujejo halogene elemente, še posebno spojini z dvema

kloridnima atomoma in spojini pri katerih je namesto primarne aminske prisotna

gvanidinska skupina. Rezultati testiranja IC50 so pokazali, da pri spojini 13 potrebujemo za

inhibicijo encimske hitrosti na polovico maksimalne približno 4 x večjo koncentracijo kot

pri spojini 15.

7. SKLEP

V okviru diplomske naloge smo v spojino vodnico (slika 9) vključili več strukturnih

sprememb (slika 10). Kot rezultat smo dobili 8 končnih spojin. Spojine so derivati

triptamina in 5-metoksitriptamina, ki delujejo zaviralno na bakterijsko glikoziltransferazo.

Spojine smo sintetizirali po dveh sinteznih poteh. V prvi sintezni poti smo p-cianobenzilno

skupino spreminjali v različne fragmente, ki bi lahko pripomogli k bolj specifični vezavi v

encim glikoziltransferazo. V drugi sintezni stopnji pa smo poleg p-cianobenzilnega

fragmenta uvedli še 3,4-difluoro in 3,4 dikloro derivata. Namesto aminske skupine,

prisotne v spojini vodnici, smo uvedli tudi gvanidinsko skupino. S spreminjanjem

funkcionalnih skupin se spreminjata tako protimikrobna učinkovitost kot citotoksičnost.

Pri izvajanju sinteznih postopkov nismo imeli težav, večina reakcij je potekla z dobrimi ali

odličnimi izkoristki. V nekaterih primerih smo že z ekstrakcijo spojino popolnoma očistili

in dodatne metode čiščenja niso bile potrebne. Pri nekaterih pa smo zaradi čiščenja s

kolonsko kromatografijo ali prekristalizacijo izgubili nekoliko več spojine. Ugotovili smo,

da s kolonsko kromatografijo izgubimo bistveno več produkta kot z uporabo

kristalizacijske metode. Zato smo slednjo večkrat uporabili, poleg tega pa je ta metoda

enostavnejša in hitrejša. V nekaterih primerih bi izkoristek reakcije lahko povečali z

dodatkom reaktanta v večjem prebitku. Izkoristke reakcij smo v nekaterih primerih



- 60 -

izboljšali tudi tako, da smo najprej izvajali ekstrakcijo, nato prekristalizacijo, suhi

preostanek po uparitvi matičnice iz postopka prekristalizacije pa smo ločevali na kolonski

kromatografiji.

Iz rezultatov testiranja citotoksičnosti lahko zaključimo, da so spojine 13, 17 in 19 za

nadaljnje raziskave neprimerne zaradi citotoksičnosti, saj se nahajajo pod mejo 80%

metabolne aktivnosti. V strukturi vsebujejo dikloro in difluoro derivate, kar že v osnovi

predstavlja nevarnost za citotoksičnost. Zanimivo je, da spojina 15 ni kazala citotoksičnih

učinkov, čeprav vsebuje dva klorova atoma. Spojine 4, 7, 8, 11 in 15 se nahajajo nad mejo

90% metabolne aktivnosti, zato so v primeru dobre protimikrobne učinkovitosti primerne

za nadaljnji razvoj. Iz rezultatov testiranja protimikrobne učinkovitosti lahko povzamemo,

da so se, sodeč po rezultatih MIC na različnih bakterijskih kulturah, spojine 13, 15 in 19

izkazale za zelo učinkovite. Na žalost pa sta spojini 13 in 19 tudi citotoksični, zato ne

moreta biti osnovi za nadaljnje raziskave. Spojina 15 pa je po drugi strani med testiranimi

spojinami najbolj protimikrobno učinkovita in obenem ni citotoksična. Predstavlja dobro

osnovo za nadaljnji razvoj derivatov triptaminov kot potencialnih protimikrobnih

učinkovin. Od spojine vodnice se razlikuje po tem, da namesto metiltio skupine vsebuje

bioizosterno metoksi skupino, namesto aminske vsebuje gvanidinsko skupino, na mestu 2

v indolnem obroču pa ne vsebuje metilne skupine. Sklepamo lahko, da zamenjava z

metoksi skupino in odstranitev metilne skupine z indolnega obroča izboljša protimikrobno

učinkovitost in zmanjša citotoksičnost. Rezultati so pokazali, da so spojine z gvanidini bolj

protimikrobno aktivne in z izjemo spojine 15 tudi bolj citotoksične od pripadajočih

aminov. Zaključimo lahko, da so triptaminski in 5-metoksitriptaminski derivati dobri

kandidati za nove potencialne protimikrobne učinkovine. Upamo, da bodo nekega dne

prestali faze kliničnih študij in prišli na tržišče kot uspešne učinkovine v boju z

rezistentnimi sevi bakterij.



