VALIDASI METODE HIGH PERFORMANCE LIQUID … · jenis sampel yang mengandung kafein seperti kopi, teh, minuman energi, dan formulasi farmasi mengandung obat dapat dianalisis menggunakan

VALIDASI METODE HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY (HPLC) FASE TERBALIK PADA PENETAPAN

KADAR KAFEIN DALAM KOPI BUBUK MURNI ROBUSTA MEREK “X”

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Maria Clara

NIM: 148114056

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2018

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

VALIDASI METODE HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY (HPLC) FASE TERBALIK PADA PENETAPAN

KADAR KAFEIN DALAM KOPI BUBUK MURNI ROBUSTA MEREK “X”

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Maria Clara

NIM: 148114056

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2018


ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Karya ini kupersembahkan kepada Tuhan Yesus Kristus dan Bunda Maria yang

selalu memberikan hal terbaik untukku. Kepada Papa, Mama, dan Adik sebagai

bentuk pencapaian atas segala doa dan dukungan. Kepada keluarga dan sahabat

setia yang selalu mendukung. Serta almamater Universitas Sanata Dharma.


v


vi


vii

PRAKATA

Syukur dan pujian penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas

segala berkat dan karunia-Nya sehingga penelitian dan penyusunan skripsi yang

berjudul “Validasi Metode High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Fase Terbalik pada Penetapan Kadar Kafein dalam Kopi Bubuk Murni Robusta

Merek X” telah selesai. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk

memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) di Fakultas Farmasi, Universitas

Sanata Dharma, Yogyakarta.

Selama proses penelitian berlangsung hingga selesai skripsi, penulis

mendapat banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu,

penulis ingin menyampaikan terimakasih kepada:

1. Ibu Aris Widayati, M. Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Ibu Dr. Sri Hartati Yuliani, Apt. selaku Ketua Program Studi Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

3. Ibu Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing yang telah

bersedia membimbing dengan segala kesabaran, dukungan, pengarahan, serta

saran selama proses penelitian hingga berakhirnya skripsi.

4. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt. selaku dosen penguji untuk segala

masukan, kritik, dan saran hingga skripsi ini tersusun.

5. Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc. selaku dosen penguji untuk

segala masukan, bimbingan, dukungan, dan saran hingga skripsi ini tersusun.

6. Ibu Melania Perwitasari, M.Sc., Apt., Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt., dan

Ibu Putu Dyana Christasani, M.Sc., Apt selaku Dosen Pembimbing Akademik

atas bimbingannya selama ini.

7. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt., selaku Kepala Penanggung Jawab

Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan izin penggunaan

laboratorium untuk kepentingan penelitian.

8. Laboran Mas Bimo, Pak Ketul, Pak Kayat, Pak Parlan, Mas Kunto yang baik

hati membantu, menemani, dan mendukung proses penelitian di laboratorium.


viii

9. Keluarga tercinta Papa Michael Dominicus Haryanto, Mama Septia Ping, dan

adik Christine Agnes yang selalu memberikan doa, dukungan, dan suka cita

setiap waktu.

10. Rekan istimewa pada penelitian ini, Yulius Denis Chrismaaji, untuk doa,

pengertian, dan bantuannya sehingga mampu melewati suka-duka proses

penelitian untuk menyelesaikan skripsi.

11. Rekan satu bimbingan “POLIMORFISME” yakni Maria Redita, Chintya

Halim, Yohana Alpionita, Petrus Febrian Widihantoro, Rabulas Nugroho,

Evan Julian, Jasvidianto Chriza, dan Dismas Adi Prabowo. Terima kasih atas

kerjasamanya.

12. Teman-teman FSM B 2014, serta sahabat/saudara terkasih yang mendukung:

Mbak Yokhe, Vincent, “Fant[4]stic” Marselly, Ham, dan Deni, “Enam Sejoli”

Momon, Anna, dan Ivon, “Sisterhood” Debby, Heppy, Eka, Fenny, Ranti,

Lenny, Devi, dan Maya, serta pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu per

satu.

Penulis menyadari bahwa masih terdapat kekurangan dalam penulisan

skripsi ini. Untuk hal tersebut, penulis mengharapkan saran dan kritik yang

membangun dari semua pihak. Akhir kata, semoga skripsi ini dapat berguna bagi

pembaca dan ilmu pengetahuan.

Yogyakarta, 8 Januari 2018

Penulis


ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ........................................................................................ i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. ii

HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ...................................................................... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .......................................................... v

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................................ vi

PRAKATA ....................................................................................................... vii

DAFTAR ISI .................................................................................................... ix

DAFTAR TABEL ............................................................................................ x

DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xi

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xii

INTISARI ......................................................................................................... xiii

ABSTRACT ....................................................................................................... xiv

PENDAHULUAN ........................................................................................... 1

METODE PENELITIAN ................................................................................. 3

HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................ 10

KESIMPULAN ................................................................................................ 19

SARAN ............................................................................................................ 19

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 20

LAMPIRAN ..................................................................................................... 22

BIOGRAFI PENULIS ………………………………………………………. 62


x

DAFTAR TABEL

Tabel I. Data resolusi kafein pada sampel kopi .................................................. 13

Tabel II. Data perolehan nilai AUC dari enam seri baku kafein ......................... 15

Tabel III. Data akurasi dan presisi baku kafein................................................... 17

Tabel IV. Data perolehan kembali adisi baku kafein .......................................... 18


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Kriteria penerimaan akurasi .............................................................. 9

Gambar 2. Kriteria penerimaan presisi ............................................................... 10

Gambar 3. Struktur molekuler kafein, C8H10N4O2, serta profil kromofor dan

auksokrom ........................................................................................................... 11

Gambar 4. Spektrum serapan larutan seri kafein konsentrasi 25, 30, dan 50

ppm pada pelarut air dan metanol (50:50) .......................................................... 12

Gambar 5. Reaksi kafein terhadap penambahan NaOH ...................................... 13

Gambar 6. Kromatogram kafein pada larutan baku 75 ppm (a), sampel kopi

tanpa adisi baku (b), dan sampel kopi dengan adisi baku kafein 75 ppm ........... 14

Gambar 7. Kurva baku kafein (Replikasi 3) ....................................................... 16

Gambar 8. Kurva rentang seri konsentrasi kafein ............................................... 18


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Sertifikat analisis standar kafein ..................................................... 22

Lampiran 2. Kemasan sampel kopi bubuk murni robusta................................... 23

Lampiran 3. Contoh perhitungan konsentrasi larutan kafein .............................. 24

Lampiran 4. Spektrum panjang gelombang maksimum kafein .......................... 25

Lampiran 5. Kromatogram pelarut aquabidestilata dan metanol ....................... 26

Lampiran 6. Kromatogram larutan seri baku kafein replikasi 1 ......................... 27



Lampiran 9. Kromatogram larutan seri baku kafein – data rentang ................... 45

Lampiran 10. Kromatogram larutan seri baku kafein – data akurasi dan

presisi ................................................................................................................. 51

Lampiran 11. Contoh perhitungan akurasi dan presisi........................................ 56

Lampiran 12. Kromatogram sampel kopi ........................................................... 57

Lampiran 13 Kromatogram sampel kopi adisi baku kafein 75 ppm ................... 59

Lampiran 14. Contoh perhitungan perolahan kembali ........................................ 61


xiii

INTISARI

Kafein termasuk alkaloid metil xantin yang ditemukan dalam kopi.

