Upload
prasetyo-hadi-nugroho
View
120
Download
10
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Tugas Kimed Cyclopamine - Kelompok 4
Citation preview
TUGAS KIMIA MEDISINAL
MAKALAH CYCLOPAMINE SEBAGAI OBAT KANKER
Disusun oleh:
Wenny Zuricha Z. 260110100106
Anggita Sekarsari 260110100107
Intan Mutiara Sari 260110100108
Hanifa Rozanah 260110100109
Prasetyo Hadi N. 260110100110
Raden Bayu Indradi 260110100112
Willi Tri Andika 260110100113
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
BANDUNG
2013
1. Sejarah Penemuan Obat Cyclopamine
Pada pertengahan abad ke-20, anak-anak kambing pada peternakan-
peternakan di negara bagian Idaho lahir dengan cacat kraniofacial yang parah. Anak-
anak kambing yang baru lahir di daerah Idaho terinfeksi hingga 25%. Tingkat
keparahan cacat ini disebut holoprosencephaly yang bervariasi dari ekstrim cyclopia
(hanya satu mata ditempatkan langsung di dahi, disertai dengan kelainan otak) hingga
rahang atas yang agak pendek. Cacat lebih parah lagi yaitu tidak lengkap atau benar-
benar tak terbagi belahan otak juga penciuman dan saraf optik. Pengembala domba
yang terinfeksi meminta Departemen Pertanian untuk membantu ketika penyakit
telah mencapai endemik dan kerugian ekonomi tidak lagi ditoleransi. Lynn F. James,
salah satu ilmuwan yang diutus, tinggal bersama domba selama tiga musim panas di
akhir 1950-an dan menemukan bahwa pada saat kekeringan domba pindah ke tempat
yang lebih tinggi dan merumput pada tempat dengan bunga veratrum californicum
yang tumbuh melimpah. Richard F. Keeler dari Laboratorium Penelitian Tanaman
Beracun kemudian tahu hubungan antara konsumsi veratrum californicum oleh
domba hamil dan kejadian cyclopia dalam keturunan mereka. Dengan makan
veratrum californicum, menunjukkan bahwa cacat domba hamil tersebut diinduksi
dari hari ke-14 kehamilan dan kehamilan itu diperpanjang hingga 87 hari (masa
kehamilan domba sehat adalah 147-152 hari)
Veratrum californicum, juga dikenal sebagai semacam tumbuhan California
yang salah satunya adalah tumbuhan lili dari family melanthiaceae yang asli dari
belahan bumi utara tetapi terutama berlimpah di daerah pegunungan barat Amerika
Serikat.
2. Identifikasi Target Obat & Target Penyakit
Cyclopamine mempunyai aktivitas baik sebagai antitumor maupun
teratogenik. Kemampuannya ini secara khusus menghambat respon seluler terhadap
jalur sinyal Hedgedog vertebrata. Jalur sinyal Hedgedog vertebrata memiliki peran
penting dalam mengontrol pertumbuhan, terutama selama proses perkembangan,
tetapi seringkali aktif berlebih dalam pembentukan tumor.
Penerimaan sinyal Hh, yang melibatkan transmembran multipass (TM),
protein Patched (PTCH) dan smoothened (Smo). Selama proses sinyal Hh normal,
protein Hh mengikat ke PTCH, sehingga menurunkan penekanan PTCH – mediasi
dari Smo, sebuah jarak relatif reseptor G-protein-coupled (GCPRs). Aktivasi Smo
kemudian memicu serangkaian peristiwa intraseluler, berpuncak pada aktivasi
transkripsi Gli – dependent.
Cyclopamine berperan mengganggu sinyal pada peristiwa tersebut dengan
mempengaruhi fungsi Smo, sebagai antagonizes Hh aktivitas jalur secara PTCH-
independen dan melemahkan potensi terjadinya onkogenik, dengan mengangakat
bentuk aktif dari Smo.
3. Membuat Prosedur Uji
Reaksi utama yang mendasari biosintesis senyawa Cyclopamine yang
merupakan senyawa alkaloid adalah reaksi mannich antara suatu aldehida dan suatu
amina primer dan sekunder, dan suatu senyawa enol atau fenol. Biosintesis alkaloid
juga melibatkan reaksi rangkap oksidatif fenol dan metilasi. Jalur poliketida dan jalur
mevalonat juga ditemukan dalam biosintesis alkaloid.
