EPSTEIN BARR VIRUS VCA IgM ELISA · 2020. 5. 5. · EPSTEIN BARR VIRUS VCA IgM ELISA EN 3/14 version 1 Enzyme immunoassay for the detection of IgM antibodies to Epstein-Barr virus

EPSTEIN BARR VIRUS VCA IgM ELISA

KAPDVCAM

EPSTEIN BARR VIRUS VCA IgM ELISA EN

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CONTENT

1 Introduction ..................................................................................................... 3

2 Test Principle.................................................................................................... 4

3 Materials Provided ........................................................................................... 5

4 Other Material Required for Manual Test Performance ................................... 6

5 Storage and Stability ........................................................................................ 6

6 Preparation of Reagents ................................................................................... 6

7 Preparation of Samples .................................................................................... 7

8 Assay Procedure ............................................................................................... 7

9 Working Schedule ............................................................................................ 9

10 Quality Control ............................................................................................... 10

11 Results Interpretation .................................................................................... 10

12 Safety Precautions ......................................................................................... 11

13 Procedural Notes............................................................................................ 12


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Enzyme immunoassay for the detection of IgM antibodies to Epstein-Barr virus viral capsid antigen in human serum, plasma

or cerebrospinal fluid

1 Introduction

Epstein-Barr virus (EBV) is a member of the Herpetoviridae family (HHV4). An infected human is the source of infection that spreads mainly through air-borne transmission or direct contact. EBV is an etiologic agent of infectious mononucleosis (IM) and it is also related to Burkitt’s lymphoma and nasopharyngeal carcinoma. 90% of people become infected with EBV during childhood. After the incubation period (1-2 month) some people develop typical symptoms of IM – fever, pharyngitis and lymphadenopathy. Symptoms of EBV infection are influenced by patient age and immune system status. EBV persists latently in the organism for the rest of the individual’s life and can be reactivated.

Diagnosis of the disease is based on an anamnesis, a clinical picture and laboratory tests. Determination of specific IgA, IgG and IgM antibodies against particular EBV antigens (VCA, EBNA-1, EA-D) using ELISA method is a powerful tool for the detection and determination of stage of EBV infection.

VCA: Anti-VCA IgG antibodies have an anamnestic character and persist in infected individuals for their entire life. Seroconversion can be detected in the early phase of the primary infection. A significant rise in IgG anti-VCA antibodies indicates reinfection or reactivation. Determination of IgG antibodies avidity enables differentiation between a primary and past infection or reactivation. IgM and IgA antibody responses are typical for active infection. High levels of IgM anti-VCA are usually present in acute and convalescent phases of IM, while in EBV reactivation IgM response is low and often undetectable and IgA response is more pronounced. After recovery, both IgM and IgA antibodies may persist for several weeks or months.

EBNA-1: During the acute phase of primary infection IgM antibodies are detected, while IgG antibody response is delayed. Absence of IgG anti-EBNA with concomitant presence of IgG and IgM anti-VCA is a diagnostic marker of infectious mononucleosis. Long term absence of IgG anti-EBNA-1 antibody may indicate immune deficiency.

EA-D: IgM and IgG antibodies to EA-D antigen are additional markers of primary EBV infection. High titres of IgG anti-EA-D are typically present in late acute and convalescent phases of infectious mononucleosis.


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2 Test Principle

The kit is intended for detection of specific IgM antibodies in a sample by means of a sandwich type of the EIA method (i.e. a solid phase coated with specific antigen – antibody from the analysed sample – labelled antibody). The labelled antibody (conjugate) is an animal immunoglobulin fraction to human IgM conjugated with horseradish peroxidase. Peroxidase activity is determined in the test by a substrate containing TMB. Positivity is indicated when blue colour appears; after stopping solution has been added, blue changes to yellow. The yellow colour intensity is measured by a photometer at 450 nm, and it is proportional to the concentration of specific IgM antibodies in the sample.