Senyawa ini dapat meningkatkan performa kerja seseorang sehingga banyak

diminati. Meskipun demikian, penggunaan kafein yang berlebihan dapat memicu

kelainan yang mempengaruhi sistem syaraf pusat, sehingga dibutuhkan penetapan

kadar kafein pada kopi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas metode

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) fase terbalik pada penetapan

kadar kafein dalam kopi bubuk murni robusta merek “X”.

Penelitian ini bersifat non-eksperimental deskriptif. Metode yang

digunakan yaitu High Performance Liquid Chromatography (HPLC) fase terbalik

dengan kolom oktadesil silika C18, komposisi fase gerak aquabidestilata : metanol

(50:50), kecepatan alir 1,0 mL/menit dan detektor UV 272 nm.

Parameter validasi yang diteliti meliputi selektivitas, linearitas, akurasi,

presisi, dan rentang. Hasil penelitian menunjukkan hasil selektivitas yang baik

dengan nilai resolusi (Rs) 2,293 dan linearitas yang baik dengan nilai koefisien

korelasi (r) 0,9956. Nilai akurasi dan koefisien variasi yang baik untuk baku kafein

pada konsentrasi 75 ppm dan 150 ppm secara berurutan adalah 102,606%; 1,789

dan 102,020%; 1,249. Rentang pengukuran yaitu pada konsentrasi 25-300 ppm.

Berdasarkan hasil tersebut, maka metode ini memiliki validitas yang baik untuk

penetapan kadar kafein dalam kopi bubuk murni robusta merek “X”.

Kata kunci: kafein, HPLC fase terbalik, validasi metode.


xiv

ABSTRACT

Caffeine is one of methyl xanthine alkaloid can be found in coffee. This

substance can enhancing someone’s performance, therefore most people like it.

However, the excessive of caffeine intake can influence central nervous system, so

it is necessary to determine caffeine in coffee. This study aims to validate the

reversed phase HPLC method for caffeine determination in “X” brand robusta

coffee.

This was a non-experimental descriptive research using reversed phase

HPLC method by using octadecyl silica C18 as the stationary phase, redistilled water

and methanol as the mobile phase (50:50), flow rate 1.0 mL/min and UV detector

272 nm.

Validity parameter observed included selectivity, linearity, range,

accuracy, and precision. Result of the study shows that the method has good

selectivity with the resolution (Rs) of 2.293 and a good linearity with correlation

coefficient (r) of 0.9959. Recovery value and coefficient variation for raw caffeine

at the concentration 75 ppm and 150 ppm were 102.606%; 1.789 and 102.020%;

1.249 respectively. Range of the measurement were 25-300 ppm. Based on the

result, it can be summed up that this method is valid to determine caffeine in “X”

brand robusta coffee.

Keywords: caffeine, reversed phase HPLC, validation method.


1

PENDAHULUAN

Kopi termasuk tanaman perkebunan yang biasa dikonsumsi dalam bentuk

minuman dan banyak digemari karena memiliki rasa serta aroma yang menarik

(Rizky dkk., 2015). Kopi dikenal sebagai sumber utama kafein yang mampu

meningkatkan performa kerja seseorang (Nawrot et al., 2003). Minuman kopi

diperoleh dari proses pengolahan biji tanaman kopi menjadi bubuk kemudian

diseduh (Hayati dkk., 2012; Rizky dkk., 2015). Kopi bubuk merupakan biji kopi

yang telah disangrai, digiling atau ditumbuk hingga menyerupai serbuk halus

(Hayati dkk., 2012). Terdapat beberapa varietas kopi yang dibudidayakan di

Indonesia yakni robusta, arabika, dan liberika (Oktadina dkk., 2013). Menurut

Anonim (2016) sebesar 80% luas areal pertanaman kopi di Indonesia merupakan

jenis kopi robusta dan mendominasi hasil produksi.

Senyawa kafein (1,3,7-trimetilxantin) termasuk jenis alkaloid yang banyak

terdapat di daun teh (Camellia sinensis L.), biji kopi (Coffea arabica L.), dan biji

coklat (Theobroma cacao) (Patil, 2012). Secara farmakologis, kafein dalam tubuh

mampu menstimulasi sistem syaraf pusat, stimulus otot jantung, dan relaksasi otot

polos bronkus (Chowdhury et al., 2012). Penggunaan kafein dalam jumlah berlebih

atau dosis tinggi justru dapat memicu beragam kelainan yang mempengaruhi sistem

syaraf pusat, sistem kardiovaskular, peningkatan sekresi lambung, penurunan

fungsi hati, serta menyebabkan kematian jika kafein dalam tubuh mencapai 10 gram

(Patil, 2012).

Dalam Surat Keputusan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan

Republik Indonesia Nomor HK.00.05.23.3644 tentang Ketentuan Pokok

Pengawasan Suplemen Makanan disebutkan bahwa dosis maksimum kafein adalah

150 mg/hari yang dibagi minimal dalam tiga dosis (BPOM RI, 2004). Artinya,

dalam satu kali konsumsi produk kopi mengandung tidak lebih dari 50 mg kafein

per sajian. Di Indonesia, terdapat berbagai macam bentuk sediaan produk kopi yang

beredar di pasaran. Produk kopi tersebut di antaranya kopi instan, kopi bubuk

murni, kopi dekafeinasi, maupun permen kopi. Permasalahan yang muncul adalah

produk kopi bubuk murni tersebut tidak mencantumkan besarnya kadar kafein pada


2

kemasan sehingga masyarakat tidak mengetahui perkiraan kadar kafein dalam satu

kali penyeduhan kopi, padahal kafein memiliki efek merugikan jika dikonsumsi

berlebihan. Salah satu upaya menghindari timbulnya efek yang tidak diharapkan

tersebut, maka perlu dilakukan penetapan kadar kafein untuk memastikan bahwa

kadarnya masih memenuhi batas konsumsi yang sudah ditentukan. Untuk

menjamin bahwa metode yang akan digunakan memberikan hasil pengukuran yang

dapat dipertanggungjawabkan, maka harus dilakukan validasi metode terlebih

dahulu (Sugihartini dkk., 2014). Validasi metode dilakukan dengan menilai

beberapa parameter yaitu selektivitas, linearitas, akurasi, presisi dan rentang.

