Hersteller Manufacturer Fabricant SERION ELISA classic ... · SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG/IgM, Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG, Epstein-Barr Virus EA IgG INHALTSVERZEICHNIS

HerstellerManufacturerFabricantFabbricanteFabricanteΚατασκευαστήςVýrobceProducentПроизводитель

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SERION ELISA classicEpstein-Barr Virus VCA IgG/IgM, Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG, Epstein-Barr Virus EA IgG

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AAL136 06/2015

136.23

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG/IgM, Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG, Epstein-Barr Virus EA IgG INHALTSVERZEICHNIS

1 ANWENDUNGSBEREICH

2 DIAGNOSTISCHE BEDEUTUNG

3 TESTPRINZIP SERION ELISA classic

4 INHALT UND ZUSAMMENSETZUNG

5 ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE MATERIALIEN

6 LAGERUNG UND HALTBARKEIT

7 DURCHFÜHRUNG SERION ELISA classic

7.1 Allgemeine Hinweise

7.2 Probenvorbereitung und Lagerung

7.3 Reagenzienvorbereitung

7.4 Übersicht - Testablauf

7.5 Manuelle Testdurchführung

7.6 Automatische Testdurchführung

7.7 Positivkontrolle / Richtigkeitskontrolle

7.8 Liquordiagnostik

8 TESTAUSWERTUNG

8.1 SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG, EBV EA IgG

8.2 Grenzwertbereiche

8.3 Quantifizierungsgrenzen

8.4 Automatische Testauswertung / Software

8.5 Testgültigkeitskriterien

8.6 Interpretation der Ergebnisse

8.7 Referenzbereiche gesunder Probanden

9 LEISTUNGSMERKMALE

9.1 Sensitivität und Spezifität

9.2 Präzision

10 SICHERHEITSMASSNAHMEN

10.1 Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen

10.2 Entsorgung

11 LITERATUR

Aktualisierungen Versionsnummer: V 136.23 Vorhergehende Version: V 22.11/12-1 Änderung in Kapitel: generelle Überarbeitung D

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Pos : 1 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/U pdate/U pdate: EBV @ 10\mod_1322572463655_6.doc @ 45734 @ Pos : 2 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/Einl eitung " Enzymimmunoassay" @ 4\mod_1255336385816_6.doc @ 21164 @

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG/IgM, Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG, Epstein-Barr Virus EA IgG

Enzymimmunoassay zur Bestimmung von humanen Antikörpern

für die in vitro-Diagnostik Pos : 3 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Bes tell nummern/EBV: Bes tellnummern @ 0\mod_1188368235293_6.doc @ 6488 @

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG Best.-Nr.: ESR1361G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgM Best.-Nr.: ESR1361M

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG Best.-Nr.: ESR1362G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG Best.-Nr.: ESR1363G

Pos : 4 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/Kapitelüberschrif t " Anwendungsber eich" @ 0\mod_1177351044007_6.doc @ 168 @ 1

1 ANWENDUNGSBEREICH Pos : 5 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Anwendungsber eich/EBV: Anwendungsbereich @ 14\mod_1404456157024_6.doc @ 61969 @

Die SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG, VCA IgG bzw. IgM und EBNA1 IgG sind qualitative und quantitative Immunoassays für den Nachweis von humanen Antikörpern in Serum oder Plasma gegen Komponenten des Epstein-Barr Virus (EBV). Der SERION ELISA classic EBV EA IgG und der SERION ELISA classic EBV VCA IgM dienen zur Erfassung akuter Infektionen und Reaktivierungen. Der SERION ELISA classic EBV VCA IgG wird zur Diagnose von Primärinfektionen und zurückliegenden Infektionen eingesetzt. Der SERION ELISA classic EBV EBNA1 IgG dient ausschließlich zum Nachweis zurückliegender Infektionen. Die SERION ELISA classic EBV VCA und EBNA1 IgG wurden zum Nachweis intrathekal gebildeter Antikörper für die Liquordiagnostik validiert.

Pos : 6 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/Kapitelüberschrif t "Diag nostische Bedeutung" @ 0\mod_1177351537598_6.doc @ 219 @ 1

2 DIAGNOSTISCHE BEDEUTUNG Pos : 7 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Di agnostische Bedeutung/EBV: Diagnostische Bedeutung @ 14\mod_1404456314366_6.doc @ 61987 @

Das Epstein-Barr Virus (EBV) ist ein humanpathogenes DNA-Virus aus der Familie der Herpesviren. Es ist weltweit verbreitet. Wie bei allen Herpesviren ist die Durchseuchungsrate sehr hoch und liegt bei Erwachsenen zwischen 90 und 95 %. In den so genannten Entwicklungsländern erfolgt die Primärinfektion in den ersten Lebensjahren und verläuft häufig subklinisch. Im Gegensatz dazu ist in Ländern mit guten hygienischen Verhältnissen die Primärinfektion zeitlich verzögert. Sie trifft vor allem Teenager und junge Erwachsene. Die altersbezogene Spitze der Primärinfektionen ist bei 15- bis 20-jährigen zu verzeichnen. Ca. 50 % der Infizierten entwickeln dann das Krankheitsbild der Infektiösen Mononukleose. Die Übertragung erfolgt hauptsächlich über den Speichel infizierter Personen. Infektionen über Blutprodukte und Knochenmarktransplantate sind weniger häufig.

Im Rahmen der Primärinfektion werden zunächst die Speicheldrüsen infiziert. Über den Speichel gelangen die Viren dann in die Zellen des Nasen-Rachenraums. Die Krankheit äußert sich in diesem Stadium mit grippeähnlichen Symptomen. Durch nachfolgende Infektion der B-Lymphozyten wird das Virus im Körper verbreitet. Die B-Lymphozyten werden durch das Virus zur Proliferation stimuliert, die aber vom Immunsystem in der Regel kontrolliert wird. Die infizierten B-Zellen lassen sich als charakteristische atypische Lymphozyten im peripheren Blut nachweisen. Diese Zellen haben eine variable Form mit auffälligem basophilen Zytoplasma und deutlich sichtbaren Zellkernen. Im weiteren Verlauf der Erkrankung kann es zu hohem Fieber, Splenomegalie, Lymphadenitis, Thrombo-zytopenie und Hepatitis kommen. Wegen der Verbreitungsart des Virus vor allem durch den Speichel, wurde dem Krankheitsbild der Primärinfektion, der Infektiösen Mono-nukleose (IM, bzw. Pfeiffersches Drüsenfieber), auch die Bezeichnung Kissing disease gegeben. In seltenen Fällen kann eine akute Infektiöse Mononukleose in eine chronisch aktive Infektion übergehen.

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Hierbei bleiben die Symptome der Infektiösen Mononukleose über längere Zeit erhalten. Die Pathogenese dieser Erkrankung ist noch weitgehend ungeklärt. Als mögliche Ursachen werden genetische Disposition und / oder die Infektion mit stark lytischen Virusstämmen diskutiert.

In bestimmten Regionen ist das Epstein-Barr Virus eng mit dem Auftreten des Nasopharynxkarzinoms korreliert. Dieser Tumor des Hals-Nasen-Rachenraums besteht aus undifferenzierten Epithelzellen und hat stark metastasierende Eigenschaften. Die Erkrankung ist weltweit verbreitet, kommt aber gehäuft in bestimmten Regionen Südchinas vor. Neben genetischer Disposition werden auch Umwelteinflüsse, wie z. B. Ernährungsgewohnheiten, als Kofaktoren diskutiert.

Ein weiterer Tumor, das Burkitt-Lymphom (BL), ist mit dem Epstein-Barr Virus korreliert. Dieser monoklonale B-Zelltumor tritt gehäuft in Afrika und Papua Neu Guinea v. a. in Regionen mit einer hohen Malariarate auf. In über 90 % dieser Lymphome wird das Epstein-Barr Virus nachgewiesen. Da Plasmodium-Infektionen einen Einfluss auf die Immunantwort nehmen, wird die Malaria als Kofaktor zur Entstehung des Burkitt-Lymphoms diskutiert. Sporadisch kann das BL auch in anderen Teilen der Welt auftreten. In diesen Fällen wird das Virus aber deutlich seltener in den Tumoren nachgewiesen, so dass weitere Kofaktoren (z. B. genetische Veränderungen durch Chromosomen-translokation) zur Ausbildung des Lymphoms zu vermuten sind.

Gleich nach der Übertragung des Epstein-Barr Virus werden im Körper des Patienten IgM Antikörper gegen Early Antigen (EA) gebildet. Die maximale Antikörperkonzentration wird ungefähr mit Auftreten der Symptome beobachtet. Etwa zwei Wochen nach der Übertragung beginnt die Produktion der EA IgG, VCA (Virus Capsid Antigen) IgM und VCA IgG Antikörper. Die größte VCA IgM Antikörperkonzentration ist dann etwa drei Wochen nach Beginn der Symptome zu finden. EA IgG Antikörper werden oft über einen längeren Zeitraum nach der Infektion nachgewiesen. Danach sinken die Konzentrationen der VCA IgM und später der EA IgG Antikörper wieder ab. Die VCA IgG Antikörper erreichen etwa sechs Wochen nach Beginn der Symptome ihre Maximalkonzentration, die lebenslang auf diesem hohen Niveau bestehen bleibt. Etwa drei Wochen nach Beginn der Symptome beginnt die Bildung der EBNA1 IgG Antikörper, die zum Nachweis einer abgelaufenen EBV-Infektion dienen. Diese erreichen nach etwa sieben Monaten ihren Maximalwert. Die EBNA1 IgG Antikörperkonzentration bleibt beim normalen Verlauf einer EBV-Infektion lebenslang auf hohem Niveau. Bei Reaktivierungen, z. B. durch Immunsupressionen, steigt der Titer von EA IgG Antikörpern in den meisten Fällen stark an, während der Titer von VCA IgM meist nicht ansteigt. Nur in seltenen Fällen kann es nach Immunsuppression zum Verlust der EBNA1 IgG Antikörper kommen, so dass EA IgG ein sehr guter Marker für Reaktivierungen ist. Pos : 8 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/T es tprinzip/Tes tpri nzip ELISA classic @ 4\mod_1255342796551_6.doc @ 21207 @ 1

3 TESTPRINZIP SERION ELISA classic

Der ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ist ein immunologisches Verfahren, das sich insbesondere in der Infektionsserologie zur Erfassung von Antikörpern bewährt hat. Die Nachweisreaktion basiert auf der spezifischen Interaktion von Antikörpern und Antigenen. Zu diesem Zweck wurden die Teststreifen der Mikrotiterplatten des SERION ELISA classic mit spezifischen Antigenen von Infektionserregern zur Bindung der in der Patientenprobe vorhandenen Antikörper beschichtet. Weitere, mit Alkalischer Phosphatase markierte Sekundärantikörper detektieren die so gebildeten Immun-komplexe. Das Enzym katalysiert eine Reaktion, in deren Verlauf das farblose Substrat p-Nitrophenylphosphat in das farbige Produkt p-Nitrophenol umgewandelt wird. Die Signalstärke des Reaktionsprodukts ist proportional zur Antikörperkonzentration in der Probe und wird photometrisch erfasst. Pos: 9 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für nur ein Dokument/Inhalt und Zusammensetzung/EBV: Inhalt und Zusammensetzung @ 14\mod_1404461827273_6.doc @ 62077 @ 1

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4 INHALT UND ZUSAMMENSETZUNG

Testkomponenten Stück / Volumen Brechbare Mikrotiterstreifen mit je acht antigenbeschichteten Einzelkavitäten (insg. 96) MTP , 1 Testrahmen. Das Beschichtungsmaterial ist inaktiviert.

12 Stück

Standardserum (gebrauchsfertig) STD , Humanserum in proteinhaltigem Phosphatpuffer; negativ getestet für anti-HIV-Ak, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen) und anti-HCV-Ak; Konservierungsmittel: < 0,1 % Natriumazid; Farbstoff: Amaranth O

2 x 2 ml

Kontrollserum negativ (gebrauchsfertig) NEG , Humanserum in proteinhaltigem Phosphatpuffer; negativ getestet für anti-HIV-Ak, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen) und anti-HCV-Ak; Konservierungsmittel: < 0,1 % Natriumazid; Farbstoff: Lissamin-Grün V

2 ml

Anti-Human IgA, IgG oder IgM Konjugat (gebrauchsfertig) APC , Gegen humanes IgA, IgG oder IgM gerichteter, polyklonaler Antikörper, konjugiert mit Alkalischer Phosphatase, stabilisiert in proteinhaltiger Lösung; Konservierungsmittel: < 0,1 % Methylisothiazolon und < 0,1 % Bromnitrodioxan

13 ml

Waschlösungskonzentrat (ausreichend für 1000 ml) WASH , Natriumchlorid Lösung mit Tween 20 und 30 mM Tris/HCl, pH 7,4; Konservierungsmittel: < 0,1 % Natriumazid

33,3 ml

Verdünnungspuffer (gebrauchsfertig) DILB , oder spezieller Verdünnungspuffer S1 (gebrauchsfertig) DILBS1 (Spezieller Verdünnungspuffer für SERION ELISA

classic EBV EA IgG. Unmittelbar vor Gebrauch schütteln!) Proteinhaltiger Phosphatpuffer mit Tween 20 (DILB) und Lysat von E. coli (DILBS1); Konservierungsmittel: < 0,1 % Natriumazid; Farbstoff: 0,01 g/l Bromphenolblau

2 x 50 ml

Stopplösung (gebrauchsfertig) STOP ,

< 0,1 N Natronlauge, 40 mM EDTA

15 ml

Substrat (gebrauchsfertig) pNPP , Para-Nitrophenylphosphat in lösungsmittelfreiem Puffer; Konservierungsmittel: < 0,1 % Natriumazid

13 ml

Qualitätskontrollzertifikat mit Standardkurve und Wertetabelle INFO ,

(Quantifizierung der Antikörper in IU/ml bzw. U/ml)

2 Seiten

Pos : 10 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Z usätzliche benötigte M aterialien/Z usätzlich benötigte Materiali en (für ALLE T este) @ 12\mod_1375104535967_6.doc @ 57219 @ 1

5 ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE MATERIALIEN

- Übliche Laborausrüstung - Für den IgM Nachweis: SERION Rf-Absorbens (Best. Nr. Z200 (20 ml)) - Spektralphotometer für Mikrotiterplatten mit Filter, Wellenlänge 405 nm,

empfohlene Referenzwellenlänge im Bereich von 620 nm - 690 nm (z. B. 650 nm) - Waschvorrichtung für Mikrotiterplatten - Inkubator 37 °C - Feuchte Kammer - Aqua dest. - Click-Clips (Best. Nr. VT120) - Optional: SERION ELISA control Pos : 11 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Lag erung und Hal tbar kei t/Lager ung und Haltbar keit @ 13\mod_1397031131719_6.doc @ 59207 @ 1

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6 LAGERUNG UND HALTBARKEIT

Reagenz Lagerung Haltbarkeit

Mikrotiterstreifen (mit Antigen beschichtet)

ungeöffnet

nach Anbruch bei 2 – 8 °C in Gegenwart von Trockenmittel und wieder verschlossen gelagert

bis Verfallsdatum

Mindesthaltbar-keit: 4 Wochen

Standardseren / Kontrollseren

ungeöffnet / nach Anbruch bei 2 – 8 °C

bis Verfallsdatum

Konjugat ungeöffnet / nach Anbruch bei 2 – 8 °C

bis Verfallsdatum

Verdünnungspuffer ungeöffnet / nach Anbruch bei 2 – 8 °C

bis Verfallsdatum

Waschlösung ungeöffnet / nach Anbruch bei 2 – 8 °C

Gebrauchsverdünnung bei 2 – 8 °C

Gebrauchsverdünnung bei Raumtemperatur

bis Verfallsdatum

2 Wochen

1 Woche

Substrat ungeöffnet / nach Anbruch bei 2 – 8 °C

bis Verfallsdatum

Stopplösung ungeöffnet / nach Anbruch bei 2 – 8 °C

bis Verfallsdatum

Pos: 12 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Testdurchführung/Überschrift: Durchführung @ 0\mod_1184679699953_6.doc @ 2472 @ 1 7 DURCHFÜHRUNG SERION ELISA classic Pos : 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Allgemeine Hi nweise ELISA cl assic @ 12\mod_1379504700667_6.doc @ 57727 @ 2

7.1 Allgemeine Hinweise

Nur die strikte Einhaltung der Arbeitsvorschrift gewährleistet korrekte Ergebnisse. Für die sachgemäße Anwendung der SERION ELISA classic sind ausschließlich die SERION ELISA classic Komponenten zu benutzen. Letztere dürfen nicht gegen Reagenzien anderer Hersteller ausgetauscht werden. Die Standard- und Kontrollseren der SERION ELISA classic werden chargenspezifisch für jeden Testkit optimal eingestellt und können nicht in anderen Chargen eingesetzt werden. Waschlösung, Substratlösung und Stopplösung können mit allen SERION ELISA classic chargen- und kitunabhängig angewendet werden. Jeder SERION ELISA classic enthält einen gebrauchsfertigen Probenverdünnungspuffer. Bei Anwendung einiger SERION ELISA classic ist der Einsatz spezieller Verdünnungspuffer notwendig, um eine gleichbleibend hohe Ergebnisqualität sicherzustellen. Die Verdünnungspuffer sind chargenunabhängig anwendbar.