Antigen Used

Recombinant antigens with highly specific immunodominant epitopes of EBV VCA


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3 Materials Provided

Microtiter Plate 1 pc

coated with antigen, 12 x 8 breakable wells in bag with desiccant

Negative Control (Calibrator 1) 5 U/ml 1 × 2 ml

Solution containing no specific human antibodies, ready to use

CUT-OFF (Calibrator 2) 20 U/ml 1 × 3 ml

Solution containing specific human antibodies in cut-off concentration, ready to use

Positive Control (Calibrator 3) 80 U/ml 1 × 2 ml

Solution containing specific human antibodies, ready to use

Calibrator 4 (160 U/ml) 1 × 2 ml

Solution containing specific human antibodies, ready to use

Conjugate 1 × 15 ml

Solution containing peroxidase labelled animal immunoglobulin to human IgM, ready to use

Sample Diluent 11 1 × 105 ml

Buffer with protein stabilisers and IgG/RF sorbent, ready to use

TMB Solution 1 × 15 ml

Chromogenic substrate solution containing

TMB/H2O2 ready to use

Wash Solution 1 × 75 ml

20× concentrated buffer

Stop Solution 1 × 15 ml

Acid solution, ready to use

Instructions for use 1 pc


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4 Other Material Required for Manual Test Performance

Single and multichannel pipettes

Disposable tips

Microplate washer

Timer

Incubator (37°C)

Microplate reader

5 Storage and Stability

Store the kit at +2°C to +8°C. Do not freeze. If the kit is stored as described, the labelled expiration date is valid. The expiration date is indicated on the package. The opened kit should be used within three months.

Samples Preparation and Storage

The following human body liquids can be used for testing: serum, citrate plasma and cerebrospinal fluid. Anticoagulants in the plasma (except for citrate) as well as bacterially contaminated, haemolytic or chylous samples can affect the test results.

Samples can be stored at +2°C to +8°C for one week. For a longer period, store samples at -20°C. Diluted samples should be used as soon as possible.

6 Preparation of Reagents

Dilute the Wash Solution 1:20 (1 part of solution and 19 parts of distilled water); e.g. 75 ml of the concentrated Wash Solution + 1425 ml of distilled water.

Salt crystals might develop in the bottle with the concentrated Wash Solution. Prior to use, it is necessary to dissolve the crystals by warming the bottle in a water bath. The diluted Wash Solution is stable at +2°C to +8°C for one week.

The Controls (positive, negative and CUT-OFF) are ready to use, do not dilute further!

The Conjugate is ready to use, do not dilute further!

TMB Solution is a one-component chromogenic substrate solution ready to use, do not dilute further!

Interchangeability of reagents

The Sample Diluent, TMB Solution and the Avidity Solution are interchangeable between some ELISA of DIAsource Immunoassays S.A., provided they have the identical numeric marking (e.g. Sample Diluent 2, Sample Diluent 3, etc.). Further information relative to this interchangeability can be requested to DIAsource ImmunoAssays S.A.


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7 Preparation of Samples

Mix gently the Sample Diluent prior to use.

Dilution of sera and plasma samples

Dilute well mixed samples 1:101 with the Sample Diluent:

e.g.: 10 µl of sample + 1 ml of the Sample Diluent

Mix well and incubate at room temperature for 10 minutes.

Dilution of cerebrospinal fluid samples (CSF)

Dilute well mixed CSF 1:3 with the Sample Diluent:

e.g.: 50 µl of CSF + 100 µl of the Sample Diluent

Mix well and incubate at room temperature for 10 minutes.

8 Assay Procedure

Allow all reagents to come to room temperature and mix well. If you do not use a whole microplate, return unnecessary strips into the bag with desiccant. Seal the bag tightly and store at +2°C to +8°C. Keep dry!

1. Dispense the controls (calibrators) and the diluted samples according to the working schedule.

Semiquantitative evaluation in Index of Positivity (IP)

• Leave A1 well empty (blank).

• Pipette 100 µl of the Negative Control (Calibrator 1) into 1 well.

• Pipette 100 µl of CUT-OFF (Calibrator 2) into 2 wells.

• Pipette 100 µl of the Positive Control (Calibrator 3) into 1 well.

• Pipette 100 µl of the diluted samples (see Chapter Preparation of Samples) into the other wells.

Quantitative evaluation in Units U/ml

• Leave A1 well empty (blank).

• Pipette 100 µl of the Negative Control (Calibrator 1) into 1 well.

• Pipette 100 µl of CUT-OFF (Calibrator 2) into 2 wells.

• Pipette 100 µl of the Positive Control (Calibrator 3) into 2 wells.

• Pipette 100 μl of the Calibrator 4 into 2 wells.

• Pipette 100 µl of the diluted samples (see Chapter Preparation of Samples) into the other wells.

2. Cover the microplate with the lid and incubate at 37°C for 30 minutes.


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3. Aspirate the content of the wells and wash 5× with the working strength Wash Solution. Fill the wells up to the edge. Finally, tap the inverted microplate thoroughly on an absorbent paper to remove solution remnants.