Berdasarkan review artikel oleh Patil (2012), disebutkan bahwa berbagai

jenis sampel yang mengandung kafein seperti kopi, teh, minuman energi, dan

formulasi farmasi mengandung obat dapat dianalisis menggunakan sistem HPLC

fase terbalik. Metode tersebut digunakan karena dapat menentukan kadar kafein

dalam sampel kompleks. Oleh karena itu, pada penelitian ini juga menggunakan

metode HPLC fase terbalik.

Beberapa penelitian lain tentang analisis kafein dalam berbagai produk

juga telah banyak dilakukan. Penelitian oleh Chowdhury et al (2012) tentang

validasi metode HPLC fase terbalik pada penentuan kadar kafein dalam tablet

parasetamol-kafein dengan komposisi fase gerak air : metanol (60:40), kecepatan

alir 1,0 mL/menit, deteksi UV pada panjang gelombang 272 nm memberikan hasil

yang cepat, akurat, selektif, presisi dan sensitif. Selain itu, Agung (2017) telah

melakukan uji validasi metode bioanalisis kafein dengan instrumen kromatografi

cair kinerja tinggi fase terbalik menggunakan sampel plasma darah orang jawa

memberikan hasil optimal. Komposisi fase gerak yang digunakan adalah

aquabidestilata : metanol (50:50) dan dijadikan acuan pada penelitian ini.

Oleh karena itu, penelitian ini melakukan validasi metode pada penetapan

kadar kafein dalam kopi bubuk murni robusta merek “X” menggunakan metode

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Reversed Phase atau dengan

nama lain Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik.


3

METODE PENELITIAN

Bahan

Bahan yang digunakan yaitu sampel kopi bubuk murni jenis Robusta

merek “X”, metanol, kloroform (pro analysis grade) (Merck), aquabidestilata,

baku kafein (certificate of analysis working standart, no. 17/03/WS/014, USP),

natrium hidroksida, seng asetat, dan kalium ferosianida.

Alat dan instrumentasi

Alat yang digunakan yaitu seperangkat alat HPLC fase terbalik LC-2010C

(Shimadzu) dengan detektor UV, kolom C18 dimensi 250 x 4,6 mm dan ukuran pori

5 µm (Phenomenex), seperangkat komputer (Dell) B6RDZIS Connexant system

RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S, printer merek HP (Deskjet 1000 J110a),

spektrofotometer UV-1800 (Shimadzu), ultrasonikator (Retsch), alat vakum (Gast),

vortex (Ika-Werk), sentrifugator (Thermo Scientific Heraeus Pico), timbangan

analitik (Ohaus PA224C) (max 220 g, d=0,0001 g), solvent membrane filter

Whatman (0,45 µm), syringe filter ukuran pori 0,45 µm (Minisart), spuit injeksi 5

mL (Terumo), mikropipet 100 µL dan 1000 µL (Acura 825), mikrotube 2 mL,

waterbath, corong Buchner, dan alat-alat gelas (Pyrex).

Metode

Validasi metode analisis pada penetapan kadar kafein dalam kopi bubuk

murni robusta merek “X” dilakukan dengan metode Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi fase terbalik menggunakan komposisi fase gerak hasil optimasi oleh

Kurniawan (2017) yaitu aquabidestilata dan metanol (50:50), fase diam kolom

oktadesil silika C18, kecepatan alir 1,0 mL/menit, volume injeksi 20 µL, panjang

gelombang pengamatan 272 nm, dan dengan kondisi isokratik. Parameter validasi

metode analisis yang diteliti yaitu selektivitas, linearitas, akurasi, presisi dan

rentang.


4

Pembuatan fase gerak

Fase gerak yang digunakan yaitu aquabidestilata dan metanol. Masing-

masing larutan disaring menggunakan kertas saring Whatman pada corong Buchner

dengan bantuan pompa vakum, selanjutnya diawaudarakan menggunakan

ultrasonikator selama 5 menit. Pencampuran fase gerak dilakukan di dalam

instrumen HPLC dengan perbandingan aquabidestilata : metanol (50:50).

Pembuatan pelarut

Pelarut yang digunakan yaitu metanol dan aquabidestilata yang dicampur

dengan perbandingan 50:50. Larutan disaring menggunakan kertas saring Whatman

pada corong Buchner dengan bantuan pompa vakum, selanjutnya diawaudarakan

menggunakan ultrasonikator selama 5 menit.

Pembuatan larutan stok dan intermediet kafein

Baku kafein ditimbang saksama lebih kurang 100 mg kemudian dilarutkan

dengan pelarut dalam labu takar 50 mL sehingga didapat konsentrasi larutan stok

2000 ppm. Sejumlah 5,0 mL larutan stok kafein dilarutkan dengan pelarut dalam

labu takar 10 mL sehingga didapat konsentrasi larutan intermediet kafein 1000

ppm.

Pembuatan larutan seri baku kafein

Larutan seri kafein dibuat dengan cara mengambil masing-masing 75, 100,

125, 150, 175, dan 200 µL larutan intermediet kafein kemudian dimasukkan

kedalam mikrotube berbeda, setelah itu ditambahkan sejumlah tertentu pelarut

sampai masing-masing seri volumenya menjadi 1 mL sehingga didapat larutan seri

baku kafein dengan konsentrasi 75, 100, 125, 150, 175 dan 200 ppm. Masing-

masing larutan seri baku kafein ditambahkan sejumlah 40 µL NaOH 10 N kemudian

diekstraksi menggunakan 1 mL kloroform lalu divortex. Fase kloroform diambil

dan ditampung dalam suatu wadah. Ekstraksi menggunakan kloroform dilakukan

tiga kali untuk masing-masing larutan seri baku kafein kemudian diuapkan

menggunakan waterbath suhu 90°C dalam lemari asam sampai diperoleh ekstrak


5

kering kafein. Ekstrak kering yang didapat kemudian dilarutkan dengan 1 mL

pelarut. Larutan tersebut disaring menggunakan syringe filter ukuran pori 0,45 µm

lalu diawaudarakan menggunakan ultrasonikator selama 5 menit. Dilakukan

replikasi tiga kali.

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum kafein

Larutan seri kafein untuk penetapan panjang gelombang serapan

maksimum dibuat dengan cara mengambil sebanyak 125, 150 dan 250 µL larutan

intermediet kafein kemudian ditambahkan pelarut dalam labu takar 5 mL sehingga

didapat larutan seri dengan konsentrasi 25, 30 dan 50 ppm. Masing-masing larutan

dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 225-325 nm menggunakan

spektrofotometer UV. Panjang gelombang maksimum dipilih dari seri konsentrasi

yang memberikan nilai absorbansi paling tinggi, kemudian digunakan untuk

mendeteksi kafein pada sistem HPLC.

