Reaktion des Epstein-Barr Virus und seiner Wirtszelle B95 ...· Reaktion des Epstein-Barr Virus und

  • View
    214

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of Reaktion des Epstein-Barr Virus und seiner Wirtszelle B95 ...· Reaktion des Epstein-Barr Virus und

  • Reaktion des Epstein-Barr Virus und seiner Wirtszelle B95-8 auf die berexpression der extrazellulr-regulierten Kinase 3 (p97)

    Von der Medizinischen Fakultt

    der Rheinisch-Westflischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades

    einer Doktorin der Medizin genehmigte Dissertation

    vorgelegt von

    Anne Caroline Kaufmann

    aus

    Dsseldorf

    Berichter: Herr Universittsprofessor Dr. med. Klaus Ritter Herr Privatdozent Dr. med. Sebastian W. Lemmen

    Tag der mndlichen Prfung: 16. Mai 2006

    Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek

    online verfgbar.

  • I

    Inhaltsverzeichnis

    1. Einleitung................................................................................................................................1

    1.1 Das Epstein-Barr Virus...................................................................................................1

    1.2 Epidemiologie des Epstein-Barr Virus ...........................................................................1

    1.3 Reaktivierung des Epstein-Barr Virus ............................................................................2

    1.4 Mechanismen der EBV-Reaktivierung...........................................................................2

    1.5 ERK3 ..............................................................................................................................3

    1.6 Ziel und Arbeitsprogramm .............................................................................................4

    2. Material und Methoden.......................................................................................................6

    2.1 Material.......................................................................................................................6

    2.1.1 Gerte.......................................................................................................................6

    2.1.2 Zelllinien..................................................................................................................6

    2.1.3 Plasmide...................................................................................................................7

    2.1.4 Bakterienstmme .....................................................................................................8

    2.1.5 Oligonukleotide .......................................................................................................9

    2.1.5.1 Primer (Sigma, ARK) .......................................................................................9

    2.1.5.2 Hybridisierungs-Sonden (TIB Molbiol) ...........................................................9

    2.1.6 Antikrper..............................................................................................................10

    2.1.7 Kits und Chemikalien ............................................................................................11

    2.2 Methoden .................................................................................................................13

    2.2.1 Zellkulturtechniken.......................................................................................13

    2.2.1.1 Kultivierung von Bakterien ............................................................................13

    2.2.1.2 Herstellung von Glycerin Stabs ..................................................................13

    2.2.1.3 Kultivierung eukaryotischer Zellen ...............................................................14

    2.2.1.4 Quantifizierung eukaryotischer Zellen ...........................................................14

    2.2.2 Plasmidprparation aus E. coli ..............................................................................14

    2.2.3 Ethanolfllung .......................................................................................................15

    2.2.4 Quantifizierung von DNA und RNA.....................................................................15

    2.2.5 Isolierung von Gesamt-DNA.................................................................................16

    2.2.6 Isolierung von GesamtRNA ................................................................................16

    2.2.7 Spaltung der DNA mit DNase I in RNA Lsungen ..............................................16

    2.2.8 Reverse Transkription............................................................................................17

    2.2.9 Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen ......................................................17

  • II

    2.2.10 Polymerase-Ketten Reaktion (PCR).................................................................18

    2.2.10.1 Konventionelle PCR.....................................................................................18

    2.2.10.2 Real time PCR ..............................................................................................19

    2.2.11 Sequenzieren von DNA .......................................................................................23

    2.2.12 Agarose-Gelelektrophorese .................................................................................25

    2.2.13 Methoden der DNA-bertragung auf Bakterien und eukaryotische Zellen.......26

    2.2.13.1 Hitzeschock-Transformation von E. coli ......................................................26

    2.2.13.2 Transfektion von eukaryotischen Zellen durch Superfect-vermittelten ...27

    Transfer 27

    2.2.14 Immunologische Methoden ................................................................................27

    2.2.14.1 Immunfluoreszenztest (IFT) .........................................................................27

    2.2.14.2 Bestimmung der DNA-Syntheserate ............................................................29

    2.2.14.3 Durchflusszytometrie....................................................................................29

    2.2.14.4 Isolierung von Proteinen aus eukaryotischen Zellen ...................................30

    2.2.14.5 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford (1976)....................31

    2.2.14.6 Konzentrieren von Proteinlsungen .............................................................31

    2.2.14.7 Western Blot ..................................................................................................31

    2.2.14.7.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)..........................32

    2.2.14.7.2 Elektro-Blot ...........................................................................................35

    2.2.14.7.3 Frbung mit Ponceau S..........................................................................36

    2.2.14.7.4 Immunblot.............................................................................................36

    2.2.15 Statistische Auswertung.................................................................................37

    3. Ergebnisse.........................................................................................................................38

    3.1 Expression von pcDNA-ERK3antisense in B95-8 Zellen..............................................38

    3.1.1 Prparation des Expressionsvektors pcDNA-ERK3antisense...............................38

    3.1.2 Kontrolle der Transfektionseffizienz...................................................................39

    3.1.3 Nachweis der ERK3 (p97)-berexpression auf Transkriptebene ......................40

    3.1.4 Nachweis der ERK3 (p97)-berexpression auf Proteinebene ...........................46

    3.2 Untersuchung der Effekte der berexpression von ERK3 (p97) auf die

    Reaktivierung des lytischen Zyklus in B95-8 Zellen ...........................................................49

    3.2.1 Erhhung der Transkription von BZLF1 und BRLF1 in ERK3 (p97)-

    berexprimierenden Zellen...............................................................................................49

    3.2.2 Expression von EBV-Early Antigen in pcDNA-ERK3antisense transfizierten...52

  • III

    B95-8 Zellen .....................................................................................................................52

    3.3 Untersuchung der Signaltransduktionswege bei der ERK3 (p97)-getriggerten

    Reaktivierung des EBV .....................................................................................................54

    3.3.1 Expression von 14-3-3/PLA2 in ERK3 (p97)-berexprimierenden Zellen auf

    Proteinebene .....................................................................................................................54

    3.3.2 Expression von ERK3 (p97) in SAH, PKB und 14-3-3/PLA2-

    berexprimierenden Zellen...............................................................................................55

    3.4 Untersuchungen von Zellwachstum und Zelldifferenzierung in B95-8- Zellen nach

    Transfektion mit pcDNA-ERK3antisense und pcDNA3.1-E...............................................60

    3.4.1 Modulation der DNA-Syntheserate in ERK3 (p97)-transfizierten Zellen.......61

    3.4.2 Modulation der Oberflchenantigene in ERK3 (p97)-transfizierten Zellen.....62

    4. Diskussion ..........................................................................................................................64

    4.1 Die extrazellulr regulierte Kinase 3 (ERK3) .............................................................64