Trabajo de Fin de Máster Sandra Gabriela Barrazueta …repositorio.educacionsuperior.gob.ec/bitstream/28000/267/1/T... · La composición química del aceite esencial de romero varía

Introducción

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Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando etanol y CO2 supercrítico

1. INTRODUCCIÓN

Introducción

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1.1. Los compuestos fenólicos y su actividad funcional antioxidante.

Los compuestos fenólicos son un amplio grupo de sustancias con diferentes

estructuras químicas y actividad, son constituyentes importantes de las plantas y que a

su vez les otorga múltiples efectos benéficos. Están presentes generalmente en forma de

glucósidos en los extractos de las frutas, hierbas, vegetales, cereales y otros materiales;

lo que ha permitido su utilización por la industria alimentaria no solo por las

características organolépticas que le confieren a los alimentos, sino porque retardan la

oxidación de los lípidos y mejoran la calidad nutricional de los alimentos. (Muñoz A,

Ramos F. 2007).

Los compuestos antioxidantes juegan un papel muy importante en los alimentos.

La oxidación lipídica es una de las principales causas de deterioro químico, lo que

resulta en la rancidez y/o el deterioro de la calidad nutricional, color, sabor y seguridad

de los alimentos, los iniciadores para esta oxidación incluyen rayos UV, luz, calor,

enzimas, variedades de radicales libres, microorganismos, metales y metalopreoteínas

(Albu S. y col., 2004).

Además de su papel como estabilizadores de alimentos, pueden proteger las

células contra los efectos de los radicales libres y por tanto, tienen un efecto destacado

en la prevención de problemas cardíacos, cáncer y otras enfermedades (Suhaj, 2006).

Recientes estudios han indicado el mecanismo fundamental del potencial preventivo de

algunos compuestos fenólicos, los cuales juegan un rol importante por su actividad

antioxidante (Kähkönen y col., 1999) , anti-inflamatoria, aumento del potencial inmune,

efecto antihormonas, modificación de enzimas metabolizadoras de drogas, influencia

sobre el ciclo celular y diferenciación celular, inducción de apoptosis, supresión y

proliferación, angiogénesis, los cuales cumplen roles en la iniciación y modificación del

estado secundario del desarrollo neoplásico (Tsuda y col., 2004).

La relación estructura-actividad influye decididamente sobre la actividad

biológica de los compuestos fenólicos (flavonoles, chalconas, flavonas, flavanonas,

isoflavonas, taninos, estilbenos, curcuminoides, ácidos fenólicos, coumarinas, lignanos

y quinonas). El número y la posición de grupos hidroxi, la glicosilación y otras

substituciones determinan la actividad de secuestro de radicales por los compuestos

Introducción

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fenólicos. Las diferencias que existen entre la actividad de secuestro de radicales están

atribuidas a las diferencias estructurales de hidroxilación, glicosilación y methoxilación.

Los extractos de hierbas, especias, y otros materiales vegetales ricos en

compuestos fenólicos son de creciente interés en la industria alimentaria porque

retardan la degradación oxidativa de los lípidos y por consiguiente, mejoran la calidad y

el valor nutricional de los alimentos. Las hierbas se utilizan en muchos dominios,

incluyendo la medicina, la nutrición, aromatizantes, bebidas, teñido, repelentes,

perfumes, cosméticos (Djeridane A, y col., 2006).

1.2. Plantas Labiadas

Las Lamiáceas (Lamiaceae), también llamadas labiadas, son una familia que

comprende unos 210 géneros y alrededor de 3.500 especies, perteneciente al

orden Lamiales. Tradicionalmente, esta familia era conocida por el nombre de Labiadas,

pero siguiendo las recomendaciones del Código de Nomenclatura Botánica, su nombre

ha sido substituido por Lamiaceae en alusión al género tipo de la familia: Lamium.

Incluye varias especies muy utilizadas como condimento en alimentación, como

la menta, albahaca, orégano, mejorana, tomillo y romero.

Son hierbas perennes, algunos subarbustos y raramente árboles o trepadoras, que

contienen aceites esenciales en todas las partes de la planta. El nombre original de esta

familia era labiadas debido a la peculiar forma de la flor (generalmente de color

violáceo), 5 pétalos fusionados en forma de boca con un labio superior, generalmente

bilobulado y más corto, y uno inferior, trilobulado, los 5 sépalos también están unidos,

sus estambres (4) conforman un androceo didínamo (2 estambres más largos y 2 más

cortos). Las flores son bisexuales y surgen en ramilletes terminales de 5 ó 6 (a veces

más o menos) florecillas cada uno. Los tallos son generalmente cuadrangulares

con hojas aovadas, opuestas y decusadas.

En el presente estudio se utilizaron tres tipos de plantas labiadas: Romero

(Rosmarinus officinalis), albahaca (Ocimum basilicum) y mejorana (Origanum

majorana).

Introducción

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1.2.1. Romero (Rosmarinus officinalis L.)

Romero (Rosmarinus officinalis L.) es una hierba típica de la región y cocina

Mediterránea, que se ha estudiado como un producto natural con diversas actividades

biológicas tales como: anti-inflamatoria, anti-tumoral, quimiopreventiva,

hepatoprotectora, contra la diabetes, antioxidante, anti-proliferativa, antiviral,

antimicrobiana, anticonceptiva y antidepresiva, entre otros (Vicente G. y col., 2010).

Hojas de romero y extractos de las hojas se utilizan cada vez más como alimento

y gracias a su contenido en sustancias antioxidantes se los utiliza para remplazar

antioxidantes sintéticos como butilado Hidroxianisol (BHA) y butilhidroxitolueno

(BHT) (Etter, 2005).

La composición química del aceite esencial de romero varía ampliamente

dependiendo de las condiciones agrícolas de cultivo, así como con las técnicas de

extracción utilizadas.

Las sustancias principales asociadas con la actividad antioxidante son los

diterpenos fenólicos tales como: carnosol, rosmanol, ácido carnósico, metil carnosato, y

los ácidos fenólicos como los ácidos rosmarínico y cafeico (Ibáñez y col., 2003;

Terpenic y col., 2009; Napoli y col., 2010; Zaouali y col., 2010). En particular, el

ácido carnósico y carnosol han sido reconocidos como los compuestos antioxidantes

más abundantes presentes en los extractos de romero.

1.2.2. Albahaca (Ocimum basilicum)

La albahaca Ocimum basilicum es una hierba que se utiliza muy comúnmente

como condimento en la comida; también es muy valiosa debido a sus propiedades

farmacéuticas, por ejemplo, el aceite volátil producido de sus hojas se utiliza como

antioxidante (Harsh y col., 2002). Muchos estudios científicos demostraron que el

extracto de albahaca es un fuerte eliminador de radicales y puede considerarse como

una buena fuente de antioxidantes naturales (Javanmardi y col., 2003; Lee y col., 2005;

Abas y col., 2006).

Introducción

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Estudios realizados por Javanmardi y col., (2003) sugirieren que el 71% de la

capacidad antioxidante de la albahaca no se origina únicamente por los compuestos

fenólicos sino que también puede provenir de la presencia de metabolitos secundarios,

tales como aceites volátiles, carotenoides, vitaminas y otras sustancias. Jayasinghe y

col., (2003) mostraron la existencia de un efecto sinérgico antioxidante en el extracto

de albahaca entre el ácido rosmarínico y α-tocoferol.

En el trabajo de Yamasaki y col., (1998) se reporta que extractos acuosos de

albahaca dulce tienen un efecto anti-VIH. Además estudios realizados por Pérez-

Gutiérrez y col., (1992) sugieren que los extractos acuosos de albahaca poseen una

acción sobre el sistema cardiovascular y los extractos alcohólicos una actividad similar

a la de la atropina.

La albahaca (Ocimum basilicum) contiene altos niveles de ácidos fenólicos que

contribuyen a su capacidad antioxidante (Javanmardi, Khalighi y col., y Vivanco, 2002,

Lee & Scagel, 2009, 2010). Las concentraciones del ácido rosmarínico, en particular se

han asociado con las cualidades medicinales de la hierba (Petersen y Simmonds, 2003).

El ácido rosmarínico se observa en la literatura como compuesto fenólico prevalente en

la albahaca (Javanmardi y col., 2002, Lee & Scagel, 2009), pero otros derivados del

ácido cafeico, tal como ácido chicorésico (Lee, 2010; Lee y Scagel, 2009, 2010),

también se encuentran en altas concentraciones.

La albahaca es conocida por su gran diversidad genética que tienen entre 65 y

150 especies reportadas, que son basadas en variaciones de características morfológicas

tales como: hábitat de crecimiento, color de la hoja, el tamaño, la forma y la

composición aromática (Kintzios y Makri, 2007). Varios estudios realizados por (Labra

y col., (2004); Javanmardi y col., (2002) reportan que existen variaciones en la

composición del aceite esencial, compuestos fenólicos y actividad antioxidante entre las

distintas variedades de albahaca debido a su diferentes rasgos genéticos.

Estudios realizados por Kwee y Niemeyer (2011) demuestran la influencia de los

cultivares en la composición fenólica y propiedades antioxidante de 15 cultivares

comunes de albahaca (ver Tabla 1).

Introducción

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Tabla 1. Concentraciones promedio de ácidos fenólicos (mg / g peso seco) en las

variedades de albahaca estudiadas.