Preparasi sampel kopi

Sampel kopi bubuk ditimbang saksama lebih kurang 2 g kemudian

dilarutkan dalam 150 mL akuades panas lalu diaduk. Sejumlah 1 mL larutan kopi

ditampung mikrotube, kemudian ditambahkan seng asetat dan kalium ferosianida

masing-masing 500 µL lalu divortex. Koloid yang terbentuk kemudian

disentrifugasi menggunakan sentrifugator kecepatan 5000 rpm selama 5 menit

sehingga terpisah dengan filtrat. Filtrat yang diperoleh kemudian ditampung dalam

mikrotube kemudian ditambahkan 40 µL NaOH 10 N. Selanjutnya diekstraksi

dengan 1 mL kloroform lalu divortex. Fase kloroform diambil dan ditampung

dalam suatu wadah. Ekstraksi menggunakan kloroform dilakukan tiga kali untuk

masing-masing larutan sampel kopi kemudian diuapkan menggunakan waterbath

suhu 90°C dalam lemari asam sampai diperoleh ekstrak kering kafein. Ekstrak

kering yang didapat kemudian dilarutkan dengan 1 mL pelarut. Larutan tersebut

disaring menggunakan syringe filter ukuran pori 0,45 µm lalu diawaudarakan

menggunakan ultrasonikator selama 5 menit. Dilakukan replikasi tiga kali.


6

Penentuan persen perolehan kembali



ditampung dalam mikrotube, kemudian ditambahkan sejumlah 75 µL baku kafein,

seng asetat dan kalium ferosianida masing-masing 500 µL lalu divortex. Koloid

yang terbentuk kemudian disentrifugasi menggunakan sentrifugator kecepatan

5000 rpm selama 5 menit sehingga terpisah dengan filtrat. Filtrat yang diperoleh

kemudian ditampung dalam mikrotube kemudian ditambahkan 40 µL NaOH 10 N.

Selanjutnya diekstraksi dengan 1 mL kloroform lalu divortex. Fase kloroform

diambil dan ditampung dalam suatu wadah. Ekstraksi menggunakan kloroform

dilakukan tiga kali untuk masing-masing larutan sampel kopi kemudian diuapkan





replikasi tiga kali. Konsentrasi baku kafein yang ditambahkan dalam sampel

dihitung dari selisih hasil konsentrasi sampel adisi dengan konsentrasi sampel kopi,

kemudian dihitung nilai persen perolehan kembali.

Validasi metode analisis

1. Penentuan selektivitas dan spesifisitas



ditampung dalam mikrotube, kemudian ditambahkan sejumlah 75 µL baku kafein,

seng asetat dan kalium ferosianida masing-masing 500 µL lalu divortex. Koloid

yang terbentuk kemudian disentrifugasi menggunakan sentrifugator kecepatan

5000 rpm selama 5 menit sehingga terpisah dengan filtrat. Filtrat yang diperoleh

kemudian ditampung dalam mikrotube kemudian ditambahkan 40 µL NaOH 10 N.

Selanjutnya diekstraksi dengan 1 mL kloroform lalu divortex. Fase kloroform



7

dilakukan tiga kali untuk masing-masing larutan sampel kopi kemudian diuapkan





replikasi tiga kali. Selektivitas ditentukan dengan mengamati resolusi dari

kromatogram kafein pada sampel kopi. Spesifisitas ditentukan dengan mengamati

kromatogram dan waktu retensi kafein pada larutan baku, sampel kopi tanpa adisi

baku, dan sampel kopi dengan adisi baku kafein.

2. Penentuan kurva baku dan linearitas

Larutan seri kafein dibuat dengan cara mengambil sebanyak 75, 100, 125,

150, 175, dan 200 µL larutan intermediet kafein dalam masing-masing mikrotube,

kemudian ditambahkan sejumlah tertentu pelarut sampai masing-masing seri

volumenya menjadi 1 mL sehingga didapat larutan seri baku kafein dengan

konsentrasi 75, 100, 125, 150, 175 dan 200 ppm. Masing-masing larutan seri baku

kafein ditambahkan sejumlah 40 µL NaOH 10 N kemudian diekstraksi

menggunakan 1 mL kloroform lalu divortex. Fase kloroform diambil dan

ditampung dalam suatu wadah. Ekstraksi menggunakan kloroform dilakukan tiga

kali untuk masing-masing larutan seri baku kafein kemudian diuapkan





replikasi tiga kali. Dari kromatogram akan diperoleh nilai AUC untuk masing-

masing seri konsentrasi. Nilai AUC kemudian diplotkan terhadap masing-masing

seri konsentrasi baku kafein untuk memperoleh persamaan y=bx+a. Linearitas

ditentukan dari nilai koefisien korelasi (r).


8

3. Penentuan akurasi dan presisi

Larutan seri kafein dibuat dengan cara mengambil sebanyak 75, 150, dan

200 µL larutan intermediet kafein dalam mikrotube, kemudian ditambahkan

sejumlah tertentu pelarut sampai masing-masing seri volumenya menjadi 1 mL

sehingga didapat larutan seri baku kafein dengan konsentrasi 75, 150, 200 ppm.

Masing-masing larutan seri baku kafein ditambahkan sejumlah 40 µL NaOH 10 N

kemudian diekstraksi menggunakan 1 mL kloroform lalu divortex. Fase kloroform


dilakukan tiga kali untuk masing-masing larutan seri baku kafein kemudian

diuapkan menggunakan waterbath suhu 90°C dalam lemari asam sampai diperoleh

ekstrak kering kafein. Ekstrak kering yang didapat kemudian dilarutkan dengan 1

mL pelarut. Larutan tersebut disaring menggunakan syringe filter ukuran pori 0,45

µm lalu diawaudarakan menggunakan ultrasonikator selama 5 menit. Dilakukan

replikasi tiga kali. Nilai akurasi ditentukan dengan membandingkan hasil kadar

analit uji dengan kadar standar analit untuk masing-masing seri konsentrasi. Nilai

presisi ditentukan dengan membandingkan hasil standar deviasi dengan rata rata

jumlah akurasi.

4. Penentuan rentang

Larutan seri kafein dibuat dengan cara mengambil sebanyak 25, 50, 225,

250, 275, dan 300 µL larutan intermediet kafein dalam mikrotube, kemudian

ditambahkan sejumlah tertentu pelarut sampai masing-masing seri volumenya

menjadi 1 mL sehingga didapat larutan seri baku kafein dengan konsentrasi 25, 50,

225, 250, 275 dan 300 ppm. Masing-masing larutan seri baku kafein ditambahkan

sejumlah 40 µL NaOH 10 N kemudian diekstraksi menggunakan 1 mL kloroform

lalu divortex. Fase kloroform diambil dan ditampung dalam suatu wadah. Ekstraksi

menggunakan kloroform dilakukan tiga kali untuk masing-masing larutan seri baku

kafein kemudian diuapkan menggunakan waterbath suhu 90°C dalam lemari asam

sampai diperoleh ekstrak kering kafein. Ekstrak kering yang didapat kemudian

dilarutkan dengan 1 mL pelarut. Larutan tersebut disaring menggunakan syringe

filter ukuran pori 0,45 µm lalu diawaudarakan menggunakan ultrasonikator selama


9

5 menit. Rentang pengukuran ditentukan dari konsentrasi terendah dan tertinggi seri

baku kafein yang masih memenuhi parameter linearitas, akurasi, dan presisi.