- 61 -

8. LITERATURA

1. Patrick, G.L. An Introduction to medicinal Chemistry, 4th edition, Oxford University Press:

Oxford, 2009; 421-474

2. Lemke, T.L.; Williams D.A. Foye's Principles of Medicinal Chemistry, 7th edition,

Lippincott Williams&Wilkins: Baltimore, 2012; 1073-1124

3. Gareth, T. Medicinal Chemistry An Introduction; John Wiley & Sons, Ltd: Chichester,

2000, 159-169

4. Liu, H.; Wong, C.H. Characterization of a transglycosylase domain of Streptococcus

pneumoniae PBP1b. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2006, 14, 7187-7195

5. Breukink, E.; de Kruijff, B. Lipid II as a target for antibiotics. Nature Reviews Drug

Discovery, Advance online publication, marec 2006, 1-10

6. Terrak, M. Peptidoglycan Glycosyltransferase Inhibition: New Perspectives for An Old

Target. Anti-Infective Agents in Medicinal Chemistry, 2008, 7, 180-192

7. Ostash, B.; Walker, S. Bacterial transglycosylase inhibitors. Current Opinion in Chemical

Biology, 2005, 9, 459-466

8. Madigan, M.T.; Martinko, J.M.; Stahl, D.A.; Clark, D.P.; Brock Biology of

Microorganisms, 13th edition, Pearson Education: San Francisco, 2012, 47-84

9. Willey, J.M.; Sherwood, L.M.; Woolverton C.J.; Prescott, Harley and Klein's

Microbiology, 7th edition, The McGaw-Hill Companies, Inc.: New York, 2008, 39-78

10. Black, J.G. Microbiology principles and explorations, 8th edition, John Wiley & Sons, Inc.:

Hoboken, 2012, 76-96

11. Vollmer, W.; Höltje, J.V. A Simple Screen for Murein Transglycosylase Inhibitors.

Antimicrobial agents and chemotherapy, 2000, 44, 1181-1185

12. Di Guilmi, A.M.; Dessen, A.; Dideberg, O.; Vernet, T. Bifunctional Penicillin-Binding

Proteins: Focus on the Glycosyltransferase Domain and its Specific Inhibitor Moenomycin.

Current Pharmaceutical Biotehnology, 2002, 3, 63-75

13. Goffin, C.; Ghuysen J.M. Multimodular Penicillin-Binding Proteins: An Enigmatic Family

of Orthologs and Paralogs. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1998, 62, 1079-

1093



- 62 -

14. Tortora, G.J.; Funke, B.R.; Case, C.L.; Microbiology An Introduction, 11th edition,

Pearson Education: Glenview, 2013, 79-97

15. Offant, J.; Michoux, F.; Dermiaux, A.; Biton, J.; Boure, Y. Functional characterization of

the glycosyltransferase domain of penicillin-binding protein 1a from Thermotoga

maritima. Biochimica et Biophysica Acta, 2006, 1764, 1036-1042

16. Di Guilmi, A.M.; Mouz, N.; Martin, L.; Hoskins, J.; Jaskunas, S.R.; Dideberg, O.; Vernet,

T. Glycosyltransferase Domain of Penicillin-Binding Protein 2a from Streptococcus

pneumoniae Is Membrane Associated. Journal of Bacteriology, 1999, 181, 2773-2781

17. Halliday, J.; McKeveney, D.; Muldoon, C.; Rajaratnam, P.; Meutermans, W. Targeting the

forgotten transglycosylases. Biochemical pharmacology, 2006, 71, 957-967

18. Wang, Q.M.; Peery, R.B.; Johnson, R.B.; Alborn, W.E.; Yeh, W.K.; Skatrud, P.L.

Identification and Characterization of a Monofunctional Glycosyltransferase from

Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology, 2001, 183, 4779-4785

19. Shih, H.W.; Chen, K.T.; Chen, S.K.; Huang, C.Y.; Cheng, T.J.R; Ma, C.; Wong, C.H.;

Cheng, W.C. Combinatorial approach toward synthesis of small molecule libraries as

bacterial transglycosylase inhibitors. Organic & Biomolecular Chemistry, 2010, 8, 2586-

2593

20. Derouaux, A.; Turk, S.; Olrichs, N.K.; Gobec, S.; Breukink, E.; Amoroso, A.; Offant, J.;

Bostock, J.; Mariner, K.; Chopra, I.; Vernet, T.; Zervosen, A.; Joris, B.; Frère, J.M.;

