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LLEE DDIIAAGGNNOOSSTTIICC BBIIOOLLOOGGIIQQUUEE

DDUU PPAALLUUDDIISSMMEE PPAARR

MMIICCRROOSSCCOOPPIIEE

6ème édition de l’Atelier Paludisme

Session 2008 17 Mars au 18 Avril 2008

Dr Marie Ange Rason - Dr Didier Ménard Unité de Recherche sur le Paludisme

Institut Pasteur de Madagascar

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DDIIAAGGNNOOSSTTIICC BBIIOOLLOOGGIIQQUUEE

DDUU PPAALLUUDDIISSMMEE

Il comprend plusieurs étapes

- ETAPE 1-

Prélèvement du malade

- ETAPE 2-

Préparation et coloration de la goutte épaisse et du frottis mince

- ETAPE 3-

Examen de la goutte épaisse à la recherche des parasites du

paludisme

Si la recherche est négative : Conclure par « Examen négatif, Absence de

Plasmodium »

Si la recherche est positive, passer à l’étape 4

- ETAPE 4-

Identification des espèces de Plasmodium sur la goutte épaisse

et le frottis mince

- ETAPE 5-

Estimation de la densité parasitaire sur la goutte épaisse (si il y a peu

de parasites) ou sur le frottis mince (si il y a beaucoup de parasites)

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EETTAAPPEE 11 PPrrééllèèvveemmeenntt dduu mmaallaaddee

Matériel nécessaire

Lames de verre propres

Lancette stérile

Méthanol ou Ethanol

Coton hydrophile

Crayon gras ou stylo graveur

Méthode

Chez les enfants et adultes, la

piqûre se fait au niveau du 3ème

ou 4ème doigt de la main gauche,

sur le côté qui est moins sensible

que le bout du doigt

Chez les nourrissons de moins de

6 mois, la piqûre se fait au niveau

du talon ou du gros orteil.

Nettoyer l'endroit choisi d'abord

avec un tampon de coton imbibé

d'alcool, puis avec un tampon sec

pour enlever toute trace d'alcool.

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Piquer d'un coup sec et rapide.

Essuyer la première goutte de

sang avec un tampon de coton

sec

De la main droite : prendre une

lame

en la tenant par les bords.

De la main gauche : presser le

doigt piqué pour faire sortir une

goutte de sang.

Prendre une 2ème lame et

recueillir une seconde goutte de

sang en la mettant délicatement

en contact avec une extrémité de

la lame

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EETTAAPPEE 22 PPrrééppaarraattiioonn eett ccoolloorraattiioonn ddee llaa ggoouuttttee ééppaaiissssee eett

dduu ffrroottttiiss mmiinnccee

PPrrééppaarraattiioonn ddee llaa ggoouuttttee ééppaaiissssee

Faire un étalement épais, au centre de la lame.

Étaler le sang avec le coin d'une lame propre jusqu'à épaississement uniforme.

Les étalements trop minces ou trop épais ne se colorent pas bien.

Au bout de la lame, inscrire au crayon gras le numéro du malade.

Laisser sécher à l'air pendant au moins 10 minutes, par exemple sur un plan

de travail ensoleillé, à condition de protéger l'étalement contre les mouches et

la poussière.

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PPrrééppaarraattiioonn dduu ffrroottttiiss mmiinnccee

Tenir la lame d'une main. De l'autre, poser le bord de la lame rodée juste en

avant de la goutte de sang.

Faire glisser la lame rodée jusqu'à ce qu'elle touche la goutte de sang.

Laisser le sang se répartir tout le long du bord de la lame rodée.

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Pousser la lame rodée jusqu'au bout de la lame d'étalement, d'un mouvement

doux et régulier (tout le sang doit être réparti avant que l'on atteigne le bout de

la lame.

Vérifier que l'étalement est bien fait (voir dessin A) :

- il ne doit pas présenter de lignes transversales ou horizontales

- il doit être lisse aux extrémités, et non irrégulier ou strié, comme sur le

dessin B

- il ne doit pas être trop long ni trop épais

- il doit être étalé uniformément

Un séchage correct est capital pour conserver la qualité de l'étalement,

surtout dans les pays à climat humide. Sécher en agitant rapidement à 5 cm

environ d'une lampe à alcool allumée ; sur le côté de la lampe, un peu au-

dessus de la flamme (mais jamais directement au-dessus).

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Inscrire sur la lame le nom et le numéro du malade. Écrire au crayon gras sur

la partie épaisse de l'étalement, qui n'est pas utilisée pour l'examen.