Fuente: Kwee E.M., Niemeyer E.D. Food Chemistry 128 (2011) 1044–1050

1.2.3. Mejorana (Origanum majorana L.)

La mejorana aromática comprende varias hierbas que pertenecen a distintas

especies, el más conocido es el Origanum majorana L. (syn. Majorana hortensis

Moench, M. Vulgaris Miller), nativo del sur de Chipre y Turquía. También se

cultiva extensivamente como mejorana dulce, que es una hierba anual, en varias zonas

de Europa, Norte de África, América y Asia. Las hojas secas de mejorana dulce son

ampliamente utilizadas en la industria alimentaria como agentes aromatizantes

de aderezos, sopas, en la formulación de vermut y amargos, entre otros (Kokkini S.

1993).

Desde la antigüedad ha sido conocida la actividad biológica de su aceite

esencial en particular sus propiedades antibacterianas, antimicóticas y antioxidantes, por

lo que la investigación de la composición y sabor de esta materia prima es de gran

interés (Baratta, M y col., 1998). Su aceite esencial y extractos alcohólicos se aplican

en productos farmacéuticos, perfumes y los cosméticos (Bauer, Garbe y Surburg, 1990;

Price 1995)

Introducción

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Algunos estudios han demostrado que la composición y aroma puede variar con

el origen de las plantas y las condiciones de cultivo (Vera R. y col., 1995). Por ejemplo,

algunos aceites esenciales de mejorana se han obtenido con altos contenidos de

alcoholes monoterpénicos mientras que en otros los fenoles son los principales

constituyentes. En algunos aceites, el componente principal, es el 4-terpineol solo o

junto con otros alcoholes monoterpénicos tales como el cis y trans-sabineno hidrato y

α-terpineol; timol y carvacol se detrminaron en pequeñas cantidades (Vági E. y col.,

2004).

El aceite esencial posee propiedades antimicrobianas contra enfermedades

transmitidas por bacterias y hongos micotoxigénicos (Baratta y col., 1998; Daferea y

col., 2000; Decanos y Svoboda, 1990; Ezzeddine y col., 2001).

Según los estudios realizados por Vági y col., (2004) tanto en la extracción

alcohólica y supercrítica el componente principal del aceite esencial de mejorana es el

4-terpinenol, además de otros compuestos minoritarios como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2. Composición del aceite esencial de mejorana, obtenidos por extracción

alcohólica y supercrítica (% área pico analizó por GC y métodos de GC-MS)

Fuente: E. Vági y col., Food Research International 38 (2005) 51–57.

Introducción

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Los extractos etanólicos y supercríticos mostraron una composición similar,

aunque en el extracto supercrítico el contenido de 4-terpineol es casi dos veces superior

al del extracto etanólico.

1.3. Procedimientos tradicionales e innovadores para la extracción de

compuestos fenólicos a partir de plantas labiadas.

Actualmente una de líneas más importantes de la investigación en la tecnología

de los alimentos es el aislamiento de compuestos naturales con propiedades funcionales

a partir de fuentes naturales. Aislamiento de compuestos puros o incluso grupos de

compuestos con propiedades terapéuticas, tales como antioxidantes, normalmente se

hace por HPLC a escala preparativa (Esaki H., y col., 1998).

Las tecnologías tradicionales para la producción de extractos de plantas incluye

la extracción sólido-líquido (solid-liquid extraction, SLE), utilizando diferentes tipos de

disolventes: variando el disolvente de la extracción de acuerdo a los compuestos que se

quiera obtener. Por ejemplo, los carotenoides son fácilmente extraídos por medio de

disolventes no polares (hexano, pentano, éter de petróleo) o disolventes moderadamente

polares (tetrahidrofurano, diclorometano) incluyendo sus mezclas con disolventes

polares tales como alcoholes (Rodríguez-Bernaldo de Quirós y Costa, 2006). Por otro

lado, los compuestos fenólicos se extraen generalmente utilizando agua (Bergman y

col., 2003) y los lípidos usando etanol o metanol (Maeda y col., 2010).

La SLE o lixiviación es un proceso por el cual se extrae uno o varios solutos de

un sólido, mediante la utilización de un disolvente líquido. Ambas fases entran en

contacto íntimo y el soluto o los solutos pueden difundirse desde el sólido a la fase

líquida, lo que produce una separación de los componentes originales del sólido; es una

técnica utilizada tradicionalmente para la extracción de determinados compuestos en

matrices vegetales, con diferentes tipos de disolventes según la clase de analito que

se quiera obtener; por ejemplo en la industria alimenticia las aplicaciones más

frecuentes son: extracción de aceites y grasas animales y vegetales, lavado de

precipitados, obtención de extractos de materias animales o vegetales, obtención de

azúcar, fabricación de té y café instantáneo, entre otras.

Introducción

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Esta técnica tradicional de extracción tiene ciertos problemas como son lentitud,

laboriosidad, empleo de grandes cantidades de disolventes tóxicos, poca selectividad,

entre otras; por lo que la creciente demanda de mayor productividad en los laboratorios,

análisis más rápidos y métodos más automatizados ha llevado al estudio y creación de

nuevas técnicas de extracción que permitan mayor rapidez, eficacia, fiabilidad,

sencillas, sin empleo de disolventes tóxicos, etc.

El desarrollo de nuevas técnicas de separación para las industrias química y

alimentaria ha recibido mucha atención últimamente debido a las nuevas restricciones

del Reglamento para el medio ambiente, salud pública y la necesidad de minimizar los

costos de energía (Coelho L.A.F. y col., 1996). El uso de disolventes orgánicos para

obtener extractos de plantas, además de las dificultades asociadas con la restricción de

los mismos para ser utilizados por la industria alimentaria tiene la desventaja de la

transformación oxidativa durante la separación del disolvente (S.L. Sebastián y col.,

1998).

Técnicas de extracción alternativas con mejor selectividad y eficacia son

altamente deseadas, con el fin de eliminar o disminuir el uso de disolventes, evitar la

degradación o la pérdida de sustancias sensibles, reducir la energía y la mano de obra

de los procesos convencionales.

La extracción acelerada con disolventes (Accelerated Solvent Extraction, ASE),

es una nueva técnica de extracción que usa los disolventes habituales a presiones y

temperaturas elevadas, lo que permite extracciones rápidas y efectivas de muestras

sólidas; las altas temperaturas producen efectos interesantes como mejor solubilidad de

los analitos en líquidos y aumento de las cinéticas de desorción de los compuestos de la

matriz.

Está basada en una técnica más antigua denominada "soxhlytic extraction" que

reduce el consumo de disolvente y el tiempo de preparación de muestra. El disolvente es

bombeado hacia un recipiente de extracción que contiene la muestra a extraer. La

muestra es calentada y presurizada. El disolvente presurizado se mantiene en forma

líquida a una temperatura por encima de su punto de ebullición y así se acelera la

cinética de desorción del analito de la matriz de la muestra; tiene varios beneficios como

son: ahorro de tiempo: 10-15 minutos es el tiempo típico en realizar una extracción,

Introducción

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reducción de coste de disolvente: el equipo utiliza alrededor de 15 ml de disolvente por

cada gramo de muestra, reducción de disolventes de desechos; principalmente.

La extracción asistida con ultrasonidos (Ultrasound Assisted Extraction, UAE)

se considera una prometedora tecnología para la industria de procesamiento de

alimentos (The Sonochemistry Centre, 2006). Son señales de alta intensidad que se

utilizan para modificar un proceso o un producto (Mulet et al., 1999). Con una

frecuencia más baja y mayor potencia producen cambios físicos y químicos en el medio

a través de la generación y subsiguiente colapso de burbujas de cavitación, las cuales

aparecen, crecen y colapsan dentro del líquido. Esto ocurre asimétricamente cerca de

las interfases y golpes sobre la superficie sólida. Se requiere de un medio líquido, un

generador de energía y un transductor, el cual convierte energía eléctrica, magnética o

cinética en energía acústica (Mulet et al., 2003).

La ventaja de utilizar ultrasonido en la extracción de plantas ya se ha aplicado a

un sin número de compuestos de interés, tanto en la farmacología y la industria

alimentaria (Vinatoru y col., 1999 ). La mejora observada en la extracción de

compuestos orgánicos por ultrasonido se atribuye a una intensificación de la

transferencia de masa, debido al fenómeno de cavitación producido en el disolvente por

el paso de una onda ultrasónica o sonora.

Las ondas sonoras son ondas de presión que se transmiten a través de un medio

material, en ausencia de este es imposible su transmisión. Precisamente por ello las

ondas sonoras provocan la contracción y posterior expansión del medio en el cual se

propagan. Cuando este medio es un disolvente pueden formarse burbujas o cavidades en

el líquido que terminen por explotar en un proceso que se conoce como cavitación.

Estas burbujas explotan violentamente produciendo un incremento local de presión y

temperatura muy notable que no es perceptible en el sistema como un conjunto debido

al pequeño tamaño de las burbujas

El ultrasonido también ejerce un efecto mecánico, permitiendo una mayor

penetración de disolvente en el cuerpo de la planta. Esto, junto con una mayor

transferencia de masa y la ruptura significativa de las células, a través del colapso de

cavitación de la burbuja, tiene el efecto de liberar el contenido de las células en el

volumen del medio (Albu y col., 2004 ).

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Además puede producir algunos efectos químicos debido a la producción de

radicales libres dentro de las burbujas de cavitación. La sonicación de agua resulta en la

formación de radicales hidroxilo altamente reactivos que pueden combinarse para

formar peróxido de hidrógeno que puede o no ser beneficioso para el proceso de

extracción en sí (Paniwnyk y col., 2001). No obstante, otros disolventes como etanol,

acetato de etilo o butanona producen menos radicales libres que el agua bajo

condiciones similares de sonicación, y ya se ha observado que la extracción de ácido

carnósico se mejora significativamente por sonicación (Albu y col., 2004).

