Az immunológiai vizsgálatok helye a laboratóriumi medicinában

Az immunológiai vizsgálatok helye a laboratóriumi medicinában

Dr. Prohászka ZoltánSemmelweis Egyetem

III. Sz. Belgyógyászati KlinikaKutatólaboratórium

[email protected]

• Mi az egészséges immunrendszer működésének két alapvető jellemzője? – A veszélyes idegentől védj meg

• Fertőzések ne alakuljanak ki• A saját flóra tolerálása

– Az ártalmatlan sajátot ne bántsd• Autoimmunitás ne alakuljon ki• A károsodott saját kerüljön eltakarításra

2012.03.08 Laboratóriumi Medicina, Prohászka Zoltán ([email protected])

A klinikai immunológiai vizsgálatok célja

• A beteg immunrendszerének vizsgálata– Jól működik az immunrendszer?

• Immundeficiencia gyanú, fokozott infekció hajlam valamely jól jellemezhetőtényező hiánya miatt

• Megfigyelhető valamely fertőzés vagy oltás hatására kialakult immunválasz?• A károsodott saját eltakarításra kerül?

– Kóros az immunrendszer működése? • Tolerancia vesztés, autoimmunitás• A „megváltozott sajátra” adott helytelen válasz• Kóros sejtszaporulat vagy kóros szekréciós tevékenység

• Immunológiai módszerek felhasználása egyéb betegségek vizsgálatában– Az immunrendszer elemeinek felhasználása diagnosztikai célból, legtöbbször

antitest alapú mérések– Akut fázis reakció és a gyulladás mértékének mérése


Akkor mit is csinálnak egy immunológiai laborban…?Antitestet mérnek vagy antitesttel mérnek

• A beteg immunrendszerének vizsgálata– Jól működik az immunrendszer?

• Immundeficiencia gyanú, fokozott infekció hajlam valamely jól jellemezhető tényező hiánya miatt

• Megfigyelhető valamely fertőzés vagy oltás hatására kialakult immunválasz?

– Kóros az immunrendszer működése? • Tolerancia vesztés, autoimmunitás• A „megváltozott sajátra” adott helytelen válasz• Kóros sejtszaporulat vagy szekréciós tevékenység• A károsodott saját eltakarításra kerül?

• Immunológiai módszerek felhasználása egyéb betegségek vizsgálatában

– Az immunrendszer elemeinek felhasználása diagnosztikai célból, legtöbbször antitest alapúmérések

– Akut fázis reakció és a gyulladás mértékének mérése

• Immunglobulin szint meghatározás• Infekciós szerológia• Autoantitest meghatározás• Akut-fázis fehérje meghatározás, szérum

elektroforézis• Komplement fehérje meghatározás• Limfocita-transzformció, sejtes

vizsgálatok• Sejtfelszíni markeranalízis• Kóros fehérje meghatározás, immun-

elektroforézis• Immun(hiszto)kémia, immunassay-k


Az előadás célja• Típusos betegek bemutatása az immunológiai laboratóriumban gyakran

felmerülő klinikai problémák megvilágítására• A gyakori problémák megoldása során használt módszerek áttekintése

– Antitestek általános és analitikai tulajdonságai

– Antitest meghatározás a klinikai diagnosztikában• Autoantitestek• Infektív szerológia• Funkcionális vizsgálatok

– Antitest alapú mérések klinikai-diagnosztikai felhasználása, • Gyulladás, akut fázis reakció• Molekuláris medicina, biomarkerek• Sejtfelszíni markeranalízis

• Nem célja az előadásnak az összes módszer áttekintése és az egyes mérések elvének részletes bemutatása, valamint az immunológiai betegségek részletes áttekintése és laboratóriumi jeleik összefoglalása


Az antitestek alaptulajdonságai

Antigénkötés (Fab)Variábilis és hipervariábilis régiók

Biológiai funkciók (Fc)Osztály (izotípus) és alosztályFéléletidőReceptorkötés (FcR)Komplementaktiváió

Két könnyűlánc (kappa vagy lambda)

Két nehézlánc (gamma, mű, alfa, epszilon vagy delta)

(izotípusok, vagy osztályok)2012.03.08 Laboratóriumi Medicina, Prohászka Zoltán ([email protected])

Az antitestek alaptulajdonságai

Image provided by Wellcome Library, London

Illustration of Paul Ehrlich’s lecture"On Immunity with Special Reference to Cell Life", which he gave to the Royal Societyon 22 March 1900.