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CCoolloorraattiioonn ddee llaa ggoouuttttee ééppaaiissssee

Matériel nécessaire

Éprouvette de 50 ml

Pipette en verre de 5 ml

Poire en caoutchouc

Bac à coloration

Agitateur

Pinces à lame

Râtelier à lames

Minuterie

Colorant de Giemsa

Eau du robinet ou de pluie

Préparation du Giemsa à 10 %

Remplir le bac à coloration avec 45 ml d’eau du robinet ou de pluie

Ajouter 5 ml de colorant de Giemsa à l’aide d’une pipette plastique

Mélanger à l’aide d’un agitateur

NB : La solution de Giemsa à 10 % ne se conserve que 2 jours

Coloration des lames

Plonger les lames à colorer dans la cuve à coloration contenant la solution

de Giemsa à 10 %

Laisser colorer pendant 10 minutes

Sortir la lame, rincer en laissant la lame sous un filet d’eau du robinet

Laisser sécher la lame à l’air pendant 30 minutes en position horizontale

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CCoolloorraattiioonn dduu ffrroottttiiss mmiinnccee

Matériel nécessaire

Coloration rapide Kit RAL 555 (3 x 100 ml)

Recharge fixateurs RAL 555

Recharge Eosine RAL 555

Recharge Bleu RAL 555

Coloration des lames

Plonger 30 secondes la lame dans le fixateur (flacon 1)

Plonger 30 secondes la lame dans l’éosine (flacon 2)

Rincer la lame à l’eau du robinet

Plonger la lame 2 minutes dans le bleu (flacon 3)

Sortir la lame, rincer en laissant la lame sous un filet d’eau du robinet

Laisser sécher la lame à l’air pendant 30 minutes en position horizontale

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EETTAAPPEE 33 EExxaammeenn ddee llaa ggoouuttttee ééppaaiissssee àà llaa rreecchheerrcchhee ddeess

ppaarraassiitteess dduu ppaalluuddiissmmee

L'examen d'une goutte épaisse est basé sur l'observation microscopique de 100

champs de bonne qualité. C'est-à-dire que l'on ne peut pas déclarer le

prélèvement négatif avant d'avoir examiné 100 champs sans parasite.

Technique d'examen des gouttes épaisses

1. Mettre de l'huile à immersion sur la goutte épaisse.

2. Amener l'objectif à immersion 100 x au-dessus de la zone sélectionnée de la

goutte épaisse.

3. Abaisser l'objectif jusqu'à ce qu'il entre en contact avec l'huile.

4. S'assurer que la zone choisie a bien la qualité requise et examiner la lame

sur 100 champs avec l'objectif à immersion. Ne déplacer la lame que d'un

champ à la fois, en suivant le schéma ci-dessus. Corriger la mise au point

fine avec la vis micrométrique.

5. Pour vous aider, utilisez un compteur manuel pour compter le nombre de

champs examinés.

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A l'examen, vous devez observer :

La goutte épaisse est formée d'un grand nombre d'hématies

déshémoglobinisées rassemblées en paquets.

Lors de la coloration de la goutte épaisse, l'eau de la solution de Giemsa agit

sur les globules rouges non fixés : le contenu des cellules se dissout alors

dans l'eau.

Les leucocytes et les plaquettes présentent un aspect très semblable à ce que

l'on observe dans un frottis. Comme ils n'ont pas été étalés par le frottis, les

globules blancs paraissent plus petits, avec un cytoplasme plus compact

autour du noyau.

Hématies N : Neutrophile

E : Éosinophile L : Lymphocyte P : Plaquettes

Dans les gouttes épaisses, les parasites, comme les globules blancs,

apparaissent plus petits que dans les frottis. Il vous faudra sans doute regarder

avec beaucoup d'attention avant de les apercevoir. Vous devrez refaire la mise au

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point fine avec la vis micrométrique chaque fois que vous changez de champ.

Vous observerez ainsi la goutte épaisse dans différents plans horizontaux.

Les fins anneaux de cytoplasme apparaissent parfois interrompus ou incomplets.

C'est l'aspect normal des trophozoïtes dans les gouttes épaisses.

De même l'absence d'hématie peut également rendre difficile l'observation des

granulations de Schüffner ; en fait, dans les parties les plus épaisses de la goutte

il est parfois impossible de les voir. On peut cependant souvent observer le

«fantôme» des globules rouges entourant les parasites dans les parties les plus

fines, en général au bord de la goutte épaisse, ce qui aide à poser le diagnostic.

Remarque : Il est impossible d'observer les taches de Maurer avec P. falciparum

dans une goutte épaisse.