La extracción con fluidos supercríticos (Supercritical Fluid Extraction, SFE), es

una técnica que ha tenido un gran desarrollo en los últimos años en las industrias

química, farmacéutica y alimentaria debido a sus numerosas aplicaciones y ventajas. Es

una técnica de extracción benigna con el medio ambiente, eficiente para materiales

sólidos, elimina el problema del disolvente tóxico residual en los productos, permite el

uso temperaturas más bajas que conducen a una menor deterioro de los componentes

térmicamente lábiles, retiene las características organolépticas de las materias a partir de

especias, entre otras (Simandi, 1998).

La SFE es una operación unitaria que aprovecha el poder disolvente de fluidos a

temperaturas y presiones por encima de su punto crítico. Un fluido supercrítico es

cualquier fluido que a temperatura y presión superior a sus valores críticos tiene

propiedades intermedias entre un líquido y un gas; es decir poseen densidades similares

a la de los líquidos pero su viscosidad es mucho menor (entre 5 y 20 veces menor), lo

que hace que los coeficiente de difusión de los solutos sean mucho mayores que en un

disolvente líquido.

Es por ello que las extracciones llevadas a cabo con fluidos supercríticos son en

primer lugar tan completas como las llevadas a cabo con disolventes líquidos, ya que

ambos presentan similares características solvatantes y, en segundo lugar, mucho más

rápidas y eficientes, ya que su baja viscosidad favorece los fenómenos de transferencia

de materia y la penetrabilidad en los poros de la matriz de la muestra.

Entre las tecnologías de procesos innovadores, la extracción con fluidos

supercríticos (SFE) es en efecto, la aplicación más ampliamente estudiada; en la

práctica la SFE se lleva a cabo generalmente utilizando dióxido de carbono (CO2) por

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varias razones prácticas: tiene moderadamente baja presión crítica (74 bar) y

temperatura (32°C), no es tóxico, no inflamable, disponible en alta pureza a un coste

relativamente bajo, es reconocido como GRAS (Generally Recognized as Safe), y se

elimina fácilmente a partir del extracto. El CO2 supercrítico tiene una polaridad similar

al líquido pentano y por lo tanto es adecuado para la extracción de compuestos lipófilos.

Por ejemplo, teniendo en cuenta las características lipofílicas de los aceites esenciales

de las plantas, por todas estas razones el CO2 es el más utilizado (Fornari T. y col.,

2012).

Uno de los inconvenientes que presenta el CO2 supercrítico es su baja polaridad

lo que dificulta la extracción de solutos polares; para la extracción de esta clase de

compuestos se utiliza un cosolvente que es un disolvente orgánico que se añade al

fluido supercrítico en pequeñas cantidades (hasta un 10% v/v). Algunos cosolventes

utilizados son: dimetil sulfóxido, hexanol, 2-propanol, 2-metoxietanol, agua, ácido

fórmico, etc.

El parámetro más relevante en el proceso de SFE de la planta matriz es la

presión de extracción, que puede ser usada para ajustar la selectividad del disolvente

supercrítico. La regla general es: cuanto mayor es la presión, mayor es el poder

disolvente y menor es la selectividad de la extracción (B. Simandi y col., 1998). Con

respecto a la temperatura de extracción, en el caso de compuestos termolábiles los

valores se debe establecer en el intervalo de 35-50°C, en las proximidades del punto

crítico, y tan bajo como sea posible para evitar degradación (Fornari T. y col., 2012).

Varios estudios reportan el uso del etanol y otros alcoholes de bajo peso

molecular en la SFE de plantas y hierbas. En estos casos, los compuestos antioxidantes

eran el blanco de estudio. Leal y col., (2008); estudiaron la SFE de albahaca con agua

como codisolvente a diferentes concentraciones (1, 10 y 20%); los autores concluyeron

que el rendimiento de extracción aumenta a medida que aumenta el porcentaje de

cosolventes, con una reducción del contenido de compuestos terpénicos y un aumento

del contenido de los ácidos fenólicos en los extractos.

Menaker y col., (2004); y Hamburger y col., (2004); también observaron un

incremento en el rendimiento de extracción cuando se emplea etanol como codisolvente

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en la SFE de albahaca; se observó una disminución sustancial de los componentes de

aceites esenciales cuando aumenta la cantidad del codisolvente y la densidad del CO2,

por el contrario el extracto es enriquecido en compuestos de tipo flavonoide.

Fornari T. y col., (2012) estudiaron el efecto de etanol como codisolvente en la

extracción supercrítica de hojas de romero a diferentes presiones de extracción como se

muestra en la Tabla 3. La cantidad de aceite esencial extraído, el cual está representado

en la tabla por sus principales constituyentes no se incrementa significativamente

cuando el etanol se emplea como codisolvente, aunque si se observa un aumento en la

cantidad de ácido carnósico y el carnosol. El principal efecto de emplear etanol como

codisolvente en la SFE de romero se observa en la recuperación de sus compuestos

fenólicos antioxidantes, pero no en la extracción de sustancias del aceite esencial.

Tabla 3. Efecto del cosolvente en la extracción supercrítica de hojas de romero

Fuente: Fornari T. y col., Journal of Chromatography A, 1250 (2012) 34–48

Objetivos

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2. OBJETIVOS

Objetivos

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2.1. Objetivo General

• Estudiar el efecto del uso de ultrasonidos como etapa previa a la Extracción con

Fluidos Supercríticos de hojas de romero (Rosmarinus officinalis), albahaca

(Ocimum basilicum) y mejorana (Origanum majorana), para potenciar la

extracción de compuestos fenólicos y minimizar la cantidad de etanol empleada

en el proceso.

2.2. Objetivos Específicos

• Comparar diferentes técnicas de extracción, en términos de rendimiento,

relación etanol/planta utilizada, tiempo de extracción y concentración de

compuestos fenólicos obtenidos en los extractos.

• Analizar mediante cromatografía de líquidos (HPLC) los extractos obtenidos

para identificar y cuantificar los compuestos fenólicos.

• Explorar la posibilidad de obtener extractos con altos contenidos de ácido

rosmarínico.

• Determinar el contenido de polifenoles totales en los extractos obtenidos para

valorar la eficacia de las distintas técnicas de extracción.

.

Materiales y Métodos

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3. MATERIALES Y MÉTODOS


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3.1. Material vegetal

Las hojas secas de las plantas labiadas utilizadas en el presente estudio son

romero (Rosmarinus officinalis), albahaca (Ocimum basilicum) y mejorana (Origanum

majorana), proceden de Herboristería MURCIANA. La molienda de las hierbas se

realizó en un molino de cuchillas Grindomix modelo GM200; logrando un diámetro

final de partícula homogéneo.

3.2. Productos químicos y reactivos

El dióxido de carbono CO2 (N38) utilizado en el presente estudio tiene una

pureza de 99,5% en relación (w/w) suministrado a partir de Carburos Metálicos Madrid.

El disolvente polar utilizado es el etanol de grado espectroscópico.

Los patrones de A. Carnósico (≥ 96%) y carnosol (≥ 98%) fueron adquiridos

de Bioquímica de Alexis (Madrid, España). El ácido rosmarínico (97%) proviene de

Sigma-Aldrich (Madrid, España). El ácido fosfórico de grado HPLC de Panreac.

Acetonitrilo grado HPLC fue del Laboratorio de exploración (Gliwice, Polonia).

3.3. Métodos de Extracción

3.3.1. Extracción sólido-líquido (SLE).- Los experimentos se llevaron a cabo

utilizando 1 g de muestra con 100 ml de etanol a 50 º C, presión de 1 bar en un agitador

orbital aparato de Stuart S150 durante 24 h. Después de la extracción se separó el

disolvente por evaporación bajo vacío usando un rotavapor. Finalmente, el extracto se

secó en una corriente de N2 hasta peso constante. Todos los experimentos se realizaron

por duplicado. Las muestras secas obtenidas se almacenaron a 4°C en la oscuridad

hasta su análisis.

3.3.2. Extracción acelerada con disolventes (ASE).- Las extracciones se

realizaron con etanol como disolvente en un sistema de ASE 350 Dionex Corporation

(Sunnyvale, CA, EE.UU.) equipado con una unidad controladora de disolvente.

Cada celda de extracción (10 ml de capacidad) se llenó con 1 g de muestra

sólida y 1 g de arena de mar como un emparedado, y luego se ubicó en un horno.

Posteriormente se llenó la celda con disolvente hasta alcanzar una presión

correspondiente a 103 bar y se calentó hasta alcanzar la temperatura deseada. Se


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realizaron extracciones estáticas a 150 ºC durante 10 min. Después de la extracción las

celdas se lavaron con el disolvente y posteriormente el disolvente se purgó desde la

celda utilizando gas N2 hasta que la despresurización completa se llevó a cabo.

Los extractos fueron recuperados en viales de vidrio y el disolvente se eliminó

por evaporación bajo vacío y se secó en una corriente de N2. Todos los experimentos se

realizaron por duplicado. Las muestras secas se almacenaron a 4ºC en la oscuridad hasta

su análisis.

3.3.3. Extracción Asistida con Ultrasonidos (UAE).- Las extracciones se

realizaron en un baño de ultrasonidos marca JP Selecta modelo 3000513. Las hojas

secas de cada una de las plantas labiadas molidas previamente (5g) se colocaron en un

matraz erlenmeyer de 250 cm3; se añaden 100 cm3 de etanol. El matraz y su contenido

se sumergieron en un baño de ultrasonidos y se realizó el sonicado durante 5, 15 y 30

min; el rango de temperatura se mantuvo a ≤ 30 0C y presión de 1 bar.

Se efectuó la extracción con ultrasonidos con el mismo procedimiento arriba

mencionado para la materia prima vegetal remanente (hojas secas de romero, albahaca y

mejorana) luego de ser extraída por el procedimiento SFE combinado con ultrasonidos

que se describe en la sección 3.3.5.