Mi a közös a 4 betegben?

• Beteg 1– 2003-ban született fiú, 2 éves korától beteges (évi kb. 10 alsó- és felső légúti

infekció, 5-6 antibiotikum kúra/év). Ambuláns vizsgálat. • Beteg 2

– 1978-ban született nő, 20 éves kora óta van szem- és szájszárazsága, izületi panaszai, bőrtünetei, gyorsult süllyedése, vashiányos anémiája. 2 hete hőemelkedése és szúró mellkasi fájdalma is van, sürgős kórházi felvétel.

• Beteg 3– 1951-ben született férfi, 46 éves korában intermittáló láz, hepato-splenomegalia

miatt kórházi kezelés. Hepatitis B és C szerológia negatív, EBV szerológia negatív, ennek ellenére Mononucleosis diagnózissal bocsátották el. 1 évvel később ismét lázas, jó étvágy mellett fogyott, éjszakai izzadása és hőemelkedése tartós. Néhány hónappal később elhúzódó panaszok és nyirokcsomó duzzanat miatt kórházi felvétel kivizsgálás céljából.

• Beteg 4– 1988-ban született nő, korábban lényeges betegsége nem volt, 5 napja gyenge,

palpitáció érzése van, feje fáj. Láztalan,, enyhén icterusos, sápadt, vérzés nincs. Sürgős kórházi felvétel.


Beteg 1, általános kivizsgálás

• 2003-ban született fiú, 2 éves korától beteges (évi kb. 10 alsó- és felső légúti infekció, 5-6 antibiotikum kúra/év). Ambuláns vizsgálat.

• Fennáll-e krónikus betegség (szekunder immundeficiencia)?

– Vérkép, máj- és vesefunkció, gyulladás-tápláltság, vasanyagcsere

• Jó általános állapotú, jól fejlett, kissé obesfiú. Status: neg.

• Megalapozott a gyanú, hogy primer immundeficiencia áll a háttérben

• Vérkép– Vvt 5 T/L, Hgb 132 g/L, HCT 0,375, MCV

75 fL– Vas 15 umol/L, TVK 65 umol/L– WBC 5,16 G/L, Neut 53%, Ly 33%– PLT 329 G/L

• Máj és vesefunkció, gyulladás– sGOT 31 U/L, sGPT 15 U/L, Kreatinin 67

umol/L, – C-reaktív fehérje 2 mg/L


Beteg 1, immunológiai kivizsgálás

• Immundeficiencia gyanú miatti kivizsgálás

– Immunglobulin szintek, (alosztályok)– Komplement aktivitás– Fagocita funkció– Limfocita populációk vizsgálata

(citometria)– Aktív immunizálás hatásának lemérése

• Immunglobulin szintek– IgG 11,3 g/L, IgA 0 g/L, IgM 0,4 g/L

• Komplement funkcionális szűrőtesztek– Klasszikus reakcióút aktivitás 67% – Alternatív reakciót aktivitás 93%– Lektin reakcióút aktivitás 4%

• Komplement fehérje meghatározás– Komplement C3 1,28 g/L– Komplement C4 0,38 g/L


Immunológiai méréstechnikák 1: az antigén-antitest reakció detektálása folyadék fázisban

Turbidimetria: A koncentrációval arányos fényintenzitás csökkenését méri.

Nefelometria: A koncentrációval arányos szórt fény intenzitását méri

• Ezek az eljárások kifejezetten alkalmasak egy nagyobb, fehérje természetű molekula mennyiségének meghatározására

• Feltétele, hogy rendelkezzünk a mérendő molekula ellen antitesttel (agglutináljon vagy precipitáljon)

• Az 1-es beteg kivizsgálása során ilyen módszerrel történt az immunglobulinok, a C-reaktívfehérje, a C3 vagy a C4 koncentráció mérése.