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Les espèces plasmodiales dans les gouttes épaisses

PPllaassmmooddiiuumm ffaallcciippaarruumm Trophozoïtes jeunes, en croissance, et/ou gamétocytes matures

généralement visibles

Trophozoïtes Schizontes

Gamétocytes

PPllaassmmooddiiuumm vviivvaaxx Tous les stades sont visibles; semis de granulations de Schüffner dans les

fantômes des érythrocytes de l’hôte, surtout sur les bords de la goutte épaisse

Trophozoïtes Schizontes

Gamétocytes

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PPllaassmmooddiiuumm oovvaallee Tous les stades sont visibles; semis de granulations de Schüffner nettement

visibles dans les fantômes des érythrocytes de l’hôte, surtout sur les bords de la goutte épaisse

Trophozoïtes Schizontes

Gamétocytes

PPllaassmmooddiiuumm mmaallaarriiaaee Tous les stades sont visibles

Trophozoïtes Schizontes

Gamétocytes

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EETTAAPPEE 44 IIddeennttiiffiiccaattiioonn ddeess eessppèècceess ddee PPllaassmmooddiiuumm ssuurr llaa

ggoouuttttee ééppaaiissssee eett llee ffrroottttiiss mmiinnccee

En cas de résultat positif, il est nécessaire d’examiner le frottis mince pour

déterminer le ou les espèce(s) en cause.

Examen du frottis mince

Pour examiner un frottis, procéder de façon systématique et normalisée :

Mettre la lame sur la platine.

Placer l'objectif 100 x à immersion au-dessus du bord du frottis, à mi-distance

de ses deux extrémités.

Mettre une goutte d'huile à immersion à cet endroit.

Abaisser l'objectif à immersion jusqu'à ce qu'il soit en contact avec l'huile.

Examiner le frottis de la façon suivante pour déterminer le ou les espèce(s) en

cause.

Identification des espèces plasmodiales

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Les parasites découverts dans le sang en sont à différents stades de

développement

Les hématies parasitées peuvent rester identiques ou changer de couleur ou de

forme, ou encore contenir des granulations roses (granulations de Schüffner).

Attention : on peut trouver plusieurs espèces associées chez un même malade.

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PPllaassmmooddiiuumm ffaallcciippaarruumm

Trophozoïte jeune Stade fréquent

Cytoplasme : petit anneau fin, bleu pâle, sans granulations Chromatine : 1 ou 2 petits grains rouges

Trophozoïte adulte Stade fréquent

Cytoplasme : anneau bleu soutenu épais, ou aspect en virgule, ou en point d'exclamation

Schizonte Très rare

Pratiquement jamais trouvés dans les étalements de sang (sauf dans les cas très graves)

Mérozoites : 18 à 32 Pigment: brun foncé ou noir

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Gamétocyte Stade assez fréquent

Forme : banane, croissant ou faux Couleur : bleu (mâle) ou bleu soutenu (femelle)

Noyau : rose-rouge Pigment : quelques grains bleu- noir situés au centre du cytoplasme, ou dispersés

Hématie De taille normale

Peuvent comporter des cellules crénelées contenant des trophozoïtes adultes. Contiennent souvent quelques grains rouges de taille et de forme irrégulières.

Densité parasitaire Souvent très élevée

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PPllaassmmooddiiuumm mmaallaarriiaaee

Trophozoïte jeune Stade fréquent

Cytoplasme : anneau bleu soutenu épais, avec quelques grains de pigments noirs Chromatine : 1 grosse tâche rouges

Trophozoïte adulte Stade fréquent

Cytoplasme : soit tâche compacte, arrondie, bleu foncé, avec de nombreux grains de

pigment noirs, soit disposé en bande (étalements minces seulement). Chromatine : tâche ronde ou bande rouge

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Schizonte Stade assez fréquent

Mérozoites : 8 à 10 Chacun est une grosse tâche rouge entourée d’un peu de cytoplasme pâle.

Ils peuvent avoir une disposition irrégulière (forme jeune) ou être disposés en couronne (forme adulte

Gamétocyte Stade assez fréquent

Forme : grand, ovale ou arrondi Couleur : bleu soutenu (femelle) ou clair (mâle)

Noyau : une tâche ronde de chromatine rouge contre un bord Pigment : gros grains noirs dans le cytoplasme

Hématie De taille et forme normales

Peuvent comporter des cellules crénelées contenant des trophozoïtes adultes. Contiennent souvent quelques grains rouges de taille et de forme irrégulières.

Densité parasitaire Faible

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PPllaassmmooddiiuumm vviivvaaxx

Trophozoïte jeune Stade fréquent

Cytoplasme : anneau bleu assez gros, à contour irrégulier Chromatine : 1 grain rouge, assez gros

Trophozoïte adulte Stade peu fréquent

Cytoplasme : large tâche bleue, irrégulière (quelque fois divisée en 2, 3 ou 4), avec de petits grains de pigment brun-orange.