Los extractos obtenidos fueron filtrados al vacío y recuperados en viales de

vidrio, el disolvente se eliminó utilizando un rotavapor y se secó en una corriente de N2.

Todos los experimentos se realizaron por duplicado. Las muestras secas se almacenaron

a 4ºC en la oscuridad hasta su análisis.

3.3.4. Extracción con fluidos supercríticos (SFE).- Las extracciones con

fluidos supercríticos se llevaron a cabo en una planta a escala piloto modelo (Thar

Technology, Pittsburgh, PA, USA, model SF2000). La planta tiene una celda de

extracción con una capacidad de 2 L y dos separadores diferentes (S1 y S2), cada uno

de 0,5 L de capacidad. Todos ellos tienen controladores independientes de presión y

temperatura. La celda de extracción tiene una relación altura / diámetro de 5,5 (0,42 m

de altura, 0.076 m de diámetro interior). La planta de extracción también incluye un

sistema de recirculación en el cual el CO2 se condensa y se bombea hasta la presión de

extracción deseada.


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Las extracciones se realizaron a una temperatura de 400C y a una presión de

150 bar; el caudal de inyección del CO2 fue de 30 g/min y 60g/min dependiendo del

tipo de experimento. El tiempo de extracción para los experimentos fue de 3 horas

aproximadamente.

Los extractos obtenidos fueron filtrados al vacío y recuperados en viales de

vidrio, el disolvente se eliminó utilizando un rotavapor y se secó en una corriente de

N2. Las muestras secas se almacenaron a 4ºC en la oscuridad hasta su análisis.

3.3.5. Extracción con fluidos supercríticos combinada con etapa previa de

ultrasonidos (US-SFE).- En el caso de la extracción con fluidos supercríticos

combinada con ultrasonidos se efectuó una etapa previa a la SFE en donde las hojas

secas de romero, albahaca y mejorana previamente molidas, se mezclaron en un vaso de

precipitación con etanol en una relación 2:3 (peso de materia prima/ volumen de

disolvente); luego se sometió la mezcla a sonicado durante 30 min cuidando que la

temperatura del baño se mantenga ≤ 300C; el pastiche obtenido se sometió a SFE a las

mismas condiciones arriba mencionadas.

3.3.6. Análisis por HPLC.- La cuantificación de ácido carnósico, carnosol y

ácido rosmarínico de los extractos se analizaron empleando un HPLC equipado con un

MICROSORB-MV-100, columna C18 (Varian) de 250 mm x 4,6 mm y 5 µm de tamaño

de partícula. La fase móvil consistió en acetonitrilo (disolvente A) y 0,1% de ácido

fosfórico en agua (disolvente b) aplicando la siguiente gradiente: 0-8 min, 23% A y 8-

25 min, 77% de A. Esta última composición se mantuvo durante 15 minutos y las

condiciones iniciales fueron ganadas en 5 min.

Tiempo total de análisis fue de 45 minutos. La velocidad de flujo fue constante a

0,7 mL / min. Volumen de inyección fue de 20 µL y la detección se llevó a cabo

mediante el uso de una red de diodos de detección del sistema de Varian la misma que

almacena la señal a una longitud de onda de 230, 280 y 350 nm.

3.3.7. Estimación del contenido de Polifenoles Totales.- Para esta prueba se

utilizó el Método Folin-Ciocalteu que es un método colorimétrico descrito

anteriormente por Gao y col., (2000). En tubos de ensayo se mezclan en el siguiente

orden 3 ml de H2O Mili Q, 50 µL muestra o patrón y 250 µL de reactivo de Folin-


20


Ciocalteu; se incuban a temperatura ambiente durante 3 min. Luego se añade a la

mezcla 0,75 ml de Carbonato de sodio al 20% y 0,95 ml de H2O Mili Q; se agita en el

vortex y se dejan las muestras en reposo durante dos horas en la oscuridad. La

absorbancia del color azul resultante fue medida en un espectrofotómetro a 760 nm. La

cuantificación se hace con respecto a las curvas de concentración de ácido gálico; los

resultados finales se expresan como mg de ácido gálico / mg muestra.

Resultados y Discusión

21


4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN


22


4.1. RESULTADOS

4.1.1. Análisis comparativo de la eficiencia de la extracción de compuestos

fenólicos a partir de hojas de romero (Rosmarinus officinalis), albahaca (Ocimum

basilicum) y mejorana (Origanum majorana) utilizando diferentes técnicas de

extracción.

Las Tablas 4, 5 y 6 muestran el resumen de los resultados obtenidos al aplicar

diferentes técnicas de extracción (SLE, ASE y UAE) utilizando etanol como disolvente

líquido de extracción para recuperar compuestos fenólicos a partir de hojas de romero,

albahaca y mejorana. Algunos resultados corresponden a trabajos previos del grupo de

investigación (tal como se indica en las tablas correspondientes) pero se incluyen en

esta memoria a efectos de establecer una comparación fundamentada de las diferentes

técnicas de extracción.

Tabla 4. SLE con etanol a 50°C, a presión ambiente, durante 24 horas. AC:

ácido carnósico; CAR: carnosol; AR: ácido rosmarínico.

Planta % rendimiento

% peso

AC

% peso

CAR

% peso

AR

total AC extraído (mg / g planta)

mg AC / mL etanol

mg AR / mL etanol

Romero 20,66 12,36 1,29 2,43 25,54 0,3 0,05

Albahaca 11,60 - - 1,18 - 0,01

Mejorana 11,90 - - 3,13 - 0,04

Fuente: Datos previos del grupo de investigación.

Tabla 5. ASE con etanol a 150°C, a 103 bar y tiempo de extracción 10 min. AC: ácido

carnósico; CAR: carnosol; AR: ácido rosmarínico.

Planta % rendimiento

% peso

AC

% peso

CAR

% peso

AR


mg AC / mL etanol

mg AR / mL etanol

Romero 63,83 4,63 1,29 2,49 29,63 1,5 0,80

Albahaca 14,90 - - 2,88 - 0,22

Mejorana 39,25 - - 5,29 - 1,04



23


Tabla 6. UAE con etanol a temperatura ≤ 30°C y presión de 1 bar. AC: ácido

carnósico; CAR: carnosol; AR: ácido rosmarínico.

Planta Tiempo

(min)

% rend.

% peso AC

% peso CAR

% peso AR

mg AC / mL etanol

mg AR / mL etanol

Romero*

5 9 20,44 2,20 1,25 0,92 0,06

15 12,8 18,52 1,76 1,36 1,19 0,09

30 25,6 12,94 0,59 2,09 1,66 0,27

Albahaca**

5 1,50 - - 1,66 - 0,01

15 1,84 - - 1,74 - 0,02

30 1,66 - - 1,51 - 0,01

Mejorana**

5 2,19 - - 3,89 - 0,04

15 7,12 - - 2,13 - 0,08

30 10,99 - - 1,85 - 0,10

* Datos previos del grupo de investigación.

** Este trabajo.

Las Figuras 1 a 3 muestran los cromatogramas correspondientes al análisis por

HPLC de las muestras obtenidas mediante la extracción con ultrasonidos (30 min) de

cada una de las plantas estudiadas. Se indica en las correspondientes figuras el pico

correspondiente al ácido rosmarínico, uno de los antioxidantes objetivo del estudio de

extracción. Asimismo, en los cromatogramas correspondientes a la albahaca y mejorana

pueden observarse otros picos importantes, muy posiblemente correspondientes a otros

compuestos fenólicos que no ha sido posible identificar en este trabajo. Por esto, se

consideró utilizar la determinación del contenido de polifenoles totales como medida de

la recuperación de antioxidantes fenólicos en los extractos. Por otro lado, en el

cromatograma correspondiente al extracto de romero se indican los picos


24


correspondientes a carnosol y ácido carnósico (antioxidantes reconocidos como los

mayoritarios).

Como puede verse en las tablas, los rendimientos de las extracciones ASE (10

min) son considerablemente mayores que en el caso de la SLE (24 h) o de la UAE (5-30

min). Las altas temperaturas de extracción aplicadas en las extracciones ASE, así como

el efecto de la alta presión, incrementa considerablemente la disolución de analitos en el

disolvente, cuando se la compara con las extracciones sólido-líquido a presión ambiente

o incluso con la extracción asistida por ultrasonidos. Sin embargo, la concentración de

los antioxidantes identificados no es mucho mayor en los extractos ASE y,

particularmente, es sensiblemente inferior en lo que respecta a la extracción de ácido

carnósico del romero. Este hecho puede explicarse en términos de los altos rendimientos

obtenidos en las extracciones ASE, lo que implica una importante co-extracción de

compuesto no deseados, que puede disminuir la concentración de antioxidantes en el

extracto.

En cuanto a la extracción de ácido rosmarínico (AR) la extracción ASE es la que

produce extractos con mayor concentración (% en peso) de este ácido fenólico. Este

resultado, sumado a los altos rendimientos ASE obtenidos, hacen que esta técnica sea la

que, indudablemente, permite la mayor recuperación de AR de las plantas estudiadas

(tanto por g de planta como por mL de etanol empleado). En cuanto a la variedad de

planta, los extractos de mejorana son los que presentan mayor contenido de AR

(particularmente en la extracción ASE, dónde se extraen unos 21 mg de AR por gramo

de hojas), seguidos de los extractos de romero (16 mg/g) y de albahaca (4 mg/g).