• A precipitáció– Érzékeny az antigén és antitest

mennyiségére, pontos beállítást igényel, lényege az antitest-antigén kapcsolódási reakció után keletkező komplex (csapadék)

– Lehet kvalitatív vagy kvantitatív– Megfelelő diffúziós közeg megválasztása

után egyes esetekben szabad szemmel is látható a precipitin (Ouchterlony analízis)

– Fehérje festéssel, egyéb detektálási módszerekkel, standardok alkalmazásával érzékenysége növelhető: immunprecipitáció

– Elektroforézissel kombinálható(Immun-elfo, rakéta immunelfo, keresztezett immunelfo)

– A precipitáció elvén működnek a folyadék fázisú immunassay-k, melyek antigénmeghatározási módszerek: nefelometria, turbidimetria, particle-enhanced-immunoturbidimetry


Az immunglobulinok mennyiségének változása az életkor függvényében (g/L)

Imm

ungl

obul

inok

men

nyis

ége

g/L

életkor

IgG

IgAIgM

5-17

2-8

3-11

Felnőtt:

6-16

0,02-0,2

0,01-0,08

0,2-0,7

0,2-1

0,8-4

0,5-2


A komplementrendszer működésének vizsgálata funkcionális szűrőtesztekkel

• Birka-vörösvértest lízis mérésén alapuló eljárások– CH50/ml = a beteg 1 mL szérumának azzal a részével, amely 1 mL 2%-os

szenzibilizált birka vörösvérsejt szuszpenzió 50%-os hemolízisét hozza létre (72 CH50/mL= 1/72 mL szérum okozza az 50%-os lízist)

• Szilárdfázisú technikán alapuló eljárások (Wielisa rendszer)

A csökkent működésű, vagy hiányzó komponensek

A funkcionális tesztben mért aktivitás

Klasszikus Lektin Alternatív C1q, C1r, C1s Alacsony Normál Normál C4, C2 Alacsony Alacsony Normál MBL, MASP2 Normál Alacsony Normál B, D, P Normál Normál Alacsony C3, C5, C6, C7, C8, C9 Alacsony Alacsony Alacsony


A Beteg 1 kivizsgálásának összefoglalása

• Jó általános állapot, megfelelő tápláltság• Krónikus betegség hiánya• Gyakori infekcióhajlam • Primer immundeficiencia gyanú majd kivizsgálás • Diagnózis: szelektív IgA hiány és komplement lektin-út (MBL) hiány

– Közönséges variábilis immundeficiencia (<4 g/L immunglobulin)– http://www.emki-minosegfejlesztes.hu/site/conf/upload/dokumentum_4_66.pdf

• További kivizsgálási lehetőségek primér immundeficiencia gyanú esetén– Fagocita funkció vizsgálata (jelzett mikróbával vagy oxidative-burst detektálással)– Limfocita populációk vizsgálata citofluorimetriával, blasztos transzformáció vizsgálata

mitogénekkel vagy spec. antigénekkel)– NK-sejt aktivitás vizsgálata– Kemotaxis vizsgálata– Oltásra (pl. pneumococcus) adott antitestválasz vizsgálata


2. beteg: általános kivizsgálás

– 1978-ban született nő, 20 éves kora óta van szem- és szájszárazsága, izületi panaszai, bőrtünetei, gyorsult süllyedése, vashiányos anémiája. 2 hete hőemelkedése és szúró mellkasi fájdalma is van, sürgős kórházi felvétel.

• Differenciáldiagnosztika, gyors orientálódás

• Sovány, sápadt, arcon bőrpír, egyéb lényeges kóros fizikális eltérés nélkül.

• Megalapozott a gyanú, hogy autoimmunbetegség áll a háttérben

• Vérkép– Vvt 3,1 T/L, Hgb 86 g/L, HCT 0,27– WBC 5,9 G/L, Neut 69%, Ly 28%– PLT 280 G/L

• Máj és vesefunkció, gyulladás– sGOT 38 U/L, sGPT 48 U/L, Kreatinin 76

umol/L, – C-reaktív fehérje 19,6 mg/L

• Véralvadás– Prothrombin 66% (INR 1,3)– Fibrin-degradációs termék (D-dimer) 10,16

ug/ml• Vizeletvizsgálat

– proteinuria (1,7 g/24 óra)– 10-15 kilúgozott vvt

• Infekció– Hemokultúra negatív


Beteg 2: immunológiai kivizsgálás (kivonat)

