10
Enhanced resistance of HeLa cells to cisplatin by overexpression of g-glutamyltransferase Sandrine Daubeuf a , Pierre Leroy a , Aldo Paolicchi b , Alfonso Pompella b , Maria Wellman a , Marie Madeleine Galteau a , Athanase Visvikis a,* a Thiols et Fonctions Cellulaires, Faculte  de Pharmacie, Universite  Henri Poincare Â-Nancy 1, 30 rue Lionnois, 54000 Nancy, France b Dipartimento di Patologia Sperimentale, Sezione di Patologia Generale, Scuola Medica, via Roma, I-56126 Pisa, Italy Received 7 November 2001; accepted 25 April 2002 Abstract g-Glutamyltransferase (GGT), which is a key enzyme for the cellular glutathione (GSH) homeostasis, was shown to be overexpressed in human tumor cells selected for resistance to cisplatin and to in¯uence the resistance of experimental tumors in vivo. We ®rst established that cisplatin treatment of HeLa cells was accompanied by an early 3-fold induction of GGT synthesis, enhancing the possibility that this enzyme plays an important role in the cell defenses against this anticancer drug. This role was then studied using a GGT-transfected HeLa cell line (HeLa±GGT) exhibiting 10 times the activity of the parental HeLa cells (120±150 and 10±14 mU/mg protein, respectively). Both cell lines showed comparable intracellular GSH levels and cisplatin resistance when cultured in high (250 mM) or low (50 mM) cysteine- containing medium. When 50 mM of GSH were included in the low-cysteine culture medium only HeLa±GGT cells partially recovered their intracellular GSH and exhibited an increased resistance to cisplatin. Cisplatin treatment also inhibited GGT-dependent production of reactive oxygen species, a process depending on the availability of cysteinylglycine produced during GSH catabolism. Furthermore, we showed that cisplatin forms adducts with cysteinylglycine 10 times more rapidly than with GSH, and that these adducts were formed only in the extracellular medium of HeLa GGT cells. This extracellular mechanism could at least partially account for the increased resistance of GGT-rich cells to cisplatin. # 2002 Elsevier Science Inc. All rights reserved. Keywords: Cisplatin resistance; g-Glutamyltransferase; GSH catabolism 1. Introduction The tripeptide g-Glu±Cys±Gly (GSH) is the main non- protein intracellular thiol. It plays a crucial role in the maintenance of the intracellular redox state and thus protects the cell against oxidative injuries. GSH reacts also with many toxic agents to form conjugates which can be easily excreted by means of speci®c transporters [1]. The elevation of intracellular GSH has been widely demon- strated in cells resistant to platinum agents, especially cisplatin (CDDP) [2] and the depletion of GSH sensitizes cells to these compounds [3]. However, it is not clear how GSH acts exactly, e.g. by complexing and exporting the drugs via the GSH-X pump [4], or by protecting cells against reactive oxygen species (ROS) [5], or also by increasing DNA repair [6]. The increase of intracellular GSH level in resistant cells could depend on induction of g- glutamylcysteine synthetase (g-GCS), the rate-limiting enzyme in GSH synthesis, but several experimental evi- dences showed that under physiological conditions, cysteine availability, and not g-GCS activity, is the key factor determining intracellular GSH synthesis [7]. In view of this, an important role could be played by g-glutamyl- transferase (GGT); in fact, GGT is a cell surface enzyme that initiates the cleavage of extracellular GSH, thereby providing GGT-positive cells with a secondary source of cysteine capable of enhancing the intracellular synthesis of GSH [8]. GGT activity was shown to be induced in cells selected for their resistance to CDDP [2,9] and in samples from a patient resistant to CDDP-based chemotherapy Biochemical Pharmacology 64 (2002) 207±216 0006-2952/02/$ ± see front matter # 2002 Elsevier Science Inc. All rights reserved. PII:S0006-2952(02)01118-8 * Corresponding author. Tel.: 33-3-83-68-21-54; fax: 33-3-83-68-21-54. E-mail address: [email protected] (A. Visvikis). Abbreviations: GSH, glutathione; GGT, gamma-glutamyltransferase; cysgly, cysteinylglycine; g-GCS, gamma-glutamylcysteine synthetase; CDDP, cis-diamminedichloroplatinum(II); LC-DMEM, low-cysteine DMEM; HC-DMEM, high-cysteine DMEM; ROS, reactive oxygen species; DHR-123, dihydrorhodamine-123; Rh-123, rhodamine-123.

Enhanced resistance of HeLa cells to cisplatin by overexpression of γ-glutamyltransferase

Embed Size (px)

Citation preview

�������� ������� � ���� ���� �� ������ �� ������������ �������������� ����

������� ������ �� ����� ������� ���� ��������� �� ��� �������������� �������� ���� �������� !�������� ������� "�#��$

������� �� ������ ���� ������� �� ���� �� ���������� ���������� ���� ������������� �� �� � � ������� � ��� ����� �����!�"�������� �� ������#�� $"���������� $�%��� �� ������#�� &������� $� ��� '������ ��� (���� )��*�+* ����� )����

%������ & '������� ())*+ �������� (, ���� ())(

��������

��!����������� ���� -!!./� 0��� � #�� ��1��� �� ��� �������� ���������� -!��/ �������� 0� ��0� �� �� ����������� ������ ����� ���� ������� �� ������� �� ������ ��� �� �2����� ��� ������� � ����������� ����� � ����3 � 4�� ��������

���� ������ ��������� � ���� ���� 0� ���������� �� �� ����� 5� ��� ������� � !!. ������ �������� ��� ������ ���� ��

��1��� ���� �� �������� ���� � ��� ���� �� ��� ����� �� ��������� ����3 .� ���� 0� ���� ����� ��� � !!.����� ����� ����

���� ��� -����6!!./ ������� *) ��� ��� ������ � ��� �������� ���� ���� -*()6*,) ��� *)6*7 �89�� ������� ����������/3 :���

���� ��� ��0�� ���������� ������������ !�� ����� ��� ������ ������� 0��� �������� � ��� -(,) ��/ �� ��0 -,) ��/ ��������������� �����3 ��� ,) �� � !�� 0��� ������� � ��� ��0������� ������� ����� ���� ����6!!. ���� �������� ������������� ������������ !�� ��� ������� �� ������� ������� �� ������3 ;����� ��������� ��� ������ !!.���������� ��������� �

������� ������ ����� � ����� �������� �� ��� ��������� � ������������� �������� ����� !�� ��������3 <����������� 0�

��0�� ���� ������ ��� ������ 0�� ������������� *) ��� ���� ������ ���� 0�� !��� ��� ���� ���� ������ 0��� ����� ����

� ��� ������������� ����� � ���� !!. ����3 .� ������������� ������� ����� �� ���� �������� ������� �� ��� ������� �������

� !!.���� ���� �� ������3 � ())( ������ ������ =��3 ��� ���� �������3

,��-����. ;����� �������+ ��!����������� ����+ !�� ��������

� ���� ������

.�� �������� ��!��6;�6!�� -!��/ ��� ��� ���������� ������������ ����3 =� ���� � ������ ���� � ���

���������� � ��� ������������ ����� ���� ��� ���

������� ��� ���� ����� ������� �>���3 !�� �����

��� 0�� ���� ���� ����� �� ��� ���>����� 0��� ���

�� ���� �������� �� ���� � ���4� ���������� ?*@3

.�� �������� � ������������ !�� �� ���� 0���� ������

������ � ���� ������ �� ������� ������ ��������

������ -;���/ ?(@ ��� ��� �������� � !�� ���1�

���� �� ���� �������� ?5@3 ��0����� � ��� ����� ��0

!�� ��� �������� �3�3 �� ��������� ��� �������� ���

���� ��� ��� !���A ���� ?7@� �� �� ��������� ����

����� ������� ������ ���� -%B�/ ?,@� �� ��� ��

������� �'� ����� ?C@3 .�� ������ � ������������

!�� ����� � ������ ���� ����� ������ �� ������� � ���������������� �������� -��!;�/� ��� ������������1��� � !�� ������ ��� ������ ����������� ���

����� ��0�� ���� ����� ���������� ��������

������ ���������� ��� ��� ��!;� ������� ��� #�� ����� ��������� ������������ !�� ����� ?&@3 =� ��0

� ��� �� �������� ���� ����� �� ������ �� ��������������� ���� -!!./+ � ���� !!. � ���� �� ��� ��1���

���� ����� ��� �������� � ������������� !��� �������

������� !!.������ ���� 0�� � �������� ����� �

������ ������� � �������� ��� ������������ ����� �

!�� ?D@3 !!. ������ 0� ��0� �� �� ������ � ����

������� �� ���� ������� �� ;��� ?(�E@ ��� � �����

��� � ������ ������ �� ;�������� ������������

:�������� ������������ C7 -())(/ ()&6(*C

)))C�(E,(9)(9F 6 �� ���� ������ � ())( ������ ������ =��3 ��� ���� �������3

�==G � ) ) ) C � ( E , ( - ) ( / ) * * * D � D

$ ;���������� ������3 .��3G �55�5�D5�CD�(*�,7+ ��G �55�5�D5�CD�(*�,73

/����� �������. ��#H������3���������3 � -�3 "�#/3

011���������. !��� ����������+ !!.� ������������������ ����+

������ �������������+ ��!;�� �������������������� ��������+;���� ������������������������-==/+ �;������ ��0�������

����+ �;������ ���������� ����+ %B�� ������� ������

����+ ��%�*(5� ���������������*(5+ %��*(5� ���������*(53

?*)@3 ;��� ��� � ��� ��� � 4���� ��������� �����

����� � ������ � ��� ������ ��� � �� ����� ��

��� ��I���� ��������� � ;���������� ���� �������

���3 ���� ���� ��0�� � ��������� ���0��� ���

����� ��� ��1��� ������� �� !�� �������� � �����

����� �� � �������� ���� ��� ?**@3 ) ����� ���� ��

��� '������ ;����� =������ ���� �������� �������

��0�� �� ��������� ���0��� !!. ������ ��� ���

����� �� ��#������ ����� ?*(@� ��0���� ���� ���� 0���

��� ����� � ������� ����� ��� � ������� ��� �#���

������� ��� ���� � !!. � ������� �� ��������

����� �� �� ���� ���3

.�� �� � �� ���� 0� �� �������� ��� ���� � !!.

����������� � ������ ���� ������� �� ;��� �����

���������� �������3 .� �� ��� 0� �������� �����

������� ������� ������� -(,) �� � ������ � ���������� �����/ ��� ����� ������� ������� ����� �� ���

���������� ������������ � ������ -,) ��/� ��� ������� �� ;��� � �� ����� ���� ��� �����������

����� !!.� ����6!!.� ��� ��� �������� ���� ���� ����3

� �������� �� ����� �

+2�2 ���� ����� � �� �� �������� �� ���������

.�� ����6!!. ���� ��� 0� �������� � ��� �������

���� ��� �����.���� -;�������/ ����� � ��� ����� �����

����� �� ��� ������ �.%��!!. �������� ��� ��� ������

��'� � ����� !!. ?*5@3 .�� ��� ������ �I����� �

��� ����� !!. 0��� ������ � ��� ��� ===9A��= �� �

��� �.%�( ������ ��� ���� ����� ����� 0�� ��� �.J�

��� ������� ����� �� ���� ���� ��� ��� �������3

.0����� ��� ���� � ��� ���� ������ ���� 0��� ����� �

E) �� ���� ��� �� 7� *), ����9��3 .�� ���� 0�������0�� �� ������� ��� ����������0� ����� �� ��� �������

����� �� *)) ��9��3 ����������������� �������0��� �������� � ��� 5 0��# 0��� ��������� ��#��

�� ��� ������ ������� -����/� ��� ��������3 ���

� 4���� ������� 0� ��������� ��� !!. ������ � ����

����� 0� �������3 B�� ����� ����� ����6!!. 0�

���� �� ����� *(,6*,) �8 � !!.9�� ������� ���

������� �� �� ����3 .�� �������� ���� ��� ������

*)6*, ��� ��0�� !!. ������ -*)6*7 �89�� ������/3

;��� 0��� ���0� � ���� -����� �� ����� ����

��� (,) �� ������ ��� ��������� ��� 0�� �� �� ������ ���������� ����� �;�����/ ����������� 0��

*)K -�9�/ ���� ��������� ���� ��� ���� -:��������/� *K

-�9�/ �������6��������� ������ -����/3 .�� ����

0����� ������ ��� �������� -����/� 0� ���������

��� 0�� ,) �� ������ ��� ,) �� �������� -!���/-�� ����� 0�� �� �� ����� � ��0������� �����

�;�����/ ��� ��� �� ��������� � ����� 0��

��0 ����� � �� ����������� ���� ���3 ;������ 0���

�������� �� 5&� � � ����4�� ��������� � E,K �� ���,K ;B(3

�� ������ � , �� ������������������������-==/

-;���/ -����/ ���# ������ 0� �������� � *,) ��

'�;� ��� ����� �� �7�3 .�� ���# 0� ����0�� ����� 70��#3

+2+2 0������ �3 &&� �(�0� �4"������

� ��� (7 �� � ;��� ���������� ����� �%'� 0�

��������� ��� ��� !������� %'� ��������� #� -����/3

.���� %'� � 7 �� 0��� ��� �� ������ ����������0�� ()) 8 � ����" ������ ���������� -�������/

��� )3, �� ����-�./*C6*D � ,) �� �������� ,) ��.�6�;� �� D35� &, �� J;�� 5 �� ��;�(� *) ��

�.. ��� * �� � ���� �'.�3 !!. ����� �%'� 0�

����4�� ��� ����� ���*6���( -��� �����G

,����.!!�;!�;..;�!;.;.;;�5� ��� ������ ������ ,���!;;!��;;�!�!!..!.�!��5�/3 �(������������� �I����� 0��� ����4�� 0�� ��� �����

-,���;;;;;�;.!�����!�.!��5�/ ��� ����� ������ -,���.;..;���;;.;;�.!�.!�5�/3 ����� � !!. ������ �� ��� ; �%'� ������� 0� ��� �����

��� ������ � ����� -���G ,��;�;�!!!!�;�.�;��!.!�!�5�� ������G ,��!���.�!;.!��!;�;!�;!;�5�/� ��� ������ ����� -���G ,��!;;;�!���!.!�!�!;�!..�5�� ������G ,��.;;�!���!;�!�;.�!�!!!�,�/ ?*7@3 %���� 0��� ������1�� �� ��� �(������������ ����3

+2�2 '��� ����� �3 &&� ��������

!!. ������ 0� ��������� ��� �������������5����������7���������� ��� ������������ � ����� ��� ������

��� ������� � �������� ������� ?*,@� ��� 0�

������� � �89�� ������ -���� � ,��������1����9

��9�� ������/3 ������ ������������ 0� ���������

��� :�%�� ������� -;����� :���/ �������� �� ���

���� �������L ������������� ��� ����� ���� �����

�� � �������3

+2 2 '��� ����� �3 �������� ��� &$� �� �3

�4������� ��� &$� �� ��������#����� 5���#��6

+2 2�2 $��"�� "��"������ 3�� �������� ��� &$�

���� �����

.�� ���� 0��� ����� � C�0��� ����� ��� ��������

����� � �;����� �� � �;����� ����� (7 ��3 ;���

0��� ���� �������� �� �������� (7 �� � �;����� ��

�;����� � ��� ������� �� ������ � , �� ;���3 =������� ��� � ��� � ,) ��!��0� ����� � �;������ ��� ������� �� ������ � , �� ;���3 ;��� 0���0���� 0�� ���� �:�� ������� � ,)) �� � 535K -09�/��������� ���� ��� ����� ���� �� *(�))) # �� , �� ��

�7�3 .�� ���������� 0� ��� �� ���� ���������� ������ ������ �� ������ �����������3 :��� �������������

��� ������������ ����� 0��� #��� �� �D)� ���� ���;�����3

()D !2 $����� �� ��2 7 8���������� ����������#� * 5+��+6 +�9:+�*

+2 2+2 $��"�� "��"������ 3�� �4������� ��� �����

���� �����

���� ��� ����6!!. ���� ����� � C�0��� ����� (7 ��

�� ��� ��������� 0��� �������� � ���� ��������

* �� !�� �� �� &373 .0� ������� �������� ��I��� �

����� 0��� ������ � ��� ������� ������� ����� ���

���� 0�� ()) �� 535K -09�/ ��������� ��� ������3���� �� ���; ������ ����� 0��� ������ *)� ��� � �

)3EK -09�/ '�;� �������� 7 �� ��.�3

+2 2�2 ���� �������

.�� ���� ���������� 0��� ��� ����� ��� � ������

���� ���;������ ������� � �������� ��� � ���4��

���� 0�� ���������������� -.:�/ ��� ���������

������1���� 0�� � ������������ 2�������� ��������

&�2�����(�*�5����1�����1����7��� ������ -�:��</ �

�������� ������� ?*C@3 :��2�� �� *)) �� � ��� ������������ ������ ,) �� � ��� ������� ������� -����������� ���� )35 �/� () �� )3, � '�B� -*)) �� � ������ � ������������ �����/� (,) �� )3( � ������ �� ���� E3)� ,) �� ,K -�9�/ .:�� ��� ,) �� (35 �� �:��<0��� �����3 .�� ������� ������ 0� �������� �� ,)� ��() ��+ ���� ��� ������1���� ������� 0� ������ ��

����� ,) �� * ��;�� ��� ���; ����� 0� ��� �����3

+2�2 $ ������ ������

;��������� 0� ���� �� ��� �.. -5�-7�,�

����������1���(���/�(�,������� �����1���� ������/

���3 ���� �� ����6!!. ���� 0��� ������ � EC�0���

����� ��� �������� �� (7 �� � ��� ���������� �����3

.���� ���� 0��� �������� � ()) �� � ����� ��������� ��� ������� ������������ � ;���3 � ��� ��������

(7 �� � �������� () �� �.. -, ��9��/ 0��� ����� �� �������� ����0�� �� �������� �� 5 ���� ����3 .��

������� ����1�� ������� 0� �����1�� � ()) �����B ��� �������������������� ������� �� ,E, ��3

+2*2 '������# �3 �������� �4�#� �"����� "��� ����

M����4����� � %B� 0� ��� ����� ��� ��� ����

������������*(5 -��%�*(5/ ����� 0��� ���1�� ��

����� %B� �� ��� 2�������� ���������*(5 -%��*(5/

?*&@3 � ���# ������ � *) ����%�*(5 0� �������� �

������� �������3 ;��� 0��� ����� � C�0��� ����� �

�;����� (7 �� �� ��� ��� ���������3 .���� ��� ����

0��� ������ 0���� 0�� ( �� � �:� ��� �������� �� 5&� �� * �� � �:� �������� * �� !��� (, �� ��%�*(5�*,) �� <�5� ��� *C, �� ��.�3 .0� ������� ����������I��� � ����� 0��� 0�����0� ��� 2��������� 0�

������� ��� � ��������� 2�������� -;���2��� (5,)+

�������+ :�� ���� ��� 8��/ �� �� �������� ��� ���

�� 0��������� � 7D, ��� ,5) ��� ����������3 �����

����� ��������� �������� * �� !��� (, �� ��%�*(5��� *,) �� <�5� ��� *C, �� ��.� � �:� 0� ��� ��������3

+292 0������ �3 &$�: �� ���#��:�!!� ��� ���

.�� ����� � !��6;��� ��� �����6;��� ������

0� ���� �� ��� �������� � :�������� �� ��3 ?*D@3 .��

���; ���� ��� �� ������ ��� ��������� � ;���6

���� ������ ������� �� ������ ����� � �������>�����

4���� 0�� � () �� ���� -����� %������� &*(,/� � ����������� �������� ������ -�;������� %� *D ��� ������

-, ��/ (,)� 7 ��+ ����# ��������/ ������ 0��)35, �� ����������� �������� �� �� �� (3, �� � 2�0

���� � )3D �� ���* ��� � 8" ���������������� ��������� �������� �� (5) ��3 ���� 0��� �������� ��� ��

���������3 %������� ��� � ;���� ������ !��6;����

;���6������ ��� !�� 0��� ��3 (3&� (3D� 53)� 535 ���

,3, ��� ����������3 ����# ������ � ;��� ��� ����

���� 0��� �������� �� � ������������ � 535 �� � �

*) �� �������� �� �� �� &37 ����� 0�� *,) ��'�;�3

;��� ��� ���� ������ 0��� ���� � � *G*) ���� -�9�/�

��� ��� ������ 0��� �������� �� 5&�3 �� � ����� ���������� ������ ��� ) �� (, ��� ��I��� 0��� 0���

���0� ��� ��������� �>����� ��� ��� ���; ����3 '�

��4���� � ������ ���0��� ��� ����� ��������� �

���� ���� �� (5) �� 0� ������� ��� ;��� ���������

0� �� ���� *)� ��� �� ���� ���� �� �� 0���������3

.��� � ����� �� ��������� ��� ������� ���� � ��� ������

-������� � ��9��/� � 0� �������� ���� ��� ������

��������� 0� ����� ��� �� ��� ���� ����������3

=� ����� �� ���� ��� ������� � ;���6����� ������

� ��� ������� ����� � ��� �0� ���� ���� � ��0 ���;

���� 0� ���������3 =� ���� � � �I��� ;*D -5 ��/*,)� 5 �� 3�3 ������ -������ ������/ ������ 0�� �*) �� �������� �� �� �� (3& �������� , �� ������

���� ��� ���� �� � 2�0 ���� � )3, �� ���*3 8"�������� 0� �������� �� (*, ��3 .�� ������ � ���

���������� -��������� ��� ���/ ����0�� ��� � 4����

�������� � ;���6����� ������ ��� ;���6!��

������� ;���� !�� �� �����3 %������� ��� � ;����

;���6!��� !��� ����� ��� ;���6����� ��� 0��� ��3

(3)� 535� ,3D� C3) ��� &3D ��� ����������3

+2;2 $���������� �������

��� ��� 0��� �� �� � ��������� ��� ��� ����� 0���

������� � ��� ���� ��� ������� ������� -����� ��/3�������L ������� ��� 0� ��� �� ������� �����3

� �������

�2�2 )� ���� �3 &&� �4"������ � ���� ����� �3���

�!!� ��������

��� ���� ��� ���� ������ �� ;��� � ��� ��0

�������� ������������ !��� ��!;� ��� !!. ������?(@� ��� � ��� � � ���� ��������� ;��� ��������� ��

!!. ������ �� ��� ��� ���� � ������� ��� 0���

!2 $����� �� ��2 7 8���������� ����������#� * 5+��+6 +�9:+�* ()E

����������� �������� � ����� ���� ���3 .��� 0� 4��

����� ��� ��������� � !!. ������ � ���� ���� � ���

;��� ���������3 �������2���� ���� ���� 0��� �������

0�� ����� ������������ � ;��� -)6*) ��/ �� (7 ���7D ��� ��� !!. ������ 0� ������� � ���� �������3

� ��0� � <�3 *�� !!. ������ 0� ������ ������

� ������ �� ;��� -*37� ��� � ��� (7 �� ��������� 0��

(3, ��� ;���/3 ������ ������� 0� ������� � ���7D �� �� ��������� 0�� (3, ��� , ��� ;��� -(3D� ���/3.�������� 0�� ����� ;��� ������������ -*) ��/