En el caso del romero el rendimiento global de extracción UAE a los 30 min,

con un total de 25,6%, es el segundo mejor valor luego de la extracción ASE

refiriéndose a las técnicas de extracción; en cuanto al % peso de ácido carnósico (AC)

se observa que disminuye a mayor tiempo de extracción UAE (20,44% en 5 min y

12,94% en 30 min) y en cuanto a la eficiencia en consumo de etanol el mejor resultado

corresponde a la extracción UAE durante 30 min (1,66 mg AC / mL etanol).

Los extractos de hojas de albahaca obtenidos por UAE presentan valores de

rendimiento de extracción considerablemente inferiores (hasta 10 veces menores) en

comparación con las técnicas SLE y ASE. Además, el rendimiento de extracción y el %


25


en peso de ácido rosmarínico no se ve afectado al aumentar el tiempo, tal como se

observa en las otras dos plantas en estudio; los resultados obtenidos en los tres tiempos

5, 15 y 30 min se mantienen prácticamente constantes y del mismo orden que los

obtenidos en los extractos SLE y ASE.

Figura 1. Cromatograma del extracto UAE de romero (2.5 mg/ml).

Figura 2. Cromatograma del extracto UAE de albahaca (2.5 mg/ml).

Figura 3. Cromatograma del extracto UAE de mejorana (2.5 mg/ml).


26


La extracción UAE de mejorana presenta el segundo mejor valor en cuanto al

rendimiento, con un total de 10,99%. El rendimiento de extracción se incrementa al

aumentar el tiempo de experimentación aunque el % peso de AR disminuye; la mayor

cantidad de AR se extrae en 30 min con una concentración de 1,85% en peso, lo que

equivale a 2 mg AR / g planta (10 veces menor a la recuperada mediante la extracción

ASE).

Por otro lado, en cuanto a la eficiencia en el uso del disolvente, puede observarse

de las Tablas 4, 5 y 6 que las extracciones ASE y UAE son mucho más eficaces por mL

de etanol utilizado, con recuperaciones de ácido carnósico del romero unas 3-5 veces

mayor que la SLE. La eficiencia del uso del disolvente depende no sólo de la variedad

de planta sino también del componente que se desea recuperar. Por ejemplo, en el caso

del romero tanto la extracción ASE como UAE producen similar recuperación de AC

por mL de etanol consumido (mayor concentración de AC y menor rendimiento en la

UAE, resultan en valores similares de mg AC / mL etanol al obtenido en la extracción

ASE). En cambio, tal como se mencionó anteriormente, para la recuperación de AR es

la extracción ASE la que resulta más eficiente, tanto en el caso del romero como en el

de la mejorana y la albahaca.

La Tabla 7 muestra los resultados de repetir la extracción con ultrasonidos

durante 30 min, pero utilizando como materia prima el material remanente en la celda

de extracción, luego de una extracción combinada US-SFE. Estos ensayos se llevaron a

cabo puesto que, tal como se explicará luego, se observó que en la extracción

combinada US-SFE no era posible extraer ácido rosmarínico. Por lo tanto, se esperaba

que al volver a extraer el material ya procesado, se obtendría un extracto con un alto

contenido de ácido rosmarínico. Sin embargo, como puede verse en la Tabla 7, la

concentración de ácido rosmarínico en los extractos sólo aumenta considerablemente (se

duplica) en el caso de la mejorana; para romero y albahaca el %AR se mantiene del

mismo orden de magnitud del obtenido en los ensayos UAE utilizando la materia prima

vegetal original. Además, se puede observar que en el caso del romero y la mejorana el

rendimiento resultante disminuyó, como era de esperar, ya que la materia prima tuvo

una etapa previa de extracción; la albahaca, por el contrario, mantuvo porcentajes de

rendimiento similares al obtenido cuando se procesa la materia prima vegetal original.


27


Tabla 7. UAE con etanol a temperatura ≤ a 30°C y presión de 1 bar del material

vegetal previamente extraído por US-SFE. AC: ácido carnósico; CAR: carnosol;

AR: ácido rosmarínico.

Planta Tiempo

(min)

% rendimiento

% peso

AC

% peso

CAR

% peso

AR

Romero 30 8,55 8,98 1,82 1,63

Albahaca 30 1,64 - - 1,37

Mejorana 30 2,02 - - 3,67

4.1.2. Extracción supercrítica con y sin cosolvente (etanol) de hojas de

romero, albahaca y mejorana

En cuanto a las extracciones utilizando la tecnología de fluidos supercríticos, los

resultados se muestran en las Tablas 8 y 9, correspondientes a la extracción utilizando

CO2 puro (Tabla 8) y CO2 con etanol como cosolvente (Tabla 9).

Tabla 8. SFE de hojas de romero, albahaca y espinaca a 40°C, 300 bar y 60 g/min

de CO2. AC: ácido carnósico.

Planta tiempo (min)

Rend. %

S1

% peso

AC

Rend. %

S2

% peso

AC


Romero 360 4,52 10,89 - - 4,92

Romero* 420 2,83 16,90 1,53 3,12 5,26

Albahaca 300 1,96

Majorana 300 2,03

*SFE con fraccionamiento del extracto en dos separadores en línea.



28


Tabla 9. SFE con etanol como cosolvente a 40°C, 150 bar y 60 g/min de CO2.

AC: ácido carnósico.

Planta peso materia prima (g)

tiempo (min)

% etanol cosolvente

rend. %

% peso AC

% peso CAR

mg AC / mL etanol

Romero 400 210 5,02 7,99 30,64 4,77 12,38

Albahaca 400 210 3,77 3,23 - - -

Mejorana 300 190 3,16 2,88 - - -

Los resultados de las extracciones SFE con CO2 puro, corresponden a trabajos

previos del grupo de investigación, tal como se indica en la correspondiente tabla. Por

otro lado, las condiciones seleccionadas para llevar a cabo las extracciones con

cosolvente (presión, temperatura, porcentaje de cosolvente) se basan en la experiencia

previa del grupo de investigación (Vicente y col., 2012). Las Figuras 4, 5 y 6

corresponden a los cromatogramas obtenidos para los extractos producidos utilizando

etanol como cosolvente.

Figura 4. Cromatograma del extracto de romero obtenido por SFE con etanol como

cosolvente (concentración 2,5 mg/ml).


29


Figura 5. Cromatograma del extracto de albahaca obtenido por SFE con etanol como

cosolvente (concentración 5 mg/ml).

Figura 6. Cromatograma del extracto de mejorana obtenido por SFE con etanol como

cosolvente (concentración 5 mg/ml).

Tal como se esperaba, la extracción SFE utilizando etanol como cosolvente (en

bajas concentraciones, < 5 %) mejora los rendimientos de extracción para todas las

plantas estudiadas en comparación con la SFE utilizando CO2 puro. En el caso del

romero el rendimiento aumenta un 75%, para la albahaca un 90% y para la mejorana el

aumento es del orden de 40%.

También, tal como se esperaba, y en base al análisis de la concentración de ácido

carnósico en los extractos de romero, puede observarse que el uso de etanol como

cosolvente mejora considerablemente la recuperación de antioxidantes: en la extracción

SFE sin cosolvente se recuperan unos 5 mg de AC por g de hojas de romero procesadas,

mientras que en la extracción SFE con etanol como cosolvente se recuperan casi 25 mg


30


de AC por g de hojas. Este valor es del mismo orden que los obtenidos en la extracción

ASE y UAE de romero (29-33 mg AC / g planta). Por otro lado, es importante destacar

que comparando la eficiencia en términos de cantidad de etanol empleado puede decirse

que la SFE con etanol cosolvente logra recuperaciones de AC por mL de etanol mucho

mayores que la extracción ASE o UAE (12,38 mg vs.1,5-1,66 mg). Como desventaja, se

observa que no ha sido posible extraer ácido rosmarínico de ninguna de las plantas

estudiadas mediante la SFE con etanol cosolvente.

4.1.3. SFE de hojas de romero, albahaca y mejorana combinada con una etapa

previa de extracción con ultrasonidos (US-SFE)

Teniendo en cuenta la alta eficiencia en cuanto al consumo de etanol que

presenta la extracción SFE con etanol cosolvente, se investigó el efecto de combinar una

etapa previa de sonicación con la posterior extracción por SFE (US-SFE). Estos

estudios constituyen una etapa preliminar para preparar la construcción de una celda

de extracción de alta presión acoplada a una sonda de generación de utltrasonidos.

La Tabla 10 muestra los resultados obtenidos de la extracción combinando una

etapa previa de ultrasonidos (30 min con etanol en proporción 2:3 peso planta / mL

etanol) seguida de la extracción SFE con CO2 (40°C y 150 bar). Como puede verse en la

tabla, esta extracción combinada permitió un aumento importante del rendimiento de

extracción de romero y mejorana, aunque no así de la albahaca. La Figura 7 corresponde

al cromatograma del extracto de hojas de romero producido utilizando US-SFE, en

donde se identifican el ácido carnósico y carnosol.

Particularmente, en el caso del romero, se observa una disminución en el %

peso de antioxidantes (ácido carnósico y carnosol) pero un aumento de la cantidad de

AC recuperado por mL de etanol empleado, cuando se compara la US-SFE con la SFE

con etanol. Asimismo, la reducción del flujo de CO2 de 60 g/min a 30 g/min, permitió

obtener un extracto de romero con considerablemente mayor rendimiento (15,03% vs.

7.99%) y mejor eficacia en términos de la cantidad de etanol empleada (23,19 mg vs.

12,38 mg AC por mL de etanol empleado), aunque con un contenido de antioxidantes

algo menor (25.9% vs. 35.4%).


31


Por otro lado, y a pesar de la etapa previa de ultrasonidos, la extracción de

ácido rosmarínico no se logró en ninguna de las plantas estudiadas. Evidentemente, es

necesario emplear mayores cantidades de cosolvente polar y, posiblemente, mayores

densidades de CO2 para recuperar ácido rosmarínico mediante SFE.