Analisis hasil

1. Selektivitas dan spesifisitas

Selektivitas metode ditentukan dari nilai resolusi. Resolusi yang baik yaitu

puncak senyawa analit terpisah dari puncak senyawa lain dengan nilai ≥ 1,5

(AOAC, 2013). Spesifisitas ditentukan dengan mengamati kromatogram dan waktu

retensi kafein pada larutan baku, sampel kopi tanpa adisi baku, dan sampel kopi

dengan adisi baku kafein. Syarat variasi waktu waktu retensi yaitu ≤0,05 menit

(Snyder et al., 2010).

2. Linearitas

Konsentrasi seri larutan baku kafein diplotkan terhadap nilai AUC masing-

masing seri larutan baku kafein sehingga diperoleh persamaan y=bx+a. Linearitas

ditentukan dari nilai koefisien korelasi (r) yaitu > 0,99 (AOAC, 2013).

3. Akurasi

Akurasi ditentukan dari perbandingan hasil kadar analit uji dengan kadar

standar analit yang dinyatakan dalam persen, yang dihitung dengan rumus:

Akurasi = kadar terukur

kadar sebenarnya x 100%

Konsentrasi Rentang Penerimaan (%)

100% 98-101

10% 95-102

1% 92-105

0,1% 90-108

0,01% 85-110

10 µg/g (ppm) 80-115

1 µg/g (ppm) 75-120

10 µg/kg (ppb) 70-125

Gambar 1. Kriteria penerimaan akurasi (AOAC, 2013)


10

4. Presisi

Presisi ditentukan dari nilai koefisien variasi (KV), yang dihitung dengan

rumus: KV = standar deviasi (SD)

rata-ratax 100%

Konsentrasi Rentang Penerimaan RSD (%)

100% 1

10% 1,5

1% 2

0,1% 3

0,01% 4

10 µg/g (ppm) 6

1 µg/g (ppm) 8

10 µg/kg (ppb) 15

Gambar 2. Kriteria penerimaan presisi (AOAC, 2013)

5. Rentang

Konsentrasi seri larutan baku kafein diplotkan terhadap AUC masing-

masing seri larutan baku kafein sehingga diperoleh persamaan y=bx+a. Rentang

ditentukan dari konsentrasi terendah dan tertinggi seri baku kafein yang masih

memenuhi linearitas, akurasi, dan presisi.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Validasi metode pada penetapan kadar kafein dilakukan dengan metode

High Performance Liquid Chromatography (HLPC) fase terbalik menggunakan

komposisi fase gerak aquabidestilata dan metanol (50:50), fase diam kolom

oktadesil silika C18, dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit pada panjang gelombang

pengamatan 272 nm. Validasi metode dilakukan untuk menjamin hasil yang

diperoleh dapat dipertanggungjawabkan sehingga dapat digunakan untuk

menghitung kadar kafein dalam sampel kopi bubuk murni robusta. Parameter

validasi yang diteliti meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, presisi dan rentang.


11

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum kafein

Penentuan panjang gelombang maksimum pada penelitian ini dilakukan

dengan mengukur serapan kafein dalam pelarut aquabidestilata dan metanol

(50:50) menggunakan spektrofotometer UV. Kafein memiliki gugus kromofor dan

auksokrom pada strukturnya (Gambar 3) sehingga dapat memberikan serapan pada

daerah sinar ultraviolet.

Gambar 3. Struktur molekuler kafein, C8H10N4O2, serta profil kromofor dan auksokrom.

Pada penentuan panjang gelombang pengamatan digunakan tiga seri

konsentrasi kafein yaitu 25, 30 dan 50 ppm dengan tujuan untuk memastikan bahwa

pada panjang gelombang yang diperoleh terjadi serapan maksimal senyawa kafein.

Masing-masing seri konsentrasi diukur serapannya pada rentang panjang

gelombang 225-325 nm, karena panjang gelombang maksimum teoritis kafein

berkisar pada rentang panjang gelombang tersebut yaitu 273 nm (Moffat et al.,

2011). Panjang gelombang hasil pengukuran dapat digunakan apabila besarnya

lebih kurang 3 nm terhadap panjang gelombang teoritis (Snyder et al., 2010). Hasil

spektrum serapan larutan kafein (Gambar 4) menunjukkan bahwa ketiga seri

konsentrasi memberikan serapan maksimal pada 272 nm sehingga pada analisis

selanjutnya panjang gelombang tersebut digunakan untuk pengukuran larutan baku

kafein maupun sampel kopi pada sistem HPLC.

Auksokrom

Kromofor


12

Gambar 4. Spektrum serapan larutan seri kafein konsentrasi 25, 30 dan 50 ppm pada

pelarut aquabidestilata dan metanol (50:50)

Preparasi sampel kopi

Sampel yang akan diinjeksikan pada sistem HPLC merupakan filtrat yang

telah dipisahkan dari koloid dengan cara preparasi sampel kopi. Preparasi sampel

merupakan suatu prosedur pembersihan (clean up) matriks sampel dari senyawa-

senyawa lain sehingga dapat mengisolasi analit dengan efektif (Nollet and Toldra,

2015). Tahap ini menggunakan seng asetat dan kalium ferosianida yang kemudian

membentuk seng ferosianida. Seng ferosianida merupakan clarifying/clearing

agents yang berfungsi untuk mengendapkan protein, lemak, tannin, asam amino

serta zat warna pada sampel kopi (Nollet and Toldra, 2015). Penambahan seng

ferosianida pada sampel kopi akan membentuk endapan koloid sehingga harus

dipisahkan dari filtrat dengan cara sentrifugasi. Filtrat yang didapat kemudian

ditambahkan dengan NaOH 10 N lalu diekstraksi menggunakan pelarut kloroform

dengan bantuan vortex. Fase kloroform kemudian diuapkan diatas waterbath

sampai diperoleh ekstrak kering kafein. Ekstraksi sampel kopi menggunakan

pelarut kloroform karena kafein mudah larut dalam kloroform dengan kelarutan

1 g dalam 5,5 mL (Anonim, 2014; Moffat et al., 2011). Tujuan penggunaan NaOH

adalah untuk melepas kafein dalam sampel kopi yang berbentuk garam larut dalam

air supaya menjadi kafein berbentuk basa larut dalam kloroform. Reaksi kafein

terhadap penambahan NaOH ditampilkan pada Gambar 5.

nm.

225.00 240.00 260.00 280.00 300.00 325.00

Ab

s.