<�3 *3 ;��� ��������� ����� !!. ����� � ���� ����3 -�/ =������� � !!.������G ���� 0��� ������� 0�� ) -�������/� *� (3,� �� , �� � ;��� ��(7 �� -�/ �� 7D �� -�/ ��� !!. ������ 0� ������� � 0���� ���� �������3 %���� ��0� ��� ����� �� � ����� ���������3 ��� � )�))* �3 �������

����3 -:/ =������� � !!. ����� �%'� �����G ���� 0��� ������� 0�� ) -�������/� (3, �� , �� � ;��� (7 �� �� ��� ����� %'� ���������3 %.��;% 0���� ����� � ������� � ������ (3 .�� ������� ������ � !!. ����� �%'�0� ������� �� ��� ���� !!.9�(������������ ����3 ���� ��� ��� ���� � �0� ���������� ���������3 =����G ���������� � ��� ����������� ������ ��� ��� �� I���� ����� � !!. ��� �(������������ ����+ ���� *G������� �������+ ���� ( ��� 5G ������� ����+ ���� 7 ��� ,G ���� ������� 0�� (3, �� ;���+ ���� C ��� &G ���� ������� 0�� , �� ;���3 -;/ =������� � !!. �%'� ������G %.��;% 0� ��� ����� ��� ����� ������ � -�/ �� ������ ; -�/ ��� � ������ ����������� ��� ����0�� �� �������� ����3.�� ������� ������ � ���� !!. �%'� ������ 0� ������� �� ��� ���� !!. ������9�(������������ ����3 =����G ���������� � ��� ������������������� ���� ��� �� I���� ����� � ���� !!. �%'� ������ �����3 .�� ����0 ������ ��� �������� ����� ��� ��� ������ ��� ����������� 1�3

���� *G ������� ����+ ���� (G ���� ������� 0�� (3, �� ;���+ ���� 5G ���� ������� 0�� , �� ;���3

(*) !2 $����� �� ��2 7 8���������� ����������#� * 5+��+6 +�9:+�*

������� � � ��0�� ������� � !!. ������� �#��� ��� ��

�� ������� ���� ���� ����� -���� ��� ��0�/3

� ���� ������� 0������ ��� ������� � ��� !!.

������ 0� ��� �� �� ������ � ��� ��1��� �����3

.���� %'� 0� ��������� ��� ������� ��� ;�����������

���� ����� ��� ��� !!. ����� �%'� ����� 0� ���������

�� %.��;% ��� ���*6���( �����+ �(������������0� ��� � �� ������� �������3 � ��0� � <�3 *:� ���

!!. ����� �%'� ����� ������� � ��� (7 �� ��������� 0��

(3, ��� , �� � ;���� ��� ��0�� ���� ��� ������ �!!. ������ � ��� ;��� ���������� �������� �� ���

������ � ��� ����������� �%'�3

!!. ���� = �%'� ��0 � ���������� � ���� ,�

8.% ��� �� ���������� ����� ����� ��� �������� �� ���

�� � � ����� �������� ?*E@3 � ���� �������� ��0�

���� � ���� ����� �0� ������ -� ��� ;/ � !!. �%'�

= 0��� ����� ������� ��� ���� ���� 0��� � �������

��������� � ��� *(�<�������������� ������� *5��������

-.��/� .'<� �� �������� ��������� ?*7@3 � ��0� �<�3 *;� (7 �� ;��� ��������� ������ ���� ������3

������� �0� ������ � � ������������� ������ -�� ,�

��� &� ��� � ��� (3, ��� , �� ;���/3 ������� ; 0������� �� 7� ��� �� ����� ���������3 .��� ��� �������

������ � !!. ����� �%'� = 0� ��� �� ��� ������ � ��

���� ���� �0� ��������� ������3

.�#�� ��������� ���� ����� ��0 ���� ��� � ��� �����

������ � ���� ���� �� ;��� ��������� �� ������

� !!. ����� ��� ������3

�2+2 /���1������� �� ����������%���� �3 ����:&&�

���� ���

� ���� �#�� 0������ ��� ������� ������ � !!.

������ ����� ������ �� ��������� �� ��� ���� ������ ��

;���3 ;��� ����� �����4�� �� ���>������ 0��

!�� ��� ����� �������� ����� ��� ���� ?7@3 !!. ���

���� � ������ ���� � ;��� �����4����� �� ������� ���

�������� � !�� ������ �������� 0��� ��0 ����

��������� � ������������� ������ ��� ������3 =� ����� ��

������ ���� ��� �2����� � �� ������� !!. �������

0� ���� ����� ���� ���� 0�� ��� �.%��!!. ������ ���

0� �������� � ���� ��� ������� ����� *()6*,) �89

�� � !!.3 :��� ���� ��� ����6!!. ���� ��� �������

���� ��!;� ������ -C(� (�, ��� ,D� ( ���� ������� �����9��9��� ����������/3

�2+2�2 )������� ��� &$� ������

� 4�� ����� ��� ���4����� � ��� ������������

!�� ����� � ��� �������� ���� ��� ��� ���� ����� ����6

!!. ���� ��� ����� � ����� ������� �������� ��� �

��� ������� �� ��� � , �� ;���3 %���� ��� ������1�� � .���� *3 8���� ������� ������� ������� -�;�

����� (,) �� ������/� ���� ���� ��� �������� ����������� ����� � ������������ !�� -5E�,� 5�& ���5,�E� 5�, ����9�� �� ���� ��� ����6!!. ���������������/3 �������� ��� ������������� ������������

� ������ �� ,) �� -�;�����/� 0��� ��� ������������� ���� � ����� ����� ������� � � �������

������� � ��� ������������ ����� � !�� -D� ���/ � ����

���� ���� 0��� ��� ������� ���������� ����� � �����

�������� !�� -,�5� (�, ��� 5�&� )�C ����9�� �� ������� ����6!!. ����� ����������/3 ����� ��� ��0 �����

�������� !�� ������ ��� ���� ���� ������ 0� ��� � �����

-��� ��0�/3 ��� ,) �� � !�� 0��� ����� �� ��� ������������ � ��� �;������ 0� �������� ���� � ����6

!!. ����� � ,� ��� ������ � ��� ������������ !�� �����

� �������� ����� �� ��� ���� ���� �������� � ��� ���

����� �� �� ����6!!. ���� �������� � ��� �;�����

�����3

.��� ����� ���������� ���� �� ������������ ��0

������������ � ������� ��� !!. ������ � ��� ����

���� � ������������� !��� ��� � ������� ������� ���

������������ !�� �����3

8���� ����� ������� ������� ������ � ���� ����6

!!. ��� ���� ���� ���� ��������� 0�� , �� ;��� ��(7 �� ������� ��� ������������ !�� ����� -.���� */�

������� ���� ��� ;������������� ������ � ��������

����� !�� ������������ 0� ���������� ��� ��� ����

����� � ��� ������� ����� ��� ��� !!. ������3

�2+2+2 ������4����� �3 �!!�

� ���� ������ ����� ��� ��� ������� �������� ���

���������� � ;��� �� ��� �0� ���� ��� ��� ��� ����

������ 0� ��������� ��� ��� �.. ���3

� ��0� � <�3 (� ��� :� ��� ���������� � ;����

0� ���������� ��� ��� � ���� ���� ��� ����6!!.