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Für jede Immunglobulinklasse (IgA, IgG, IgM) gibt es drei verschiedene Konjugat-konzentrationen, deren Einstufung als + (niedrig), ++ (mittel) und +++ (hoch) durch eine entsprechende Kennzeichnung auf dem Etikett erfolgt. Konjugate gleicher Konzentration und Immunglobulinklasse können mit anderen SERION ELISA classic chargen- und kitunabhängig angewendet werden. Die unsachgemäße Verdünnung der Reagenzien kann zum Verlust an Nachweisempfindlichkeit führen. Um Kontamination zu vermeiden, sollten immer aseptische Techniken zur Entnahme von Reagenzienaliquots angewendet werden. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ist u. a. von der sorgfältigen Mischung der angesetzten Reagenzien abhängig. Aus diesem Grund sollen die Behältnisse von Kontrollseren vor Entnahme gut geschüttelt werden. Auch die Probenverdünnungen sollen vor dem ersten Pipettierschritt mit einem Monomixer (z. B. Vortex) gut durchmischt werden. Weiterhin ist auf eine sorgfältige Pipettierung und die Einhaltung der vorgegebenen Inkubationszeiten und -temperaturen zu achten. Große Zeitdifferenzen zwischen der Pipettierung der ersten und der letzten Kavität bei der Zugabe von Proben- und Kontrollseren, Konjugat und Substrat führen zu unterschiedlichen Inkubationszeiten, welche die Präzision und Reproduzierbarkeit der Messwerte beeinflussen können. Die Testreagenzien sollen während der Lagerung und Inkubation vor hellem Licht geschützt werden. Korrektes Waschen verhindert Testunspezifitäten. Aus diesem Grund müssen die Gebrauchsanleitungen der verwendeten Waschgeräte befolgt werden. Wichtig sind die gleichmäßige Befüllung der Kavitäten der Flachbodenplatten mit Waschlösung und deren vollständige Entfernung, um unkontrollierbare Verdünnungseffekte auszuschließen. Schaumbildung ist in jedem Fall zu vermeiden! Nach Gebrauch sind die Komponenten gut zu verschließen, um deren Austrocknung und Kontamination zu vermeiden. Beim Verschließen der Fläschchen ist eine Verwechslung der Deckel zu vermeiden. Der SERION ELISA classic kann nur ausgewertet werden, wenn die chargenspezifischen Validitätswerte des im Kit enthaltenen Qualitätskontrollzertifikates erfüllt wurden. Pos : 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Probenvor ber. und Lager ung (für ALLE Err eger auß er Borreli a, CM V, FSM E, H SV,Masern,Mumps,R öteln,VZ V) @ 8\mod_1263998040982_6.doc @ 28428 @ 2

7.2 Probenvorbereitung und Lagerung

Lipämische, hämolytische sowie ikterische Proben (Serum oder Plasma) sollten nur unter Vorbehalt eingesetzt werden. Bakteriell kontaminierte Proben sollten nicht verwendet werden. Geeignete Untersuchungsmaterialien sind nach Standardlabortechniken gewonnene Seren oder Plasmen (EDTA, Citrat, Heparin). Die Proben dürfen nicht thermisch inaktiviert werden. Pos: 15 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Testdurchführung/Kapitelüberschrift Probenverdünnung @ 0\mod_1184679414434_6.doc @ 2312 @ 3

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7.2.1 Probenverdünnung

Vor Testbeginn die Proben (V1) in Verdünnungspuffer (V2) verdünnen: Pos : 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung, T eil 1 @ 5\mod_1256050091616_6.doc @ 22817 @ SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG (spezieller Verdünnungspuffer B231-S1!)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG (Verdünnungspuffer B231)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG (Verdünnungspuffer B231)

Der Verdünnungspuffer des SERION ELISA classic EBV EA IgG (B231-S1) ist nicht gegen die Verdünnungspuffer der SERION ELISA classic EBV VCA bzw. EBNA1 austauschbar.

V1 + V2 = 1 + 100 je 10 µl Patientenprobe zu je 1000 µl Verdünnungspuffer

Pos : 17 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung, T eil 2 Ü berschrift @ 0\mod_1188369220721_6.doc @ 6548 @ SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgM Pos : 18 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Probenver dünnung: R heumafaktor-Interferenz (für T ests mit IgM-Nachweis) @ 9\mod_1316422765852_6.doc @ 36506 @

Rheumafaktor-Interferenz Rheumafaktor-Antikörper sind vorwiegend Autoantikörper der IgM Klasse, die bevorzugt an IgG Immunkomplexe binden. Der spezifische Nachweis von IgM Antikörpern kann durch diese Rheumafaktoren zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Ferner besteht die Möglichkeit, dass bindungsschwächere, erregerspezifische IgM Antikörper durch bindungsstärkere IgG Antikörper verdrängt werden. Ein IgM Nachweis kann dann falsch-negativ ausfallen. Aus diesem Grund ist es erforderlich, die Proben für die IgM Bestimmung mit Rheumafaktor-Absorbens vorzubehandeln (SERION Rf-Absorbens, Best.-Nr. Z200 (20 ml/100 Bestimmungen)). Die Rf-Absorption erfolgt durch Inkubation der Patientenprobe im Rf-Verdünnungspuffer über 15 Minuten bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Die Anwendung ist in einer speziellen Arbeitsanleitung beschrieben. Pos : 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung T eil 3 @ 5\mod_1256050082945_6.doc @ 22801 @ Zunächst erfolgt eine 1+4 Verdünnung von Rheumafaktor-Absorbens (V1) mit Verdünnungspuffer (V2).

V1 + V2 = V3 (1 + 4) je 200 µl Rf-Absorbens zu je 800 µl Verdünnungspuffer

Nun werden die Patientenproben (V4) in diesem Rf-Verdünnungspuffer (V3) verdünnt:

V4 + V3 = 1+100 je 10 µl Patientenserum zu je 1000 µl Rf-Verdünnungspuffer

Pos : 20 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenver dünnung: Mischung der Proben @ 4\mod_1255343607624_6.doc @ 21287 @

Nach jeder Verdünnung und vor dem Pipettierschritt sollten die Proben mit einem Monomixer gut durchmischt werden, um eine homogene Lösung herzustellen. Pos : 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenlager ung @ 4\mod_1255343526141_6.doc @ 21271 @ 3

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7.2.2 Probenlagerung

Die Patientenproben sollten nicht länger als 7 Tage bei 2 – 8 °C aufbewahrt werden. Eine längere Lagerung der Proben ist bei ≤ -20 °C möglich. Mehrmaliges Auftauen und Wiedereinfrieren soll vermieden werden. Verdünnte Proben können bei 2 – 8 °C eine Woche aufbewahrt werden. Pos : 22 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Reagenzienvorberei tung - KOMPLETT @ 12\mod_1379504953325_6.doc @ 57763 @ 23333333

7.3 Reagenzienvorbereitung

Alle Testreagenzien müssen vor dem Testansatz auf Raumtemperatur erwärmt werden.

7.3.1 Mikrotiterstreifen

Die mit Kürzeln für Erreger und Immunglobulinklasse versehenen Teststreifen sind mit einem Trockenmittel in einem Verschlussbeutel aus Aluminium verpackt. Der Verschlussbeutel darf nur entlang der Schweißnaht aufgeschnitten werden, um ein Wiederverschließen zu gewährleisten. Nicht benötigte Teststreifen und Kavitäten müssen aus dem Rahmen genommen und wieder luftdicht mit dem Trockenmittel im Aluminiumbeutel eingeschlossen werden. Bei Beschädigung sowie nach unsachgemäßem Verschließen dürfen die Mikrotiterstreifen nicht mehr verwendet werden.

7.3.2 Kontrollseren / Standardseren (gebrauchsfertig)

Kontroll- und Standardseren sind gebrauchsfertig und dürfen nicht verdünnt oder mit Rheumafaktor-Absorbens behandelt werden. Bei jedem Testlauf müssen unabhängig von der Anzahl der eingesetzten Teststreifen Kontrollseren in Einfach-, Standard- bzw. Cut off - Seren in Doppelbestimmung mitgeführt werden.

7.3.3 Anti-Human IgA, IgG oder IgM AP-Konjugat (gebrauchsfertig)

Die zugewiesene Konjugatkonzentration (+, ++, +++) ist auf dem Qualitätskontrollzertifikat angegeben. Bitte zusätzlich Angabe auf dem Etikett beachten.

7.3.4 Waschlösung (Konzentrat)

Das Waschlösungskonzentrat (V1) ist im Verhältnis 1:30 mit Aqua dest. auf ein Endvolumen (V2) zu verdünnen. Beispiel:

Waschlösungskonzentrat (V1) Endvolumen (V2)

33,3 ml 1000 ml

1,0 ml 30 ml

7.3.5 Verdünnungspuffer für Proben (gebrauchsfertig)

7.3.6 Substrat (gebrauchsfertig)

Eine leichte Gelbfärbung des ungeöffneten Substrats ist möglich. Hieraus ergibt sich keine Qualitätsminderung!

7.3.7 Stopplösung (gebrauchsfertig)

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Pos: 23 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Testdurchführung/Testablauf/Überschrift Testablauf @ 0\mod_1180955922843_6.doc @ 732 @ 2

7.4 Übersicht - Testablauf Pos : 24 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/T establauf/EBV: T establ auf @ 5\mod_1256047227345_6.doc @ 22673 @

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG, VCA IgG/IgM, EBNA1 IgG

quantitativ

Für den IgM Nachweis mit den Proben eine Rf-Absorption durchführen, siehe Punkt 7.2.1.; Inkubation 15 Minuten bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C.

Probenverdünnung1 (Patientenproben)

1 + 100

Pos : 25 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Testabl auf/T establ auf @ 12\mod_1365489408139_6.doc @ 55709 @

Zugabe der verdünnten Proben und der gebrauchsfertigen Kontroll-/ Standardseren (100 µl)

INKUBATION 60 Min./ 37 °C feuchte Kammer

WASCHEN (4 x 300 µl DIL WASH )²

Zugabe der Konjugatlösung APC (100 µl)


WASCHEN (4 x 300 µl DIL WASH )²

Zugabe der Substratlösung pNPP (100 µl)


Zugabe der Stopplösung STOP (100 µl)

EXTINKTIONSMESSUNG bei 405 nm

1Sonderverdünnungspuffer bei folgenden SERION ELISA classic: Borrelia burgdorferi IgG, IgM, EBV EA IgG sowie Hantavirus Puumala IgG, IgM.

²Bei manueller Abarbeitung:

Platte nach dem Waschvorgang auf Papiertüchern gründlich ausklopfen.

Pos : 26 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/M anuelle Tes tdurchführ ung (für ALLE Erreg er auß er Adeno, Coxi ella, RSV) @ 12\mod_1379505649011_6.doc @ 57781 @ 2

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7.5 Manuelle Testdurchführung

1. Erforderliche Anzahl Kavitäten in den Testrahmen einsetzen und Protokollblatt anlegen. 2. Je 100 µl der verdünnten Proben bzw. der gebrauchsfertigen Kontrollen in die

benötigten Kavitäten der Teststreifen pipettieren. Eine Kavität für den Substratleerwert freilassen, z. B.:

Kavität ELISA quantitativ

A1 Substratleerwert

B1 Negative Kontrolle

C1 Standardserum

D1 Standardserum

E1 Patient 1 ...

F1 Patient 2 ...

3. Probeninkubation für 60 Minuten (+/- 5 Min.) bei 37 °C (+/- 1 °C) in der feuchten Kammer.

4. Am Ende der Inkubationszeit die Kavitäten waschen (mit Waschgerät oder manuell): - Inkubationsflüssigkeit aus den Kavitäten absaugen oder ausschütten - in jede Kavität 300 µl Waschlösung füllen - Waschlösung absaugen oder ausschütten - Vorgang 3 x wiederholen (also insgesamt 4 x waschen) - die Platte auf Papiertüchern ausklopfen

5. Konjugatzugabe 100 µl des gebrauchsfertigen IgA/IgG/IgM Konjugates in die entsprechenden Kavitäten pipettieren (ohne Substratleerwert).

6. Konjugatinkubation für 30 Minuten (+/- 1 Min.) bei 37 °C (+/- 1 °C) in der feuchten Kammer.

7. Am Ende der Inkubationszeit die Kavitäten waschen (wie oben). 8. Substratzugabe

Je 100 µl gebrauchsfertige Substratlösung in alle Kavitäten (auch Substratleerwert) pipettieren.

9. Substratinkubation für 30 Minuten (+/- 1 Min.) bei 37 °C (+/- 1 °C) in der feuchten Kammer.

10. Stoppen der Reaktion Je 100 µl Stopplösung in alle Kavitäten pipettieren, Mikrotiterplatte zum Mischen leicht schütteln.

11. Extinktionsmessung Innerhalb 60 Minuten bei 405 nm gegen den Substratleerwert messen, Referenzwellenlänge im Bereich zwischen 620 nm und 690 nm (z. B. 650 nm).

Pos : 27 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Automatische Tes tdurchführung @ 5\mod_1255350306938_6.doc @ 21541 @ 2

7.6 Automatische Testdurchführung

Die SERION ELISA sind validiert für die Anwendung auf ImmunomatTM und Gemini sowie auf DYNEX DSX® und DS2® und geeignet für die Anwendung auf baugleichen Automaten. Die automatische Prozessierung erfolgt analog zur manuellen Bearbeitung. Bitte beachten Sie, dass unter speziellen Arbeitsbedingungen laborinterne Anpassungen der Substrat-inkubationszeiten notwendig sein können. Pos : 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Positi vkontroll e / Richtigkeitskontroll e @ 8\mod_1260286311409_6.doc @ 27528 @ 2

deutsch 11

7.7 Positivkontrolle / Richtigkeitskontrolle

Zur periodischen Überprüfung der Untersuchungsmethode im Rahmen des laborinternen Qualitätsmanagements empfehlen wir die Anwendung unserer SERION ELISA control. Die Positivkontrollen dienen als Richtigkeitskontrollen sowie zur Überprüfung der Präzision der angewandten Methode. Der Gebrauch ist in einer separaten Arbeitsanleitung beschrieben.