2.500

2.000

1.500

1.000

0.500

0.000

11

1

Konsentrasi 25 ppm

Konsentrasi 30 ppm

Konsentrasi 50 ppm


13

Gambar 5. Reaksi kafein terhadap penambahan NaOH

Penentuan selektivitas dan spesifisitas

Selektivitas merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk

memisahkan analit secara tepat dalam matriks sampel yang masih terdapat

senyawa-senyawa lain. Penentuan selektivitas diamati dari pemisahan puncak

kafein dalam sampel kopi dan dinyatakan dengan nilai resolusi (Rs). Berdasarkan

AOAC (2013), nilai resolusi yang diharapkan yaitu ≥ 1,5. Hasil penentuan

selektivitas ditunjukkan pada Tabel I.

Tabel I. Data resolusi kafein pada sampel kopi

Replikasi Resolusi

1 2,677

2 2,042

3 2,162

Tabel I menunjukkan nilai resolusi kafein pada sampel kopi dari tiga kali

replikasi. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa seluruhnya memenuhi kriteria

resolusi maka metode analisis yang digunakan memiliki selektivitas yang baik

karena dapat memisahkan kafein (analit) dari senyawa lainnya dalam sampel.

Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk

mendeteksi analit dalam matriks sampel secara spesifik. Pada penelitian ini,

spesifisitas ditentukan dengan mengamati kromatogram dan waktu retensi kafein

pada larutan baku, sampel kopi tanpa adisi baku, dan sampel kopi dengan adisi baku

kafein.

Kafein bentuk garam (larut dalam

air).

Kafein bentuk basa (larut dalam

kloroform).


14

(a)

(b)

(c)

Gambar 6. Kromatogram kafein pada larutan baku 75 ppm (a), sampel kopi tanpa adisi

baku (b), dan sampel kopi dengan adisi baku kafein 75 ppm (c).

Keterangan: Komposisi fase gerak air dan metanol (50:50), fase diam kolom oktadesil

silika C18, kecepatan alir 1,0 mL/menit, dan panjang gelombang pengamatan 272 nm.

Dari kromatogram (Gambar 6) diketahui bahwa baku kafein, sampel kopi

tanpa adisi baku, dan sampel kopi dengan adisi baku kafein secara berurut-urut

memiliki waktu retensi 2,491; 2,472; dan 2,482 menit. Menurut Snyder et al (2010)

syarat variasi waktu retensi yaitu ≤0,05 menit, dan selisih waktu retensi baku kafein

dengan sampel kopi hanya 0,019 menit maka dapat dikatakan dalam sampel kopi


15

terdapat kandungan kafein. Selain itu, dari kromatogram sampel kopi dengan adisi

baku kafein (c) terjadi peningkatan tinggi pucak dan respon AUC sehingga

mendukung pernyataan bahwa dalam sampel yang digunakan terdapat kandungan

kafein.

Penentuan kurva baku

Kurva baku merupakan kurva yang menunjukkan hubungan antara

konsentrasi seri baku kafein dengan respon instrumen berupa Area Under Curve

(AUC). Larutan seri baku kafein dibuat dengan enam konsentrasi yaitu 75, 100,

125, 150, 175, dan 200 ppm yang direplikasi tiga kali. Tiap-tiap replikasi baku

kafein dibuat kurva hubungan antara konsentrasi baku dengan respon AUC

kemudian dipilih salah satu kurva baku yang akan digunakan untuk analisis

kuantitatif.

Tabel II. Data perolehan nilai AUC dari enam seri baku kafein

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Konsentrasi

baku kafein

(ppm)

AUC

Konsentrasi

baku kafein

(ppm)

AUC

Konsentrasi

baku kafein

(ppm)

AUC

79,125 2902996 79,125 3027324 79,125 2811785

105,500 3280099 105,500 3858806 105,500 4018724

131,875 5694373 131,875 4146723 131,875 5400692

158,250 6593247 158,250 5180387 158,250 6275503

184,625 7783849 184,625 7016203 184,625 7900548

211,000 9676685 211,000 8912115 211,000 8543801

a = -1598090,771 a = - 917758,095 a = - 646024,400

b = 52299,059 b = 43255,041 b = 44609,736

r = 0,9876 r = 0,9630 r = 0,9959

Dari ketiga replikasi tersebut dipilih nilai koefisien korelasi (r) yang paling

baik karena memiliki hubungan peningkatan konsentrasi dan respon instrumen

yang linear. Berdasarkan AOAC (2013) koefisien korelasi yang disarankan yaitu

r ≥ 0,99. Tabel II menunjukkan bahwa replikasi tiga dengan persamaan

y = 44609,736x–646024,400 memiliki nilai koefisien korelasi paling baik (r =

0,9959) sehingga dipilih dan digunakan untuk menghitung kadar kafein dalam

sampel kopi bubuk.


16

Gambar 7. Kurva baku kafein (Replikasi 3)

Akurasi dan Presisi

Akurasi merupakan kedekatan hasil yang diperoleh pada saat penelitian

dibandingkan dengan hasil yang sebenarnya (true value), dan presisi merupakan

kedekatan antar hasil pengukuran pada kondisi yang telah ditentukan dan

dinyatakan dengan nilai koefisien variasi (KV) (Snyder et al., 2010). Penetapan

akurasi dan presisi dilakukan menggunakan tiga seri konsentrasi baku kafein

dengan tiga kali replikasi. Dari hasil pengukuran, nilai AUC diolah menggunakan

persamaan kurva baku sehingga diperoleh data konsentrasi terukur dan konsentrasi

sebenarnya. Menurut AOAC (2013) kriteria penerimaan akurasi dan presisi pada

konsentrasi 100 ppm yaitu 85% - 110% dan 4%, sedangkan pada konsentrasi 1000

ppm yaitu 90%-108% dan 3%. Berdasarkan Tabel III, maka level konsentrasi

bawah (75 ppm) dan tengah (150 ppm) memiliki akurasi dan presisi yang baik

karena memenuhi kriteria penerimaan. Sedangkan pada level konsentrasi atas (200

ppm) memiliki nilai akurasi yang baik namun tidak memenuhi nilai presisi yang

baik.

y = 44609,736x - 646024,400

r = 0,9959

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

0 50 100 150 200 250

AU

C

Konsentrasi kafein (ppm)


17

Tabel III. Data akurasi dan presisi baku kafein

Pada penelitian ini juga dilakukan penentuan persen perolehan kembali

menggunakan metode penambahan baku. Baku kafein yang ditambahkan ke dalam

sampel kopi sejumlah 75 ppm. Nilai persen perolehan kembali menjadi tolak ukur

efisiensi ekstraksi dan untuk mengetahui bahwa keseluruhan metode analisis,

termasuk proses clean up, tidak menghilangkan kafein. Berdasarkan Tabel IV,

diketahui bahwa konsentrasi sampel adisi melebihi nilai kadar terukur pada level

konsentrasi atas (200 ppm) yang ditampilkan pada Tabel III. Hal ini menandakan

terjadi ekstrapolasi karena konsentrasi adisi sampel tidak masuk dalam penentuan

kurva baku, tetapi berdasarkan parameter rentang yang ditampilkan pada

Gambar 8 menunjukkan bahwa perpanjangan seri konsentrasi baku kafein masih

memberikan kurva yang linear dengan nilai koefisien korelasi yang baik yaitu

0,9983. Kriteria perolehan kembali untuk kadar 100 ppm menurut AOAC (2013)

yaitu tidak kurang dari 95% dan hasil rata-rata perolehan kembali baku kafein

sebesar 98,619% sehingga terbukti bahwa metode analisis yang digunakan mampu

memberikan perolehan kembali baku kafein dengan baik.