4. Pipette 100 µl of the Conjugate into all wells except A1 well.

5. Cover the microplate with the lid and incubate it at 37°C for 30 minutes.

6. Aspirate the content of the wells and wash 5× with the working strength Wash Solution. Fill the wells up to the edge. Finally, tap the inverted microplate thoroughly on an absorbent paper to remove solution remnants.

7. Pipette 100 µl of TMB Solution into all wells. Avoid contamination – see Chapter Procedural Notes.

8. Cover the microplate with the lid and incubate at 37°C for 30 minutes. Keep out of light.

9. Stop the reaction by adding 100 µl of the Stop Solution in the same order and intervals as the substrate was added.

10. Read the colour intensity in wells against blank (A1 well) using photometer set to 450 nm. The absorbance should be read within 30 minutes after stopping the reaction.


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9 Working Schedule

Semiquantitative evaluation Quantitative evaluation

Index of Positivity (IP) Units U/ml

BL TS 4

NC TS 5

CO

CO

PC

TS 1

TS 2

TS 3

A

B

C

D

E

G

H

F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

BL TS 1

Cal1 TS 2

Cal2 TS 3

Cal2 TS 4

Cal3 TS 5

Cal3

Cal4

Cal4

A

B

C

D

E

G

H

F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

BL Blank (empty well) BL Blank (empty well)

NC 100 µl Cal1 100 µl

CO 100 µl Cal2 100 µl

PC 100 µl Cal3 100 µl

TS 1-x 100 µl diluted tested sample Cal4 100 µl

TS 1-x 100 µl diluted tested sample


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10 Quality Control

The test is valid if:

The absorbance of blank is lower than 0.150.

BLANK < 0.150

The absorbance of the Negative Control (Calibrator 1) is lower than half of the mean absorbance of CUT‒OFF (Calibrator 2).

< 0.5 ×

The mean absorbance of CUT-OFF (Calibrator 2) is within a range of 0.150 – 0.900.

0.150 < < 0.900

The absorbance of the Positive Control (Calibrator 3) is 1.5-fold higher than the mean absorbance of CUT‒OFF (Calibrator 2).

> 1.5 ×

The absorbance of the Calibrator 4 is higher than the absorbance of the Positive Control (Calibrator 3).

>

11 Results Interpretation

Calculation of Index of Positivity (IP)

Divide the absorbance of a tested sample by the mean absorbance of CUT-OFF measured in the same test run:

Interpretation of the test results is described in Table 1.

Table 1 Interpretation of test results

Index of Positivity (IP)

Evaluation

lower than 0.9 negative

0.9 to 1.1 borderline

higher than 1.1 positive


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Examination of borderline samples, i.e. samples with Index of Positivity from 0.9 to 1.1, should be repeated from a new sample collected after 2 to 6 weeks regarding to the disease specifics.

Quantitative evaluation in Units (U/ml)

Construct a calibration curve by plotting the concentration (X) of the calibrators in U/ml against the corresponding absorbance (Y). Construct the calibration curve by single point cross connection. Read the values of antibody level (U/ml) in samples from the calibration curve. Interpretation of the quantitative test results is described in Table 2.

Table 2 Quantitative interpretation in Units (U/ml)

Antibody level (U/ml) Evaluation

lower than 18 negative

18 to 22 borderline

higher than 22 positive

Examination of borderline samples should be repeated from a new sample collected after 2 to 6 weeks regarding to the disease specifics.

Serological finding can be interpreted only in the context of results of other laboratory tests and patient clinical picture.

12 Safety Precautions

The kit is intended for in vitro diagnostic use only.

The sera used for controls were tested and found to be negative for HIV 1 and HIV 2, HBsAg, HCV, TPHA. In spite of this fact, they still need to be handled as potentially infectious materials.

Some reagents contain sodium azide, which is a toxic compound. Avoid contact with skin.

The Stop Solution contains diluted acid solution. Avoid contact with eyes and skin.

It is necessary to observe the local safety rules and regulations.

For more information refer to Stop Solution MSDS.

First aid

In case of contact with eyes, flush with copious amount of water and seek medical assistance. In case of contact with skin and clothing, remove all the contaminated clothes. Wash the skin with soap and plenty of running water. In case of contact with solutions containing plasma or clinical samples, disinfect the skin. In case of


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accidental ingestion, flush the mouth with drinking water and seek medical assistance.