7.8 Liquordiagnostik

Die SERION ELISA classic EBV VCA und EBNA1 IgG sind zur Detektion von intrathekal gebildeten Antikörpern geeignet und wurden für die Liquordiagnostik validiert. Sie dienen damit auch zum Nachweis sowie zur Differenzierung von entzündlichen Prozessen im Zentralnervensystem (ZNS). Die Testdurchführung ist in einer speziellen Arbeitsanleitung beschrieben. Eine Auswertungssoftware unterstützt die Berechnung der Antikörperindizes nach einem Schema von Prof. Hansotto Reiber. Pos : 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: TESTAU SWER TUNG + Erreg er @ 1\mod_1197038305478_6.doc @ 11384 @ 12

8 TESTAUSWERTUNG

8.1 SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG, EBV EA IgG Pos : 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: 4-PL M ethode @ 13\mod_1397031924809_6.doc @ 59224 @

Die mathematische Kalibrationskurve zur Antikörperquantifizierung mit SERION ELISA classic Immunoassays basiert auf der 4-Parameter Logistik (4 PL) Funktion. Die vier Parameter A, B, C und D charakterisieren den exakten Verlauf der Standardkurve:

Parameter A: untere Asymptote (OD) Parameter B: Steigung der Kurve Parameter C: Wendepunkt Parameter D: obere Asymptote (OD)

Die Institut Virion\Serion GmbH ermittelt für jeden SERION ELISA classic Immunoassay die chargenspezifische 4 PL Standardkurve in mehrfachen Testläufen unter Einhaltung optimaler Bedingungen. Die vier Parameter werden auf den Qualitätskontrollzertifikaten der SERION ELISA classic angegeben. Der Korrekturfaktor F zur Adaption des Testniveaus des Anwenders an die vorgegebenen 4 PL Standardkurve berechnet sich aus der auf dem Qualitätskontrollzertifikat angegebenen Referenz-OD und der gemessenen, testlauf-spezifischen OD des Standardserums (STD): Durch Multiplikation aller optischen Messsignale (OD) mit diesem Korrekturfaktor F wird das Testniveau des Anwenders an die vorgegebene 4 PL Standardkurve adaptiert. Interassay-Schwankungen werden ausgeglichen, so dass eine Antikörperquantifizierung mit der vorgegebenen Standardkurve möglich wird.

)1)(

ln(1

)/(−

−∗

−−

=AFPatientOD

AD

BC

emlUAktivität

WertODSTDgemessener

WertODSTDF

Referenz=

DE

deutsch 12

Zur Ableitung der Antikörperaktivität aus den optischen Signalen (OD) von Patientenproben stehen nach Abzug des Substratleerwerts (blank) von allen Messwerten und Bildung des OD Mittelwerts (mean value, MV) des doppelt aufgetragenen Standardserums (STD) mehrere Möglichkeiten zur Verfügung, die in einer separaten Anleitung ausführlich beschrieben sind. Pos : 31 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estauswertung/Grenzwertber eich ( für T es te mehrerer Ig-Klassen) @ 12\mod_1375360254888_6.doc @ 57396 @ 2

8.2 Grenzwertbereiche

Die Grenzwertbereiche der SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG und EBV EA IgG sind auf den Qualitätskontrollzertifikaten angegeben und kennzeichnen die Bereiche grenzwertiger Messergebnisse. Die Bewertung einer Patientenprobe unterhalb des Grenzwertbereichs charakterisiert ein negatives Testergebnis; die Bewertung einer Patientenprobe oberhalb des Grenzwertbereichs wird als positives Testergebnis interpretiert. Pos : 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Quantifi zierungsgrenzen @ 6\mod_1258098664276_6.doc @ 24398 @ 2

8.3 Quantifizierungsgrenzen

Die Quantifizierungsgrenzen sind auf dem Kontrollzertifikat des SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG und EBV EA IgG angegeben. Im Rahmen der Leistungsbewertungsstudie wurde die Verdünnungslinearität über diesen Bereich nachgewiesen. Sollten Patientenproben Messwerte oberhalb dieses Bereichs erzielen, können die Proben in einer höheren Verdünnung analysiert werden. Die erhaltenen Antikörperkonzentrationen sind dann mit dem zusätzlichen Verdünnungsfaktor zu multiplizieren. Pos : 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Automatische Tes tauswertung @ 12\mod_1375166354143_6.doc @ 57317 @ 2

8.4 Automatische Testauswertung / Software

Für die automatisierte Auswertung von optischen Messsignalen werden die Software SERION easyANALYZE, die Software SERION evaluate sowie die Microsoft® Excel®-basierte Auswertehilfe SERION activity auf Anfrage gerne zur Verfügung gestellt. Pos : 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: Tes tgültig kei tskriterien @ 12\mod_1375166094763_6.doc @ 57299 @ 2

8.5 Testgültigkeitskriterien

- Der Substratleerwert muss einen OD-Wert < 0,25 aufweisen.

- Die negative Kontrolle muss in der Testauswertung als negativ bewertet werden.

- Bei quantitativen SERION ELISA classic muss der OD-Mittelwert des Standardserums nach Abzug des Substratleerwerts innerhalb des Gültigkeitsbereiches liegen, der auf dem chargenspezifischen Qualitätskontrollzertifikat angegeben ist.

- Bei qualitativen SERION ELISA classic müssen der OD-Wert der Positivkontrolle und der Mittelwert der OD-Werte des Cut off - Serums jeweils nach Abzug des Substratleerwertes innerhalb des Gültigkeitsbereichs liegen, der auf dem chargenspezifischen Qualitätskontrollzertifikat angegeben ist.

- Die OD Einzelwerte des Standardserums bzw. des Cut off – Serums dürfen nicht um mehr als 20 % differieren.

Sind diese Kriterien nicht erfüllt, ist der Testlauf ungültig und muss wiederholt werden. Pos : 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: Interpretation der Ergebnisse @ 0\mod_1190013774869_6.doc @ 9938 @ 2

deutsch 13

8.6 Interpretation der Ergebnisse Pos : 36 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Inter pretation der Ergebnisse @ 14\mod_1404459355399_6.doc @ 62041 @ Ein positives Ergebnis bestätigt das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern. Ein negatives Ergebnis zeigt, dass im Serum keine klinisch relevante Antikörperaktivität gegen den Erreger vorhanden ist, schließt jedoch eine frische Infektion nicht aus. Im Falle eines grenzwertigen Ergebnisses ist keine sichere Bewertung der Patientenprobe möglich. In einem solchen Fall sollte der Test parallel mit einer, im Abstand von ein bis zwei Wochen entnommenen, neuen Serumprobe (Serumpaar) wiederholt werden. Die Diagnose einer Primärinfektion (Infektiöse Mononukleose, IM) erfolgt vor allem durch den Nachweis von Antikörpern, die gegen frühe Antigene (Early Antigen) und gegen den Proteinkomplex des viralen Kapsidproteins (Virus Capsid Antigen, VCA) gerichtet sind. Die Bedeutung und das Auftreten von Antikörpern gegen VCA sind seit langem belegt. Kurz nach Infektion mit dem Virus treten EA und VCA IgM Antikörper auf, die mit Abklingen der akuten Infektion wieder verschwinden oder nur in sehr geringer Aktivität vorliegen. Dahingegen persistieren die etwa zeitgleich oder leicht verzögert gebildeten VCA IgG Antikörper lebenslang, wobei die Antikörperaktivität variieren kann. Im Fall einer Reaktivierung (z. B. nach Immunsuppression) kommt es zu einem deutlichen Anstieg der EA IgG und der VCA IgG Antikörper. In seltenen Fällen können dann auch VCA IgM Antikörper wieder nachweisbar sein. Wie nach Reaktivierung sind auch für das Burkitt-Lymphom bzw. Nasopharynxkarzinom sehr hohe VCA IgG Antikörperspiegel charakteristisch. Darüber hinaus kommt dem Nachweis von VCA IgA Antikörpern bei der Diagnose des Nasopharynxkarzinoms eine unterstützende Aussage zu. Ein erhöhter EA Antikörperspiegel ist ebenfalls charakteristisch bei Patienten mit Nasopharynxkarzinom und nach Reaktivierung. Mehrere Wochen nach einer Primärinfektion werden Antikörper gegen das EBV-Nukleäre Antigen 1 (EBNA1) gebildet, welche lebenslang persistieren. Unter Immunsupression kann es zu einem Verlust der Antikörper gegen EBNA1 kommen. Allein oder zusammen mit VCA IgG Antikörpern gelten sie als Marker für eine zurückliegende Infektion. Die Konstellation EBNA1 IgG und VCA IgG wird als abgelaufene Infektion beurteilt. Nach Reaktivierungen, z. B. nach Organtransplantation, wird häufig ein Abfall der EBNA1 IgG Antikörper beobachtet. Gleichzeitig steigen oftmals die VCA spezifischen IgG Antikörper wieder an und die Antikörper gegen das Early Antigen werden erneut gebildet.

Grenzwertige Ergebnisse im SERION ELISA classic EBNA1 IgG werden bei gleichzeitig positivem SERION ELISA classic EBV VCA IgG Ergebnis positiv bewertet, so dass die serologische Antikörperkonstellation für eine lange zurückliegende Infektion spricht. In der folgenden Tabelle sind mögliche Antikörperkonstellationen und ihre diagnostische Aussage zusammenfassend dargestellt.

DE

deutsch 14

Grundinterpretationsschema: Das Grundinterpretationsschema soll in erster Linie zur Unterscheidung zwischen Seronegativität, Primärinfektion und zurückliegender Infektion anhand der vier wichtigsten serologischen Marker EA IgG, VCA IgG, VCA IgM und EBNA1 IgG dienen.

EA IgG VCA IgM VCA IgG EBNA1 IgG Bewertung

- - - - Seronegativität

+ - - -

frische Infektion

- + - -

+ + - -

+ + + -

+ - + -

- + + -

- - + -

- - + + zurückliegende Infektion

- - - +

++ - ++ + Reaktivierung

++ + ++ +

Kreuzreaktionen mit Antikörpern gegen andere Herpesviren (z.B. CMV, HSV, VZV) können nicht ausgeschlossen werden. Pos : 37 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: Refer enzbereiche gesunder Pr obanden @ 8\mod_1258644290978_6.doc @ 26748 @ 2

8.7 Referenzbereiche gesunder Probanden

Die Untersuchung von Seren unselektierter Blutspender aus dem süddeutschen Raum mit SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus ergab folgende Verteilung: Pos : 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Refer enzbereich gesunder Probanden @ 12\mod_1380024245277_6.doc @ 58089 @

SERION ELISA classic Anzahl negativ grenzwertig positiv

EBV VCA IgG 131 3 (2,3 %) 2 (1,5 %) 126 (96,2 %)

EBV VCA IgM 131 131 (100 %) - -

EBV EBNA 1 IgG 131 11 (8,4 %) - 120 (91,6 %)

EBV EA IgG 131 92 (70,2 %) 11 (8,4 %) 28 (21,4 %) Pos : 39 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift Leistungsmer kmale @ 0\mod_1184676089844_6.doc @ 2101 @ 1

deutsch 15

9 LEISTUNGSMERKMALE Pos: 40 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Leistungsmerkmale/Kapitelüberschrift: Sensitivität und Spezifität @ 0\mod_1190013251494_6.doc @ 9923 @ 2 9.1 Sensitivität und Spezifität Pos : 41 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Sensi ti vität und Spezifi tät @ 5\mod_1255688283007_6.doc @ 22590 @ Die SERION ELISA classic EBV VCA IgG, IgM und SERION ELISA classic EBV EBNA-1 IgG wurden im Rahmen einer internen Studie mit jeweils 155 Seren von serologisch negativen Blutspendern sowie von Patienten mit akuter und zurückliegender EBV Infektion gegen den ELISA eines Mitbewerbers validiert.

Die Bestimmung der Leistungsparameter des SERION ELISA classic EBV EA IgG erfolgte im Rahmen einer internen Studie mit 96 Serumproben von gesunden Blutspendern und Patienten mit akuter EBV Infektion gegen zwei ELISA und einen Immunoblot führender Mitbewerber.

Sensitivität Spezifität

SERION ELISA classic EBV VCA IgM > 99 % 94,2 %

SERION ELISA classic EBV VCA IgG > 99 % > 99 %

SERION ELISA classic EBV EBNA 1 IgG 96,2 % 94,4 %

SERION ELISA classic EBV EA IgG 84,0 % 95,0 %

Grenzwertige Ergebnisse wurden bei der Berechnung der Sensitivität und Spezifität nicht berücksichtigt. Pos : 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift Präzisi on @ 0\mod_1184676568397_6.doc @ 2116 @ 2

9.2 Präzision Pos : 43 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Präzision @ 14\mod_1404457829683_6.doc @ 62005 @

SERION ELISA classic EBV EA IgG:

Probe Mittlere

Extinktion (OD) Intraassay

VK (%) Mittlere

Extinktion (OD) Interassay

VK (%)

Serum 1 0,616 4,5 0,637 5,5

Serum 2 0,746 5,3 0,814 6,6

Serum 3 2,125 3,0 2,191 2,8

SERION ELISA classic EBV VCA IgM:

Probe Mittlere


VK (%) Mittlere


VK (%)

Serum 1 0,530 8,7 0,551 7,2

Serum 2 1,582 5,1 1,703 6,4

Serum 3 2,249 7,9 2,311 8,7

DE

deutsch 16

SERION ELISA classic EBV VCA IgG:

Probe Mittlere


VK (%) Mittlere


VK (%)

Serum 1 0,554 2,2 0,644 7,1

Serum 2 1,355 2,4 1,510 4,5

Serum 3 1,437 3,0 1,636 4,5

SERION ELISA classic EBV EBNA1 IgG:

Probe Mittlere


VK (%) Mittlere


VK (%)

Serum 1 0,305 2,8 0,341 8,4

Serum 2 0,952 2,5 1,093 4,1

Serum 3 1,622 3,1 1,799 4,2 Pos : 44 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Allgemei ne Texte ELISA classic/Sicherheitsmaßnahmen @ 12\mod_1374740573162_6.doc @ 57165 @ 122

10 SICHERHEITSMASSNAHMEN

10.1 Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen

Der SERION ELISA classic ist nur für die Anwendung durch Fachpersonal vorgesehen, welches die Arbeitstechniken einwandfrei beherrscht. Für die Handhabung der Testreagenzien und der Patientenproben gelten die anerkannten Laborregeln:

- Die Testpackung enthält Verdünnungen humaner Seren. Obwohl alle eingesetzten Seren negativ auf anti-HIV-Ak, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen) und anti-HCV-Ak getestet wurden, müssen sie als potentiell infektiös betrachtet werden.

- Nicht mit dem Mund pipettieren.

- In Bereichen, in denen mit Testreagenzien oder mit Patientenproben gearbeitet wird, nicht essen, trinken oder rauchen.

- Beim Umgang mit Testreagenzien und Patientenproben direkten Kontakt durch das Tragen von Laborkittel, Einweghandschuhen und Schutzbrille vermeiden. Hände anschließend gründlich reinigen.

- Die Patientenproben und alle potentiell infektiösen Materialien sind nach der Testdurch-führung zu dekontaminieren.

- Die Reagenzien sind unzugänglich für Kinder aufzubewahren.