Kebanyakan alkaloid diendapkan dari larutan netral atau asam oleh sejumlah
reagen yang mengandung logam berat seperti merkuri (Hg) platina (Pt), bismuth (Bi)
dan emas (Au), dengan membentuk ikatan garam dengan mereka
Untuk memperoleh cyclopamine secara tepat dan banyak dilakukan dengan
mengisolasi cyclopamine dari tumbuhan Veratum californicum. Akar dari tumbuhan
dibasahi dengan 5% ammonia tersebut dikeringkan terlebih dahulu sampai benar-
benar kering. Kemudian cyclopamine dibiarkan pada suhu ruangan benzena.
Penyimpanan dilakukan pada suhu 00C selama beberapa bulan sampai campuran
alkaloid mengkristal.
Pemurnian dilakukan dengan beberapa langkah rekristalisasi untuk
memberikan hasil sekitar 320 mg per kilogram kering akar. Oleh karena kebutuhan
kita untuk cyclopamine dibutuhkan jumlah yang signifikan, dibutuhkan skala besar
praktis skema isolasi. Untuk mengisolasinya digunakan ekstraktor sohxlet karena
dirasa lebih efisisen untuk menghasilkan jumlah cyclopamine yang cukup besar.
Analisis kromatografi cair - spektrometri massa (LC-MS) menunjukkan kemanjuran
metode ini. Metode baru ini menunjukkan bahwa sedikit cyclopamine yang tetap
berada didalam material tumbuhan setelah ekstraksi soxhlet mencapai sepuluh siklus.
Prosedur ekstraksi ini juga memungkinkan untuk penentuan kuantitatif cyclopamine
dari sumber alami. LC-MS secara kuantitatif menunjukkan bahwa akar dari Veratrum
californicum berisi 2,34 g cyclopamine per kg bahan tanaman kering. Ekstraksi yang
dilakukan menggunakan dua ekstraktor soxhlet dihubungkan dengan dengan mantel
pemanas, dengan benzena sebagai pelarut.
Teknik soxhlet digunakan karena teknik ini merupakan suatu teknik ekstraksi
berulang yang sangat efisien untuk digunakan. Hal ini dikarenakan pelarut yang telah
membawa zat yang terekstrak, diuapkan, kemudian didinginkan, sehingga dapat
digunakan lagi. Pelarut benzena digunakan dalam proses isolasi ini karena bila dilihat
dari strukturnya cyclopamine merupakan suatu senyawa organik yang dapat larut
dalam benzena.
Langkah berikutnya dalam proses adalah untuk mengisolasi cyclopamine dari
volume besar benzena. Ini dilakukan dengan melewatkan seluruh larutan benzena
melalui kolom gelas yang diisi dengan silika gel. Analisis silika gel kromatografi
lapisan tipis (TLC) menunjukkan bahwa benzena merupakan pelarut yang tidak
cukup kuat untuk memindahkan alkaloid dari titik asal. Ini secara efektif
memungkinkan untuk menjebak semua cyclopamine dari larutan benzena. Untuk
tujuan ini, benzena dari kedua soxhlet telah ditambahkan ke puncak kolom silika gel
dilengkapi dengan alat vakum untuk mempercepat pemisahan.
Di vakum penyaringan volume benzena melewati kolom selama 45 menit.
Proses ini menghasilkan alkaloid tanaman yang terkonsentrasi (termasuk
cyclopamine) di bagian atas kolom. Sebuah keuntungan luar biasa dari metode ini
adalah bahwa benzena yang mengalir berisi begitu sedikit bahan dan bisa digunakan
kembali berkali-kali sebelum langkah untuk pemurnian dengan redestilasi diperlukan.
Untuk mempercepat kromatografi, kolom ini terhubung ke sumber vakum untuk
menarik pelarut melalui kolom. Elusi dari alkaloid ini dilakukan dengan
menggunakan langkah gradient CH2Cl2-isopropanol (97:3), CH2Cl2 -isopropanol
(93:7), dan kemudian CH2Cl2-isopropanol (75:25). Penghilangan pelarut dari fraksi
semi-murni mengandung cyclopamine terkonsentrasi dengan pengurangan tekanan.
Rekromatografi ekstrak ini dimurnikan dengan menggunakan aliran silika gel dengan
etil asetat-iso-propanol-amonia (85:14:1) menghasilkan cyclopamine murni yang
cukup untuk dipadatkan oleh triturasi dengan aseton dingin.