���� ��� � ��� ������� � ��0� �� ���������� ����

��������� � ��� ����� -=;,) &3, �� � ��� �������/3.��� ����� ������ ����� � ���� �������� ������ �����

��� � ������������ !��� ����I���� �� � ����� ������

���������� �� ��� � ��� ��� ;��� ������3 ��� ,) ��

.���� *

=�2����� � ������������� ���-�/�� ������������ ��� ;��� ��������� �� ������������ !�� �����

!�� -����9�� ������/

(,) �� �� ,) �� �� ,) �� �� � ,) �� !���;��� �, �� ;��� �;��� �, �� ;��� �;��� �, �� ;���

���� 5E3, � 53& ,(3C � C37 ,35 � (3, &3) � )3D 73) � )3( &35 � (3D����6!!. 5,3E � 53, 753C � 53) 53& � )3C E35 � (3, *E35 � 73&$$ (&3) � (3C$$

$$ � � )�))* � �������� ���� ���� �������� ����� ��� ��� �������3 ��� ��4���� �� ����6!!. ���� �������� � ��� ������� �

,) �� ��3

!2 $����� �� ��2 7 8���������� ����������#� * 5+��+6 +�9:+�* (**

!��0� ������� � ��� �;����������� ����6!!.

���� ��0�� � ��4������ ����� ������ ��� =;,) 0���

���������� 0�� (3, �� , �� � ;���3 =� ������� �����0� �� ������ � ��� ������� ������ � ��� ���� �� ���

���� ���� ���3

.��� ����� ������ �� ������� �������� �� ��� �����

������������ !�� ������� � ����6!!. ���� -.���� */�

������ �0� ��0�� -<�3 (����:/� ��� ������������!��

������������ �� ��� �2����� ��� ;��� ������3 .�����

���� 0� �#�� 0������ �� ������������� ������ �������� ��

!!.���!��� ����� �� �������� �� ��� ������� �����

������� � ����6!!. ����3

�2+2�2 &$� ����1�����

���� ��� ����6!!. ���� 0��� �������� � ��� ����

���� � * �� !��� ��� ��� ���������� � ��� ��������

��� ��� ���������� � ����� 0��� ������� ������� �

E) �� �����3 � ��0� � <�3 5�� � ��� E) �� ����

���� ������� ���� ()K � ��� !�� ������ � ���

����� 0����� ����� ��� ��� ��� ������ ����6

!!. ���� ������� E)K � ��� ������������� ��������3

.�� !!.���������� !�� �������� 0� ����������

� ����6!!. ���� �� �� ����������� � ����� � ���

����� -<�3 5:/3 � ��������� � ���� ���� ��� �����

����������� 0� �� �� ��0��3 .��� ��������� ����

4���� ���� ����6!!. ����� ��� �� ���� !!. �������

�������� � ����� ���� � ������������� !�� ����������

��� ����� �����������3

�2+2 2 (<$ "��� ����

=� ��0 0��� ���������� ���� � ��� ������� �

������� ������ !�� �������� ���� �� ��� ���������

� %B� ?()@3 ���� ��� ����6!!. ���� 0��� ��������

� ��� ������� � !�� ��� �� ��� ������ ��� ��� %B�

��������� 0� ��������� �� ��� ������� ���� � ��%�

*(5 �� %��*(53 � ��0� � <�3 7� ���� ���� ���

�������� � ��4���� ������ � %B�3 � ���������

����6!!. ����� ��� �� ���� ����� !!. ������ ����

����� (35 ��� ���� %B� ���� ���� ����3 ��� ;���

0� ������� �� ��� �������� ������ %B� ���������

<�3 (3 ;��� ���������� �� ���� ��� ����6!!. ����3 ���� -�/ ������6!!. -�/ ���� 0��� ����� � EC�0��� ����� ��� 0��� �������� �� (7 �� � ��� ������� � ������� ������������ � ;���3 "�����

0� ������� ��� �..3 -�/ ;��� 0��� �������� � �;����� -(,) ����/+ -:/ ���� 0��� �������� � �;����� -,) �� ��/+ -;/ ���� 0����������� � �;����� ����������� 0�� ,) �� !��3 %���� �������� K � ��������� ������� ���� ��� ��� ����� �� � ���� �������������������3 �������� �� ����� � � ������ � ������ ���0���

���� ��� ����6!!. �� ��� ������� ;��� ������������G �� � )�),+��� � )�))*3

<�3 53 ������������� !�� �������� ��� ����� ����������� �� ����

��� ����6!!. ����3 ���� -�/ �� ����6!!. -�/ ���� ����� � C�0�������� 0��� �������� 0�� * �� !�� � �;�����3 ������ �

������������� ����� 0��� 0�����0� �� ����� ���� ��� !�� -�/ ���

����� -:/ ������������ 0��� ������� �� ���;3 "���� 0��� ��>����

�� ����� �������� ������ �������3 %���� ��� ����� �� � ����� ��������������3

(*( !2 $����� �� ��2 7 8���������� ����������#� * 5+��+6 +�9:+�*

0� ������ �� E(K �� ���� ���� ��� �� C(K ��

����6!!. ����3

��������� � %B� �� ��� !!.���������� ��������

��� �� ��� ��� �������� � ��� ���� ����� � �����3 =�

��� 0��� ���������� ���� ;��� ��� ����� 0�� ��� ����

����� � !�� �� ��� � ����� ���� � ������ ?7�*D@3 ��

���������� �� ��� ������ � !!.���������� %B�

��������� �� ;��� ����� �� � ������� ����� 0��

!�� �� 0�� ����� ��� ����#�� ��� ������� ���� �����3

;���I������� 0� ���4�� �� ������� �� �������

��� ���� � � ����� ������� � ������ ���0��� !�� ��

����� ��� ;���3

�2�2 ������� �3 &$�: �� ���#��:�!!� ���"��4��

.�� ��������� � ���� ����������� ������ 0�� � *G*

���������� ���� -;���6!�� ��� ;���6�����/ 0�

������� ��� ���; � ��� � ���� �������� �����

-0��� *, ��/� ��� � ��������� ���� 0� ��������

� ��� ������ 0��# �� ��2��� ��� �������� � ���� ����

0�� ;���3

� ��0� � <�3 ,� �����6;��� ������ �������

������� ���� ������ -0��� , ��/ � ������� 0��� ���

��������� � !��6;��� ������ ������� ����� �� ��

�� *, ��3 .�� ���� � ������� � �����6;��� ������

-)3**(C ��9��/� ���������� �� ��� ����� ���� � ���

������ 0� *) ��� ����� ���� ��� ���� � ������� �

!��6;��� ������ -)3)*)( ��9��/3

.�� ������ ���; ����� ��� �� ���� ��� ���

� ������ ���0��� ��� �������� � !�� ��� ������

0� ������ �� ���� ������� !��6;��� ������ ���

�����6;��� ������3 =� ����� �� ���������1� ��� ����

���� � �����6;��� ������ � ��� ������� ����� �

��� �0� ����� ���� ���� � ��0 ���; ���� ��� �

������� �� � ��� ����� ���� 0� ���������3 �� ��

���� �����6;��� ������ 0��� �������� ��� !��

��� ;���� 0��� ����� ����� ������� 0�� !�� ���

!��6;��� ������ ������� 0�� ������ -������������� ��

�������� � ���������� �����/3 ���� ��� ����6!!. ����0��� �������� � �:� �������� * �� !��� , ��

������ ��� *)) �� ;���3 ������ 0��� 0�����0� ������� ��� ������� ��� �����1��3 � ��0� � <�3 C� �

���# ����������� �� ��� �����6;��� ������ 0�

������� ���� �� ����6!!. ���� -������� <�3 C:

��� ;� �������� ��� *)) ��/� ������� ���� ��

������� ��������� �� !!. �������� ������3

.�#�� ��������� ���� ����� ��� ������ 0�� ��� ����6

!!. ���� ��0 �� ������� ������� �� ;��� ����

0��� !�� ������ � ��� ������������� �����3 !!.�

��������� �������� � !�� ����� � ��� ��������� �

����� ������� ����� 0��� � � ���� ��� �������������

������ 0�� ;���� ��� ����� ��0���� ��� ��������� ��

�������� ��� ����3 ��0����� �� ����� ������������ �

;��� -*) ��/� �� ������� ��� �� �� ������ ��������� ��� ����3

<�3 73 ������������� %B� ��������� �� ���� ��� ����6!!. ����3

���� -�/ �� ����6!!. -�/ ���� ����� � C�0��� ����� 0��� �������� �� C) �� 0�� )3, �� !��� *C) �� <�5�6��.� ��� (, �� ��%�*(5� ��� ������ �� � ��� ������� � ,) �� ;���3 %B� ��������� 0�������� � ��%�*(5 �������3 %���� ��0� ��� ����� �� � ���������� ���������3 ��� � )�))* �3 ���� �������� � ��� ������ � ;���3

<�3 ,3 <������� � ;���6!�� ��� ;���6����� ������ � �����+ * �� � ;��� 0� �������� ����� 0�� *) �� !�� -�/ �� 0�� *) �� �����-�/ � *) �� �������� �� �� �� &37 �� 5&�3 ������ 0��� 0�����0� �� ����� ��� ��� ��� ;��� ������ 0��� ������� �� ���;3 "���� ��� ������ ��� � ����� ��������� 0��� ���� ��� ��� �������3 .�� �I����� 0��� ������ ��� ��� ����� ���� � ��� ����� -)65 �� �� ;���6����� ������

��� )6*, �� �� ;���6!�� ������� ����������/3

!2 $����� �� ��2 7 8���������� ����������#� * 5+��+6 +�9:+�* (*5

� ����������

;���������� ���� ���� ������ � ��� ��������� �����

��� �� ��0 ��� � �� ����� ���� ���� �������� ���� ��

��� ��������� � ��� ����� ������ �� ;��� ��������

0��� � ��� ���� �������3 %������ �� ��#������

����� ��� ������� ������ ���� ��� ������ � ���4���

��� � ��� ����#� � ��� ���� ?(*@� �� �� �������

��������� � ��� ���� �� �� ������ ����� ��������

�������� ��� � !�� ?7@ �� �� ������� ������ ?((@3 =�

�� ���� ��0� ���� � ����� ���#��� ����� ��!;� ������� � ��� ;��� ��������� ����������� 0�� ���

�%�9!�� ���� ?((@3 ���� � ������ ����� ����0 ���

���� �� ������ ���� !�� ����� ��� ����� ��� ��

���� � ����� �������� ���� � ��� ���� ��� �� ������

���� � 4������ ��� !��6;��� ��������3

.�� ������� ��� ��� �� ��� ����I����� � ��

�������� �'� ����� �������3 ;��� ��������� �

����� ������ ������ ���� ������� � ��� ������� �

�%;;�* 0��� � ������ ����� � ��� ��������� ����

�������� ����0�� ���� ��� ��� ;�����'� ������

����� ?(5@3 <����������� ��������� � ��� ������� �

�������� -��� � ��3��� ������ ��= �� ���1�/ �� �����

������� ���� -��� � "��/ - �� ����0 �� ?(7@/ ����

��� ���� �������� � ��� �������� ������� �� ;���3

!!.0��� � #�� ��1��� �� ��� �������� !�� �����

��� �� ���� ��0� �� �� ����������� � � ����� ����

� ������ ��� � ������ ?(,@� ������� ?(C@ �� ���� ?(&@3

=������� � !!. �� ���� ������� � ����� ����� ����

������� �� ������� �� ��������������� ���� ?*)@3 �

4�� ��0�� ���� �� ����� ������ � ���� ���� �� � ����

������� �� ;��� �� ������ � !!. �������3 .��

��1��� ������ 0� ������ 5� ��� � ��� 7D �� 0�� (3, ��;��� ��������� ��� ��� ������� 0��� ���������� 0�� ��

������ ����������� � ��� !!. �%'�3 !��0� �� ��3 ?(@

���� ��� ��0� � ���������� ���0��� ��� ������ � ���

������ ����������������� ���� ��� ��� ��� ����� � !!.

�%'�3��0����� ���� ����0��� �������� ��� � ���������

������� �� ��� ����3 .��� ��� ���� ���� ��� !!. �%'�

0� ������������ � �����I����� ���;����������

���� ��� ��!;��%'�3.��������� �������� �� ��������� � !!. ����� ������ �� 0��� ��������3 ;���

��������� ��� ������ ��3�� ��� ��= ?(7@� ��� ��� �����

������� ����� �� ������� �������� � ���*3 .� �����

�� ���� �� ��� ��!;� ������� � ��� ���� ���������I����� ������ �0� ���* ������� ������� ?(D@3

<�� ��� ����� !!. ���� ���� ��� �������� ����������

��� ���������� � ���� :!!.�%'� = �� ���� �������

��� � ������ ���*��#� ������� ������� ?*E@3

�������� ������� �� .�� ?*7@� �� ���� � �%'�

������ ������� � ���� ����3 =� ������� ���� � ��� ;

!!. �%'� = ��� ��� ��>�� !!. �%'� ��� ��� ����

��� ���� ������ �� ;���3 .��� ��� ������ � ��� �����

!!. �%'� ����� ��� �� ��������� �� ��� ������ � ����

�0� ������3 ��0����� �� � ������� ��� �� ��� ����

��������������� ��� �������� ���� �0�!!.�%'�3

� ���� ����� �� ��� ���� � !!. � ��� ������ �

���� ���� �� ;��� ��� �0� �����G ��� �����.����

���� ������� *)6*7 �89�� � !!.� ��� ��� ��� ����

��� ����� ���� ����� 0�� ��� ����� !!. �I����� ���

������� � ����� ����� � ��� ��1��� -*)6*,� ��� �

�������� �� ��� �������� ���� ���/3 .� �������� 0�

����� � ����� �� ���� ��� ���� ������ ��� ����� �����

0�� ���������� �� ;��� �������3 =������ �� ��������

���� ��������� ���������� ���� 0�� 0������4��� ��

���� ��� � ��� �� � ����� ���� ��� ��� ������3

<�3 C3 <������� �����6;��� ������ � ������������� �����3 ;���

0��� �������� 0�� * �� !��� , �� ������ ��� *)) �� ;��� � �:��� 5&�3 ������������� ����� 0� ��� �� ���; ����� �� ��� � ) -�/��� *)) �� �� ����6!!. ���� -:/ �� ���� ���� -;/3 %������� ���

���G (� 5� 535� ,3D� C ��� &3D ��� ����������� ;��� -*/� ������ ��� !��6

;��� ������ -(/� !�� ��� ����� -5/ ��� ;���6����� ������ -7/3

(*7 !2 $����� �� ��2 7 8���������� ����������#� * 5+��+6 +�9:+�*

����� ��� � ������ � !!.������� ��� �0� ���� ���

������� ���������� ��!;� ������ ��� ������������!�� ������������ ����� � ��0� �� ���������� ����

����� ������� �����3 �������� ������� � ��� ��0�

������ ����� ������� �� � ������� �������

-�D)K/ � ��� ������������ !��� �� � ������ � ����������� ������ 0��� �������3 ����6!!. ���� �����

������� ����� ,)K � ���� ������������ !�� ���� 0���

!�� 0� ����� ���������������3 .��� ���� 0�� ��� !!.