10.2 Entsorgung

Bitte beachten Sie die jeweils geltenden gesetzlichen Vorschriften! Pos : 45 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Liter atur/Liter atur @ 13\mod_1396939862911_6.doc @ 59079 @ 1

11 LITERATUR

Literatur zum SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus finden Sie am Ende dieser Gebrauchsanweisung. === Ende der Liste für T extmar ke Inhalt ===

SERION ELISA classic

Epstein-Barr Virus VCA IgG/IgM, Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG, Epstein-Barr Virus EA IgG CONTENTS

1 INTENDED USE

2 DIAGNOSTIC RELEVANCE

3 TEST PRINCIPLE SERION ELISA classic

4 KIT COMPONENTS

5 MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED

6 STORAGE AND STABILITY

7 TEST PROCEDURE SERION ELISA classic

7.1 Evidence of Deterioration

7.2 Sample Preparation and Storage

7.3 Preparation of Kit Reagents

7.4 Overview - Test Procedure

7.5 Manual Test Procedure

7.6 Automated Test Procedure

7.7 Positive Control / Accuracy Control

7.8 CSF Diagnostics

8 TEST EVALUATION


8.2 Borderline Ranges

8.3 Limits of Quantification

8.4 Automated Evaluation / Software

8.5 Criteria of Validity

8.6 Interpretation of Results

8.7 Reference Range of Healthy Individuals

9 PERFORMANCE CHARACTERISTICS

9.1 Sensitivity and Specificity

9.2 Reproducibility

10 SAFETY MEASURES

10.1 Statements of Warning

10.2 Disposal

11 REFERENCES

Updates Current version Nr.: V 136.23 Previous version: V 22.11/12-1 Update in section: General Update

E

N

english 2

Pos : 1 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/U pdate/U pdate: EBV @ 10\mod_1322572463655_18.doc @ 45735 @ Pos: 2 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Allgemeine Texte ELISA classic/Einleitung "Enzymimmunoassay" @ 4\mod_1255336385816_18.doc @ 21165 @


Enzyme-immunoassay for determination of human antibodies

for in vitro diagnostic use Pos: 3 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für nur ein Dokument/Bestellnummern/EBV: Bestellnummern @ 0\mod_1188368235293_18.doc @ 6490 @ SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG Order Nr.: ESR1361G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgM Order Nr.: ESR1361M

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG Order Nr.: ESR1362G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG Order Nr.: ESR1363G Pos: 4 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Allgemeine Texte ELISA classic/Kapitelüberschrift "Anwendungsbereich" @ 0\mod_1177351044007_18.doc @ 170 @ 1 1 INTENDED USE Pos : 5 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Anwendungsber eich/EBV: Anwendungsbereich @ 14\mod_1404456157024_18.doc @ 61970 @

The SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG, VCA IgG, IgM and EBNA1 IgG tests are quantitative and qualitative immunoassays for the detection of human antibodies in serum or plasma directed against components of the Epstein-Barr Virus (EBV). The SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG and SERION ELISA classic EBV VCA IgM are recommended for the detection of acute infections or reactivations. The SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG determines primary and recent infections. The SERION ELISA classic EBNA1 IgG is recommended for the determination of past infections. The SERION ELISA classic EBV VCA and EBNA1 IgG tests are validated for the demonstration of intrathecally synthesized antibodies in CSF diagnostics. Pos : 6 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/Kapitelüberschrif t "Diag nostische Bedeutung" @ 0\mod_1177351537598_18.doc @ 221 @ 1

2 DIAGNOSTIC RELEVANCE Pos : 7 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Di agnostische Bedeutung/EBV: Diagnostische Bedeutung @ 14\mod_1404456314366_18.doc @ 61988 @

The Epstein - Barr virus (EBV) is a human pathogenic virus belonging to the Herpesvirus family. It occurs worldwide and, in common with all Herpesviruses, the prevalence in the general population is high, reaching 90 to 95 % in the adult population. In the so called developing countries, primary infection is generally in the first year of life and is often asymptomatic. In contrast, in countries with high standards of hygiene primary infection occurs mainly in teenagers and young adults. The peak age for infection is between 15 and 20 years and around 50 % of those infected will develop an infectious mononucleosis. Transmission is primarily through exchange of saliva although other routes are possible such as from blood products or bone marrow transplantation.

During a primary infection the salivary glands are initially involved and virus reaches the nose and throat via the saliva. At this stage, the symptoms of infection are flu-like. The virus is disseminated throughout the body by infected B lymphocytes, which are normally regulated by the immune system but are stimulated to proliferate by the virus. These infected B lymphocytes in the peripheral blood are characteristically atypical with a variable shape, distinctly basophile cytoplasm and an obvious nucleus. As the disease progresses it may manifest as high fever, splenomegaly, lymphadenitis, thrombocytopenia, and hepatitis. Due to the virus’s dissemination and transmission strategy, primarily via saliva, infectious mononucleosis (IM) or glandular fever has also been called the “kissing disease”. In rare cases an acute IM infection can lead to a chronic active disease state. In such cases the symptoms of IM may continue for a considerable time period. The pathogenesis of this complication is unclear although genetic predisposition and/or infection with a particularly lytic strain of virus are suspected. In certain geographical regions EBV is closely associated with the incidence of nasopharyngeal carcinoma. This carcinoma of the pharynx, nose and throat consists of undifferentiated epithelial cells and has a propensity for metastasis. This disease occurs globally but is particularly common in certain regions of south China. Genetic predisposition as well as environmental aspects such as diet are under discussion as cofactors.

english 3

Burkitt´s lymphoma (BL) is also a tumor associated with EBV, primarily in the geographical regions of Africa and Papua New Guinea. This monoclonal B-cell tumor is also linked to areas with high incidence of malaria and over 90 % of such tumors show evidence of the E-B virus. The influence of plasmodium infection on the immune response brings the role of malaria as a cofactor for BL into discussion. Sporadic cases of BL in other regions do occur, however in such cases EBV is much less commonly detected and other cofactors such as genetic changes through chromosome translocation are thought to be responsible for the tumour.

Very early in infection IgM is produced against the early antigen (EA). Maximum concentrations of antibodies tend to coincide with the onset of symptoms, and approximately two weeks after initial infection EA IgG, VCA (Virus Capsid Antigen) IgM and VCA IgG production begins. The highest anti-VCA IgM concentrations are found around three weeks following the onset of symptoms. EA IgG are often detectable for a considerable time following infection. Subsequently the concentrations of VCA IgM and later EA IgG antibodies fall. Anti VCA IgG reaches a peak some six weeks after symptoms appear and remain at a high level lifelong. Around three weeks after appearance of symptoms EBNA1 IgG antibodies, which are an indicator of a past infection, begin to be produced and reach a peak at around seven months and remain at a high level for life following a normal EBV infection. Reactivation of the virus (such as immunosuppression) usually leads to a significant increase in EA IgG antibodies while VCA IgM titres seldom increase. Only very occasionally, following immunosuppression, does EBNA1 IgG disappear so that EA IgG is a good marker for reactivation. Pos : 8 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/T es tprinzip/Tes tpri nzip ELISA classic @ 4\mod_1255342796551_18.doc @ 21208 @ 1

3 TEST PRINCIPLE SERION ELISA classic

The ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) is an immunoassay, which is particularly suited to the determination of antibodies in the field of infectious serology. The reaction is based on the specific interaction of antibodies with their corresponding antigen. The test strips of the SERION ELISA classic microtiter plate are coated with specific antigens of the pathogen of interest. If antibodies in the patient´s serum sample are present, they bind to the fixed antigen. A secondary antibody, which has been conjugated with the enzyme alkaline phosphatase, detects and binds to the immune complex. The colourless substrate p-nitrophenylphosphate is then converted into the coloured product p-nitrophenol. The signal intensity of this reaction product is proportional to the concentration of the analyte in the sample and is measured photometrically. Pos : 9 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Inhalt und Z usammensetzung/EBV: Inhalt und Z usammensetzung @ 14\mod_1404461827273_18.doc @ 62078 @ 1

4 KIT COMPONENTS Test Components Pieces / Volume Break apart microtiter test strips each with eight antigen coated single wells, (altogether 96) MTP , 1 frame. The coating material is inactivated.

12 pieces

Standard serum (ready-to-use) STD , Human serum in protein containing phosphate buffer; negative for anti-HIV Ab, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus surface antigen) and anti-HCV Ab; preservative: < 0.1 % sodium azide; colouring: Amaranth O

2 x 2 ml

Negative control serum (ready-to-use) NEG , Human serum in protein containing phosphate buffer; negative for anti-HIV Ab, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus surface antigen) and anti-HCV Ab; preservative: < 0.1 % sodium azide; colouring: Lissamin Green V

2 ml

Anti-human IgA, IgG or IgM conjugate (ready-to-use) APC , Anti-human IgA, IgG or IgM polyclonal antibody, conjugated to alkaline phosphatase, stabilised with protein stabilisation solution; preservative: < 0.1 % methylisothiazolone, < 0.1 % bromnitrodioxane

13 ml

E

N

english 4

Washing solution concentrate (sufficient for 1000 ml) WASH , Sodium chloride solution with Tween 20 and 30 mM Tris/HCl, pH 7.4; preservative: < 0.1 % sodium azide

33.3 ml

Dilution buffer (ready-to-use) DILB or special dilution buffer S1 (ready-to-use) DILBS1 (Special dilution buffer for SERION ELISA classic EBV EA IgG. Shake immediately before use!) Protein containing phosphate buffer with Tween 20 (DILB) and lysate of E. coli ( DILBS1 ); preservative: < 0.1 % sodium azide; colouring: 0.01 g/l Bromphenol blue

2 x 50 ml

Stopping solution (ready-to-use) STOP , < 0.1 N sodium hydroxide, 40 mM EDTA

15 ml

Substrate (ready-to-use) pNPP , Para-nitrophenylphosphate in solvent free buffer; preservative: < 0.1 % sodium azide

13 ml

Quality control certificate with standard curve and evaluation table INFO , (quantification of antibodies in IU/ml or U/ml)

2 pages

Pos: 10 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Zusätzliche benötigte Materialien/Zusätzlich benötigte Materialien (für ALLE Teste) @ 12\mod_1375104535967_18.doc @ 57220 @ 1 5 MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED - Common laboratory equipment - For the IgM detection: SERION Rf-Absorbent (Order Nr. Z200 (20 ml)) - Photometer for microtiter plates with filter, wavelength 405 nm,

recommended reference wavelength 620 nm - 690 nm (e.g. 650 nm) - Microtiter plate washer - Incubator 37 °C - Moist chamber - Distilled water - Click-Clips (Order Nr. VT120) - Optional: SERION ELISA control Pos: 11 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Lagerung und Haltbarkeit/Lagerung und Haltbarkeit @ 13\mod_1397031131719_18.doc @ 59208 @ 1

6 STORAGE AND STABILITY

Reagent Storage Stability

Microtiter strips (coated with antigen)

unopened

after opening at 2 – 8 °C in closed aluminum bag with desiccant

see expiry date

minimum shelf-life: four weeks

Control sera / Standard sera

unopened / after opening at 2 – 8 °C see expiry date

Conjugate unopened / after opening at 2 – 8 °C see expiry date

Dilution buffer unopened / after opening at 2 – 8 °C

see expiry date

Washing solution unopened / after opening at 2 – 8 °C

working dilution at 2 – 8 °C

working dilution at room temperature

see expiry date

2 weeks

1 week

english 5

Substrate unopened / after opening at 2 – 8 °C see expiry date

Stopping solution unopened / after opening at 2 – 8 °C

see expiry date

Pos : 12 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Überschrift: Durchführ ung @ 0\mod_1184679699953_18.doc @ 2473 @ 1

7 TEST PROCEDURE SERION ELISA classic Pos : 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Allgemeine Hi nweise ELISA cl assic @ 12\mod_1379504700667_18.doc @ 57728 @ 2

7.1 Evidence of Deterioration

Optimum results can only be achieved if the instructions are strictly followed. Only use SERION ELISA classic reagents when using SERION ELISA classic immunoassays. The components must not be exchanged for reagents of other manufacturers. Standard and control sera of SERION ELISA classic immunoassays are defined exclusively for the test kit to be used and must not be used in other lots. Washing solution, substrate and stop solution can be used for all SERION ELISA classic immunoassays irrespective of the lot and the test.

Each SERION ELISA classic test contains a ready-to-use sample dilution buffer. In some cases the use of special dilution buffers is necessary to guarantee consistent quality and reliable results. The dilution buffers can be used irrespective of the lots.

There are three different conjugate concentrations for each immunoglobulin class (IgA, IgG, IgM), indicated on the label as + (low), ++ (medium) and +++ (high). Conjugates with the same concentration and of the same immunoglobulin class are interchangeable and can be used for other SERION ELISA classic immunoassays irrespective of the lot and the test. Dilution or alteration of the reagents may result in a loss of sensitivity. Use aseptic techniques when removing aliquots from the reagent tubes to avoid contamination.

Reproducibility of test results is dependent on thorough mixing of the reagents. Agitate the flasks containing control sera before use and also all samples after dilution (e.g. by using a vortex mixer).

Be sure to pipette carefully and comply with the given incubation times and temperatures. Significant time differences between pipetting the first and last well of the microtiter plate when dispensing samples and control sera, conjugate or substrate can result in different pre-incubation times, which may influence the precision and reproducibility of the results. Avoid exposure of reagents to strong light during storage and incubation.

Adequate washing avoids test unspecificities. Therefore, the washing procedure should be carried out carefully. All of the flat bottom wells should be filled with equal volumes of washing buffer. At the end of the procedure ensure that the wells are free of all washing buffer in order to avoid uncontrolled dilution effects. Avoid foaming!

Reagents must be tightly closed after use to avoid evaporation and contamination. Take care not to mix-up the caps of the bottles and/or vials.

The SERION ELISA classic immunoassay is only valid if the lot-specific validation criteria on the quality control certificate are fulfilled. Pos : 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Probenvor ber. und Lager ung (für ALLE Err eger auß er Borreli a, CM V, FSM E, H SV,Masern,Mumps,R öteln,VZ V) @ 8\mod_1263998040982_18.doc @ 28430 @ 2

7.2 Sample Preparation and Storage

Lipaemic, hemolytic or icteric samples (serum or plasma) should only be tested with caution. Obviously contaminated samples should not be tested. Serum or plasma (EDTA, citrate, heparin)

E

N

english 6

collected according to standard laboratory methods are suitable samples. Samples must not be thermally inactivated. Pos : 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Kapi tel überschrift Probenverdünnung @ 0\mod_1184679414434_18.doc @ 2313 @ 3

7.2.1 Dilution of Samples

Before running the test, patient samples (V1) must be diluted in dilution buffer (V2) as follows: Pos : 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung, T eil 1 @ 5\mod_1256050091616_18.doc @ 22818 @ SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG (special dilution buffer B231-S1!)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG (dilution buffer B231)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG (dilution buffer B231)

Dilution buffer for SERION ELISA classic EBV EA IgG (B231-S1) is not exchangeable against the dilution buffer for SERION ELISA classic EBV VCA or EBNA1.

V1 + V2 = 1 + 100 add 10 µl patient’s sample each to 1000 µl dilution buffer

Pos : 17 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung, T eil 2 Ü berschrift @ 0\mod_1188369220721_18.doc @ 6550 @

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgM Pos: 18 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für mehrere Dokumente/Testdurchführung/Probenverdünnung: Rheumafaktor-Interferenz (für Tests mit IgM-Nachweis) @ 9\mod_1316422765852_18.doc @ 36507 @ Interference with rheumatoid factors Rheumatoid factors are autoantibodies mainly of the IgM class, which preferably bind to IgG immune complexes. The presence of non-specific IgM antibodies (rheumatoid factors) can lead to false-positive results in the IgM assay. Furthermore, the possibility exists, that weak-binding pathogen-specific IgM antibodies may be displaced by stronger-binding IgG antibodies leading to a false-negative IgM result. Therefore it is necessary to pretreat samples with rheumatoid factor-absorbens prior to IgM detection (SERION Rf-Absorbent, Order Nr.: Z200 (20 ml/100 tests)). Rf-absorption is performed by incubation of the patient’s sample in Rf-dilution buffer for 15 minutes at room temperature or over night at 4 °C. The test procedure is described in a separate instruction manual. Pos : 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung T eil 3 @ 5\mod_1256050082945_18.doc @ 22802 @

Before running the test, rheumatoid factor-absorbent (V1) must be diluted 1+4 in dilution buffer (V2).