Sampel cyclopamine dianalisis melalui LC-electrospray ionisasi (ESI) yang
dihubungkan dengan spektrometri massa (MS / MS) pada sebuah perangkap ion
quadrupole spektrometer massa (LCQ Classic, Thermo-Finnigan, San Jose, CA)
digabungkan ke Hewlett - 1100 Packard sistem HPLC. Sebuah kolom fasa terbalik
1,2 × 100 mm xterra MS C-18 3,5 μm C-18 LC (Waters Corporation, Milford, MA)
juga digunakan. Cyclopamine mengalir selama 30 menit, gradien dimulai dengan
10% asetonitril, 0,2% asam format sampai 70% acetonitril, 0,2% asam format
mengalir dengan laju 100 μL / menit dan pasca-kolom 1:10 split. Larutan blanko
dianalisis antara sampel untuk membatasi carryover. Beberapa massa spektra juga
diperoleh baik di Waters Micromass Misa ZQ dilengkapi dengan detektor Waters 600
HPLC fotodioda pompa dan detektor array atau pada Thermo Quantum TSQ
Finnegan dilengkapi dengan Agilent 1100 seri sistem HPLC. Sistem HPLC ini
digunakan untuk menganalisis apakah benar senyawa yang telah diisolasi tersebut
merupakan cyclopamine yang benar-benar murni.
4. Mencari Lead Compound
Beberapa penelitian telah dilakukan untuk memperoleh “lead compound” dari
cyclopamine. Pertama, sintesis 17-asetil-5α - etiojerva-12 ,14,16-trien-13β-ol dari
bahan kimia sederhana telah dilaporkan oleh Johnson dkk. Kemudian Masamune,
dkk, melaporkan mengkonversi cyclopamine relatif jervine, di mana karbon-11
metilena di cyclopamine dioksidasi menjadi keton dalam jervine. Wolff-Kishner, juga
telah melaporkan suatu cara yaitu mereduksi jervine menghasilkan cyclopamine.
Namun menghasilkan hasil yang relatif rendah.
Oleh karena kebutuhan senyawa yang cukup besar untuk penelitian hewan
dan mamalia sehingga perlu dipikirkan suatu metode yang lebih efisien untuk
mengekstrak dan memurnikan senyawa cyclopamine dari akar Veratrum
californicum. Serta suatu cara untuk menganalisis karbon dan resonansi proton dari
cyclopamine.
5. Hubungan Aktivitas Struktur (SAR)
Dalam strukturnya, ternyata cyclopamine ini memiliki kelemahan antara lain
ketidakstabilan cyclopamine sendiri dari struktur C12-C13 double bond.
Sehingga dilakukan penelitian untuk mendapatkan struktur yang lebih baik
lagi yakni derivate dari cyclopamine. Derivate pertama yaitu KAAD-cyclopamine
dimana memiliki kelebihan yaitu memiliki kelarutan yang lebih baik dan
meningkatkan aktivitas biologi sekitar 10-20 lebih baik. Sampai sejauh mana ikatan
ganda nonconjugated di posisi C5-C6 ditransformasikan ke enon sesuai dalam
kondisi fisiologis masih belum diselidiki
Ada juga derivate lain yaitu D-homocyclopamine. Infinity Pharmaceuticals
menerbitkan pendekatan tahapan untuk derivatif D-homocyclopamine, yaitu derivatif
dengan tujuh cincin D. Derivatif ini tidak mewarisi ketidakstabilan cyclopamine,
karena aromatisasi oleh pembelahan sistem eter alil tidak dapat terjadi. Beberapa
turunan dari jenis ini telah disintesis dan dipatenkan, dan profil biologis mereka telah
ditentukan.
6. Identifikasi Farmakofor
Fitur Pharmacophoric adalah kode warna: hijau untuk kelompok akseptor ikatan
hidrogen (HBA1-3) dan biru untuk daerah hidrofobik (Hy1-3). Atom-atom dengan
kode warna: abu-abu: karbon, putih: hidrogen, merah: oksigen, biru: nitrogen dan
kuning: sulfur.
HBA1 dan HBA3 diisi oleh hidroksil dan atom oksigen heterosiklik, masing-
masing, sementara HY2 dan HY3 ditampung cincin jenuh beranggota enam pusat dan
kelompok metil pada inti piperazine, masing-masing. Baik Hy1 maupun HbA2 yang
dipasang oleh pharmacophore tersebut.
7. Desain Obat Untuk Pengoptimalan Interaksi Reseptor
Pada penelitian Hamon Florian tahun 2010. Prodrug glukuronida pertama dari
inhibitor sinyal Hedgedog cyclopamine telah disintesis. Derivatisasi karbamoil dari
cyclopamine secara signifikan menurunkan toksisitas terhadap U87 sel line
glioblastoma manusia. Ketika prodrug yang diinkubasi dengan β-glukuronidase
dalam media kultur, obat aktif secara efisien dirilis sehingga memulihkan aktivitas
antiproliferasinya.