• Immunológiai kivizsgálás poliszisztémás autoimmun betegség gyanúja esetén

– Szérum elektroforézis (és immun elektroforézis)

– Immunglobulin szintek– Autoantitestek– Akut fázis fehérjék– Komplement

• Összfehérje 80 g/L, alb. 30 g/L, gamma globulin 34 g/L

• Immunelfo: kóros fehérje nem mutatható ki, poliklonálisimmunglobulin szaporulat

• IgG 32,4, IgA 4,55, IgM 3,17 g/L


A szérum összfehérje tartalma és az egyes frakciók egymáshoz viszonyított aránya alapján kiszámolható az ALB-α1−α2−β−γfrakció mennyisége.

Paraprotein (kóros immunglobulin) elektroforetikus képe

+ -

Szérum elektroforézisD

enzi

tás


Immun-elektroforézis

Anti-humán szérum

Anti-humán IgG

Anti-humán IgM

Anti-humán IgD

Betegek szérumai (elfo)

+ -

Elfo G A M κ λ

Szemikvantitatív változat (leolvasás szemmel):

Kvantitatív változat (leolvasás denzitométerrel):

Korszerű eljárás: a szabad könnyű-és nehézlánc meghatározásanefelometriával

(IgG-kappa monoklonális komponens)


Beteg 2: immunológiai kivizsgálás (kivonat)

• Immunológiai kivizsgálás poliszisztémás autoimmun betegség gyanúja esetén

– Szérum elektroforézis és immun elektroforézis

– Immunglobulin szintek– Autoantitestek– Akut fázis fehérjék– Komplement

• Összfehérje 80 g/L, alb. 30 g/L, gamma globulin 34 g/L

• Immunelfo: kóros fehérje nem mutatható ki, poliklonálisimmunglobulin szaporulat

• IgG 32,4, IgA 4,55, IgM 3,17 g/L• anti-nukleáris antigén (ANA) 1:160

erősen poz (homogén)• Pozitív: Anti-kromatin, anti-hiszton,

anti-SSB, anti-DNS, anti-nucleosoma• Anti-kardiolipin (ACLA), anti-beta2-

gpI pozitív• Anti-C1q pozitív• Negatív: anti-centromer, SSA, Scl70,

Jo, Sm, RNP, ANCA


Autoantitest kimutatás: Immunfluoreszcencia

• Anti-nukleáris antitestek, anti-neutrofil citoplazma antitestek…stbkimutatása mikroszkópos technikával

ANA (Hep2G) cANCA(granuláris, citoplazmatikus)

pANCA(homogén, perinukleáris)

• Ez az eljárás kifejezetten alkalmas olyan autoantitestek meghatározására, amelyek egy jól meghatározható helyű/fajta sejtantigénnel reagálnak, a festődés mintázata lényeges információt hordoz. A mérés/leolvasás munkaigényes, nehezen standardizálható.

• Feltétele, hogy rendelkezzünk az autoantigént kifejező sejttel/szövettel és fluoreszcens jelölésű anti-humán IgG/IgA/IgM antitesttel

• A 2-es beteg kivizsgálása során ilyen módszerrel történt az ANA és ANCA meghatározás


Antitest kimutatási technikák 2: szilárd fázisú technikák

• Ez az eljárás kifejezetten alkalmas olyan autoantitestekmeghatározására, melyek egy könnyen előállíthatóantigénnel reagálnak, a mérés kevéssé munkaigényes, jól standardizálható

• Feltétele, hogy rendelkezzünk a tiszta autoantigénnel és jelölt anti-humán IgG/IgA/IgMantitesttel

• A 2-es beteg kivizsgálása során ilyen módszerrel történt az ANA és ANCA meghatározás kivételével az összes autoantitestmeghatározás.

ag beteg szérum

jelölt anti-humán antitest


Titrálás, titer

• Titer: a koncentráció mérőszáma. Olyan esetekben kerül sor alkalmazására, ahol a mérendő anyag mennyisége nem fejezhető ki egyértelmű analitikai egységekben, pl. vírusmennyiség, antitest. A titer annak a legmagasabb hígítási foknak felel meg, amelyben egy reakció még pozitív. Ha a 8. lépésben pozitív utoljára a reakció, akkor a minta titere 1:256 (2-8).

