Diagnostic biologique Diagnostic biologique du paludismedu paludisme

Dr Didier Ménard

Unité de Recherche sur le Paludisme

Vincent Thonier

Unité de Recherche sur le Paludisme

Institut Pasteur de Madagascar

Mercredi 7 Mars 2007

5ème Atelier Paludisme

PlanPlan

� importance du diagnostic biologique

� Les différentes méthodes disponibles

� mise en évidence directe des parasites

� mise en évidence des antigènes parasitaires

� mise en évidence de l’ADN parasitaire

� Bilan complémentaire du paludisme

� En pratique

importance du diagnostic biologique du importance du diagnostic biologique du paludismepaludisme

� Faible spécificité des signes cliniques

� Surestimation des cas de paludisme � Antananarivo : sujets consultants au niveau des CSB pour suspicion de

paludisme : 2% RDT +

� Toamasina : sujets hospitalisés pour suspicion de paludisme : 10% GE +

� surprescription et surconsommation de traitement antipaludique � Mauvaise prise en charge des cas de fièvre avec Sous estimation

des autres pathologies

� majore la pression médicamenteuse exercée sur le parasite

mise en évidence directe mise en évidence directe des parasitesdes parasites

� Deux principales techniques :

� la goutte épaisse et le frottis mince

� le QBC

goutte épaisse et frottis mince (1) goutte épaisse et frottis mince (1) = gold standard

principe techniqueprincipe technique

- ETAPE 1-Prélèvement du malade

- ETAPE 2-Préparation et coloration de la ge et du fm

- ETAPE 3-Examen de la ge à la recherche des parasites du paludisme

Si la recherche est négative : Examen négatif, Absence de Plasmodium »Si la recherche est positive, passer à l’étape 4

- ETAPE 4-Identification des espèces de Plasmodium sur la ge et le fm

- ETAPE 5-Estimation de la densité parasitaire

sur la ge (peu de parasites)

ou sur le fm (beaucoup de parasites)

AvantagesAvantages

Bonne sensibilité faible coût

Identification des stades et des espèces

Mesures quantitativesLecture rétrospective

InconvénientsInconvénientsDélai du rendu des résultats

Personnel qualifié Équipement

Problèmes des infections mixtes

goutte épaisse et frottis mince (2)goutte épaisse et frottis mince (2)

mise en évidence des antigènes mise en évidence des antigènes parasitairesparasitaires

� Deux principales techniques

� Test immunochromatographique = test de diagnostic Rapide = tdr (rdt)

� RIA et ELISA (Pas d’intérêt dans le diagnostic)

principe techniqueprincipe techniqueDétection d’antigènes parasitaires par Immunochromatographie

Test immunochromatographique = Test immunochromatographique = tdrtdr

((rdtrdt) (1)) (1)

3 Groupes d’antigènes détectés par les tdr

� HRP II : Histidine-rich protein 2 � pLDH : Plasmodium lactate dehydrogenase

� Aldolase

tdrtdr (2)(2)

TDR commercialisés :� HRP II seule � HRP II + aldolase� pLDH (Falciparum-specific pLDH and

pan-specific pLDH) � HRP II + pan-specific pLDH� HRP II + pan-specific pLDH + vivax-specific pLDH � aldolase

TDR (3)TDR (3)

AVANTAGESAVANTAGES

Rapidité : 15-20 min.

Simplicité d’utilisation

Peut être réalisé sans expérience

Bonne sensibilité et bonne spécificité

Ne nécessite pas d’équipements

spécifiques

Adapté au terrain

InconvénientsInconvénients

Coût : 1-2 USD.

Pas quantitatif

Ne distingue pas P.v des autres espèces

Stabilité des réactifs sur le terrain ?