Prodrug Glucuronide Cyclopamine
Pemecahan Cyclopamine-glucoronide menjadi Cyclopamine
Pada penelitian Martin et. al tahun 2008 melaporkan sintesis antagonis
Hedgedog dari cyclopamine, yang mana senyawa tersebut disebut herein. Asam
sensitif D-cincin cyclopamine tersebut homolog dengan berdasarkan penataan ulang
urutan cyclopropanasi kemoselektif dan stereoselektif asam-katalis. Modifikasi
lanjutan dari alkohol A / B-cincin homoalilik ke keton terkonjugasi menyebabkan
penemuan analog cyclopamine baru dengan sifat pengobatan ditingkatkan dan
potensi vitro (EC50) berkisar antara 10 sampai 1000 nM.
8. Drug Design-Optimizing Pharmacokinetic Properties
IPI-269.609 merupakan turunan pertama dari cylopamine yang kemudian
dikembangkan. Hal ini disebabkan karena cyclopamine menunjukkan afinitas yang
rendah dari Smo (Smoothened), biovailibilitas oral yang buruk , farmakokinetik
suboptimal , dan stabilitas metabolisme yang rendah.
IPI-926 merupakan analog semisintetik dari cyclopamine,yang secara
substansial meningkatkan potensi dan profil farmakokinetik terhadap cyclopamine,
kemudian dirancang dan disintesis. Dengan menggunakan model rekayasa genetika
yang dapat bekerja untuk mematikan kanker pankreas.
IPI-269609 menghambat metastasis sistemik di orthotopic xenografts yang
dibentuk dari jalur sel kanker pankreas manusia.
9. Toxicologycal & Safety Test
Pada beberapa penelitian cyclopamine pada domba, pengamatan efek
teratogenik diperlukan pada pemberian oral perhari 2-3 g / hewan (rata-rata berat
badan pada hewan 50 kg; 40-60 mg/kg). kebutuhan akan dosis tinggi yang
disebabkan karena sifat farmakokinetik atau potensi yang buruk, beberapa penelitian
terbaru menunjukkan beberapa pencerahan pada kedua aspek tersebut. Pada domba,
eliminasi waktu paruh pendek (1,1 ± 1 jam) diukur ketika garam tartrat cyclopamine
(1,6 mg / kg) diberikan secara intravena (iv). Sedangkan pada tikus, bioavailabilitas
oral cyclopamine (memberikan respon sebanyak 33% relatif terhadap intraperitonieal
untuk pengamatan ini). Hal ini menunjukkan kemungkinan buruknya pengamatan ini
terhadap sifat farmasetika.
Banyak tes seluler yang telah dikembangkan untuk mengevaluasi potensi
inhibitor jalur Hh. Cyclopamine menghambat proses Hh-dependent termasuk :
(a) Induksi HNF3B pada embrio ayam dengan pengujian lempeng saraf (IC50 pada
10 nM)
(b) Pengujian Gli-reporter
(c) diferensiasi c3H10T1/2 (IC50 pada 300-400 nM)
Sedangkan efek teratogenik dari cyclopamine dikaitkan dengan aktivitas on-
target pada Smo dan jalur Hh, adanya bukti bahwa cyclopamine mungkin tidak
sepenuhnya selektif. Konsentrasi tinggi pada cyclopamine (10 M) menunjukkan
adanya efek sitotoksik pada sel kanker yang tidak mengekspresikan Smo, hal ini
memperlihatkan bahwa efek yang diamati yaitu off- target.
10. Chemical Development & Production
Meningkatnya kebutuhan atas cyclopamine telah mengakibatkan peningkatan
jumlah derivat cyclopamine semisintetik. Semua struktur cyclopamine-like sampai
saat ini disintesis dari cyclopamine natural dengan modifikasi kimia dari produk
naturalnya. Karena belum ada jalur sintesis total untuk mendapatkan cyclopamine,
maka hingga saat ini belum ada cyclopamine dari hasil sintesis sintesis .
a. KAAD Cyclopamin
KAAD-Cyclopamine adalah derivate cyclopamine pertama yang menunjukkan
kelarutan yang lebih baik dan meningkatkan potensi biologis pada faktor 10 – 20,
didapatkan dalam lima langkah dari cyclopamine natural.
b. D-homocyclopamine
Infinity Pharmaceutical memublikasikan pendekatan tahapan-tahapan untuk
mendapatkan derivat D-homocyclopamine. Derivat ini tidak mewarisi sifat
ketidakstabilan cyclopamine, karena aromatisasi dengan pemotongan pada sistem alil
eter tidak dapat terjadi. Beberapa derivat dari sistem ini telah disintesis dan
dipatenkan., dan profil biologinya telah dideterminasi.
c. Analaog dari Turunan Estrone
Analog cyclopamine yang disederhanakan telah dipreparasi dari estrone
melalui empat tahapan oleh Winkler et al (2009). Struktur C-nor-D-homosteroid
dihilangkan, piridin digunakan pada tempat cincin piperidin, dan fenol digunakan
untuk menggantikan homoalil alkohol. Meskipun modifikasi ini mempunyai
pengaruh yang besar terhadap struktur, polaritas, dan keasaman, aktivitas biologi
masih tetap nyata.