• Mikrotiter lemez

2 4 8 16 32 64 128

256

512

1024

2048

4096

8192

1638

4

0

1

2

3

Titer

Opt

ikai

den

zitá

s(r

ead-

out)


Titrálási görbék, direkt antitest ELISA(pl. anti-HBsAg-IgG)

2 4 8 16 32 64 128

256

512

1024

2048

4096

8192

1638

4

0

1

2

3Sok antitest, titere 1:512

Kevés antitest, titere 1:16

pozitívnegatív

Titer

Opt

ikai

den

zitá

s (4

90nm

)


Szilárd fázisú immunasssay típusok: felosztás jelölés alapján

• RIA: Radio (γ); a jelölés izotóp. Előnye elsősorban analitikai, hátránya a sugárzással járó veszély. Egyre inkább visszaszorul

• ELISA: Enzim; előnye az egyszerűség és olcsóság, hátránya elsősorban analitikai (méréshatár).

• FIA: Fluorochrome; Előnye analitikai, hátránya a különleges detektálóműszer és az ár.

• Chemiluminescens, bioluminescens: Előnye analitikai, hátránya a luminométer szükséglet, és az ár.

• (Bioszenzor technológia)• (Macro- és microarray technológia)


A 2. beteg kivizsgálásának összefoglalása

• Fiatal nőbeteg több hónapos típusos panaszokkal• Tájékozódó vizsgálattal több, lényeges eltérésre derült fény

– Tüdőembólia gyanú– (Glomerulo)nefritisz– Anémia– Gyulladásos válaszreakció, poliklonális immunglobulin szaporulat

• A megalapozott klinikai gyanú alapján részletes kivizsgálás történt szisztémás autoimmun betegség vonatkozásában: „Immunpanel”

• Diagnózis (típusos autoantitestek): Szisztémás lupus erythematodes (ANA, anti-DNS), szekunder Sjögren sy (SSB), szekunder anti-foszfolipid sy(ACLA, anti-B2GPI), lupus nephritis (anti-C1q)


3. beteg: részletes kivizsgálás• 1951-ben született férfi, 46 éves korában intermittáló láz,

hepato-splenomegalia miatt kórházi kezelés. Hepatitis B és C szerológia negatív, EBV szerológia negatív, ennek ellenére Mononucleosis diagnózissal bocsátották el. 1 évvel később ismét lázas, jó étvágy mellett fogyott, éjszakai izzadása és hőemelkedése tartós. Néhány hónappal később elhúzódó panaszok és nyirokcsomóduzzanat miatt kórházi felvétel

• Kp. fejlett és táplált. Arcon és hajas fejbőrön seborrhoeás dermatitis. Testszerteösszefolyó urticák. A nyak bo-án, supraclavicularisan, axillarisan, inguinalisan több kisebb fájdalmatlan, mobilis nycs., hepar elérhető, lien 1 hu majus.

• Megalapozott a gyanú, hogy malignushematológiai kórkép (limfóma?) áll a háttérben

• Vérkép– Vvt 4,1 T/L, Hgb 115 g/L, HCT 0,38– WBC 3,1 G/L, Neut 68%, Ly 21%– PLT 188 G/L

• Máj és vesefunkció, gyulladás– sGOT 150 U/L, sGPT 195 U/L, Kreatinin

123 umol/L, – C-reaktív fehérje 21 mg/L, We 80 mm/ó

• Véralvadás– Prothrombin 97% (INR 1,1)

• Vizeletvizsgálat– neg

• Szérum elektroforézis és immunelfó– Összfehérje 84 g/L, alb 42 g/L, gamma

globulin 21 g/L– IgG 22,3 IgA 5,06, IgM 3,05 g/L– Monoklonális fehérje nem mutatható ki

• Infekció– Hemokultúra, HBsAg, anti-HCV negatív– Epe üledék tenyésztés: Streptococcus– Köpet tenyésztés: E. coli és gomba


Beteg 3: hematológiai kivizsgálás

• Kivizsgálás hematológiai malignóma irányában

• Perifériás kenet és csöntvelővizsgálat

• Perifériás vér sejtfelszíni markeranalízis

• Nyirokcsomó biopszia


Immunológiai méréstechnikák 3: Az antigén-antitest reakció detektálása a sejtfelszínen