V1 + V2 = V3 (1 + 4) add 200 µl Rf-absorbent each to 800 µl dilution buffer

Patient’s samples (V4) must be diluted in this Rf-dilution buffer (V3):

V4 + V3 = 1+100 add 10 µl patient’s sample each to 1000 µl Rf-dilution buffer


After dilution and before pipetting into the microtiter plate the samples must be mixed thoroughly to prepare a homogenous solution. Pos : 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenlager ung @ 4\mod_1255343526141_18.doc @ 21272 @ 3

english 7

7.2.2 Sample Storage

The patient’s samples should not be stored for more than 7 days at 2 – 8 °C. Extended storage is possible at ≤ -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing of samples. Diluted samples can be stored at 2 – 8 °C for one week. Pos: 22 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Testdurchführung/Reagenzienvorbereitung - KOMPLETT @ 12\mod_1379504953325_18.doc @ 57764 @ 23333333

7.3 Preparation of Kit Reagents

Bring all reagents to room temperature before testing.

7.3.1 Microtiter Test Strips

The microtiter test strips labeled with abreviations for pathogen and immunoglobulin class are packed with a desiccant in an aluminum bag. To open the aluminum bag of the microtiter plate please cut off the top of the marked side only, in order to guarantee proper resealing. Take unrequired cavities out of the frame and put them back into the aluminum bag. Close bag carefully to ensure airtight conditions. Do not use the strips if the aluminum bag is damaged or if the bag with remaining strips and desiccant was not properly resealed.

7.3.2 Control Sera / Standard Sera (ready-to-use)

Control and standard sera are ready-to-use and must not be diluted any further. For each test run - independent of the number of microtiter test strips to be used - control and standard sera must be included. Standard and cut off sera should be set up in duplicate. Do not treat control sera with Rf-absorbent.

7.3.3 Anti-human IgA, IgG or IgM AP-Conjugate (ready-to-use)

The required conjugate concentration (+, ++, +++) is indicated on the quality control certificate. Please refer also to the specification on the label.

7.3.4 Washing Solution (Concentrate)

Dilute washing buffer concentrate (V1) 1:30 with aqua dest. to a final volume of V2. Example:

Buffer concentrate (V1) Final volume (V2)

33.3 ml 1000 ml

1.0 ml 30 ml

7.3.5 Dilution Buffer for Samples (ready-to-use)

7.3.6 Substrate (ready-to-use)

Substrate in unopened bottle may have a slightly yellow coloring, which does not reduce the quality of the product!

7.3.7 Stopping Solution (ready-to-use)

Pos : 23 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Testabl auf/Ü berschrift Tes tablauf @ 0\mod_1180955922843_18.doc @ 733 @ 2

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english 8

7.4 Overview - Test Procedure

Pos : 24 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/T establauf/EBV: T establ auf @ 5\mod_1256047227345_18.doc @ 22674 @


quantitative

In case of IgM detection absorption of rheumatoid factor, see No. 7.2.1; Incubation 15 minutes at room temperature or over night at 4°C

sample dilution1

(patient´s samples) 1 + 100


Pipette diluted samples and ready-to-use control / standard sera into the microtest wells (100 µl)

INCUBATION 60 min./ 37 °C moist chamber

WASH (4 x 300 µl DIL WASH )²

Pipette conjugate solution APC (100 µl)


WASH (4 x 300 µl DIL WASH )²

Pipette substrate solution pNPP (100 µl)


Pipette stopping solution STOP (100 µl)

READ EXTINCTION at 405 nm

1Special dilution buffers for the following SERION ELISA classic tests: Borrelia burgdorferi IgG, IgM, EBV EA IgG and Hantavirus Puumala IgG, IgM

2For manual use:

tap plate at the end of the wash procedure on paper towel.


english 9

7.5 Manual Test Procedure

1. Place the required number of cavities in the frame and prepare a protocol sheet. 2. Add each 100 µl of diluted sample or ready-to-use controls into the appropriate wells

of microtiter test strips. Spare one well for substrate blank, e.g.: Well Quantitative ELISA

A1 substrate blank

B1 negative control

C1 standard serum

D1 standard serum

E1 patient 1 ...

F1 patient 2 ...

3. Sample incubation for 60 minutes (+/- 5 min.) at 37 °C (+/- 1°C) in moist chamber 4. After incubation wash all wells with washing solution (by automated washer or manually):

- aspirate or shake out the incubation solution - fill each well with 300 µl washing solution - aspirate or shake out the washing buffer - repeat the washing procedure 3 times (altogether 4 times!) - dry by tapping the microtiter plate on a paper towel

5. Addition of conjugate Add 100 µl of the ready-to-use IgA/IgG/IgM conjugate to the appropriate wells (except substrate blank)

6. Conjugate incubation for 30 minutes (+/- 1 min.) at 37 °C (+/- 1 °C) in moist chamber. 7. After incubation wash all wells with washing solution (see above). 8. Addition of substrate

Add 100 µl of ready-to-use substrate solution to each well (including well for substrate blank!)

9. Substrate incubation for 30 minutes (+/- 1 min.) at 37 °C (+/- 1 °C) in moist chamber. 10. Stopping of the reaction

Add 100 µl stopping solution to each well, shake microtiter plate gently to mix. 11. Read extinction

Read optical desity (OD) within 60 minutes at 405 nm against substrate blank, reference wave length between 620 nm and 690 nm (e.g. 650 nm).


7.6 Automated Test Procedure

SERION ELISA are suited for processing on automats and evaluated for use with ImmunomatTM and Gemini as well as with DYNEX DSX® and DS2®. The automated processing is performed analogous to manual use. Please note, that under special working-conditions internal laboratory adaptations of the substrate incubation times may be necessary. Pos : 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Positi vkontroll e / Richtigkeitskontroll e @ 8\mod_1260286311409_18.doc @ 27530 @ 2

7.7 Positive Control / Accuracy Control

For the periodic verification of the test method, in order to fulfil the requirements of laboratory internal quality management systems, we recommend using SERION ELISA controls to determine precision and accuracy of SERION ELISA classic test runs. The use of SERION ELISA controls is described in specific instruction manuals.

E

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7.8 CSF Diagnostics

The SERION ELISA classic EBV VCA and EBNA1 IgG test have been evaluated for the determination of intrathecal antibodies in CSF diagnostics and are recommended for the detection, as well as for the differentiation, of inflammatory processes within the central nervous system (CNS). The test procedure is described in a separate instruction manual. An Excel-based evaluation software tool supports the calculation of antibody indices according to a scheme of Prof. Hansotto Reiber. Pos : 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: TESTAU SWER TUNG + Erreg er @ 1\mod_1197038305478_18.doc @ 11386 @ 12

8 TEST EVALUATION


The mathematical curve fitting for antibody quantification with SERION ELISA classic immunoassays is based on the 4-parameter logistic (4 PL) function. The 4 parameters A, B, C, and D are representative for the exact shape of the standard curve:

Parameter A: Lower asymptote (OD) Parameter B: Slope of the curve Parameter C: Inflection point Parameter D: Upper asymptote (OD)

Institut Virion\Serion GmbH establishes a lot-specific 4 PL standard curve for each SERION ELISA classic immunoassay in multiple test runs under optimal test conditions. The four parameters are indicated on the quality control certificate of each individual SERION ELISA classic test.

For the adaption of the test level to the given 4 PL standard curve the correction factor F is calculated by dividing the standard reference OD value indicated on the quality control certificate with the measured, and consequently test run-specific, standard OD value. By multiplying the OD values obtained from patient samples with the correction factor F, the level of each individual test run is adjusted to the given 4 PL standard curve. Thereby, interassay deviations are compensated for and antibody activities can be directly evaluated from the 4 PL standard curve.

After subtraction of the substrate blank from all measured OD values and calculation of the mean OD value of the standard serum (STD), tested in duplicate, a range of possibilities are available for the evaluation of antibody activities from the optical measurement signals (OD) of patient samples. They are described in separate manuals. Pos : 31 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estauswertung/Grenzwertber eich ( für T es te mehrerer Ig-Klassen) @ 12\mod_1375360254888_18.doc @ 57397 @ 2

8.2 Borderline Ranges

The borderline ranges of the SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG and EBV EA IgG tests are specified on the quality control certificates and indicate the range of borderline test results. Values below this range indicate a negative test result; values above the borderline range are interpreted positive. Pos : 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Quantifi zierungsgrenzen @ 6\mod_1258098664276_18.doc @ 24400 @ 2

)1)(

ln(1

)/(−

−∗

−−

=AFPatientOD

AD

BC

emlUActivity

valueODSTDmeasured

valueODreferenceSTDF =

english 11

8.3 Limits of Quantification

The limits of quantification are specified on the quality control certificate of the SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG and EBV EA IgG. The linearity of dilution within this range has been demonstrated in comprehensive evaluation studies. In case a patient sample shows a test result above the upper limit of quantification, the sample may be tested at a higher dilution. The resulting antibody activity must then be multiplied by the additional dilution factor. Pos : 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Automatische Tes tauswertung @ 12\mod_1375166354143_18.doc @ 57318 @ 2

8.4 Automated Evaluation / Software

For the automated evaluation of optical measurement signals, the Software SERION easyANALYZE, the software SERION evaluate as well as the Microsoft® Excel®-based software tool SERION activity are available on request. Pos : 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: Tes tgültig kei tskriterien @ 12\mod_1375166094763_18.doc @ 57300 @ 2

8.5 Criteria of Validity

- The substrate blank must be < 0.25 OD.

- The negative control must be negative.

- By use of quantitative SERION ELISA classic tests the mean OD value (after subtraction of the substrate blank!) of the standard serum must be within the validity range, which is given on the lot specific quality control certificate.

- By use of qualitative SERION ELISA classic tests the OD-value of the positive control and the mean OD value of the cut off serum must be within the validity ranges, which are given on the lot specific quality control certificate of the kit (after subtraction of the substrate blank!)

- The variation of OD values of the standard serum or cut off serum must not be higher than 20 %.

If these criteria are not met, the test is not valid and must be repeated. Pos : 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: Interpretation der Ergebnisse @ 0\mod_1190013774869_18.doc @ 9940 @ 2

8.6 Interpretation of Results Pos : 36 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Inter pretation der Ergebnisse @ 14\mod_1404459355399_18.doc @ 62042 @

A positive test result confirms the presence of specific antibodies. A negative result indicates that no clinically relevant antibodies against the pathogen are present in the patient´s sample, but does not exclude the possibility of an acute infection. In case of a borderline result a reliable evaluation is not possible. A definitive diagnosis can only be achieved by testing paired serum samples, taken at one to two weeks intervals, in parallel.

Diagnosis of primary Infectious Mononucleosis (IM) is mainly by the detection of antibodies to the early antigen (EA) and against the protein complex known as the viral capsid antigen (VCA), the importance of which has been known for some time. Shortly after infection IgM antibodies directed against EA and VCA appear and then, as the acute infection resolves, diminish or disappear completely. In contrast, anti-VCA IgG, which is produced at almost the same time, persists life long although the levels of activity may vary. In the case of reactivation (for example following immunosuppression) there is a significant increase in the levels of both anti-EA IgG and anti-VCA IgG, and, in rare cases, VCA IgM may be detectable.

Patients with Burkitt lymphoma and nasopharyngeal carcinoma have the same characteristic high levels of VCA IgG as seen in reactivations. In addition, the demonstration of VCA IgA antibodies provides supporting evidence in the diagnosis of nasopharyngeal carcinoma.

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Increased levels of anti-EA antibodies are likewise a characteristic feature in patients suffering from nasopharyngeal carcinoma or experiencing a reactivation.

Several weeks following primary infection antibodies directed against the EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) appear and remain detectable lifelong although they may disappear if the patient is immunosupressed. Alone, or in combination with VCA IgG antibodies, they are considered a marker for a past infection. A decline in EBNA1 IgG is frequently observed following virus reactivation. This is usually accompanied by an increase in VCA IgG activity while antibodies against early antigen reappear.

Borderline results in the SERION ELISA classic EBNA1 IgG test in combination with positive results in the SERION ELISA classic EBV VCA IgG are interpreted as being positive and evidence of a long past infection.

In the following table the various possible combinations of antibodies and their interpretation are listed.

Basic interpretation scheme

This basic interpretation scheme is mainly for differentiation between a seronegative immune status, primary infection and past infection by using the four most important serological markers EA IgG, VCA IgG, VCA IgM and EBNA1 IgG:

EA IgG VCA IgM VCA IgG EBNA1 IgG Interpretation

- - - - seronegativity

+ - - -

acute / recent infection

- + - -

+ + - -

+ + + -

+ - + -

- + + -

- - + -

- - + + past infection

- - - +

++ - ++ + reactivation

++ + ++ +

Cross-reactions with antibodies directed against other herpes viruses (e. g. CMV, HSV, VZV) cannot be ruled out.

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Pos : 37 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: Refer enzbereiche gesunder Pr obanden @ 8\mod_1258644290978_18.doc @ 26750 @ 2

8.7 Reference Range of Healthy Individuals Testing of random blood donor sera, collected in the region of southern Germany, with SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus resulted in the following distribution: Pos : 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Refer enzbereich gesunder Probanden @ 12\mod_1380024245277_18.doc @ 58090 @

SERION ELISA classic Number negative borderline positive

EBV VCA IgG 131 3 (2.3 %) 2 (1.5 %) 126 (96.2 %)

EBV VCA IgM 131 131 (100 %) - -

EBV EBNA 1 IgG 131 11 (8.4 %) - 120 (91.6 %)

EBV EA IgG 131 92 (70.2 %) 11 (8.4 %) 28 (21.4 %) Pos : 39 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift Leistungsmer kmale @ 0\mod_1184676089844_18.doc @ 2103 @ 1

9 PERFORMANCE CHARACTERISTICS Pos : 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift: Sensiti vität und Spezi fität @ 0\mod_1190013251494_18.doc @ 9925 @ 2

9.1 Sensitivity and Specificity Pos : 41 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Sensi ti vität und Spezifi tät @ 5\mod_1255688283007_18.doc @ 22591 @

The SERION ELISA classic EBV VCA IgG, IgM and SERION ELISA classic EBV EBNA-1 IgG tests were validated in an internal study. 155 serum samples, each from serologically negative blood donors as well as from patients with acute and past EBV infection, were analysed and an ELISA from a leading European manufacturer was used as the reference test. The performance characteristics of the SERION ELISA classic EBV EA IgG test were assesssed in an internal study by the analysis of 96 serum samples from healthy blood donors and patients with suspected acute EBV infection. Two ELISA tests and an immunoblot from leading European manufacturers were utilized as reference tests.

Sensitivity Specificity

SERION ELISA classic EBV VCA IgM > 99 % 94.2 %


SERION ELISA classic EBV EBNA 1 IgG 96.2 % 94.4 %

SERION ELISA classic EBV EA IgG 84.0 % 95.0 %

Sera classified as borderline were not included into the calculation of sensitivity and specificity. Pos : 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift Präzisi on @ 0\mod_1184676568397_18.doc @ 2118 @ 2

9.2 Reproducibility Pos : 43 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Präzision @ 14\mod_1404457829683_18.doc @ 62006 @


Sample Mean Value

(OD)

Intraassay

CV (%)

Mean Value

(OD)

Interassay

CV (%)

Serum 1 0.616 4.5 0.637 5.5

Serum 2 0.746 5.3 0.814 6.6

Serum 3 2.125 3.0 2.191 2.8


Sample Mean Value

(OD)

Intraassay

CV (%)

Mean Value

(OD)

Interassay

CV (%)

Serum 1 0.530 8.7 0.551 7.2

Serum 2 1.582 5.1 1.703 6.4

Serum 3 2.249 7.9 2.311 8.7

E

N

english 14


Sample Mean Value

(OD)

Intraassay

CV (%)

Mean Value

(OD)

Interassay

CV (%)

Serum 1 0.554 2.2 0.644 7.1

Serum 2 1.355 2.4 1.510 4.5

Serum 3 1.437 3.0 1.636 4.5


Sample Mean Value

(OD)

Intraassay

CV (%)

Mean Value

(OD)

Interassay

CV (%)

Serum 1 0.305 2.8 0.341 8.4

Serum 2 0.952 2.5 1.093 4.1

Serum 3 1.622 3.1 1.799 4.2

Pos : 44 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Allgemei ne Texte ELISA classic/Sicherheitsmaßnahmen @ 12\mod_1374740573162_18.doc @ 57166 @ 122

10 SAFETY MEASURES

10.1 Statements of Warning

The SERION ELISA classic is designed for use by qualified personnel who are familiar with good laboratory practice. All kit reagents and human specimens should be handled carefully, using established good laboratory practice. - This kit contains human blood components. Although all control- and cut-off sera have

been tested and found negative for anti-HIV-ab, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen) and anti-HCV-ab, they should be considered potentially infectious.