Nombre important de faux positifs

Ne donne pas d’indication sur laviabilité des parasites

mise en évidence de l’ADN mise en évidence de l’ADN parasitaire parasitaire

La Biologie moléculaire (1)La Biologie moléculaire (1)

Principe technique� Prélèvement Sang� Extraction de L’ADN

parasitaire� Amplification par PCR � Révélation

Avantages � Sensibilité� Diagnostic d’espèce� Possibilité de quantification� Étude génome du parasite� Travail de grande série

Inconvénients� coût � Équipement très sophistiqué� Personnel qualifié � Délai de réalisation

La sérologieLa sérologie

technique� ELISA� IFI

Indications

En aucun cas le diagnostic d’accès

palustre

études épidémiologiques

Dépistage des donneurs de sang

Diagnostic rétrospectif (non valable en zone d’endémie)

Paludisme viscéral évolutif

Ag=

plasmodium

Ac sérique ?

Ac

secondaire =

anti globuline

humaine

Fluorescéine

Excitation UV

bilan biologique complémentairebilan biologique complémentaireIntérêt =

recherche de signes de gravité biologique définis par L’OMS en 2000

� Ictère (clinique) :

� bilirubine avec prédominance de la forme libre

� hémoglobinurie macroscopique

� Insuffisance rénale : créatinine (> 265 µmol/L, valeur plus basse chez l’enfant), diurèse, clearance de la créatinine

� Acidose métabolique (bicarbonates plasmatiques < 15 mmol/L) ou Gaz du sang

� Troubles de l’hémogramme � Anémie grave (Hb < 50g/L ou Ht < 15%)

� Thrombopénie

� Hypoglycémie (< 2,2 mmol/L)

Conclusion = En pratiqueConclusion = En pratique

� Diagnostic direct du parasite :

�� Si laboratoire à proximité Si laboratoire à proximité

�� A lui de définir à sa stratégie diagnostique A lui de définir à sa stratégie diagnostique

�� Si pas de laboratoire à proximitéSi pas de laboratoire à proximité

�� tests rapidestests rapides (préférentiellement HRP(préférentiellement HRP--2) 2)

� Jamais de sérologie pour un diagnostic d’accès palustre

�� Ne pas oublier les signes biologiques de gravitéNe pas oublier les signes biologiques de gravité

QBC (1) = QBC (1) = quantitative quantitative buffybuffy coatcoat

principe techniqueprincipe technique

- ETAPE 1 -Prélèvement du malade

- ETAPE 2 -Centrifugation dans un capillaire = concentration

(hématies parasitées + légères) +

action de l’Acridine orange = agent intercalent et fluorescent

- ETAPE 3 -

Lecture avec microscopie UV

- ETAPE 4 -Identification des espèces de Plasmodium

P. falciparum P. vivax

QBC (2) = QBC (2) = quantitative quantitative buffybuffy coatcoat

AVANTAGESAVANTAGES

Très Bonne sensibilité(1 parasite par µl)

Volume examiné : 60 µl vs 0.,2 µl GE

Rapidité

InconvénientsInconvénients

Toxicité de l’acridine

coût élevé

Équipements

Personnel expérimenté

Pas approprié au terrain

Pas quantitatif, espèces

mise en évidence de l’ADN mise en évidence de l’ADN parasitaire parasitaire

La Biologie moléculaire (2)La Biologie moléculaire (2)

Pour moiPour moi

�� LDH se négative en 3 jLDH se négative en 3 j

�� HrpHrp--2 se négative en 10 j2 se négative en 10 j

�� HrpHrp--2 bien meilleur stabilité que LDH e 2 bien meilleur stabilité que LDH e aldolasealdolase

�� HrpHrp--2 bien meilleure sensibilité que LDH 2 bien meilleure sensibilité que LDH falcifalci et et

aldolasealdolase ( la moins bonne sensibilité)( la moins bonne sensibilité)

�� idéale Tana HRP2+ pan idéale Tana HRP2+ pan pLDHpLDH si si trptrp cher HRP2cher HRP2

�� LDH suppose une viabilité du parasite = meilleur LDH suppose une viabilité du parasite = meilleur

suivi efficacité du traitementsuivi efficacité du traitement