• A mérés kifejezetten alkalmas a perifériás vér sejtes összetevőinek vizsgálatára, alcsoportjaik számának, aktiváltságának meghatározására

• A méréshez rendelkezni kell a meghatározott sejtfelszíni antigénekkel (CD) reagáló, fluoreszcens festékkel jelzett antitestekkel

• Előnye hogy gyors és részletgazdag képet ad, hátránya, hogy csak suspensióba vihetősejteket lehet vizsgálni

Áramlásos citofluorimetria, FACS analízis


3. beteg: Sejtfelszíni markeranalízis, perifériás vér, limfocita kapu

CD3+: 84.2% (T sejtek) CD 19+: 3.8% (B sejtek)CD5+: 79.5% CD10+/CD19+: 0.1%CD5+/CD19+: 2.3% κ+/CD 19+: 1.37%CD3+/CD4+: 2.83% (Th sejtek) λ+/CD 19+ 0. 46 %CD3+/CD8+: 78.9% (Tc sejtek)CD3+/CD16+: 3.92% (aktivált T sejtek)CD3-/CD16+/CD56+: 14% (NK sejtek)CD3+/CD7+: 42%CD45+: 98.7% (pan leukocyta marker)

Vélemény: A kórfolyamat T sejtes eredete igazolható. A CD3+/CD8+ kettős poz. sejtek magas aránya az LGL T sejtes lymphoma fennállását valószínűsíti.

CD4-FITC


• A beteg abszolút T-helper száma: – WBC x limfocita x CD4+/CD8-– 3,1 G/L x0,21 x 0,028=0,018 azaz 18/mikroliter

• Lymphadenopathia, T-helper sejtek alacsony száma, gomba a köpetben…• LAV (1983), avagy miről „egyeztetettek” Franciaország és az Egyesült

Államok elnökei (1987)? • Orvosi Nobel díj, 2008: Francoise Barré-Sinoussi, Luc Montagnier

3. beteg kivizsgálása: a nem várt fordulat



• Lymphadenopathia, T-helper sejtek alacsony száma, gomba a köpetben…

• Anti-HIV 1, 2 antitest pozitív (ELISA) (szenzitív szűrőteszt)• Anti-HIV 1, 2 antitest pozitív (Western blot) (specifikus verifikáló teszt)• Szérumban HIV gp24 core antigén pozitív (viraemia)




• Lymphadenopathia, T-helper sejtek alacsony száma, gomba a köpetben…

• Anti-HIV 1, 2 antitest pozitív (ELISA) (szenzitív szűrőteszt)• Anti-HIV 1, 2 antitest pozitív (Western blot) (specifikus verifikáló teszt)• Szérumban HIV gp24 core antigén pozitív (viraemia)

• Nyirokcsomó szövettan: – HIV-asszociált lymphadenopathia, kevert follicularis

hyperplasia/follicularis involutiós típus (follicularis involutió dominál). Mindezek mellett paracorticalis hyperplasia figyelhető meg, kifejezett polyclonalis plasmasejtes reakcióval, feltehetően bakteriális infekcióra adott válaszreakcióként.



Antitest kimutatási technikák 4: Infektív szerológia, Western-blot technika

• Antigének szétválasztása elektroforézissel

• Transzfer nylon membránra

• Antigén+jelölt antitest reakció

• Kifejezetten alkalmas infekciós szerológiai vizsgálatokra, rendelkezni kell a kórokozóantigénjeivel

• A 3-as beteg esetében a HIV antitest teszt megerősítő vizsgálata történt ezzel a módszerrel


Az infektív szerológia során meghatározott izotípus (osztály) megoszlás klinikai haszna

• Az antitestek izotípus-megoszlásánakértéke a Chlamydia pneumoniae fertőzés dinamikája példáján (vizsgálat savópárból)

– Akut infekció: IgM pozitivitás, IgA, IgGnegatív

– Perzisztáló infekció: IgA, pozitív és IgGpozitív, IgM negatív, vagy ha >1:128, IgGtiternövekedés lép fel

– Reinfekció: IgM+IgG pozitív

++-Perzisztálóinfekció

-+-Lezajlott infekció

-++Akut (reinfekció)

--+Akut (első)