- Do not pipette by mouth.

- Do not smoke, eat or drink in areas in which specimens or kit reagents are handled.

- Wear disposable gloves, laboratory coat and safety glasses while handling kit reagents or specimens. Wash hands thoroughly afterwards.

- Patient’s material and other potentially infectious material should be decontaminated after the test run.

- Reagents should be stored safely and be inaccessible to unauthorized access e.g. children.

10.2 Disposal

Please observe the relevant statutory requirements! Pos : 45 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Liter atur/Liter atur @ 13\mod_1396939862911_18.doc @ 59080 @ 1

11 REFERENCES

References to SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus are to be found at the end of this instruction for use. === Ende der Liste für T extmar ke Inhalt ===


Epstein-Barr Virus VCA IgG/IgM, Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG, Epstein-Barr Virus EA IgG SOMMAIRE

1 UTILISATION PRÉVUE

2 PERTINENCE DU DIAGNOSTIC

3 PRINCIPE DU TEST SERION ELISA classic

4 COMPOSANTS DE LA TROUSSE

5 PRODUITS NÉCESSAIRES MAIS NON FOURNIS

6 STOCKAGE ET STABILITÉ

7 PRINCIPLE DU TEST SERION ELISA classic

7.1 Signe de détérioration

7.2 Préparation et stockage de l'échantillon

7.3 Préparation des réactifs de la trousse

7.4 Aperçu général - Procédure de test

7.5 Procédure de test manuelle

7.6 Procédure de test automatisée

7.7 Contrôle positif / Contrôle de la précision

7.8 Diagnostique du liquide céphalorachidien

8 ÉVALUATION DU TEST


8.2 Fourchettes limites

8.3 Limites de la quantification

8.4 Évaluation automatique / logiciels

8.5 Critères de validité

8.6 Interprétation des résultats

8.7 Fourchette de références des personnes en bonne santé

9 CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE

9.1 Sensibilité et Spécificité

9.2 Reproductibilité

10 MESURES DE SÉCURITÉ

10.1 Mises en garde

10.2 Élimination

11 RÉFÉRENCES

Mises à jour Numéro de la version actuelle : V 136.23

Version précédente : V 22.11/12-1

Mise à jour dans la section : Mise à jour générale

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Pos : 1 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/U pdate @ 15\mod_1406189600723_23.doc @ 65571 @ Pos: 2 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Allgemeine Texte ELISA classic/Einleitung "Enzymimmunoassay" @ 4\mod_1255336385816_23.doc @ 21166 @


Test immuno-enzymatique pour la détection des anticorps humains pour le diagnostic in vitro

Pos : 3 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Bes tell nummern/EBV: Bes tellnummern @ 0\mod_1188368235293_23.doc @ 6491 @ SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG No de commande: ESR1361G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgM No de commande: ESR1361M

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG No de commande: ESR1362G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG No de commande: ESR1363G Pos: 4 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Allgemeine Texte ELISA classic/Kapitelüberschrift "Anwendungsbereich" @ 0\mod_1177351044007_23.doc @ 171 @ 1

1 UTILISATION PRÉVUE Pos : 5 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Anwendungsber eich/EBV: Anwendungsbereich @ 14\mod_1404456157024_23.doc @ 61971 @

Les tests SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG, VCA IgG, IgM et EBNA1 IgG sont des tests immuno-enzymatiques qualitatifs et quantitatifs pour le détection des anticorps humains dans le sérum ou le plasma dirigés contre les composants du virus Epstein-Barr (EBV). Le SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG et le SERION ELISA classic EBV VCA IgM sont recommandés pour la détection des infections aiguës ou les réactivations. Le SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG permet d'identifier les infections primaires et récentes. Le SERION ELISA classic EBNA1 IgG est recommandé pour l'identification des infections passées. Les tests SERION ELISA classic EBV VCA et EBNA1 IgG sont validés pour la démonstration des anticorps synthétisés par voie intrathécale dans les diagnostics du LCR. Pos : 6 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/Kapitelüberschrif t "Diag nostische Bedeutung" @ 0\mod_1177351537598_23.doc @ 222 @ 1

2 PERTINENCE DU DIAGNOSTIC Pos : 7 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Di agnostische Bedeutung/EBV: Diagnostische Bedeutung @ 15\mod_1421651635398_23.doc @ 66971 @

Le virus Epstein-Barr (EBV) est un virus pathogène pour l'humain appartenant à la famille des Herpèsvirus. On le retrouve dans le monde entier et, comme tous les herpèsvirus, la prévalence dans la population générale est élevée, atteignant 90 à 95 % dans la population adulte. Dans les pays en voie de développement, l'infection primaire se fait généralement au cours de la première année de vie et ne présente souvent pas de symptômes. Par contre, dans les pays avec des normes d'hygiène élevées, l'infection primaire a eu lieu principalement chez les adolescents et les jeunes adultes. La majorité des infections ont lieu entre 15 et 20 ans et environ 50 % des personnes infectées développeront une mononucléose infectieuse. La transmission s'effectue généralement à travers l'échange de salive, même si d'autres voies sont possibles, comme lors de l'utilisation de produits sanguins ou la greffe de moelle osseuse.

Au cours de l'infection primaire, les glandes salivaires sont initialement touchées et le virus atteint le nez et la gorge à travers la salive. À ce stade, les symptômes de l'infection ressemblent à la grippe. Le virus est disséminé à travers tout le corps par l'intermédiaire des lymphocytes B infectés, qui sont normalement contrôlés par le système immunitaire, mais qui sont stimulés, par le virus, pour proliférer. Ces lymphocytes B infectés dans le sang périphérique sont caractéristiquement atypiques avec des formes variables, un cytoplasme basophile remarquable et un noyau évident. Avec l'évolution de la maladie, elle peut se manifester sous forme de forte fièvre, de splénomégalie, de lymphadénite, de trombocytopénie et d'hépatite. Étant donné la stratégie de dissémination et de transmission du virus, qui se fait principalement par la salive, la mononucléose infectieuse (MI) ou la fièvre glandulaire a également été appelée la "maladie du baiser". Dans de rares cas, une infection MI aiguë peut conduire à un état de maladie chronique active. Dans de tels cas, les symptômes de la MI peuvent rester pendant une très longue période. La pathogenèse de cette complication n'est pas claire, même si une prédisposition génétique et/ou une infection avec une souche particulièrement lytique du virus sont suspectées.

français 3

Dans certaines régions géographiques, l'EBV est étroitement associé avec l'incidence du cancer rhino-pharyngien. Ce cancer du pharynx, du nez et de la gorge, est constitué de cellules épithéliales non différenciées et a une tendance naturelle à développer des métastases. La maladie est présente partout dans le monde mais elle est particulièrement commune dans les régions de la chine du sud. La prédisposition génétique, aussi bien que les aspects environnementaux, tels que le régime alimentaire sont considérés comme des co-facteurs.

Le lymphome de Burkitt (BL) est également une tumeur associée à l'EBV, principalement dans les régions géographique de l'Afrique et la Papouasie Nouvelle-guinée. Cette tumeur monoclonale des cellules B est également associée avec des zones à forte incidence de paludisme et chez plus de 90 % de ces tumeurs, on peut démontrer la présence du virus EB. L'effet de l'infection au plasmodium falciparum sur la réponse immunitaire incite à penser que le paludisme est un co-facteur du BL. Des cas sporadiques de BL se produisent dans d'autres régions, cependant, dans de tels cas, l'EBV est moins fréquemment détecté et d'autres co-facteurs, tels que des changements génétiques, par translocation chromosomique, sont probablement responsables de la tumeur.

Très tôt lors d'une infection, les IgM sont produits contre les antigènes précoces (AP). Les concentrations d'anticorps ont tendance à coïncider avec l'apparition des symptômes, et environ 2 semaines après l'infection initiale AP, la production d'IgG, VCA (Virus de la capside de l'antigène) IgM et VCA IgG commence. Les concentrations anti-VCA IgM les plus élevées sont détectées environ 3 semaines après l'apparition des symptômes. Les IgG AP sont souvent détectables pendant un temps considérable après l'infection. Par la suite, les concentrations d'anticorps VCA IgM, et plus tard d'IgG AP, diminuent. Les concentrations d'IgG anti-VCA atteignent un pic après environ 6 semaines après l'apparition des symptômes et restent à un niveau élevé tout au long de la vie. Après environ 3 semaines après l'apparition des symptômes, les anticorps IgG EBNA1, qui sont les indicateurs d'une infection passée, commencent à être produits et atteignent un pic autour de 7 mois et reste à un niveau élevé tout au long de la vie, suite à une infection EBV normale. La réactivation du virus (telle que l'immunosuppression) entraîne généralement une augmentation importante d'anticorps IgG AP, alors que les titres d'IgM VCA, n'augmentent que rarement. Ce n'est que très rarement, suite à une immunosuppression, que les IgG EBNA1 disparaissent, et donc, l'IgG AP est un bon marqueur de la réactivation. Pos : 8 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/T es tprinzip/Tes tpri nzip ELISA classic @ 4\mod_1255342796551_23.doc @ 21209 @ 1

3 PRINCIPE DU TEST SERION ELISA classic

Le test ELISA (test utilisant un immunoadsorbant lié à une enzyme) est un test immunologique qui convient particulièrement à la détermination d'anticorps dans le domaine de la sérologie infectieuse. La réaction est basée sur l'interaction spécifique d‘anticorps avec les antigènes correspondants. Les puits de la microplaque de dosage des coffrets SERION ELISA classic sont coatés avec l’antigène spécifique du pathogène concerné. Si les anticorps contenus dans l'échantillon de sérum du patient sont présents, ils se lient à l'antigène fixé. Un anticorps secondaire, qui a été préalablement conjugué avec l'enzyme phosphatase alcaline, détecte le complexe immun et s'y lie. Le substrat incolore p-nitrophénylphosphate est ensuite transformé en un produit coloré, le p-nitrophénol. L'intensité du signal de ce produit de réaction est proportionnelle à la concentration de l'analyte dans l'échantillon et elle est mesurée par une méthode photométrique. Pos: 9 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für nur ein Dokument/Inhalt und Zusammensetzung/EBV: Inhalt und Zusammensetzung @ 14\mod_1404461827273_23.doc @ 62079 @ 1

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4 COMPOSANTS DE LA TROUSSE Composants pour le test Pièces /

Volume Barrettes de huit puits unitaires coatés avec un antigéne (au total 96) MTP , 1 cadre. Le produit de coating est inactivé.

12 pièces

Sérum standard (prêt à l'emploi) STD , Protéine sérique humaine contenant du tampon phosphate; négatif pour l'Ac anti-VIH, HBs-Ag (antigène de surface du virus de l'hépatite B) et l'Ac anti-VHC; agent de conservation : < 0,1 % azoture de sodium; colorant : Amaranth O

2 x 2 ml

Sérum pour le contrôle négatif (prêt à l'emploi) NEG , Protéine sérique humaine contenant du tampon phosphate; négatif pour l'Ac anti-VIH, HBs-Ag (antigène de surface du virus de l'hépatite B) et l'Ac anti-VHC; agent de conservation : < 0,1 % azoture de sodium; colorant : Vert de lissamine V

2 ml

Conjugué anti IgA, anti IgG ou anti IgM humain (prêt à l'emploi) APC , IgA Anti-humain, IgG ou anticorps polyclonal IgM, conjugué à la phosphatase alcaline, stabilisé avec une solution contenant des protéines; agent de conservation: < 0,1 % méthylisothiazolone, < 0,1 % bromnitrodioxane

13 ml

Concentré de solution de lavage (en quantité suffisante pour 1000 ml) WASH , Solution de chlorure de sodium avec Tween 20 et 30 mM Tris/HCl, pH 7,4; agent de conservation : < 0,1 % azoture de sodium

33,3 ml

Tampon de dilution (prêt à l'emploi) DILB ou tampon de dilution spécial S1 (prêt à l'emploi) DILBS1 , (Tampon de dilution spécial pour SERION ELISA classic EBV EA IgG. Secouez juste avant utilisation!) Protéine contenant du tampon phosphate avec Tween 20 ( DILB ) et lysat de E. coli ( DILBS1 ); agent de conservation : < 0,1 % azoture de sodium; colorant : 0,01 g/l bleu de bromophénol.

2 x 50 ml

Solution d'arrêt (prêt à l'emploi) STOP , < 0,1 N Hydroxyde de sodium, 40 mM EDTA

15 ml

Substrat (prêt à l'emploi) pNPP , Para-nitrophénylphosphate dans un solvant ne contenant pas de tampon; agent de conservation : < 0,1 % azoture de sodium

13 ml

Certificat de contrôle de la qualité avec courbe d'étalonnage et tableau d'évaluation INFO , (quantification des anticorps en IU/ml ou U/ml)

2 pages


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5 PRODUITS NÉCESSAIRES MAIS NON FOURNIS

- équipement général de laboratoire - pour la détection d'IgM : SERION Rf-Absorbent, no de commande Z200 (20 ml) - photomètre pour plaques de microtitration avec filtre, longueur d'onde 405 nm,

longueur d'onde de référence recommandée 620 nm à 690 nm (par ex. 650 nm) - Nettoyant de plaque de microtitration - incubateur à 37 °C - chambre humide - eau distillée - Agrafes (no de commande VT120) - En option : SERION ELISA control Pos: 11 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Lagerung und Haltbarkeit/Lagerung und Haltbarkeit @ 13\mod_1397031131719_23.doc @ 59209 @ 1

6 STOCKAGE ET STABILITÉ

Réactif Stockage Stabilité

Barrettes de microtitration (coatées avec un antigène)

Avant ouverture

après ouverture, entre 2 °C et 8 °C dans sachet en aluminium fermé avec déshydratant

voir la date d'expiration

durée minimale de stockage : quatre semaines

Sérum de contrôle / Sérum standard

Avant ouverture / après ouverture entre 2 °C et 8 °C voir la date d'expiration

Conjugué Avant ouverture / après ouverture entre 2 °C et 8 °C voir la date d'expiration

Tampon de dilution Avant ouverture / après ouverture entre 2 °C et 8 °C voir la date d'expiration

Solution de lavage Avant ouverture / après ouverture entre 2 °C et 8 °C

Diluée, entre 2 °C et 8 °C

Diluée à température ambiante

voir la date d'expiration

2 semaines

1 semaine

Substrat Avant ouverture / après ouverture entre 2 °C et 8 °C voir la date d'expiration

Solution d'arrêt Avant ouverture / après ouverture entre 2 °C et 8 °C voir la date d'expiration


7 PRINCIPLE DU TEST SERION ELISA classic Pos : 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Allgemeine Hi nweise ELISA cl assic @ 12\mod_1379504700667_23.doc @ 57729 @ 2

7.1 Signe de détérioration

Des résultats optimaux ne seront obtenus que si les consignes sont scrupuleusement respectées. Seuls les réactifs SERION ELISA classic doivent être utilisés avec les coffrets SERION ELISA classic. Les composants ne doivent pas être échangés avec des réactifs provenant d'autres fabricants. Le sérum standard etle sérum contrôle des tests SERION ELISA classic sont définis exclusivement pour la trousse les contenant et ne doivent pas être utilisés