Chromatine : une tâche rouge

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Schizonte Stade assez fréquent

Mérozoites : 12 à 18 gros grains rouges compacts, posés sur le cytoplasme bleu pâle

Gamétocyte Stade fréquent

Femelle : ovale ou arrondi, bleu soutenu (femelle) ou clair (mâle) Noyau triangulaire rouge soutenu, souvent placé à une extrémité; nombreux

grains de pigments orange dans le cytoplasme. Mâle : arrondi, bleu clair

Noyau central rond, rouge clair; quelques grains de pigments orange dans le cytoplasme

Hématie Grosses granulations de Schüffner, souvent colorées en rose, surtout autour des

trophozoïtes adultes.

Densité parasitaire Moyenne

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PPllaassmmooddiiuumm oovvaallee

Trophozoïte jeune Cytoplasme : anneau régulier, bleu soutenu

Chromatine : 1 grain rouge de taille moyenne

Trophozoïte adulte Cytoplasme : tâche ronde compacte, très bleue avec quelques grains de pigment

bruns. Chromatine : une grosse tâche rouge

Schizonte Mérozoites : 8 à 14 grosses tâches rouges en couronne, autour d’un amas central

de grains de pigments bruns.

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Gamétocyte Stade fréquent

Forme : grand, ovale ou arrondi bleu soutenu Noyau : une tâche ronde

Pigment : quelques grains bruns dans le cytoplasme Différent de P. vivax par son pigment brun et de P. malariae par la présence de

grains de Schüffner

Hématie Peut paraître ovale, avec des extrémités irrégulières

Grosses granulations de James rouges, facilement visibles.

Densité parasitaire Moyenne

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EETTAAPPEE 55 EEssttiimmaattiioonn ddee llaa ddeennssiittéé ppaarraassiittaaiirree ssuurr llaa ggoouuttttee

ééppaaiissssee oouu ssuurr llee ffrroottttiiss mmiinnccee En cas de résultat positif, il est nécessaire d’estimer la densité parasitaire car la

gravité de l’infection palustre est liée au nombre d’hématies parasitées.

Un paludisme à P. falciparum est considéré comme sévère quand le nombre

d’hématies parasitées est supérieur à 100000 par µl, l’accès pernicieux est

probable au-delà de 150000 par µl. Une parasitémie supérieur à 400 000 par µl

est un élément de très mauvais pronostic

Sur la goutte épaisse

On estime la densité parasitaire sur la goutte épaisse quand le nombre de parasite est faible.

Le calcul de la densité parasitaire va être établit par rapport aux leucocytes. Il

suffit de compter le nombre de parasites que l’on voit et de compter au moins 200

leucocytes. On peut s’aider pour cela d’un compteur de cellules. On estime que le

nombre moyen de leucocytes est de 8000 par µl.

Le calcul du nombre de parasites par µl est

8000 x Nombre de parasites comptés Nombre de parasites par µl =

Nombre de leucocytes comptés

Le pourcentage d’hématies parasitées peut en être déduit en prenant comme

nombre moyen d’hématies, 4 500 000 par µl :

Nombre de parasites par µl

Pourcentage d’hématies parasitées = 45000

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Exemple :

On compte 358 parasites et 205 leucocytes sur la lame

Le nombre de parasites par µl est donc : (8000 x 358) / 205 = 13 971 par µl

Le pourcentage d’hématies parasitées est donc : 13 971 / 45 000 = 0,31 %

Sur le frottis mince

On estime la densité parasitaire sur le frottis mince quand le nombre de parasite est élevé.

On compte le nombre d’hématies parasitées par rapport au nombre d’hématies

saines et on établit le pourcentage d’hématies parasitées.

Il suffit pour cela de compter dans 3 à 4 champs microscopiques, choisis au

hasard mais éloignés les uns des autres, le nombre d’hématies (au minimum de

1000 hématies) et le nombre d’hématies parasitées.

NB : un champ microscopique à l’immersion (x 100) contient entre 150 et 300

hématies

Environ 150 hématies Environ 300 hématies

Le pourcentage d’hématies parasitées est donc :

Nombre d’hématies parasitées x 100 Pourcentage d’hématies parasitées = Nombre d’hématies saines

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Le nombre de parasites par µl peut être calculé en prenant comme nombre

moyen d’hématies, 4 500 000 par µl :

Nombre de parasites par µl = % d’hématies parasitées x 45 000

Exemple :

On compte 16 hématies parasitées sur 5 champs microscopiques d’environ 300

hématies.

Le pourcentage d’hématies parasitées est donc : (16 x 100) / 1500 = 1,06 %

Le nombre de parasites par µl est donc : 1,06 x 45 000 = 48 000 par µl