IgAIgGIgM


A 3. beteg kórtörténetének összefoglalása

• Több hónapos anamnézis, ismeretlen eredetű láz• Fizikális és laboratóriumi jelek „gócbetegségre” utaltak

– Részletes kivizsgálás több potenciális gócot (prostat, epehólyag) tárt fel• Nyirokcsomó duzzanat és „B” tünetek miatt hematológiai

malignitás gyanú, sejtfelszíni markeranalízis, szövettan– Klonalitás nem igazolódott– Többszörös lezajlott bakteriális infekciók jele látszódott (szekunder

immundeficiencia)• „Véletlen lelet”, csökkent T-helper sejtszám• Verifikált HIV-fertőzés (AIDS)


4. beteg, szül: 1988• Családi és saját anamnézis negatív, gyógyszert nem szed. • 5 napja gyenge, palpitáció, fejfájás. Láztalan. Vérzés nincs. • Sápadt, halvány nyh., enyhe icterus, P 100/min, bőrön suffusiok.• Tájékozódó vizsgálat leukémia irányában

Vérkép•WBC 7,16 G/L (12% Mo)•RBC 1,64 T/L•HGB 53 g/L•HCT 0,16•MCV 95 fL•MCH 32 pg•MCHC 338 g/L•PLT 23 G/L•RDW-CV 23,2%

Csv. működés?•Retikulocita 296 G/L•Hct-re és érési gátlásra korrigált reti. index

Kémia•Össz bilirubin 33,7 umol/L

•Indirekt bi 8,6•Crea 60 umol/L•GOT 56 U/L•GPT 142 U/L•LDH 1714 U/L•Hapltoglobin 1,1 mg/dL

•Perif kenet: fragmentocyta•d. Coombs: neg.


Klinikai gyanú: hányás, hasmenés, anaemia, thrombocytopaenia, veseelégtelenség, neurológiai tünetekKlinikai diagnózis: Thrombotycus microangiopathia (TMA)

• Haemolyticus anaemia (Htk<30%)– LDH↑ (>450 U/l)– indirekt Bi ↑, vizelet ubg ↑– haptoglobin↓– szabad haemoglobin ↑– fragmentocyták, schistocyták– reticulocytosis– d. Coombs negatív– Egyéb okok kizárása

• Thrombocyta szám ↓ (<150 109/l)• Veseelégtelenség esetén : Hemolitikus urémiás

szindróma (HUS)• Neurológiai tünetek esetén: Trombotikus

thrombocytopéniás purpura (TTP)

• Thromboticus microangiopathia (TMA):– Olyan veselaesio, amelyben a glomerulusokban és

a kis arteriolákban hyalin thrombusok vannak

www.med-ed.virginia.edu/courses/path/innes/images/rcdjpegs/rcdSlide thanks to Dr. Kline Bolton, UVA.

Curtesy of Diana Krapman


A TTP keletkezésének molekuláris oka az endothel felszín prokoagulánsátalakulása az éretlen vWF megjelenése miatt, ugyanis gátló autoantitestek

keletkeznek a vWF-hasító proteáz (ADAMTS13) ellen

Endothel sejt Endothel sejt


Az antitestek kimutatása 5: Specifikus funkció gátlás

• Feltétele az antigén jól mérhető funkciója (pl. enzimfunkció, kofaktor aktivitás, receptor-jelátviteli aktivitás, lízis)

– Véralvadási ko-faktor: fibrin dugó (pl. szerzett, autoantitestesVIII-as faktor hemofília)– Enzim: reakciósebesség, végtermék (pl. trombotikus trombocitopéniás purpura, TTP,

ADAMTS13)– Komplement fehérje: molekuláris komplex kialakulása, neo-epitóp megjelenése vagy

lízis (pl. herediter angioneurotikus ödéma, HANO, vagy hemolitikus urémiás szindróma, HUS)

– Receptor aktiválás (pl. Basedow kór, TSH receptor antitest) vagy blokkolás (Myastheniagravis, Acetil-kolin receptor antitest)

• A kimutatás módja a – keveréses, funkcionális vizsgálat (a beteg mintájában található antitest gátolja az

egészséges minta aktivitását)– Sejtes (riporter) assay– Direkt vizsgálat (antigén-antitest reakció kimutatása immunassay-vel)