Tabla 10. Extracción combinada US-SFE.

Planta CO2 (g/min)

tiempo (min)

% etanol en el CO2

rend.

%

% peso

AC

% peso CAR

mg AC / mL etanol

Romero 60 210 3,81 11,48 23,69 2,86 18,12

Romero 30 180 4,44 15,03 23,15 2,70 23,19

Albahaca 60 180 4,44 2,47 - - -

Mejorana 60 180 3,33 4,61 - - -

Figura 7. Cromatograma del extracto US-SFE de romero (flujo de CO2 30 g/min)

(concentración 2,5 mg/ml)

4.1.4. Contenido de polifenoles totales de los extractos obtenidos de

romero, albahaca y mejorana con diferentes técnicas de extracción.

En las Tablas 11 y 12 se muestra los resultados obtenidos de la prueba de

polifenoles totales realizada con el método Folin-Ciocalteu de los extractos obtenidos de

las hojas de romero, albahaca y mejorana con las diferentes técnicas de extracción.

Para el caso del romero el resultado más alto en concentración de polifenoles totales


32


corresponde a la extracción realizada con fluidos supercríticos con etanol como

cosolvente (aproximadamente un 5% de etanol) con un valor del 0,25 mg de ácido

gálico por mg de muestra; los datos obtenidos para la US-SFE son ligeramente menores.

Asimismo, se observa una correlación entre el valor FOLIN resultante y el contenido de

antioxidantes determinado para las distintas muestras. Para completar este estudio se

determinará la actividad antioxidante de los distintos extractos.

Los valores FOLIN obtenidos para las hojas de albahaca son de la misma

magnitud tanto en la extracción UAE, SFE con etanol cosolvente y US-SFE. En

cambio, para la mejorana el valor más alto corresponde al extracto US-SFE con un total

del 0,16 mg de A. gálico / mg muestra. Por otro lado, los valores FOLIN de los

extractos de romero son mayores que los de mejorana, y éstos mayores que los de

albahaca. Esto concuerda con el orden de actividad antioxidante (romero > mejorana >

albahaca) determinada en el grupo de investigación para extractos ASE obtenidos para

estas variedades de plantas utilizando distintos disolventes. Nuevamente, se observa que

se completará el estudio que se presenta en esta memoria cuantificando por distintos

métodos la actividad antioxidante de los extractos obtenidos.

Tabla 11. Comparación de polifenoles totales de los extractos de hojas de

romero obtenidos por SFE con etanol cosolvente y US-SFE.

Planta

Técnica

Absorbancia a 760nm

Concentración mg de A. gálico /

mg muestra (FOLIN)

% peso antioxidantes

(AC + CAR + AR)

Romero

SFE con etanol cosolvente ( ≈ 5%)

0,903 0,25 35,41

US-SFE caudal CO2 30 g/min

0,687 0,20 26,55

US-SFE caudal CO2 60 g/min

0,731 0,21 25,85


33


Tabla 12. Comparación de polifenoles totales de los extractos de hojas de

albahaca y mejorana obtenidos por SFE con etanol cosolvente y US-SFE.

4.2. DISCUSIÓN

En general, en relación al tipo de técnica, los extractos resultantes de los

diferentes métodos con extracción supercrítica tienen siempre rendimientos inferiores

en relación a las técnicas de extracción sólido-líquido, ASE y ultrasonidos, para todas

las variedades de plantas estudiadas.

En cuanto a los rendimientos de extracción de hojas de romero el Gráfico 1

compara los resultados obtenidos para todos los ensayos. El rendimiento ASE es,

incuestionablemente superior a todos los demás, con un total de 63,83 %. Analizando

los rendimientos donde interviene la extracción supercrítica, la extracción combinada

US-SFE es la que presenta los rendimientos más altos.

En cuanto a las extracciones de albahaca y mejorana, las conclusiones son

similares a las del romero; el rendimiento de extracción de las dos plantas son los más

altos para la extracción ASE con valores de 14,9 y 39,25% respectivamente como se

muestra en la Gráfico 2. Por otro lado, sólo en el caso de la mejorana la extracción

combinada US-SFE presenta mejores rendimientos que la SFE con etanol cosolvente,

tal cómo se observó para el romero. Para la extracción de albahaca, la etapa previa de

Planta

Técnica

Absorbancia a 760nm

Concentración mg de A. gálico / mg muestra

Albahaca

UAE (30 min) 0,331 0,11


0,387 0,12

US-SFE caudal CO2 60g/min

0,357 0,11

Mejorana

UAE (30 min) 0,275 0,09


0,412 0,13

US-SFE caudal CO2 60g/min

0,534 0,16

Efecto del uso de ultrasonidos en la extracción de plantas labiadas combinando

0

SLE

ASE

UAE (30 min)

UAE materia remanente

SFE

SFE cosolvente etanol

US-SFE CO2 60g/min

US-SFE CO2 30g/min

% Rendimiento de hojas de romero

SLE

ASE

UAE (30 min)


SFE

SFE cosolvente (etanol)

US-SFE flujo CO2 60g/min

0

% Rendimiento de hojas de albahaca y mejorana con diferentes

ultrasonidos no es capaz de producir un incremento de los rendimie

supercrítica.

Gráfico 1. Rendimiento de extracción de hojas de romero

officinalis L.

Gráfico 2. Rendimiento de hojas de albahaca

(Origanum majorana)



10 20 30 40 50

% Rendimiento de hojas de romerocon diferentes técnicas de extracción.

5 10 15 20 25 30 35 40

% Rendimiento de hojas de albahaca y mejorana con diferentes técnicas de extracción.

de producir un incremento de los rendimientos de extracción

Rendimiento de extracción de hojas de romero (Rosmarinus

officinalis L.) con diferentes técnicas de extracción.

Rendimiento de hojas de albahaca (Ocimum basilicum)

(Origanum majorana) con diferentes técnicas de extracción.


34

supercrítico

60 70

con diferentes técnicas de

40

% Rendimiento de hojas de albahaca y mejorana con diferentes

Mejorana

Albahaca

ntos de extracción

Rosmarinus

(Ocimum basilicum) y mejorana

con diferentes técnicas de extracción.


SLE

ASE

UAE (30 min)



US-SFE (flujo CO2 60g/min)

US-SFE (flujo CO2 30g/min)

Concentración de ácido carnósico en extractos de romero

% peso ácido carnósico

Con respecto a la recuperación de compuestos fenólicos el Gráfico 3 compara

los resultados para el ácido carnósico (AC) en los extractos de romero, y el Gráfico 4

para el ácido rosmarínico (AR) en las tres variedade

En el caso de la SLE de romero, el % en peso de AC obtenido tiene un valor

intermedio (12,36%) en comparación con el resto de las técnicas de extracción

analizadas; pero este porcentaje en relación a la cantidad de etanol empleado

resultado más bajo (0,3 mg AC / mL etanol) como se muestra en el Gráfico 3. Esto

significa que la técnica requiere un alto consumo de etanol, con una relación de etanol

utilizada en este trabajo de 100 ml / g planta.

evaporación y recuperación del disolvente para su reciclado demandan minimizar el

consumo de disolvente. En este sentido,

carnósico del romero, en la extracción ASE se obtuvo un total de 1,5

carnósico / mL etanol (aunque el % peso era tan solo de 4,63%) mejorando

considerablemente el consumo de etanol con respecto a la extracción sólido

Gráfico 3. Concentración y recuperación de ácido carnósico en los extractos de romero

obtenidos



0 5 10 15 20 25

SLE

ASE

UAE (30 min)



SFE (flujo CO2 60g/min)

SFE (flujo CO2 30g/min)

Concentración de ácido carnósico en extractos de romero de distintas técnicas de extracción.

% peso ácido carnósico mg ácido carnósico/ml etanol



para el ácido rosmarínico (AR) en las tres variedades de planta estudiadas.



analizadas; pero este porcentaje en relación a la cantidad de etanol empleado



utilizada en este trabajo de 100 ml / g planta. Los costos adicionales que


consumo de disolvente. En este sentido, con respecto a la recuperación de ácido

carnósico del romero, en la extracción ASE se obtuvo un total de 1,5

arnósico / mL etanol (aunque el % peso era tan solo de 4,63%) mejorando

considerablemente el consumo de etanol con respecto a la extracción sólido

Concentración y recuperación de ácido carnósico en los extractos de romero

obtenidos mediante distintas técnicas de extracción.


35

supercrítico

30 35

Concentración de ácido carnósico en extractos de romero



s de planta estudiadas.



analizadas; pero este porcentaje en relación a la cantidad de etanol empleado presenta el



Los costos adicionales que significan la


con respecto a la recuperación de ácido

carnósico del romero, en la extracción ASE se obtuvo un total de 1,5 mg ácido

arnósico / mL etanol (aunque el % peso era tan solo de 4,63%) mejorando

considerablemente el consumo de etanol con respecto a la extracción sólido-líquido.

Concentración y recuperación de ácido carnósico en los extractos de romero


0

SLE

ASE

UAE (5 min)

UAE (30 min)


Concentración de ácido rosmarínico en extractos de romero, albahaca y mejorana obtenidos con diferentes técnicas de

En el caso de los resultados obtenidos en la SFE de hojas romero

de extracción aumenta significativamente de 4,52% a 7,99% al utilizar etanol como

cosolvente. Así, el incremento es alrededor de un

carnósico / g planta; los valores han pasado de 4,92 a 24,29 mg/g, es decir,

prácticamente se ha quintuplicado el total de ácido carnósico presente en el extracto

final. Al combinar la extracción supercrítica con una etap

SFE) el aumento de rendimiento es aún mayor, como era de esperar, ya que la técnica

de ultrasonidos favorece la liberación de analitos de las células vegetales, tal como se

mencionó anteriormente. En este caso los rendimientos son 11,48% y 15,03% para

extracciones con flujos de CO

reducción del flujo de CO

prima. Este resultado puede deberse a una solubilización más lenta del etanol en el CO

supercrítico que, a su vez, favorece la extracción de analitos. Por otro lado, aunque el %

en peso de AC es mayor en la SFE con etanol los resultados finales de mg AC / mL

etanol son considerablemente mayore

Gráfico 4. Concentración

albahaca y mejorana obtenidos con diferentes técnicas de extracción.



