MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE (TEM)

Coltura battericaal TEM

Schermo fluorescente

Binoculare

Lente proiettore

Campione

Apertura Lente obiettivo

condensatore

Fonte di elettroni

Fascio di elettroni primari

Elettroni secondari

SEM

TEM

Scattering anelastico Scattering elastico

Elettroni trasmessi

TEM

e- conscattering anelastico

e- conscattering elastico

TEM convenzionale

Scattering elastico Scatteringanelastico

Elettroni incidenti

Preparazione dei campioni per TEM

FISSAZIONE

a) FISSAZIONE CHIMICA con impiego di fissativi come GLUTARALDEIDE ePARAFORMALDEIDE (per stabilizzare le proteine) e post-fissativi come OSMIO (1%) per lafissazione di lipidi. I fissativi sono usati a concentrazioni 3-5% e sciolti in tamponi

b) CRIOFISSAZIONE, congelamento rapido per immersione del campione in azoto liquido(-190°C), in genere si usano anche composti crioprotettivi per evitare danni del campione

N.B: osmio e glutaraldeide vanno maneggiati condispositivi di sicurezza secondo il D.L. 626

DISIDRATAZIONE

Procedimento che porta alla totale rimozione dell’acqua nel campione e alla sostituzione con un solvente (etanolo)

Passaggi in etanolo 25%, 50%, 75%, 90%, 95%, 100%

INCLUSIONE IN RESINA

Le resine sono sostanze che polimerizzano in opportune condizionie una volta che sono entrate nel campione induriscono il campione e lo rendono sezionabile.Le resine usate per la microscopia convenzionale sono EPOSSIDICHE(costituite da miscele di aldeidi) e polimerizzano a 60°

Il campione viene immerso in un solvente intermedio che si miscela sia conL’etanolo sia con la resina (OSSIDO DI PROPILENE)

Passaggi: ossido di propilene-etanolo, ossido di propilene assoluto,

Ossido di propilene:resine (3:1) per 1h, 1:1per 1h, 1:3 per 2hResina assoluta per 2hPolimerizzazione in stufa a 60° per 3 giorni

SEZIONAMENTO

I campioni induriti vengono tagliati mediante ULTRAMICROTOMO insezioni ultrasottili (40-80 nm) e depositati su retini (anelli con griglie diOro, nichel, rame

retino

CONTRASTAMENTO

Con metalli pesanti come uranio e piombo si aumentalo scattering elastico di membrane e inclusi nellecellule

I retini su cui sono state deposte le sezioni vengonoimmerse prima in acetato di uranile, lavati e successivamente in citrato di piombo

COLORAZIONE NEGATIVA