11. Parenting and Regulatory Affairs Clinical Trials
Cyclopamine saat ini sedang diteliti sebagai agen pengobatan pada sel basal
carcinoma, medulloblastoma, rhabdomyosarcoma (tumor yang dihasilkan dari
aktivitas Hh berlebihan), glioblastoma , dan sebagai agen pengobatan untuk multiple
myeloma .
Studi menunjukkan bahwa cyclopamine berperan sebagai inhibitor utama
hedgehog signaling pathway dalam sel . Jalur ini di beri nama berdasarkan ligan
untuk protein sinyal yang digunakan oleh sel untuk membantu sel tersebut bereaksi
terhadap sinyal kimia eksternal . Jalur ini memiliki peranan penting dalam
perkembangan embrio, yang mana ketika jalur ini tidak berjalan dengan semestinya
dapat mengakibatkan cacat pada embrio. Aktivasi tidak semestinya dari jalur ini
dapat memicu kanker pada orang dewasa, yang dapat menyebabkan sel basal
carcinoma, kanker medulloblastoma, rhabdomyosarcoma, kanker prostat, pankreas,
dan payudara. Cyclopamine bekerja dengan mengendalikan jalur ini dalam mengobati
kanker.
Uji klinik cyclopamine dilakukan kepada pasien kanker, dengan melihat
aktivitas inhibisi terhadap hedgehog pathway. Dilihat juga efek farmakologi dari
cyclopamine, termasuk farmakodinamik, farmakokinetik, efek terhadap reseptor, efek
terapi dan efek samping dari cyclopamine tersebut. Selanjutnya dilihat metabolisme
dari cyclopamine dan organ-organ yang terlibat didalamnya, serta clearence dari
cyclopamine tersebut.
Derivatif cyclopamine IPI - 926 (juga dikenal sebagai saridegib) sedang
dalam tahap evaluasi uji klinis oleh Infinity Pharmaceuticals untuk pengobatan
berbagai jenis kanker. Infinity Pharmaceuticals melakukan uji IPI - 926 dengan
menggunakan gemcitabine (analog nucleoside yang digunakan dalam chemotherapy),
dibandingkan dengan plasebo gemcitabine. Infinity Pharmaceuticals Inc
menghentikan Tahap 2 studi dari target obat untuk mengobati kanker pankreas
metastatik, setelah hasil awal pengujian menunjukkan titik akhir tujuan kelangsungan
hidup secara keseluruhan tidak akan terpenuhi. Kombinasi IPI - 926 menunjukkan
tingkat penyakit lebih tinggi daripada kombinasi plasebo, sedangkan kombinasi
Infinity menunjukkan tingkat kelangsungan hidup rata-rata kurang dari enam bulan
jika dibandingkan dengan gemcitabine saja. Sehingga hasilnya di anggap tidak
efektif.
DAFTAR PUSTAKA
Hampn et al. 2010. Study of a cyclopamine glucuronide prodrug for the selective
chemotherapy of glioblastoma. European Journal of Medicinal Chemistry 45 :
1678-1682
Martin et al. 2008. Semisynthetic Cyclopamine Analogues as Potent and Orally
Bioavailable Hedgehog Pathway Antagonists. J. Med. Chem 51 (21): 6646–
6649.
Matthew , Herper . 2005 . The Curious Case of The One-Eyed Sheep. Available
online at http://www.forbes.com/global/2005/1128/066A.html [diakses
tanggal 9 November 2013].
Oatis, Jhon E. Jr, dkk. (2008). Isolation, Purification, and Full NMR Assignments of
cyclopamine from Veratrum californicum. Chemistry Central Journal,
[Online], Vol 2 (1), 12 halaman Tersedia :
http://journal.chemistrycentral.com/content/2/1/12 [11 November 2013]
Philipp, H , Lito ,T, and Athanassions , G. 2010. Cyclopamine and Hedgehog
signaling :Chemistry, Biology, Medical Perspectives. Angewandte Chemie
Int. Ed. 49. 2-12.
Underwood, A.L dan Day, R.A. (2002). Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta :
Erlangga