0 1 2 3 4

Concentración de ácido rosmarínico en extractos de romero, y mejorana obtenidos con diferentes técnicas de

extracción

Mejorana Albahaca Romero

En el caso de los resultados obtenidos en la SFE de hojas romero


cosolvente. Así, el incremento es alrededor de un 75% en cuanto a los mg ácido



final. Al combinar la extracción supercrítica con una etapa previa de ultrasonidos (US

el aumento de rendimiento es aún mayor, como era de esperar, ya que la técnica



iones con flujos de CO2 de, respectivamente, 60 y 30 g/ min; es decir una

reducción del flujo de CO2 mejoró la recuperación del ácido carnósico de la materia

prima. Este resultado puede deberse a una solubilización más lenta del etanol en el CO

ico que, a su vez, favorece la extracción de analitos. Por otro lado, aunque el %


etanol son considerablemente mayores para las extracciones US-SFE.

Concentración de ácido rosmarínico (% en peso) en extractos de romero



36

supercrítico

5 6

Concentración de ácido rosmarínico en extractos de romero, y mejorana obtenidos con diferentes técnicas de

En el caso de los resultados obtenidos en la SFE de hojas romero el rendimiento


75% en cuanto a los mg ácido



a previa de ultrasonidos (US-

el aumento de rendimiento es aún mayor, como era de esperar, ya que la técnica



de, respectivamente, 60 y 30 g/ min; es decir una

mejoró la recuperación del ácido carnósico de la materia

prima. Este resultado puede deberse a una solubilización más lenta del etanol en el CO2

ico que, a su vez, favorece la extracción de analitos. Por otro lado, aunque el %


de ácido rosmarínico (% en peso) en extractos de romero



37


En cuanto al ácido rosmarínico (AR) la extracción ASE presenta las

concentraciones y recuperaciones más altas para las tres plantas analizadas (ver Gráfico

4), con % en peso de AR de 2,49; 2,88 y 5,29 para romero, albahaca y mejorana

respectivamente. Teniendo en cuanta el correspondiente rendimiento de extracción esto

significa 15,89; 4,29 y 20,76 mg AR / g planta. Este resultado se debe no sólo a la

polaridad del disolvente utilizado (que es el mismo que se utilizado en las otras

técnicas) sino también a la posibilidad de aplicar altas temperaturas en esta técnica de

extracción.

Si bien uno de los objetivos planteados en el uso combinado de ultrasonidos con

la extracción supercrítica ha sido la recuperación de ácido rosmarínico, en ninguno de

los tratamientos donde interviene la SFE fue posible su extracción, por lo que es

necesario continuar la investigación analizando otras variables (por ejemplo, mayor

cantidad de etanol y/o mayor densidad de CO2) y procedimientos combinados en los

métodos de extracción.

Conclusiones

38


5. CONCLUSIONES

Conclusiones

39


5. Conclusiones

� Se ha obtenido resultados positivos en la extracción supercrítica de hojas de

romero combinada con una etapa previa de ultrasonidos (US-SFE) en lo

que se refiere la optimización de la cantidad de etanol empleada en el

proceso, la concentración de antioxidantes en el extracto y el rendimiento

de extracción.

Los mg de ácido carnósico (AC) extraídos por mL de etanol consumido aumentan

en el siguiente orden: 0,3 para la SLE, 1,6 para ASE y UAE, 5,0 para SFE con CO2

puro, 12,4 en la SFE con etanol cosolvente, y 23,2 en la extracción combinada US-SFE.

Es decir, la US-SFE duplica prácticamente la recuperación de AC por mL de etanol

consumido respecto de la SFE con cosolvente.

En cuanto a la concentración de antioxidantes en los extractos de romero, el % en

peso de ácido carnósico + carnosol + ácido rosmarínico sigue el siguiente orden: 8,4%

en ASE, un 16% en SLE y UAE, 20% en SFE con CO2 puro y fraccionamiento del

extracto, 25,9% en US-SFE y 35,4 en SFE con cosolvente.

Y los rendimientos globales de extracción: 63,8% para la extracción ASE, 25,6%

UAE, 20,7% SLE, 15% US-SFE, 8% SFE con cosolvente y 3% en SFE con CO2 puro y

fraccionamiento del extracto. Es decir, el rendimiento US-SFE es el doble que en la

SFE con cosolvente y 5 veces mayor que en la SFE con CO2 puro y fraccionamiento del

extracto, logrando también un alta concentración de antioxidantes.

Evidentemente, la extracción supercrítica es más selectiva que las otras técnicas para la

extracción de ácido carnósico del romero y los efectos físicos como turbulencia,

aglomeración de partículas y la alteración de la célula que producen los ultrasonidos

favorece la liberación de ácido carnósico de la matriz vegetal, que luego es más

fácilmente extraído con CO2 supercrítico.

� También en el caso de la extracción de hojas la mejorana se ha obtenido

resultados positivos con la US-SFE.

Si bien los rendimientos de las extracciones supercríticas son, en general, mucho

menores que los de la extracción ASE, SLE o UAE, se observa en la US-SFE un

Conclusiones

40


incremento del rendimiento de extracción de un 47% referente al rendimiento obtenido

en la SFE con etanol cosolvente.

Además, los resultados del análisis de polifenoles totales indican que los extractos US-

SFE son los que tienen mayor contenido de compuestos fenólicos, con un total de 0,16

mg ácido gálico / mg extracto.

� En el caso de la extracción de hojas de albahaca la US-SFE no produce

ventaja alguna frente a las otras técnicas en lo que se refiere a rendimiento

o contenido de polifenoles totales.

Por el contrario, la US-SFE parece producir una pequeña disminución del rendimiento

de extracción respecto de la SFE con cosolvente, y el contenido de polifenoles totales es

similar en todos los extractos analizados.

� La extracción acelerada (ASE) con etanol es la técnica que resulta en la

mayor recuperación de ácido rosmarínico para todas las variedades de

plantas estudiadas. La extracción supercrítica (SFE) con CO2 puro, o

utilizando etanol como cosolvente, o combinada con ultrasonidos, no ha sido

capaz de extraer ácido rosmarínico de ninguna de las plantas labiadas

estudiadas. Esto puede afectar negativamente la calidad antioxidante de los

extractos obtenidos, puesto que el ácido rosmarínico es reconocido como un

potente antioxidante. Por esto, para completar este estudio, se llevará a cabo la

determinación de la actividad antioxidante de los extractos utilizando distintos

métodos de análisis.

Bibliografía

41


6. BIBLIOGRAFÍA

Bibliografía

42


• Abas, F., Lajis, N. H., Israf, D. A., Khozirah, S., & Kalsom, Y. U. (2006).

Antioxidant and nitric oxide inhibition activities of selected Malay traditional

vegetables. Food Chemistry, 95(4), 566–573.

• Aneta Wojdyło, Jan Oszmianski, Renata Czemerys (2007). Antioxidant activity

and phenolic compounds in 32 selected herbs Food Chemistry 105940–949.

• Anna Menaker, Marina Kravets, Mihkel Koel, Anne Orav (2004). Identification

and characterization of supercritical fluid extracts from herbs. C. R. Chimie 7

629-633.

• Azuola Rocío, Vargas Pedro (2007). Extracción de sustancias asistida por

ultrasonido (EuA). Tecnología en Marcha. Vol. 20-4 - Octubre - Diciembre P.

30-40

• Baratta, M. T.; Dorman, H. J. D.; Deans, S. G.; Figueiredo, A. C.; Barroso, J. G.;

Ruberto, G. (1998) Antimicrobial and antioxidant properties of some

commercial essential oils. FlaVour Fragr. J. 13, 235-244.

• Bauer, K., Garbe, D., & Surburg, H. (1990). Common fragrance and flavor

materials (pp. 163). Weinheim: VCH.

• Bergman M., Perelman A., Dubinsky Z., Grossman S., (2003). Scavenging of

reactive oxygen species by a novel glucurinated flavonoid antioxidant isolated

and purified from spinach. Phytochemistry, 62, 753-762.

• B. Simandi, M. Oszagyan, E. Lemberkovics, A. Kery, J. Kaszacs, F. Thyrion, T.

Matyas (1998). Food Res. Int. 31 724

• Cai YZ, Sun M, Xing J, Luo Q, Corke H. (2006). Structure–radical scavenging

activity relationships of phenolic compounds from traditional Chinese medicinal

plants. Life Sciences 78(25): 2872 – 2888.

• Charai, M.; Mosaddak, M.; Faid, M. Chemical Composition and Antimicrobial

Activities of Two Aromatic Plants: Origanum majorana L. and O. compacyum

Benth. J. Essent. Oil Res. (1996), 8, 657-664.

• Djeridane, A., Yousfi, M., Nadjemi, B., Boutassouna, D., Stocker, P., & Vidal,

N. (2006). Antioxidant activity of some Algerian medicinal plants extracts

containing phenolic compounds. Food Chemistry, 97, 654–660.