• Titrálással meghatározható az 50%-os gátlást okozó koncentráció (hagyományosan 1 Bethesda egység)


ADAMTS13 aktivitás mérés a 4. beteg mintájában• A beteg plazmájában több plazmaferezis után is 0%-os aktivitást találtunk• A keveréses vizsgálat anti-ADAMTS13 gátló antitestek jelenlétét igazolta (14

Bethesda egység)

ADAMTS-13 aktivitás mérés

0 10 20 30 40 50 60350000

450000

550000

650000

750000

850000

950000 Normál plazma (100%)

Kevert minta(NP+4. beteg, 1:1)

4. beteg

idő (perc)

Elha

síto

tt v

WF

men

nyis

ége

(FR

ETS

-vW

F-73

fluo

resz

cenc

ia u

nit 3

40nm

/460

nm)

Nincs ADAMTS13 aktivitás

Festék Jelfogó

Van ADAMTS13 aktivitás

Festék Jelfogó


A 4. beteg kórtörténetének összefoglalása

• Fiatal nőbeteg akut, sürgősségi felvételt indokoló tünetekkel• Hematológiai vizsgálat

– Kóros sejteket nem talált a periférián és ép csontvelőműködésre utalt– Súlyos normociter anémia és fragmentociták mellett LDH emelkedés, indirekt

bilirubinémia mutatkozott (hemolízis, direkt Coombs negatív)– Alacsony trombocitaszám

• Megalapozott gyanú merült fel trombotikus mikroangiopátiára• A megerősítő, specifikus, funkcionális vizsgálattal anti-ADAMTS13

autoantitesteket lehetett kimutatni, vagyis megszületett a thrombotikustrombocitopéniás purpura (TTP, Moschcowitz szindróma) diagnózis.


Az előadás során bemutatott eljárások összefoglalása

• Turbidimetria, nefelometria, folyadékfázisú immunassayk (immunkémia), akut fázis reakció, elektroforézis, immun-elektroforézis

– CRP, (PCT, TnT), C3, C4, Ig• Mikroszkópos autoantitestkimutatás, immuhisztokémia

– Anti-nukleáris faktor, anti-neutrofil citolplazma antitest• Szilárd fázisú immunassay-k

– Autoantitest meghatározások (pl. anti-DNA)• Sejtfelszíni antigénkimutatás, flow-cytometria

– Perifériás sejtpopulációk (CD4/CD8), kóros sejtek vizsgálata• Infektív szerológia (szilárd fázisú mérések, Western-blot), immunglobulin

osztályok megoszlása– HIV, EBV, HBsAg, HCV szerológia

• Funkcionális autoantitest meghatározások– ADAMTS13 gátló antitest meghatározás


Antitestekkel kapcsolatos Nobel díjak

1901 Emil Adolf von Behring– szérum terápia

1908 Ilya Ilyich Mechnikov, Paul Ehrlich– immunológiai felismerés

1913 Charles Robert Richet– anafilaxiás reakció

1919 Jules Bordet– immunológiával kapcsolatos felfedezések

1930 Karl Landsteiner– ABO vércsoport

1972 Gerald M Edelman, Rodney R Porter– az ellenanyag kémiai szerkezete

1977 Rosalyn Yallow- Radio-immunoassay

1984 Niels K Jerne, Georeg JF Köhler, César Milstein– immunszabályozás és a monoklonális ellenanyagok előállítása

1987 Susumu Tonegawa– az ellenanyag diverzitás háttere

Tom, a diftéria toxinnal elsők között immunizált ló


Immunológiai módszerek

Medicina kiadó, 2006Szerk: Erdei Anna13. fejezet (Pálóczi Katalin)

Gyakorlati laboratóriumi medicina

Literatura Medica kiadó, 2008Szerk: Debreczeni Lóránd, Kovács L. Gábor9. fejezet (Sipka Sándor, Lakos Gabriella)


Elérhető 2012. áprilistól a http://tamop.etk.pte.hu/TF/ honlapon. Könyvként nem rendelhető!

Klinikai laboratóriumi vizsgálatok és paraméterek

Semmelweis Kiadó, 2010Szerk: Szabó Antal

Documents

Az immunológiai vizsgálatok helye a laboratóriumi medicinában