Remnants disposal

All the materials used for performing the test must be treated as potentially infectious due to the contact with biological materials. Therefore they need to be disposed together with biological waste.

Expired kit disposal

Disassemble the kit and dispose the components as biological material. Discard the packaging material as required by local regulations.

13 Procedural Notes

In order to obtain reliable results, it is necessary to strictly follow the Instructions for Use. Always use clean preferably disposable tips and glassware.

Microtiter Plate – in order to prevent water condensation on the surface of the microplate, always allow the bag with the microplate to warm up to room temperature before opening.

Wash Solution – use high quality distilled water for preparing the working strength Wash Solution.

Washing procedure – keep to the prescribed number of wash cycles and fill the wells to the upper edge. The soak time (i.e. interval between two different wash cycles during which the wells stay filled up with the Wash Solution) should be approx. 30-60 seconds.

TMB Solution – the vessel used for multichannel pipetting should not be used for other reagents. Do not return the surplus TMB Solution from the pipetting vessel into the vial.

Non-reproducible results might be caused by improper methodology as following:

• insufficient mixing of reagents and samples before use

• improper replacement of vial caps

• using the same tip for pipetting different reagents

• reagent exposure to excessive temperature; bacterial or chemical contamination

• insufficient washing or filling of the wells (the wells should be filled to the upper edge), improper aspiration of Wash Solution remnants

• contamination of the well edges with Conjugate or samples

• using reagents from different kit lots

• contact of reagents with oxidants, heavy metals and their salts


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The kit might be used for sequential examinations. When preparing working strength solutions, use only the amounts of reagents needed for the analysis.

The kit might be used in all types of automatic EIA analysers.

If necessary, DIAsource ImmunoAssays S.A. can offer a certified modification of the Instructions for Use for the specific type of analyser.

The producer cannot guarantee that the kit will function properly if the assay procedure instructions are not strictly adhered to.


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Summary of EPSTEIN BARR VIRUS VCA IgM ELISA Protocol

Step No. Symbol Test steps

1

Dilute samples

serum/plasma 1:101 (10 µl + 1 ml)

cerebrospinal fluids 1:3 (50 µl + 100 µl)

2 Incubate at laboratory temperature for 10 min

3 Pipette Controls and diluted samples

Blank = empty well

4 Incubate at 37°C for 30 min

5 Aspirate and wash the wells 5×

6 Pipette Conjugate – 100 µl

Blank = empty well


8 Aspirate and wash the wells 5×

9 Pipette Substrate (TMB Solution) – 100 µl

Including blank


11 Pipette Stop Solution – 100 µl

Including blank

12 Read colour intensity at 450 nm

EPSTEIN BARR VIRUS VCA IgM ELISA

KAPDVCAM

EPSTEIN BARR VIRUS VCA IgM ELISA ES

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ÍNDICE

1 Introducción ..................................................................................................... 3

2 Principio del test .............................................................................................. 4

3 Composición del conjunto ................................................................................ 5

4 Otro equipamiento necesario para hacer el test de forma manual ................... 6

5 Almacenamiento y estabilidad ......................................................................... 6

6 Preparación de soluciones de trabajo ............................................................... 6

7 Dilución de muestras ........................................................................................ 7

8 Procedimiento de trabajo ................................................................................. 7

9 Esquema de trabajo ......................................................................................... 9

10 Validez del test ............................................................................................... 10

11 Valoración de los resultados .......................................................................... 10

12 Seguridad en el trabajo .................................................................................. 11

13 Condiciones técnicas ...................................................................................... 12


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Inmunoensayo enzimático para la detección de anticuerpos de clase IgM contra el antígeno de la cápside viral del virus Epstein-

Barr en suero humano, plasma o líquido cefalorraquídeo

1 Introducción

El virus Epstein-Barr virus (VEB) es un miembro de la familia Herpetoviridae (HHV4). Un ser humano infectado es la fuente de infección que se propaga principalmente por transmisión aérea o contacto directo. El VEB es un agente etiológico de mononucleosis infecciosa (MI) y también está relacionado con el linfoma de Burkitt y el carcinoma nasofaríngeo. El 90 % de las personas se infectan con el VEB durante la infancia. Tras el periodo de incubación (1-2 meses) algunas personas desarrollan síntomas típicos de MI: fiebre, faringitis y linfadenopatía. Los síntomas de la infección por el VEB varían en función de la edad del paciente y el estado de su sistema inmunitario. El VEB persiste de forma latente en el organismo durante el resto de la vida del individuo y se puede reactivar.