Level

Konsentrasi

Kadar

Kafein

Teoritis

(ppm)

Kadar

Kafein

Terukur

(ppm)

Akurasi

(%)

Rata-

Rata SD

CV

(%)

Bawah 79,125

79,557 100,546 102,6063

1,8358

1,7891

82,344 104,068

81,660 103,204

Tengah 158,250

162,280 102,546 102,0204

1,274

1,249

159,147 100,567

162,914 102,947

Atas 211,000

214,877 101,837 104,3506

4,6077

4,4156

214,261 101,545

231,400 109,668


18

Tabel IV. Data perolehan kembali adisi baku kafein

Konsentrasi (ppm)

Konsentrasi

adisi baku

kafein (ppm) Perolehan

kembali (%)

Rata-rata

(%)

Sampel Sampel

Adisi

C sampel

adisi – C

sampel

172,670 251,482 78,812 105,082

98,619

172,707 245,206 72,499 96,665

181,294 251,875 70,581 94,108

Rentang

Rentang suatu metode didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dan

tertinggi analit yang masih memenuhi parameter linearitas, akurasi, dan presisi.

Berdasarkan Gambar 8, didapatkan rentang pengukuran seri konsentrasi baku

kafein yaitu 25 ppm - 300 ppm dengan nilai koefisien korelasi yaitu 0,9983.

Gambar 8. Kurva rentang seri konsentrasi kafein

y = 47543x - 984563

r = 0,9983

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

0 50 100 150 200 250 300 350

AU

C

Konsentrasi kafein (ppm)


19

KESIMPULAN

Metode analisis pada penetapan kadar kafein dalam kopi bubuk murni

robusta merek “X” menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi fase terbalik

menggunakan fase diam kolom oktadesil silika C18, fase gerak aquabidestilata dan

metanol (50:50), dan kecepatan alir 1,0 mL/menit telah memenuhi parameter

validasi yang baik meliputi selektivitas (Rs= 2,293), linearitas (r = 0,9959), akurasi

dan presisi pada konsentrasi 75 ppm dan 150 ppm, serta rentang pengukuran pada

konsentrasi 25- 300 ppm.

SARAN

Penelitian terkait penetapan kadar kafein dalam sampel kopi bubuk murni

robusta merek “X” dapat menggunakan metode yang telah divalidasi ini.


20

DAFTAR PUSTAKA

Agung, S., 2017. Validasi Metode Bioanalisis Kafein dalam Sampel Darah Orang

Jawa dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik.

Universitas Sanata Dharma.

Anonim, 2014. Farmakope Indonesia.

Anonim, 2016. Outlook Kopi Komoditas Pertanian Subsektor Perkebunan. Pusat

Data dan Sistem Informasi Pertanian Sekretariat Jendral Kementrian

Pertanian, 2, 25.

AOAC, 2013. Guideline for dietary supplements and botanicals. Association of

Official Analytical Chemists, 3-9.

Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2004. Ketentuan Pokok

Pengawasan Suplemen Makanan. Kepala Badan Pengawas Obat dan

Makanan Republik Indonesia, 13.

Chowdhury, S.R., Maleque, M., dan Shihan, M.., 2012. Development and

Validation of a Simple RP-HPLC Method for Determination of Caffeine in

Pharmaceutical Dosage Forms. Asian Pharma Press., 2 (1), 1–4.

Hayati, R., Marliah, A., dan Rosita, F., 2012. Sifat Kimia dan Evaluasi Sensori

Bubuk Kopi Arabika. Jurnal Floratek., 66.

Kurniawan, J. R., 2017. Optimasi Metode Bioanalisis Kafein dalam Sampel Darah

Orang Jawa dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik.

Universitas Sanata Dharma.

Moffat, A. C., Osselton, M. D., and Widdop, B., 2011. Clarke's Analysis of Drugs

and Poisons.

Nawrot et al., 2003. Effects of Caffeine on Human Health. Taylor and Francis

Group EBSCO., 20 (1), 1–30.

Nollet, L. M. L., and Toldra, F., 2015. Handbook of Food Analysis.

Oktadina, F.D., Argo, B.D., dan Hermanto, M.B., 2013. Pemanfaatan Nanas

(Ananas Comosus L. Merr) untuk Penurunan Kadar Kafein dan Perbaikan

Citarasa Kopi (Coffea Sp) dalam Pembuatan Kopi Bubuk. Jurnal Keteknikan

Pertanian Tropis dan Biosistem., 1 (3), 266.

Patil, P.N., 2012. Caffeine in Various Samples and Their Analysis with HPLC – A

Review. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and

Research., 16 (2), 76–83.

Pradeep, S., Rameshaiah, G.N., dan Ashoka, H., 2015. Caffeine Extraction and

Characterization. International Journal of Current Research and Review, 7

(9), 16–19.


21

Rizky, T.A., Saleh, C., dan A., 2015. Analisis Kafein dalam Kopi Robusta (Toraja)

dan Kopi Arabika (Jawa) dengan Variasi Siklus pada Sokletasi. Jurnal Kimia

Mulawarman., 13 (1), 41.

Snyder, R.L., Kirkland, J.J., dan Dolan, J.W., 2010. Introducing to Modern Liquid

Chromatography.

Sugihartini, N., Fudholi., A., Pramono, S., 2014. Validasi Metode Analisa

Penetapan Kadar Epigalokatekin Galat dengan Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi. Pharmaciana., 4 (2), 112.


22

Lampiran 1. Sertifikat analisis standar kafein


23

Lampiran 2. Kemasan sampel kopi bubuk murni robusta


24

Lampiran 3. Contoh perhitungan konsentrasi larutan kafein

a. Perhitungan konsentrasi larutan stok kafein

Sejumlah 100 mg kafein dilarutkan dengan pelarut hingga 50 mL

Konsentrasi larutan stok kafein 100 mg / 50 mL = 2000 mg/mL = 2000 ppm

b. Perhitungan konsentrasi larutan intermediet kafein 1000 ppm

Sejumlah 5 mL larutan stok kafein (2000 ppm) diencerkan dengan pelarut hingga

10 mL

Konsentrasi larutan intermediet kafein (2000 ppm x 5 mL) / 10 mL = 1000

ppm

c. Perhitungan larutan seri kafein

Sejumlah 75 µL larutan intermediet kafein (1000 ppm) diencerkan dengan

pelarut hingga 1 mL

Konsentrasi larutan seri kafein (1000 ppm x 75 µL) / 1000 µL = 75 ppm

Perhitungan lainnya dilakukan sama seperti contoh sesuai dengan jumlah larutan

intermediet yang diambil.