������ ��� ���� ��� ��������� �� ��������� ������������

!�� ���� 0��� ������������� !�� ������ ��� ��� �

������ �����3 .��� ���� ��� � ���������� 0�� ������

0��# �� �������� ��� ����� ����� 0��� ��0�� ���� �

��� ������ � !!. �� ������ ��� ���� 0�� ������

?(E�5)@ ��� 0�� ��� ���� � ���� "����� �� ��3 ?&@� 0��

����������� ���� ��� ����� ��� � ������� � !��

��� ��� ��� ������1�� �� ��!;�� ��� ��� ��������� � ������3

.�� ;��� ���������� ����� ���� -��0� ��� ����

������/ ������� ������� �� ��� �0� ���� ��� �������

����������3 .��� ����� ����� ����� ����� ���� ����

����� � ���� ����� ����������� � !!. ��� �����

�������� !�� ����� ��� ��� �2������ ��� ������� ��

;���3 =� ������� �� ��� ���������� ������ ����

���� ��0� ���� !�� �������� ������� ;��� ��������

��� ?5*�5(@3 =� ���� ���� ��� !�� �������� 0�

������� �� ������������� � ��� ���� 0�� :�B� 0���

� ������ ������ � ��!;�� ��� #�� ��1��� � !���������3 .� ��������� ��� ���� �� �������� ��

��� ��� ���� :�B�������� ���� ���� ��� ���� � ��0 !��

������� ��� ���� ���� ��� ��� ������ �� ������� ���� ��0

!�� ���� � ��� ;��� ���������3 8���� ��� �������� ��!;� ����� ���� ����� ��� ��� � ��� ������ ��� !��

������� �� ;���3 =� ������ ;��� ���������� �

���� ��� ����6!!. ���� ��� �� �� ������ � ���

������������ !�� ����� ��� ������� �����3

����6!!. ���� 0��� ���� ���� ������ �� ;���

��������� 0��� � ��0 -,) ��/ ������ � !�� 0��� ������� ��� ������� �����3 �� ������� �� ������ ��

���������� ��� �� ���� ��� ����6!!. ���� ��� ����

� 4������ �������1� ��� ������������� !��� ��� �������

��� ���� 0�� �������� �� � ����� �������� ���� � ���

������������ !��3 =� �� ��� ���� ����� ����� � ;���

���� � 4������3 ������ ���� �� ������ ?55@ ��� ��� ��

��� ��� ��������3 :� �������� ����������� !!.�

���� ��� !!.���� ����� � ����� ������ ���� ������

���� ��0� ���� !!.���� ����� ���0 �0�� ���� ����

��� !!.����� �����������3 !!.���� ����� 0��� ���

���� ������ �� ;��� ���������� ��� ���� ������� ���

��� ������������ !�� ������� ���� ��� !!.����� �����3

.��� ��������� ���� ��� ������� � !!.���� �����

��� ����� ��� ��� ����� � ���� ���� �� �������

������������ !�� ����� ���� ������ 0��� ��0 ������

� ������ -��� � � �����/ ��� ��������3

��0����� �� ���������� ��� ��� �� �� ������ ��

��� �����3 =� ���� 0��� ���� ��� ����6!!. ���� 0���

�������� � � ���� �� ��0������� �������� ������ ���

=;,) �� ;��� 0� ��� ���3 � ��� ������ ���� � ���

���������� ����� ��� �������� � ������������ !��

���� ���� � ��� ��0������� ����� ��� ��� ����

����� ����� �� ������� �������� 0��� ��� ���

��� � ��� �����3 � ����� ��� ���#�� �� ������� !!.�

��� !������������ ������� �� ������ ��� �������

������� � ����6!!. ���� 0��� !�� 0� �����

���������������3

.�� ������������� ���������� � !�� �� !!. ������

����� �� ��� ���������� � ������������� ������ � �������

������� ����� 0��� � ��� ������� � ������� ����� ���

���� �� ��� ��������� � %B� ?()@3 � ��0�� ���� ����

��� ����6!!. ���� ��� ������� %B� ����������������

0�� ��� ����6!!. ���� �������� �0�� ��� ������

� %B� � �������� �� ���� ������ ����� �����������3

.� � ������ ��� �� �������� �� ��� ����� ���� � !��

��������� �� ����6!!. ����3 =����������� 0���

;��� 0� ������� � ��� �������� ������ %B�

��������� 0� �������� ������3 ;��� ��� ����� 0��

��� �� ����� � !�� �� ����� �� �������� �������� ��

��� � ����� ���� � ������ ?*D@3 =� ���� ������ ��

���� ���� ;��� ��� ����� 0�� ����� ��� ���� ����

���� 0�� !�� � ��� �� ���� � ����� �� �� ����

�������3 ���������� �� �� ��� ��� �� � ����� �����

0� ��0�� ���� ��� ���� � ������� � �����6;���

������ �� ���� *) ��� ����� ���� ��� ���� � �������

� !��6;��� ������3 � ��� ��0�� ���� ��4����

������ � �����6;��� ������ ���������� ���� � ���

������������� ����� � ����6!!. ���� �����������

���� ������������� ��������� � ����� �� ������� !!.

������ ����0 ��� ������� � ���� ������3

=� ��� �������� �� ���� ���� ��� ;��� ������������

��� � �� ����0������� ���� �� ��� ����� ������������

� ��� ���� ����� ������ ���������3 =������ %�� �� ��3 ?57@

�������� ���� ��������� ������������ � ;��� � �����

� ������ ����� ���� == ���� ������� 7 ��3 .��� � �������������� ����� ��� ������� � !!.��� ��� �������

��� � ��� ������� � ������� ���� �� ;��� ������ ���

�� �� ������� !!. ������ ��� ������������ ��������3

=� ��������� 0� ��0�� � �� ���� ���� �� �����

������ � ���� ���� �� ;��� ��������� �� ������ �

!!. �����3 =������� !!. ������ ��� �2����� ���

������������ !�� ����� ���� ����� ��0������� �������

������� ��� 0��� !�� ������ � ��� ������� �����3

���� ���� ����� ���� ��������� ������� ��� ����

������� �� ������� ������� �� ;��� ������ ����

��������� �� ��� ������������ !�� �������3 � ������

���� ��� ������� �� ;��� ��� �� � ������� 0��� �

��� 4�� ��� ����� �� ��� ������������� �����3 !!. ��������

� !�� ����� � ��� ��������� � ����� 0��� � ����

��� ������ ��� ������ 0�� ;���� ��� ����� ��� ���

����3 <������ ���� ��� � ������ �� ������� 0������

�� �����4����� ������� ���� �� � ��0�� ������������

����������� � ��� ����� �� �� � �������� ������� �

�'��;��� ������3

!2 $����� �� ��2 7 8���������� ����������#� * 5+��+6 +�9:+�* (*,

�������� ������

.�� ������ 0���� �#� �� ����#� ��� NN���� '�������

������ �� ;����� �� ������� �� �������LL �� ��� ����� �

�� 0��#3 �3 ������ 0� �������� �� � ����� ��� NN����

'������� ������ �� ;�����3LL .���# �� ����� ����� ��

�������� ����3 �������� ��� 0��� ������� �� ���

����1��� =������ %����� �� ;����� -�3=3%3;3� =����/3

����������

?*@ =�#�0� .� ���B�� <3 .�� �.����������� ���������� $����>�����

������ ����3 .���� :����� �� *EE(+*&G7C56D3

?(@ !��0� �J� ����� �� BL�0��� �O� ����� �� ������� .;�

������� ��3 ��� ������� �� ������ � ����� ������ ������

���� ��� ������� 0�� ���#�� ������ � ���������� �����3

���� '��� ���� �� 8�� *EE(+DEG5)&)673

?5@ ����� %�� �����0 ��� ������ ��� :��� ;�3 !���������

�������� ������ ������ ������� � ����� �*(*) ���#���

����3 ;����� ���� *ED&+57GE6*53

?7@ =�#�0� .� ���B��� <3 !����������������� ������������

�������������-==/ �������� 3 O :�� ;��� *EE5+(CDG()**C6(,3

?,@ ����� �� .���#� .� .�#����� 83 ;����� �������� ��������

���� �� ��������� 0�� �'� � � ����� ��� ����3 :�����:����

%� ;����� *EE7+()5G**&,6D)3

?C@ �� !�� B1�� %<� P���� %;� ������� .;3 � ��� � ���������� ��

�'� ����� � ������������� ����� ������ ������ ���� ���3 O

'��� ;����� =�� *EDE+D*G,5,6E3

?&@ ���� "����� :%� ����� �� O��I����������� �3 ;����� �������

���� ���������� ������� � ����� ������ ������� �����

������� � ���������������� �������� ������3 ��� O :�����*EEE+(C(GD&56D3

?D@ ������ ��� %�#��� �3 ������������� ���������� � ����� �

������ �� ���� ���� ����� �������������� �����������3 :��

������� *EE5+5(GC5)(6C3

?E@ ����#�0 Q� Q����0�1 O� ;������ �O� ������ ����1 %� �������� �3

=������� � ���������� ����������� �%'� �� ������� ��������� � � ����� ������ �������� ���� ���3 B���� %� *EEC+DG

7*,6(53

?*)@ ��0 ��� ���� O�� �� ;%3 !��������� ��� �����������������

���� ��1��� � ������ ������������� ���� ��� ������ ��� �

������ �� ��� ��� � ��� ��� ���� � ���� �������G ����� � ���

���� ��� ���� ����� � ���3 ;��������� *EDD+EG*(D56&3

?**@ '����� .� '�0#�# J� ���� %:� �����0 ��� .���# :O�

%����� ������������� ��� :��� �J� ��������� ;�����

JO3 ������� ���0��� ������� � ������������������ ���

1��� ��� ������ �� ������������ ������������ � ���� ���

���# ������3 ;��� :�� =������� *EED+***G55567(3

?*(@ .�0 J�� ���# �� :����� �� %��� !� �#����� !� ������ O��

������� O:� ������ ��3 !����������������� ��1��� � ���

����� ���� ��� � ��� '������ ;����� =������ ���� ��������

�������3 ��� ��������� *EE*+,*G,*D*6&3

?*5@ ;������ ;� B��� .� ������� <� "�# �� ������� �� ��������

��� !3 !!.G ��������� �I����� � ��� ����� ��������� ��'�3

:����� ��������� *EE(+75G(,(&6553

?*7@ ������ �� ������ �O� �������� =� ����� '�� "�# �� !������

��3 � ������� ��������� � �������������� ���� �%'� � �������� ����� ���� ���3 :���� :���� ���� ())*+*,CDGC&6&53

?*,@ ������ <� ����� P� :����� �� ��������� ;� ��� !3 ����������

� ����� ������������������ ���� � ������ �������G #����

�� ��� ����������� ��������3 ;�� ;�� ���� *ED*+**(G

*D&6E,3

?*C@ ����1�� O<� ������ �� �������� � ������� :� ��� !� ����� �3

���������� � ���� � ����� ����� ��� �I�� ��������������

0�� ��������� ������1���� ��� ���������� ��������3 O ;������

���� �� *EEE+5&G7CE6&C3

?*&@ %����� O� =��������� �3 ��������� � (��&���������� �������� ������������������*(5 � ��������� ����� �� ������������ �(B( �

�������� ���������� ����3 ���� ;��� :���� *EE5+5)(G57D6,,3

?*D@ :�������� �� .��� �� �� � <���� %� ;��� �� ����� !� ;����� :�

<������ '� ������� �� ;����� %� .������� �3 ;��������1���� �

����������������� ������ �� �I�� ����������������� �������

�����3 ������� �� ���� ������� � ����� ��� ��� � ���� � ���

���������� ���������� � ������ ��� ���������� �� ��� ���

������ ������3 O ;��������� : *EE,+CCEG(7&6C53

?*E@ "�# �� ��0��# �� ������ �O� =���� J� ��� �� !������� !�

������ �3 ��������� � ��� ,� �I����� � ��� ����� ��������������� ���� ����3 ��� O :����� ())*+(CDG5*&6(,3

?()@ ���1�1 %� ��������� ;� ������ �� ����� �� ��� !� ������ �3

��!����������� �������������� ��������� � ������� ������ ���� ��� � ����������9���� ���� ����3 <��� %�� :�� ��� *EED+(,G

&DC6E(3

?(*@ ����� %�� '���� O�� :��� ;�3 �������� ������ ����#� ��

������ �*(*) ���#��� ����3 ;����� ���� *ED&+5CG*E&6()*3

?((@ =�#�0� .� :�� OO� P����� P� �#���� J� <������ J� ���� ;��

.�� J�3 ;��������� ������� � �%�9!��A ���� ��� ����������������� �������� �� ����� ����� � ����� ���#��� ����3 O

:�� ;��� *EEC+(&*G*7ED*6D3

?(5@ � M� !������ J� Q���� �� .��� :� :���#�:����� <� %��� �3

;����� ������� � /((����%'� � �(&D)9;�&) ����� ������

������ ����3 O :�� ;��� *EED+5CG(57*E6(,3

?(7@ J������� �� ����� O�3 ������� � ������� �� ������3

����� %� ())*+7&DG(56753

?(,@ ��������� <����� O� �<� :��0� O�� ����� ��� .����� �.3 �����

������ ����� ����� ���������� �����������3 ;����� %�*EE7+,7G(DC6E)3

?(C@ <����� O� �<� .��������� �� ��� ��� ������ ��3 !�����

�������� ����������� � ������ ��� �������� ������� �����3���

������ *EE&+*)G*6C3

?(&@ ��P���� :%� <����� O� �<� �0���� ��� ������ ��3 ��!������������������ ������������� � ����� �������3 ��� ������

*EEC+EG*77�3

?(D@ %����� =� ���� ;�� ��������� <� ���'�� 3 ;��������1���� �

�������������������� �������������� ����� ��������G � ����

��� ���� �� ���*3 <�:� ���� *EED+7(&-*/G*(E6553

?(E@ ������ ��� %�#��� �3 ������������� ���������� � ����� �

������ �� ���� ���� ����� �������������� �����������3 :��

������� *EE5+5(GC5)(6C3

?5)@ �������� � � ���� ��� �� QQ� ;����� :Q� :���� %� B� ;'�

;��R��1�:���� �� ��� P� ���� !�� !������ O;� ����� ���

������1 %�� ���1�# ��3 !��0�� ���������� ��� ������ �� �

����� � ���������� �������������� ���� ���3 ���� '��� ������ 8�� *EEC+E5G&E(56C3

?5*@ �������� �� ����1 %� ����� �� Q����0�1 O� ;������ �O3 � ��� �

���������� �������� �� ��� ���������� � ������ ��� �������� �

� ����� �������� ���� ���3 ;����� ;�������� ��������� *EEE+7)G

5D6773

?5(@ �����0 ��� ������ ��� ��0��� �:3 � ������� ���������� �

��#������ ��� ��������� ����� ���������� � ����� ������ �����

���� ���� �� ���������� ��������3 ;����� %� *ED,+7,GC(,)653

?55@ ������ �%3 ������� � �������������� ����������� ������

����� ���� 0�� � ������� ���0�� ��������� �� �������� ����

��������� � ���-�/��3 ;��������� *EE,+*CG*D*6,3

?57@ %�� ;� ������� O�� ��������� �� ;�� B� %��� �3 ,�<����������

��� ���� ��� ��� � 0��#�� (7 �� � ��� ������� �� �������

�������� ���� ��� ���# ������G � ��������#���� ��� ������

�����3 =�� O B���� ()))+5G,756E3

(*C !2 $����� �� ��2 7 8���������� ����������#� * 5+��+6 +�9:+�*