El diagnóstico de la enfermedad se basa en la anamnesis, el cuadro clínico y las pruebas de laboratorio. La determinación de anticuerpos específicos de las clases IgA, IgG e IgM contra antígenos concretos del VEB (VCA, EBNA-1, EA-D) utilizando el método ELISA es una herramienta poderosa para detectar y determinar el estadio de la infección por el VEB.

VCA: Los anticuerpos de clase IgG anti-VCA tienen un carácter anamnésico y persisten en los individuos infectados de por vida. La seroconversión puede detectarse en la fase temprana de la infección primaria. Un aumento significativo de los anticuerpos de clase IgG anti-VCA es indicativo de reinfección o reactivación. La determinación de la avidez de los anticuerpos de clase IgG permite diferencias entre una infección primaria y pasada o reactivación. Las respuestas de los anticuerpos de clases IgM e IgA son típicas de infección activa. Normalmente hay presentes niveles elevados de IgM anti-VCA en las fases aguda y convaleciente de la MI, mientras que en la reactivación del VEB la respuesta de IgM es lenta y, a menudo, indetectable, y la respuesta de IgA es más pronunciada. Tras la recuperación, tanto los anticuerpos de clase IgM como IgA pueden persistir durante varias semanas o meses.

EBNA-1: Durante la fase aguda de la infección primaria se detectan los anticuerpos de clase IgM, mientras que la respuesta de los anticuerpos de clase IgG se retrasa. La ausencia de IgG anti-EBNA con presencia concomitante de IgG e IgM anti-VCA es un marcador diagnóstico de mononucleosis infecciosa. La ausencia a largo plazo de anticuerpos IgG anti-EBNA-1 puede indicar inmunodeficiencia.

EA-D: Los anticuerpos de las clases IgM e IgG contra el antígeno EA-D son marcadores adicionales de infección primaria por el VEB. Normalmente hay presencia de títulos


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altos de anticuerpos IgG anti-EA-D en las fases convaleciente y aguda tardía de la mononucleosis infecciosa.

2 Principio del test

El kit permite la detección de anticuerpos específicos de la clase IgM en una muestra mediante un ELISA tipo sándwich (es decir, una fase fija recubierta con un antígeno específico - anticuerpo de la muestra de ensayo - anticuerpo marcado). El anticuerpo marcado (conjugado) es una fracción de inmunoglobulina animal contra IgM humana, conjugada con peroxidasa de rábano picante. En la prueba, la actividad de la peroxidasa viene determinada por un sustrato con TMB, que adquiere un color azul en el caso de positividad. Después de añadir una solución de parada, el color azul cambia a amarillo. La intensidad del amarillo se mide utilizando un fotómetro a 450 nm, y es proporcional a la concentración de anticuerpos IgM específicos presentes en la muestra.

Antígeno utilizado

Antígenos recombinantes con epítopos inmunodominante altamente específico del VCA del VEB


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3 Composición del conjunto

Placa de microtitulación 1 ud.

recubierta con antígeno, 12 x 8 pocillos separables en una bolsa con desecante

Control negativo (calibrador 1) 5 U/ml 1 × 2 ml

La solución no contiene anticuerpos humanos específicos, en dilución de trabajo

CUT-OFF (calibrador 2) 20 U/ml 1 × 3 ml

La solución contiene anticuerpos humanos específicos en concentración límite, en dilución de trabajo

Control positivo (calibrador 3) 80 U/ml 1 × 2 ml

La solución contiene anticuerpos humanos específicos en dilución de trabajo

Calibrador 4 (160 U/ml) 1 × 2 ml

La solución contiene anticuerpos humanos específicos en dilución de trabajo

Conjugado 1 × 15 ml

La solución contiene inmunoglobulina animal contra la IgM humana marcada con peroxidasa, en dilución de trabajo.

Solución de dilución de muestras 11 1 × 105 ml

Tampón con estabilizadores de proteínas y reactivo absorbente IgG/RF, en dilución de trabajo

Solución de TMB 1 × 15 ml

Solución de sustrato cromogénico con

TMB/H2O2, en dilución de trabajo

Solución de lavado 1 × 75 ml

Tampón concentrado 20 veces

Solución de parada 1 × 15 ml

Solución de ácido en dilución de trabajo

Instrucciones de uso 1 ud.