Bibliografía

43


• Eileen M. Kwee, Emily D. Niemeyer Variations in phenolic composition and

antioxidant properties among 15 basil (Ocimum basilicum L.) cultivars Food

Chemistry 128 (2011) 1044–1050.

• Etter, S.C., (2005). Rosmarinus officinalis as an antioxidant. Journal of Herbs

Spices and Medicinal Plants 11 (1), 121–159.

• Gao, X., Ohlander, M., Jeppsson, N., Bjo¨ rk, L., & Trajkovski, V. (2000).

Changes in antioxidant effects and their relationship to phytonutrients in fruits of

sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) during maturation. Journal of the

Agricultural and Food Chemistry, 48, 1485–1490.

• G. Vicente, S. Molina, M. González-Vallinas, M.R. García-Risco, T. Fornari, G.

Reglero, A.R. Molina, (2010) Supercritical rosemary extracts, their antioxidant

activity and effect on hepatic tumor progression, The Journal of Supercritical

Fluids.

• Guenther, E. Oil of Marjoram. In The Essential Oils; D. Van Nostrand Comput:

New York, 1949; Vol. III, pp 519-545.

• Harsh, P. B., Walker, T. S., Schweizer, H. P., & Vivanco, J. M. (2002). Root

specific elicitation and antimicrobial activity of rosmarinic acid in hairy root

culture of Ocimum basilicum. Plant Physiology and Biochemistry, 40(11), 983–

995.

• H. Esaki, H. Onozaki, Y. Morimitsu, S. Kawakishi, T. Osawa, Potent

antioxidative isoflavones isolated from soybeans fermented with Aspergillusi

isaitoii, Biosci. Biotechnol. Biochem. 62 (1998) 740.

• Ibáñez L., Kubátová A., Señoráns F. J., Cavero S., Reglero G., Hawthorne S. B.,

2003. Subcritical water extraction of antioxidant compounds from rosemary

plants. J. Agric. Food Chem., 51, 375-382.

• Javanmardi, J., Stushnoff, C., Locke, E., & Vivanco, J. M. (2003). Antioxidant

activity and total phenolic content of Iranian Ocimum accessions. Food

Chemistry, 83(4), 547–550.

• Jayasinghe, C., Gotoh, N., Aoki, T., & Wada, S. (2003). Phenolics composition

and antioxidant activity of sweet basil (Ocimum basilicum L.). Journal of

Agriculture and Food Chemistry, 51 (15), 4442–4449.

Bibliografía

44


• Jean-Claude Chalchat, Mehmet Musa Ozcan Comparative essential oil

composition of flowers, leaves and stems of basil (Ocimum basilicum L.) used

as herb Food Chemistry 110 (2008) 501–503

• Kähkönen, M. P., Hopia, A. I., Vuorela, H. J., Rauha, J.-P., Pihlaja, K., Kujala,

T. S., et al. (1999). Antioxidant activity of plant extracts containing phenolic

compounds. Journal of the Agricultural and Food Chemistry, 47, 3954–3962.

• Kokkini, S. Herbs of the Labiatae - Marjoram. In Encyclopaedia of Food

Science, Food Technology and Nutrition; Macrae, R., Robinson, R. K., Sadler,

M. J., Eds.; Academic Press: London, U.K., 1993; Vol. 4, p 2345.

• M.C. Díaz-Maroto, M.S. Pérez-Coello, M.D. Cabezudo, J. Chromatogr. A 947

(2002) 23.

• L.A.F. Coelho, J.V. Oliveira, S.G. d’A´ vila, The effects of temperature and

solvent density on the characteristics of the extracts from SCFE of rosemary oil,

Braz. J. Chem. Eng. 13 (1996) 51.

• Lee, S. J., Umano, K., Shibamoto, T., & Lee, K. G. (2005). Identification of

volatile components in basil (O. basilicum L.) and thyme leaves (Thymus

vulgares L.) and their antioxidant properties. Food Chemistry, 91, 131–137.

• Maeda N., Yoshida H., Mizushina Y., 2010. Spinach and Health: Anticancer

Effect. In: Elsevier (ed.), Bioactive Foods in Promoting Health: Fruits and

Vegetables, 393-405, London, UK.

• Milan Suhaj. Spice antioxidants isolation and their antiradical activity: a review.

Journal of Food Composition and Analysis 19 (2006) 531–537.

• Muñoz A., Ramos F. Componentes fenólicos de la dieta y sus propiedades

biomedicinales. Revista Horizonte Médico. Volumen 7, N° 1, Junio (2007) 23-

31.

• Napoli M. E., Curcuruto G., Ruberto G., 2010. Screening of the essential oil

composition of wild Sicilian rosemary. Biochem. Syst. Ecol., 38, 659-670.

• Nykanen, I. High-resolution gas chromatographic-mass spectrometric

determination of the flavour composition of marjoram (Origanum majorana L.)

cultivated in Finland. Z. Lebensm Unters Forsch. 1986, 183, 172-176.

• Patrícia F. Leal & Nilson B. Maia & Quirino A. C. Carmello & Rodrigo R.

Catharino & Marcos N. Eberlin & M. Angela A. Meireles Sweet Basil (Ocimum

Bibliografía

45


basilicum) Extracts Obtained by Supercritical Fluid Extraction (SFE): Global

Yields, Chemical Composition, Antioxidant Activity, and Estimation of the Cost

of Manufacturing Food Bioprocess Technol (2008) 1:326–338

• Perez-Guitiérrez, R. M., Perez-Gutiérrez, S., Perez-Gonzalez, C., Zavala, M. A.,

& Perez, C. (1992). Action of extracts from some Mexican plants on the

cardiovascular-system. Phyton: Revista Internacional de Botânica Experimental,

53(2), 111–116.

• P.F. Leal, N.B. Maia, Q.A.C. Carmello, R.R. Catharino, M.N. Eberlin, M.A.A.

Meireles, Food Bioprocess. Technol. 1 (2008) 326.

• Rodríguez-Bernaldo de Quirós A., Costa H. S., 2006. Analysis of carotenoids in

vegetable and plasma samples: A review. J. Food Compos. Anal., 19, 97–111.

• Sarer, E.; Scheffer, J. J. C.; Svendsen, A. B. Monoterpenes in the Essential Oil

of Origanum majorana. Planta Med. 1982, 46, 236-239.

• S. Albu, E. Joyce, L. Paniwnyk, J.P. Lorimer, T.J. Mason. Potential for the use

of ultrasound in the extraction of antioxidants from Rosmarinus officinalis for

the food and pharmaceutical industry. Ultrasonics Sonochemistry 11 (2004)

261–265.

• S.L. Sebastián, E. Ramos, E. Ibáñez, J.M. Bueno, L. Ballester, J. Tabera, G.

Reglero, Dearomatization of antioxidant rosemary extracts by treatment with

supercritical carbon dioxide, J. Agric. Food Chem. 47 (1998) 13.

• Temelli, F.; Braddock, R. J.; Chen, C. S.; Nagy, S. ACS Symp. Ser. 1988, 366,

109.

• Terpinc P., Bezjak M., Abramovic, H., 2009. A kinetic model of evaluation of

the antioxidant activity of several rosemary extracts. Food Chem., 115,

740−744.

• Tiziana Fornari, Gonzalo Vicente, Erika Vázquez, Mónica R. García-Risco,

Guillermo Reglero. Isolation of essential oil from different plants and herbs by

supercritical fluid extraction. Journal of Chromatography A, 1250 (2012) 34–48

• Tiziana Fornari, Alejandro Ruiz-Rodriguez, Gonzalo Vicente, Erika Vazquez,

Monica R. Garcia-Risco, Guillermo Reglero. Kinetic study of the supercritical

CO2 extraction of different plants from Lamiaceae family. J. of Supercritical

Fluids 64 (2012) 1– 8

Bibliografía

46


• Tsimogiannis DI, Oreopoulou V. 2006. The contribution of flavonoid C-ring on

the DPPH free radical scavenging efficiency. A kinetic approach for the 3',4'-

hydroxy substituted members. Innovative Food Science and Emerging

Technologies 7(2): 140 – 146.

• Tsuda H, Ohshima Y, Nomoto H, Fujita K, Matsuda E, Iigo M, Takasuka N,

Moore MA. 2004. Cancer prevention by natural compounds. Drug Metabolism

and Pharmacokinetics 19(4): 245 – 263.

• Vagi E., Simandi B., Suhajda A., Hethelyi E. Essential oil composition and

antimicrobial activity of Origanum majorana L. extracts obtained with ethyl

alcohol and supercritical carbon dioxide. Food Research International 38 (2005)

51–57.

• Vera, R. R.; Chane-Ming, J. Chemical composition of the essential oil of

marjoram (Origanum majorana L.) from Reunion Island. Food Chem. 1999, 66,

143-145.

• Yamasaki, K., Nakano, M., Kawahata, T., Mori, H., Otake, T., Ueba, N., et al.

(1998). Anti-HIV-1 activity of herbs in Labiatae. Biological & Pharmaceutical

Bulletin, 21(8), 829–833.

• Zaouali Y., Bouzaine T., Boussaid M., 2010. Essential oils composition in two

Rosmarinus officinalis L. varieties and incidence for antimicrobial and

antioxidant activities. Food Chem. Toxicol., 48, 3144-3152.

INTERNET

• Plantas labiadas http://es.wikipedia.org/wiki/Lamiaceae

• Nuevas técnicas de preparación de la muestra F. Javier Señoráns Área de

Tecnología de Alimentos

http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/alimento/Tema-JS-AAAL-

NewPrepM.pdf

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Trabajo de Fin de Máster Sandra Gabriela Barrazueta …repositorio.educacionsuperior.gob.ec/bitstream/28000/267/1/T... · La composición química del aceite esencial de romero varía