Nguyen-Distèche, M.; Terrak, M. Small molecule inhibitors of peptidoglycan synthesis

targeting the lipid II precursor. Biochemical Pharmacology 2011, 81, 1098-1105

21. Nisin [online]. 2013. Wikipedia, the free encyclopedia. Dostopno na spletnem naslovu:

<http://en.wikipedia.org/wiki/Nisin>

22. Ramoplanin – protecting patients against CDAD attacks in hospitals [online]. 2011. LGM

Pharma. Dostopno na spletnem naslovu: <http://www.lgmpharma.com/blog/ramoplanin-

protecting-patients-against-cdad-attacks-in-hospitals/>

23. Fuse, S.; Tsukamoto, H.; Yuan, Y.; Wang, T.S.A.; Zhang, Y.; Bolla, M.; Walker, S.; Sliz,

P.; Kahne, D. Functional and Structural Analysis of a Key Region of the Cell Wall

Inhibitor Moenomycin. ACS Chemical Biology, 2010, 5, 701-711

24. Cheng, T.J.R.; Sung, M.T.; Liao, H.Y.; Chang, Y.F.; Chen, C.W.; Huang, C.Y.; Chou,

L.Y.; Wu, Y.D.; Chen, Y.H.; Cheng, Y.S.E.; Wong, C.H.; Ma, C.; Cheng, W.C. Domain

http://en.wikipedia.org/wiki/Nisin

http://www.lgmpharma.com/blog/ramoplanin-protecting-patients-against-cdad-attacks-in-hospitals/

http://www.lgmpharma.com/blog/ramoplanin-protecting-patients-against-cdad-attacks-in-hospitals/



- 63 -

requirement of moenomycin binding to bifuntcional transglycosylases and developement

of high-throughput discovery of antibiotics. PNAS, 2008, 105, 431-436

25. FDA Grants QIDP Designation to The Medicines Company's Investigational Antibiotic

Oritavancin [online]. 2013. The Medicines Company. Dostopno na spletnem naslovu:

<http://www.marketwired.com/press-release/fda-grants-qidp-designation-the-medicines-

companys-investigational-antibiotic-oritavancin-nasdaq-mdco-1850874.htm>

26. Dalbavancin [online]. 2013. Wikipedia, the free encyclopedia. Dostopno na spletnem

naslovu: <http://en.wikipedia.org/wiki/Dalbavancin>

27. Dalvance [online]. 2013. Drug Information Online. Dostopno na spletnem naslovu:

<http://www.drugs.com/nda/dalbavancin_131126.html>

28. Telavancin [online. 2014. Wikipedia, the free encyclopedia. Dostopno na spletnem

naslovu: <http://en.wikipedia.org/wiki/Telavancin>

29. Bumbaković, M. Sinteza triptaminskih zaviralcev bakterijske glikoziltransferaze s

potencialnim protimikrobnim delovanjem: diplomska naloga, Ljubljana 2011

30. Tišler, M. Organska kemija, Državna založba Slovenije, Ljubljana, 1982, 113-134 in 189-

227

31. Pečar, S.; Sollner Dolenc, M. Vaje iz farmacevtske kemije III, Fakulteta za farmacijo:

Ljubljana, 2000, 79 in 88-90

32. Catalysts cesium [online]. Acros Organics. Dostopno na spletnem naslovu:

<http://www.acros.com/_Rainbow/pdf/brochure_cesium_v2.pdf>

33. Anderluh, M. Načrtovanje in sinteza modulatorjev integrinskih receptorjev: doktorska

disertacija, Ljubljana 2004,

34. Jukič, M.; Anderluh, M.; Antimicrobial activity and cytotoxicity of some 2-amino-5-

alkylidene-thiazol-4-ones. Molecular Diversity, november 2013, 17, 773-780

35. MTT assay [online]. 2014. Wikipedia, the free encyclopedia. Dostopno na spletnem

naslovu: <http://en.wikipedia.org/wiki/MTT_assay>

36. CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation systems protocol, Tehnical

bulletin, Promega

37. Sarker, S.D.; Nahar, L.; Kumarasamy, Y. Microtitre plate-based antibacterial incorporating

resazurin as an indicator of cell growth, and its application in the in vitro antibacterial

screening of phytochemicals. Methods, 2007, 42, 321-324

http://www.marketwired.com/press-release/fda-grants-qidp-designation-the-medicines-companys-investigational-antibiotic-oritavancin-nasdaq-mdco-1850874.htm

http://www.marketwired.com/press-release/fda-grants-qidp-designation-the-medicines-companys-investigational-antibiotic-oritavancin-nasdaq-mdco-1850874.htm

http://en.wikipedia.org/wiki/Dalbavancin

http://www.drugs.com/nda/dalbavancin_131126.html

http://en.wikipedia.org/wiki/Telavancin

http://www.acros.com/_Rainbow/pdf/brochure_cesium_v2.pdf

http://link.springer.com/journal/11030

Documents

Sinteza triptaminskih derivatov s protimikrobnim … · Član diplomske komisije: doc. dr. Bojan Doljak, mag. farm . Samo Jakovac: ... 4.2.9. Sinteza 2-(2-(5-metoksi-1H-indol-3-il)etil)izoindolin-1,3-diona