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4 Otro equipamiento necesario para hacer el test de forma manual

Pipetas sencillas y multicanal

Puntas desechables

Dispositivo de lavado

Temporizador

Incubadora (37 ºC)

Lector de microplacas

5 Almacenamiento y estabilidad

Almacene los kits a temperatura entre +2 ºC y +8 ºC. No se deben congelar. Si se observan las condiciones de almacenamiento, la fecha de caducidad es válida. La fecha de caducidad se indica en el envase. Tras la apertura del kit se recomienda utilizarlo dentro de los tres meses siguientes.

Dilución y almacenamiento de muestras

Como muestra para el examen se pueden usar los siguientes fluidos del cuerpo humano: suero, plasma citratado y líquido cefalorraquídeo. Las muestras con contaminación bacteriana, hemolíticas o de quilosano y los anticoagulantes contenidos en el plasma (excepto el citrato) pueden afectar el resultado de la prueba.

Las muestras se pueden almacenar a entre + 2 ºC y + 8 ºC durante una semana. Para un almacenamiento más prolongado, almacene las muestras a -20 ºC. Las muestras diluidas deben utilizarse lo antes posible.

6 Preparación de soluciones de trabajo

Diluya la solución de lavado 1:20 (1 parte de solución y 19 partes de agua destilada). Por ejemplo, 75 ml de solución de lavado concentrada + 1425 ml de agua destilada.

En el frasco con solución de lavado concentrada se pueden formar cristales de sal. Es necesario disolver estos cristales antes del uso calentando el frasco en un baño de agua caliente. La solución diluida es estable durante una semana a entre +2 ºC y +8 ºC.

Los controles (positivo, negativo y CUT-OFF) se hacen en solución de trabajo, ¡no diluir más!

¡El conjugado está en la solución de trabajo, no diluir más!

Solución de TMB es una solución de sustrato cromogénico de un componente en dilución de trabajo, ¡no diluir más!

Intercambiabilidad de las soluciones

La Solución de dilución de muestras, la Solución de TMB y la Solución de avidez son intercambiables entre algunos ELISA de DIAsource Immunoassays S.A., siempre que tengan la marca numérica idéntica (p. ej., Solución de dilución de muestras 2,


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Solución de dilución de muestras 3, etc.). Se puede solicitar más información relativa a esta intercambiabilidad a DIAsource ImmunoAssays S.A.

7 Dilución de muestras

Mezcle bien antes del uso la solución de dilución de muestras.

Dilución de muestras de suero y plasma

Diluya las muestras bien mezcladas 1:101 en solución de dilución de muestras:

p. ej.: 10 µl de muestra + 1 ml solución de dilución de muestra

Mezcle bien e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Dilución de la muestra de líquido cefalorraquídeo (LCR)

Diluya LCR bien mezclado 1:3 con solución de dilución de la muestra:

p. ej.: 50 µl de LCR + 100 µl de la solución de dilución de muestras

Mezcle bien e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.

8 Procedimiento de trabajo

Deje que todos los reactivos se alcancen la temperatura del laboratorio y mezcle bien. Si no utiliza toda la placa, devuelva las tiras sobrantes al embalaje con secante, ciérrelo herméticamente y almacénelo a entre +2 ºC y +8 ºC. ¡Protéjalo de la humedad!

1. Dosifique los controles (calibradores) y las muestras diluidas según el esquema de trabajo.

Valoración semicuantitativa en el Índice de positividad (IP)

• Deje el pocillo A1 vacío (blank).

• Pipetee 100 µl de control negativo (calibrador 1) en 1 pocillo.

• Pipetee 100 µl de CUT-OFF (calibrador 2) en 2 pocillos.

• Pipetee 100 µl de control positivo (calibrador 3) en 1 pocillo.

• En los pocillos restantes pipetee 100 µl de muestras en la dilución correspondiente (véase el capítulo Dilución de muestras).

Valoración cuantitativa en unidades U/ml

• Deje el pocillo A1 vacío (blank).

• Pipetee 100 µl de control negativo (calibrador 1) en 1 pocillo.

• Pipetee 100 µl de CUT-OFF (calibrador 2) en 2 pocillos.

• Pipetee 100 µl de control positivo (calibrador 3) en 2 pocillos.

• Pipetee 100 μl del calibrador 4 en 2 pocillos.


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• En los pocillos restantes pipetee 100 µl de muestras en la dilución correspondiente (véase el capítulo Dilución de muestras).

2. Cubra la placa con una cubierta e incúbela a 37 ºC durante 30 minutos.

3. Absorba el contenido de los pocillos y lave 5 veces con solución de lavado de trabajo. Llene los pocillos hasta el borde superior. Finalmente, sacuda bien los restos de solución en material absorbente.