Seri

ke-

Jumlah larutan

intermediet diambil

(µL)

Jumlah

aqubidestilata

ditambahkan (µL)

Konsentrasi seri yang

didapat (µg/mL)

1 75 925 75

2 100 900 100

3 125 875 125

4 150 850 150

5 175 825 175

6 200 800 200


25

Lampiran 4. Spektrum panjang gelombang maksimum kafein

a. Data absorbansi baku kafein konsentrasi 25 ppm

b. Data absorbansi baku kafein konsentrasi 30 ppm

c. Data absorbansi baku kafein konsentrasi 50 ppm

nm.

225.00 240.00 260.00 280.00 300.00 325.00

Ab

s.

2.500

2.000

1.500

1.000

0.500

0.000

11

1

Konsentrasi 50 ppm

Konsentrasi 25 ppm

Konsentrasi 30 ppm


26

Lampiran 5. Kromatogram pelarut aquabidestilata dan metanol


27

Lampiran 6. Kromatogram larutan seri baku kafein replikasi 1

1. Konsentrasi 75 ppm


28



29



30



31



32



33




34



35



36



37



38



39




40



41



42



43



44



45

Lampiran 9. Kromatogram larutan seri baku kafein – data rentang



46



47



48



49



50



51

Lampiran 10. Kromatogram larutan seri baku kafein – data akurasi dan presisi

1. Konsentrasi 75 ppm replikasi 1



52




53




54




55



56

Lampiran 11. Contoh perhitungan akurasi dan presisi

Persamaan y = 44609,736x – 646024,400

Contoh perhitungan menggunakan level konsentrasi bawah

Perhitungan kadar terukur

Replikasi 1 2902996 = 44609,736x – 646024,400

x = (2902996 + 646024,400) / 44609,736 = 79,557 ppm

Replikasi 2 x = (3027324 + 646024,400) / 44609,736 = 82,344 ppm

Replikasi 3 x = (3027324 + 646024,400) / 44609,736 = 81,660 ppm

Perhitungan nilai akurasi

Replikasi 1 (79,557 / 79,125) x 100% = 100,546%

Replikasi 2 (82,344 / 79,125) x 100% = 104,068%

Replikasi 1 (81,660 / 79,125) x 100% = 103,204%

Rata-rata nilai akurasi = (100,546% + 104,068% + 103,204%) / 3 = 102,606%

Standar deviasi = 1,835

Koefisien variasi = (1,835 / 102,606%) x 100% = 1,789 %

Level

konsentrasi

Konsentrasi

sebenarnya

Nilai AUC

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Bawah 79,125 2902996 3027324 2996831

Tengah 158,250 6593247 6453485 6621558

Atas 211,00 8939605 8912115 9676685


57

Lampiran 12. Kromatogram sampel kopi

1. Replikasi 1

2. Replikasi 2


58

3. Replikasi 3


59

Lampiran 13. Kromatogram sampel kopi adisi baku kafein 75 ppm

1. Replikasi 1

2. Replikasi 2


60

3. Replikasi 3


61

Lampiran 14. Contoh perhitungan perolehan kembali

Persamaan y = 44609,736x – 646024,400

Perhitungan konsentrasi sampel

Replikasi 1 7056753 = 44609,736x – 646024,400

x = (7056753 + 646024,400) / 44609,736 = 172,670 ppm

Replikasi 2 x = (7058402 + 646024,400) / 44609,736 = 172,707 ppm

Replikasi 3 x = (7441432 + 646024,400) / 44609,736 = 181,294 ppm

Perhitungan konsentrasi sampel adisi

Replikasi 1 x = (10572523 + 646024,400) / 44609,736 = 251,482 ppm

Replikasi 2 x = (10292561 + 646024,400) / 44609,736 = 245,206 ppm

Replikasi 3 x = (10590031 + 646024,400) / 44609,736 = 251,875 ppm

Perhitungan konsentrasi adisi baku kafein = Konsentrasi sampel adisi –

konsentrasi sampel

Replikasi 1 251,482 - 172,670 = 78,812 ppm

Replikasi 2 245,206 - 172,707 = 72,499 ppm

Replikasi 3 251,875 - 181,294 = 70,581 ppm

Perhitungan perolehan kembali

Replikasi 1 (78,812 ppm / 79,125 ppm) x 100% = 105,080 ppm



Rata-rata = (105,080 ppm + 96,665 ppm + 94,108 ppm) / 3 = 98,618 ppm

Replikasi AUC

Sampel Sampel adisi

1 7056753 10572523

2 7058402 10292561

3 7441432 10590031


62

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Validasi Metode High

Perfomance Liquid Chromatography (HPLC) Fase

Terbalik pada Penetapan Kadar Kafein dalam Kopi

Bubuk Murni Robusta Merek X” memiliki nama lengkap

Maria Clara. Penulis lahir di Pangkalan Bun pada tanggal

16 Februari 1997 sebagai putri pertama, dari dua

bersaudara, dari pasangan Michael Dominicus Haryanto

dan Septia Ping. Pendidikan formal yang pernah ditempuh

penulis yaitu TK Cahaya Mulia Pangkalan Bun (2001-

2002), SDK Santa Maria Pangkalan Bun (2002-2008), SMP Negeri 1 Arut Selatan

Pangkalan Bun (2008-2011), SMA Stella Duce 2 Yogyakarta (2011-2014).

Pendidikan dilanjutkan pada tahun 2014 ke perguruan tinggi Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis terlibat aktif dalam organisasi,

kegiatan kepanitiaan dan sebagai asisten praktikum di kampus yaitu menjadi

anggota divisi Advokasi Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi periode

2015-2016, anggota divisi Perlengkapan PPRTOS 2014, peserta Latihan

Kepemimpinan 1 2014, anggota divisi Dokumentasi Kampanye Informasi Obat

2014, anggota divisi Pendaftaran PPRTOS 2015, koordinator divisi Dekorasi dan

Dokumentasi Latihan Kepemimpinan 1 2015, sekretaris panitia Pelepasan Wisuda

2015, sekretaris panitia PPRTOS 2016, anggota divisi Kesekretariatan TITRASI

2016, asisten praktikum Komunikasi Farmasi 2017, serta asisten praktikum Kimia

Analisis 2017.


Documents

VALIDASI METODE HIGH PERFORMANCE LIQUID … · jenis sampel yang mengandung kafein seperti kopi, teh, minuman energi, dan formulasi farmasi mengandung obat dapat dianalisis menggunakan