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avec d'autres lots. La solution de lavage, le substrat et la solution d'arrêt sont communs aux réactifs SERION ELISA classic indépendamment du lot ou l'analyse. Chaque test SERION ELISA classic contient un tampon de dilution pour les échantillons prêt à l'emploi. Dans certains cas, l'utilisation de tampons de dilution spéciaux est nécessaire pour garantir une qualité constante et des résultats fiables. Les tampons de dilution peuvent être utilisés indépendamment des lots. Il existe trois concentrations de conjugués pour chaque classe d'immunoglobuline (IgA, IgG, IgM) indiquées sur l'étiquette à l'aide des sigles + (bas), ++ (moyen) et +++ (élevé). Les conjugués ayant la même concentration et la même classe d'immunoglobuline sont interchangeables et peuvent être utilisés pour d'autres immunoessais SERION ELISA classic indépendamment du lot et du test. La dilution et la modification des réactifs peuvent entraîner une perte de sensibilité. Prélevez le plus stérilement possible dans les tubes de réactif afin d'éviter toute contamination. Pour assurer la reproductibilité des résultats des tests, il faut bien mélanger les réactifs. Agitez les flacons contenant les sérums de contrôle avant de les utiliser, mais également tous les échantillons après dilution (par ex., à l'aide d'un mélangeur vortex). Assurez-vous de pipeter soigneusement et respectez les durées et températures d'incubation. S'il existe une différence de temps importante entre le pipetage du premier et du dernier puits de la plaque de microtitration, lors de la distribution des échantillons et des sérums de contrôle, du conjugué ou du substrat, on peut avoir des durées de pré incubation différentes qui influenceront la précision et la reproductibilité des résultats. Évitez d'exposer les réactifs à une lumière trop forte lors du stockage et l'incubation. Un nombre suffisant de lavages permet d'éviter les résultats non spécifiques. Il est donc recommandé de soigneusement effectuer la procédure de lavage. Tous les puits à fond plat doivent être remplis avec un volume égal de tampon de lavage. À la fin de la procédure, assurez-vous que les puits ne contiennent plus de tampon de lavage afin d'éviter les effets de dilutions incontrôlées. Évitez de faire des bulles ! Les réactifs doivent être bien fermés après utilisation pour éviter l'évaporation et la contamination. Il faut faire attention de ne pas mélanger les bouchons des bouteilles et/ou des flacons. Le test SERION ELISA classic n'est valable que si les critères de validation, spécifiques au lot en question, et figurant sur le certificat de contrôle de la qualité sont respectés. Pos : 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Probenvor ber. und Lager ung (für ALLE Err eger auß er Borreli a, CM V, FSM E, H SV,Masern,Mumps,R öteln,VZ V) @ 8\mod_1263998040982_23.doc @ 28431 @ 2

7.2 Préparation et stockage de l'échantillon

Les échantillons lipémique, hémolytique ou ictérique (sérum ou plasma) doivent être analysés avec réserve seulement. Les échantillons qui sont à l'évidence contaminés ne doivent pas être analysés. Le sérum ou le plasma (EDTA, citrate, héparine) recueillis selon les procédés standard de laboratoire sont des échantillons convenables. Les échantillons ne doivent pas être inactivés thermiquement. Pos : 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Kapi tel überschrift Probenverdünnung @ 0\mod_1184679414434_23.doc @ 2314 @ 3

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7.2.1 Dilution des échantillons

Avant d'effectuer le test, les échantillons patient (V1) doivent être dilués dans le tampon de dilution (V2) comme suit : Pos : 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung, T eil 1 @ 5\mod_1256050091616_23.doc @ 22819 @ SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG tampon de dilution spécial B231-S1!)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG (tampon de dilution B231)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG (tampon de dilution B231)

Tampon de dilution pour le SERION ELISA classic EBV EA IgG (B231-S1) n'est pas remplaçable avec le tampon de dilution SERION ELISA classic EBV VCA or EBNA1.

V1 + V2 = 1 + 100 ajouter 10 µl d'échantillon patient chacun à 1000 µl de tampon de dilution


Interférence avec les facteurs rhumatoïdes Les facteurs rhumatoïdes sont des auto-anticorps appartenant principalement à la classe des IgM, qui se lient préférentiellement aux complexes immunitaires IgG. La présence des anticorps IgM non spécifiques (facteurs rhumatoïdes) peut entraîner des faux-positifs lors des tests IgM. En outre, la possibilité existe que des anticorps IgM à faible pouvoir de liaison et spécifiques à un pathogène donné peuvent être déplacés par des anticorps IgG qui se lient plus fortement. Ceci nous donne des faux-négatifs pour les résultats d'IgM. Il est donc nécessaire de pré-traiter les échantillons avec des absorbants de facteurs rhumatoïdes avant la détection des IgM (SERION Rf-Absorbent, no de commande : Z200 (20 ml/100 tests)). L'absorption Rf est effectuée par incubation avec l'échantillon du patient dans le tampon de dilution Rf pendant 15 minutes, à température ambiante, ou pendant toute une nuit à 4 °C. La procédure du test est décrite dans un autre mode d'emploi. Pos : 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung T eil 3 @ 5\mod_1256050082945_23.doc @ 22803 @

Avant d'effectuer le test, l'absorbant du facteur rhumatoïde (V1) doit être dilué dans le tampon de dilution (V2).

V1 + V2 = V3 (1 + 4) ajouter 200 µl Rf-absorbant

chacun à 800 µl de tampon de dilution

Échantillon patient (V4) doit être dilué dans ce tampon de dilution Rf (V3) :

V4 + V3 = 1+100 ajouter 10 µl d'échantillon patient

chacun à 1000 µl Rf-tampon de dilution Pos : 20 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenver dünnung: Mischung der Proben @ 4\mod_1255343607624_23.doc @ 21289 @

Après dilution et avant le pipetage dans la plaque de microtitration, les échantillons doivent être bien mélangés pour obtenir une solution homogène. Pos : 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenlager ung @ 4\mod_1255343526141_23.doc @ 21273 @ 3

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7.2.2 Stockage de l'échantillon Les échantillons des patients ne doivent pas être stockés pendant plus de 7 jours entre 2 et 8 °C. Un stockage plus long peut se faire à ≤ -20 °C. Évitez les cycles de congélation/décongélation répétés. Les échantillons dilués peuvent être stockés entre 2 et 8 °C pendant une semaine. Pos: 22 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Testdurchführung/Reagenzienvorbereitung - KOMPLETT @ 12\mod_1379504953325_23.doc @ 57765 @ 23333333

7.3 Préparation des réactifs de la trousse

Tous les réactifs doivent être à température ambiante avant leur utilisation.

7.3.1 Barrettes de tests

Les barrettes de test de microtitration étiquetées avec les abréviations des classes pathogènes et d'immunoglobuline sont emballées dans un sachet en aluminium avec un produit déshydratant. Pour ouvrir le sachet en aluminium de la plaque de microtitration, veuillez découper le haut du sachet à l'endroit indiqué, pour que vous puissiez fermer le sachet correctement après utilisation. Enlevez seulement les puits dont vous avez besoin de la plaque et replacez le reste dans le sachet en aluminium. Refermez soigneusement le sachet pour qu'il soit étanche à l'air. Il ne faut pas utiliser les barrettes si le sachet en aluminium est endommagé ou si le sachet, contenant le reste des barrettes et le déshydratant, n'a pas été correctement refermé.

7.3.2 Sérum de contrôle / Sérum standard (prêt à l'emploi)

Le sérum de contrôle et le sérum standard sont prêts à l'emploi et ne doivent pas être dilués. Pour chaque cycle de tests, indépendamment du nombre de barrettes devant être utilisées, les sérums de contrôle et standard doivent être mis dans la plaque. Le sérum de contrôle et le sérum standard doivent être mis en double. Il ne faut pas traiter le sérum de contrôle avec l'absorbant Rf.

7.3.3 IgA anti-humain, IgG ou conjugué IgM (prêt à l'emploi)

La concentrations de conjugués requise (+, ++, +++) est mentionnée sur le certificat de contrôle de la qualité. Veuillez également vous reporter aux indications sur l'étiquette.

7.3.4 Solution de lavage (Concentrate)

Diluez le concentré de tampon de lavage (V1) 1:30 avec de l'eau distillée jusqu'à un volume final de V2. Exemple :

Concentré de tampon (V1) Volume final (V2)

33,3 ml 1000 ml

1,0 ml 30 ml

7.3.5 Tampon de dilution pour les échantillons (prêt à l'emploi)

7.3.6 Substrat (prêt à l'emploi)

Le substrat, dans le flacon non ouvert, peut avoir une coloration légèrement jaunâtre, qui ne réduit pas la qualité du produit!

7.3.7 Solution d'arrêt (prête à l'emploi)


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7.4 Aperçu général - Procédure de test



quantitatif Dans le cas de détection d'IgM de facteur rhumatoïde, voir No. 7.2.1;

Incubation de 15 minutes à température ambiante ou toute une nuit à 4°C

dilution d'échantillon1 (échantillon de patient)

1 + 100 Pos : 25 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Testabl auf/T establ auf @ 12\mod_1365489408139_23.doc @ 55711 @

Déposez les échantillons dilués et les sérums contrôle/ standard prêts à l'emploi dans les puits (100 µl)

INCUBATION 60 min à 37 °C chambre humide

LAVAGE (4 x 300 µl DIL WASH )²

Déposez le conjugué APC (100 µl)


LAVAGE (4 x 300 µl DIL WASH )²

Déposez le substrat pNPP (100 µl)


Déposez la solution d'arrêt STOP (100 µl)

LECTURE D'EXTINCTION à 405 nm

1Les tampons spéciaux pour les tests SERION ELISA classic suivants : Borrelia burgdorferi IgG, IgM, EBV EA IgG et Hantavirus Puumala IgG, IgM

2Pour une utilisation manuelle :

tapez la plaque, à la fin de la procédure de lavage, sur un papier absorbant.


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7.5 Procédure de test manuelle

1. Placez le nombre de puits dont vous avez besoin dans le cadre et préparez une feuille de protocole.

2. Déposez 100 µl d'échantillon dilué ou de contrôles prêts à l'emploi dans les puits appropriés. Laissez un puits pour le blanc du substrat, par ex.:

puits quantitatif ELISA

A1 Blanc du substrat

B1 Contrôle négatif

C1 Sérum standard

D1 Sérum standard

E1 Patient 1....

F1 Patient 2....

3. Incubation de l'échantillon pendant 60 minutes (+/- 5 min.) à 37 °C (+/- 1°C) dans une chambre humide

4. Après incubation lavez tous les puits avec une solution de lavage (avec un laveur automatisé ou manuellement) : - aspirez ou enlevez la solution d'incubation en retournant la plaque - remplissez chaque puits avec 300 µl de solution de lavage - aspirez ou enlevez le tampon de lavage en retournant la plaque - répétez la procédure de lavage 3 fois (4 fois en tout!) - séchez la plaque de microtitration en la tapant sur un papier absorbant

5. Ajout du conjugué Ajoutez 100 µl de conjugué IgA/IgG/IgM prêt à l'emploi aux puits appropriés (sauf le blanc du substrat)

6. Incubation du conjugué pendant 30 minutes (+/- 1 min.) à 37 °C (+/- 1 °C) dans une chambre humide.

7. Après incubation, lavez tous les puits avec la solution de lavage (voir plus haut) 8. Ajout du substrat

Ajoutez 100 µl de solution de substrat prête à l'emploi à chaque puits (y compris le puits pour le blanc de substrat!)

9. Incubation du substrat pendant 30 minutes (+/- 1 min.) à 37 °C (+/- 1 °C) dans une chambre humide.

10. Arrêt de la réaction Ajoutez 100 µl de solution d'arrêt à chaque puits, secouez doucement la plaque de microtitration pour mélanger.

11. Lecture d'extinction Lisez la densité optique (DO) dans les 60 minutes à 405 nm par rapport à un blanc de substrat, longueur de référence entre 620 nm et 690 nm (ex. 650 nm).


7.6 Procédure de test automatisée

SERION ELISA est compatible avec un traitement sur automate et a été évalué quant à son utilisation avec ImmunomatTM et Gemini mais également avec DYNEX DSX® et DS2®. Le traitement automatique est effectué de façon analogue à l'utilisation manuelle. Veuillez noter que dans des conditions de manipulation particulières, il peut s'avérer nécessaire d'adapter le temps d'incubation du substrat selon le laboratoire. Pos : 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Positi vkontroll e / Richtigkeitskontroll e @ 8\mod_1260286311409_23.doc @ 27531 @ 2

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7.7 Contrôle positif / Contrôle de la précision

Pour la vérification périodique du procédé de test, pour satisfaire aux exigences des systèmes de gestion de la qualité internes des laboratoires, nous recommandons l'utilisation des SERION ELISA controls afin de déterminer la précision et la fiabilité des cycles de test du SERION ELISA classic. L'utilisation des SERION ELISA controls est décrite dans les modes d'emploi spécifiques. Pos : 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Liquordi agnosti k ( für Borr elia + FSM E + VZV + EBV + Infl uenza) @ 9\mod_1271682242806_23.doc @ 32121 @ 2

7.8 Diagnostique du liquide céphalorachidien Les tests IgG SERION ELISA classic EBV VCA, EBV EBNA1 ont été évalués pour la détermination des anticorps intrathécals lors des diagnostics du liquide céphalorachidien est il est recommandé pour la détection, mais également pour la différentiation, des processus inflammatoires dans le système nerveux central (SNC). La procédure du test est décrite dans un autre mode d'emploi. Un outil logiciel d'évaluation, basé sur Excel, permet le calcul des indices d'anticorps selon le schéma du Prof. Hansotto Reiber. Pos : 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: TESTAU SWER TUNG + Erreg er @ 1\mod_1197038305478_23.doc @ 11387 @ 12

8 ÉVALUATION DU TEST


La courbe mathématique correspondant à la quantification de l'anticorps des immunoessais SERION ELISA classic repose sur la fonction logistique à 4 paramètres (4 PL). Les 4 paramètres A, B, C et D sont représentatifs de la forme exacte de la courbe standard :

Paramètre A : asymptote inférieure (DO) Paramètre B : gradient de la courbe Paramètre C : point d'inflexion Paramètre D : asymptote supérieure (DO)

L'Institut Virion\Serion GmbH a défini une courbe standard 4 PL spécifique au lot pour chaque immunoessai SERION ELISA classic au cours de séries de test multiples réalisées dans des conditions optimales. Les quatre paramètres sont mentionnés sur le certificat de contrôle de la qualité de chaque test SERION ELISA classic. Le facteur de correction F est calculé pour l'adaptation du niveau de test à la courbe 4 PL standard donnée en divisant la valeur DO de référence standard indiquée sur le certificat de contrôle de la qualité par la valeur DO standard mesurée et spécifique au test. En multipliant les valeurs DO des échantillons des patients par le facteur de correction F, le niveau de chaque série de test individuel est adapté à la courbe standard 4PL. Ainsi, les divergences entre les séries de tests sont équilibrées et l'activité de l'anticorps peut être évaluée directement à partir de la courbe 4 PL standard. Après avoir soustrait le blanc du substrat de toutes les valeurs DO mesurées et calculé la valeur DO moyenne du sérum standard (STD), analysé en double, une gamme de possibilités est

)1)(

ln(1

)/(−

−∗

−−

=AFPatientOD

AD

BC

emlUActivity

valueODSTDmeasured


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disponible pour l'évaluation des activités d'anticorps à partir des signaux de mesure optique (DO) des échantillons du patients. Elles sont décrites dans des manuels séparés. Pos : 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estauswertung/Grenzwertber eich ( für T es te mehrerer Ig-Klassen) @ 12\mod_1375360254888_23.doc @ 57398 @ 2

8.2 Fourchettes limites

Les limites des fourchettes du test SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG, EBV EA IgG sont mentionnées sur le certificat de contrôle de la qualité et indique la fourchette pour les résultats limites des tests. Les valeurs en-dessous de cette fourchette indiquent un résultat de test négatif; les valeurs au-dessus sont interprétées comme des résultats positifs. Pos : 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Quantifi zierungsgrenzen @ 6\mod_1258098664276_23.doc @ 24401 @ 2

8.3 Limites de la quantification

Les limites de quantification sont mentionnées sur le certificat de contrôle de la qualité du test SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG, EBV EA IgG. La linéarité de la dilution dans les limites de cette fourchette a été démontrée lors des études d'évaluation complètes. Dans le cas où l'échantillon du patient donne un résultat au dessus de la limite supérieure de quantification, l'échantillon peut être testé à une dilution plus élevée. L'activité de l'anticorps ainsi déterminée doit être multipliée par un facteur de dilution additionnel. Pos : 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Automatische Tes tauswertung @ 12\mod_1375166354143_23.doc @ 57319 @ 2

8.4 Évaluation automatique / logiciels

Pour l'évaluation automatique des signaux de mesure optiques, les logiciels SERION easyANALYZE, SERION evaluate ainsi que l'outil SERION activity basé sur Microsoft® Excel® sont disponibles sur simple demande. Pos : 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: Tes tgültig kei tskriterien @ 12\mod_1375166094763_23.doc @ 57301 @ 2

8.5 Critères de validité

- Le blanc du substrat doit avoir une DO < 0,25.