4. Dosifique 100 µl conjugado en todos los pocillos excepto A1.

5. Cubra la placa con una cubierta e incúbela a 37 ºC durante 30 minutos.

6. Absorba el contenido de los pocillos y lave 5 veces con solución de lavado de trabajo. Llene los pocillos hasta el borde superior. Finalmente, sacuda bien los restos de solución en material absorbente.

7. Pipetee 100 µl de solución de TMB en todos los pocillos. Cuidado con la suciedad, véase el capítulo Condiciones técnicas.

8. Cubra la placa con una cubierta e incúbela a 37 ºC durante 30 minutos. Manténgala protegida de la luz.

9. Detenga la reacción añadiendo 100 µl de solución de parada en el mismo orden e intervalos como se dosificó el sustrato.

10. Mida en el fotómetro a una longitud de onda de 450 nm la intensidad del color de la solución en los pocillos contra el blank (pocillo A1), hasta 30 minutos tras pararse la reacción.


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9 Esquema de trabajo

Valoración semicuantitativa Valoración cuantitativa

Índice de positividad (IP) Unidades U/ml

BL TS 4

NC TS 5

CO

CO

PC

TS 1

TS 2

TS 3

A

B

C

D

E

G

H

F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

BL TS 1

Cal1 TS 2

Cal2 TS 3

Cal2 TS 4

Cal3 TS 5

Cal3

Cal4

Cal4

A

B

C

D

E

G

H

F

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

BL Blank (pocillo vacío) BL Blank (pocillo vacío)

NK 100 µl Cal1 100 µl

CO 100 µl Cal2 100 µl

PK 100 µl Cal3 100 µl

TV 1-x 100 µl muestra analizada diluida

Cal4 100 µl

TV 1-x 100 µl muestra analizada diluida


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10 Validez del test

El test es válido si:

La absorbancia del blank es menor que 0,150.

BLANK < 0,150

La absorbancia del control negativo (calibrador 1) es menor que la mitad de la absorbancia media de CUT-OFF (calibrador 2).

< 0,5 ×

La absorbancia media de CUT-OFF (calibrador 2) está en el rango 0,150 – 0,900.

0,150 < < 0,900

La absorbancia del control positivo (calibrador 3) es mayor que 1,5 veces la absorbancia media de CUT-OFF (calibrador 2).

> 1,5 x

La absorbancia del calibrador 4 es mayor que la absorbancia del control positivo (calibrador 3).

>

11 Valoración de los resultados

Cálculo del índice de positividad (IP)

Divida la absorbancia de la muestra de prueba por la absorbancia CUT-OFF media, medida en la misma serie de exámenes:


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La valoración de los resultados de la prueba se indica en la Tabla 1.

Tabla 1 Valoración de los resultados de la prueba

Índice de positividad (IP)

Valoración

menor que 0,9 negativo

de 0,9 a 1,1 límite

mayor que 1,1 positivo

El examen de muestras de límite, es decir, con un índice positivo de 0,9 a 1,1, se debe repetir a partir de una nueva muestra recogida entre 2 y 6 semanas después, teniendo en cuenta las especificidades de la enfermedad.

Valoración cuantitativa en unidades (U/ml)

Cree una curva de calibración trazando la concentración (X) de los calibradores en U/ml contra la absorbancia correspondiente (Y). Cree la curva de calibración mediante conexión transversal de un solo punto. Lea los valores de nivel de anticuerpos (U/ml) en las muestras de la curva de calibración. La valoración de los resultados del examen cuantitativo se describe en la Tabla 2.

Tabla 2 Valoración cuantitativa en unidades (U/ml)

Nivel de anticuerpos (U/ml)

Valoración

menor que 18 negativo

de 18 a 22 límite

mayor que 22 positivo

El examen de muestras límite se debe repetir a partir de una nueva muestra tras entre 2 y 6 semanas, teniendo en cuenta las especificidades de la enfermedad.

El hallazgo serológico se puede interpretar solo en el contexto de los resultados de los otros test de laboratorio y con el cuadro clínico del paciente.

12 Seguridad en el trabajo

El kit está destinado solo para fines de diagnóstico in vitro.

Los sueros utilizados en la producción de controles se examinaron para detectar VIH 1 y VIH 2, HBsAg, VHC, TPHA, con resultado negativo. A pesar de ello, es necesario tratarlos como material potencialmente infeccioso.

Algunos reactivos contienen un componente tóxico, la azida de sodio. Evite el contacto con la piel.


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La solución de parada contiene solución diluida de ácido. ¡Cuando trabaje con esta solución protéjase los ojos y la piel!

Es necesario seguir la normativa local en relación con la seguridad en el trabajo.

Para obtener más información, consulte la hoja de datos de seguridad de la solución de parada.

Primeros auxilios

En caso de contacto con los ojos, enjuague los ojos con abundante agua tibia y busque ayuda médica. En caso de contacto con la ropa y la piel, retire toda la vestimenta contaminada. Lave la piel con abundante agua y jabón. Desinfecte la piel en caso de contacto con soluciones que contengan plasma o muestras clínicas. En caso de ingestión accidental, enjuáguese la boca con agua potable y busque ayuda médica.

Eliminación de los restos

Todos los accesorios utilizados para el test es necesario considerarlos como potencialmente infecciosos debido al contacto con material biológico. Por ello, debe deshacerse de ellos junto con los residuos biológicos.

Eliminación de kits caducados

Desmonte el kit y deseche los componentes como material biológico. Deseche el embalaje y los residuos del embalaje de acuerdo con las normativas locales.

13 Condiciones técnicas

Para lograr resultados fiables, es necesario cumplir estrictamente con el manual. Utilice siempre puntas y materiales de vidrio limpios y preferiblemente desechables.

Placa de microtitulación – antes de abrir, deje siempre que la bolsa con la placa de microtitulación alcance la temperatura ambiente para evitar la condensación del vapor de agua en la superficie de la placa.

Solución de lavado – utilice agua destilada de alta calidad para preparar la solución de lavado en dilución de trabajo.

Lavado – siga el número prescrito de ciclos de lavado y llene siempre el pocillo hasta el borde superior. El tiempo en que los pocillos permanecen llenos con la solución entre ciclos de lavado (tiempo de remojo) debe ser de unos 30-60 segundos.

Solución de TMB – no utilice para otros reactivos el recipiente de pipeteo multicanal. No devuelva el resto de la solución TMB del recipiente de la pipeta al vial.

Los resultados no reproducibles pueden venir de errores metodológicos, en especial:

• mezcla insuficiente de la solución y las muestras antes del uso

• reemplazo inadecuado de las tapas de los viales

• uso de la misma punta para pipetear diferentes soluciones


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• exposición del reactivo a una temperatura excesiva; contaminación bacteriana o química

• lavado o llenado insuficiente los pocillos (los pocillos se deben llenar hasta el borde superior), mala aspiración de los restos de solución de lavado

• contaminación de los bordes de los pocillos con conjugado o muestras

• uso de reactivos de distintos lotes de kits

• contacto de los reactivos con antioxidantes, metales pesados y sus sales

El kit se puede utilizar para análisis secuenciales. Cuando prepare las soluciones de trabajo, utilice solo las cantidades de reactivos necesarios para el análisis.

El kit se podría utilizar en todos los tipos de analizadores de ELISA automáticos.

Si es necesario, DIAsource ImmunoAssays S.A. puede ofrecer una modificación certificada de las instrucciones de uso para tipos concretos de analizador.

En caso de no observarse estrictamente las instrucciones del procedimiento de trabajo, el fabricante no está en disposición de garantizar el correcto funcionamiento del kit.


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Resumen del protocolo de EPSTEIN BARR VIRUS VCA IgM ELISA

Paso n.º Símbolo Pasos de la prueba

1

Diluir muestras

suero/plasma 1:101 (10 µl + 1 ml)

líquidos cefalorraquídeos 1:3 (50 µl + 100 µl)

2

Incube a temperatura del laboratorio durante 10 min

3

Pipetee los controles y las muestras diluidas

Blank = pocillo vacío

4

Incubar a 37 °C durante 30 min

5

Aspirar y lavar los pocillos 5×

6

Pipetee el conjugado – 100 µl

Blank = pocillo vacío

7


8

Aspirar y lavar los pocillos 5×

9

Pipetee el sustrato (Solución de TMB) – 100 µl

Incluyendo los blanks

10


11

Pipetear solución de parada – 100 µl

Incluyendo los blanks

12

Medir la intensidad cromática a 450 nm

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EPSTEIN BARR VIRUS VCA IgM ELISA · 2020. 5. 5. · EPSTEIN BARR VIRUS VCA IgM ELISA EN 3/14 version 1 Enzyme immunoassay for the detection of IgM antibodies to Epstein-Barr virus