- Le contrôle négatif doit donner un résultat de test négatif.

- Avec l'utilisation des tests SERION ELISA classic la valeur de DO moyenne (après soustraction du blanc du substrat !) du sérum standard doit être dans les limites de la fourchette de validité, qui est indiqué sur le certificat de contrôle de la qualité spécifique au lot.

- SERION ELISA classic qualitatif: la valeur de DO du contrôle positif et la valeur moyenne de DO du sérum de référence doivent être dans les limites de la fourchette de validité, qui est indiqué sur le certificat de contrôle de la qualité spécifique au lot de la trousse (après soustraction du blanc du substrat !)

- La variation des valeurs de DO du sérum standard ou du sérum de référence ne doit pas dépasser 20 %.

En cas de non respect de ces critères, le test n'est pas valide et doit être refait. Pos : 36 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: Interpretation der Ergebnisse @ 0\mod_1190013774869_23.doc @ 9941 @ 2

français 13

8.6 Interprétation des résultats Pos : 37 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: Inter pretation der Ergebnisse @ 12\mod_1375363155925_23.doc @ 57416 @

Un résultat de test positif confirme la présence des anticorps spécifiques. Un résultat négatif indique qu'aucun anticorps cliniquement significatif contre l'agent pathogène n'est présent dans l'échantillon du patient, mais n'exclut pas l'éventualité d'une infection aigüe. En cas de résultat limite, une évaluation fiable n'est pas possible. Un diagnostic définitif ne peut être atteint qu'en testant parallèlement des échantillons de sérum appariés, prélevés dans un laps de temps de deux semaines. Pos : 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Inter pretation der Ergebnisse @ 15\mod_1421652419778_23.doc @ 66990 @

Le diagnostic primaire de la mononucléose primaire (MI) se fait principalement par la détection d'anticorps anti-antigène précoce (AP) et contre le complexe protéique appelé l'antigène de la capside virale (VCA), dont l'importance est connue depuis quelque temps. Très peu de temps après une infection, les anticorps IgM dirigés contre AP et VCA apparaissent et ensuite, après disparition de l'infection aiguë, ils diminuent pour disparaître complètement. Par contre, l'IgG anti-VCA, qui est produit presque au même moment, persiste tout au long de la vie, bien que les niveaux d'activité peuvent varier. Dans le cas de la réactivation (par ex., suite à une immunosuppression) il y a une augmentation importante à la fois de l'IgG anti-AP et de l'IgG anti-VCA, et, dans de rares cas, des IgM anti-VCA peuvent être détectés. Les patients souffrant du lymphome de Burkitt et du cancer rhino-pharyngien, ont les mêmes niveaux élevés d'IgG VCA caractéristiques, qu'on voit lors des réactivations. En outre, la présence des anticorps IgA anti-VCA apporte des données pour le diagnostic du cancer rhino-pharyngien. Des niveaux élevés d'anticorps anti-AP sont, de la même façon, caractéristiques des patients souffrant du cancer rhino-pharyngien ou qui sont en réactivation. Plusieurs semaines après l'infection primaire, les anticorps dirigés contre l'antigène nucléaire 1 de l'EBV (EBNA1) apparaissent et restent détectables tout au long de la vie, même s'ils peuvent disparaître si le patient est immunosupprimé. Seuls, ou en présence des anticorps IgG anti-VCA, ils sont considérés comme un marqueur des infections passées. Une diminution de l'IgG EBNA1 est fréquemment observée suite à la réactivation du virus. Ceci est généralement accompagné par une augmentation de l'activité IgG anti-VCA alors que les anticorps contre les AP apparaissent. Les résultats limites lors du test SERION ELISA classic EBNA1 IgG en association avec des résultats positifs lors du test SERION ELISA classic EBV VCA IgG sont interprétés comme étant positifs et comme la preuve d'une infection passée. Dans le tableau suivant, sont présentées les diverses combinaisons d'anticorps possibles et de leur interprétation. Schéma d'interprétation de base Ce schéma d'interprétation de base est principalement destiné à différentier entre un statut immunitaire séronégatif, une infection primaire et une infection passée à l'aide des 4 marqueurs sérologiques les plus importants EA IgG, VCA IgG, VCA IgM et EBNA1 IgG :

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EA IgG VCA IgM VCA IgG EBNA1 IgG Interprétation

- - - - séronégativité

+ - - -

infection aiguë ou récente

- + - -

+ + - -

+ + + -

+ - + -

- + + -

- - + -

- - + + infection antérieure

- - - +

++ - ++ + réactivation

++ + ++ +

Des réactions croisées avec les anticorps dirigés contre d'autres virus de l'herpès (par exemple, CMV, HSV, VZV) ne peuvent pas être écartées. Pos : 39 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: Refer enzbereiche gesunder Pr obanden @ 8\mod_1258644290978_23.doc @ 26751 @ 2

8.7 Fourchette de références des personnes en bonne santé

L’analyse d’échantillons de sérum provenant de donneurs de sang, prélevés dans la région du sud de l'Allemagne et sélectionnés aléatoirement, avec les tests SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus nous donne la distribution suivante. Pos : 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Refer enzbereich gesunder Probanden @ 12\mod_1380024245277_23.doc @ 58091 @

SERION ELISA classic nombre négatif limite positif

EBV VCA IgG 131 3 (2,3 %) 2 (1,5 %) 126 (96,2 %)

EBV VCA IgM 131 131 (100 %) - -

EBV EBNA 1 IgG 131 11 (8,4 %) - 120 (91,6 %)

EBV EA IgG 131 92 (70,2 %) 11 (8,4 %) 28 (21,4 %)

Pos : 41 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift Leistungsmer kmale @ 0\mod_1184676089844_23.doc @ 2104 @ 1

français 15

9 CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE Pos : 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift: Sensiti vität und Spezi fität @ 0\mod_1190013251494_23.doc @ 9926 @ 2

9.1 Sensibilité et Spécificité Pos : 43 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Sensi ti vität und Spezifi tät @ 15\mod_1421417016940_23.doc @ 66950 @

Les tests SERION ELISA classic EBV VCA IgG, IgM et SERION ELISA classic EBV EBNA-1 IgG ont été validés dans une étude interne. 155 échantillons de sérum, provenant de donneurs négatifs et de patients présentant une infection EBV aigüe et passée, ont été analysés. Un test ELISA d'un fabricant majeur sur le marché européen a été utilisé comme test de référence.

Les caractéristiques de performance du test SERION ELISA classic Candida EBV EA IgG ont été évaluées par l'analyse de 96 échantillon de sérums provenant de donneurs de sang sains et de patient(e)s soupçonné(e)s d'être atteint d'une infection EBV aigüe. Deux immunoessais ELISA et un test immunoblot de fabricants européens majeurs ont été utilisés comme tests de référence.

Sensibilité Spécificité





Les sérums classés comme limites n'ont pas été inclus dans le calcul de la sensibilité et de la spécificité. Pos : 44 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift Präzisi on @ 0\mod_1184676568397_23.doc @ 2119 @ 2

9.2 Reproductibilité Pos : 45 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Präzision @ 14\mod_1404457829683_23.doc @ 62007 @

SERION ELISA classic EBV EA IgG :

Échantillon Valeur moyenne

(DO)

Intra-essai

CV (%)

Valeur moyenne

(DO)

Inter-essai

CV (%)

Sérum 1 0,616 4,5 0,637 5,5

Sérum 2 0,746 5,3 0,814 6,6

Sérum 3 2,125 3,0 2,191 2,8

SERION ELISA classic EBV VCA IgM :


(DO)

Intra-essai

CV (%)

Valeur moyenne

(DO)

Inter-essai

CV (%)

Sérum 1 0,530 8,7 0,551 7,2

Sérum 2 1,582 5,1 1,703 6,4

Sérum 3 2,249 7,9 2,311 8,7

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SERION ELISA classic EBV VCA IgG :


(DO)

Intra-essai

CV (%)

Valeur moyenne

(DO)

Inter-essai

CV (%)

Sérum 1 0,554 2,2 0,644 7,1

Sérum 2 1,355 2,4 1,510 4,5

Sérum 3 1,437 3,0 1,636 4,5

SERION ELISA classic EBV EBNA1 IgG :


(DO)

Intra-essai

CV (%)

Valeur moyenne

(DO)

Inter-essai

CV (%)

Sérum 1 0,305 2,8 0,341 8,4

Sérum 2 0,952 2,5 1,093 4,1

Sérum 3 1,622 3,1 1,799 4,2 Pos : 46 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Allgemei ne Texte ELISA classic/Sicherheitsmaßnahmen @ 12\mod_1374740573162_23.doc @ 57167 @ 122

10 MESURES DE SÉCURITÉ 10.1 Mises en garde Le test SERION ELISA classic est conçu pour être utilisé par un personnel compétent qui est familier avec les bonnes pratiques de laboratoire. Tous les réactifs de la trousse et les prélévements humains doivent être manipulés avec précaution, en usant des bonnes pratiques de laboratoire. - Cette trousse contient des composants du sang humain. Même si tous les sérums de

contrôle et de seuil sont négatifs pour l'anticorps anti-VIH, HBs-Ag (Antigène de surface du virus de l'hépatite B) et l'anticorps anti-VHC, ils doivent être considérés comme potentiellement infectieux.

- Il ne faut pas pipeter à la bouche.

- Il ne faut pas fumer, consommer de la nourriture ou des boissons dans les endroits où les réactifs de la trousse ou les échantillons sont manipulés.

- Utilisez des gants jetables et portez une blouse et des lunettes de protection lors de la manipulation des réactifs de la trousse ou des échantillons. Lavez-vous bien les mains après la manipulation.

- Les échantillons de patient et autres produits potentiellement infectieux doivent être décontaminés après chaque série de tests.

- Les réactifs doivent être stockés dans un endroit sûr et doivent être inaccessibles pour les personnes non autorisées, comme des enfants.

10.2 Élimination Veuillez respecter les dispositions légales pertinentes! Pos : 47 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Liter atur/Liter atur @ 13\mod_1396939862911_23.doc @ 59081 @ 1

11 RÉFÉRENCES Des références relatives à SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus sont disponibles à la fin de cette notice. === Ende der Liste für T extmar ke Inhalt ===


Epstein-Barr Virus VCA IgG/IgM, Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG, Epstein-Barr Virus EA IgG INDICE

1 CAMPO DI APPLICAZIONE

2 RILEVANZA DIAGNOSTICA

3 PRINCIPIO DEL TEST SERION ELISA classic

4 COMPONENTI DEL KIT

5 MATERIALI NECESSARI, MA NON FORNITI

6 CONSERVAZIONE E STABILITÀ

7 PROCEDURA PER IL TEST SERION ELISA classic

7.1 Segni di deterioramento

7.2 Preparazione e conservazione dei campioni

7.3 Preparazione dei reagenti del kit

7.4 Schema riassuntivo della procedura

7.5 Procedura manuale

7.6 Procedura automatica

7.7 Controllo positivo / controllo di accuratezza

7.8 Diagnostica su liquido cerebrospinale

8 VALUTAZIONE DEL TEST


8.2 Zona grigia

8.3 Limiti di quantificazione

8.4 Valutazione automatica / Software

8.5 Criteri di validità

8.6 Interpretazione dei risultati

8.7 Valori di riferimento negli individui sani

9 CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE

9.1 Sensibilità e specificità

9.2 Riproducibilità

10 MISURE DI SICUREZZA

10.1 Avvertenze

10.2 Smaltimento

11 BIBLIOGRAFIA

Aggiornamenti Versione attuale n.: V 136.23

Versione precedente: V 22.11/12-1

Aggiornamento del capitolo: Aggiornamento generale DE

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Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione degli anticorpi umani

per uso diagnostico in vitro Pos : 3 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Bes tell nummern/EBV: Bes tellnummern @ 0\mod_1188368235293_33.doc @ 6493 @

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG N. di ordinazione: ESR1361G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgM N. di ordinazione: ESR1361M

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG N. di ordinazione: ESR1362G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG N. di ordinazione: ESR1363G

Pos: 4 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Allgemeine Texte ELISA classic/Kapitelüberschrift "Anwendungsbereich" @ 0\mod_1177351044007_33.doc @ 173 @ 1 1 CAMPO DI APPLICAZIONE Pos : 5 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Anwendungsber eich/EBV: Anwendungsbereich @ 14\mod_1404456157024_33.doc @ 61973 @

I test SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG, VCA IgG, IgM e EBNA1 IgG sono immunodosaggi quantitativi e qualitativi per la determinazione nel siero o nel plasma degli anticorpi umani diretti contro componenti del virus di Epstein-Barr (EBV). I test SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG e SERION ELISA classic EBV VCA IgM sono consigliati per la diagnosi delle infezioni acute e delle riattivazioni. Il test SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG consente di individuare le infezioni primarie e recenti. Il test SERION ELISA classic EBNA1 IgG è consigliato per rilevare le infezioni pregresse. I test SERION ELISA classic EBV VCA e EBNA1 IgG sono convalidati per la determinazione degli anticorpi sintetizzati per via intratecale nella diagnostica del CSF. Pos : 6 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/Kapitelüberschrif t "Diag nostische Bedeutung" @ 0\mod_1177351537598_33.doc @ 224 @ 1

2 RILEVANZA DIAGNOSTICA Pos : 7 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Di agnostische Bedeutung/EBV: Diagnostische Bedeutung @ 15\mod_1421651635398_33.doc @ 66973 @

Il virus di Epstein-Barr (EBV) è un patogeno umano appartenente alla famiglia degli Herpesvirus, diffuso in tutto il mondo. Come per tutti gli Herpesvirus, la prevalenza nella popolazione generale è elevata: fino al 90-95% nella popolazione adulta. Nei Paesi in via di sviluppo, l’infezione primaria si verifica in genere nel primo anno di vita ed è spesso asintomatica. Al contrario, nei Paesi con standard igienici elevati, l’infezione primaria si verifica soprattutto negli adolescenti e nei giovani adulti. Si osserva un picco di infezione nella fascia d’età compresa tra 15 e 20 anni e circa il 50% delle persone infette sviluppa una mononucleosi infettiva. il virus si trasmette principalmente attraverso la saliva, ma sono possibili anche altre vie di trasmissione, ad esempio tramite emoderivati o trapianti di midollo osseo. Nell’infezione primaria sono interessate inizialmente le ghiandole salivari e con la saliva il virus raggiunge il naso e la gola. In questa fase, la sintomatologia è simil-influenzale. Il virus si dissemina nel’organismo tramite i linfociti B infetti, normalmente regolati dal sistema immunitario, ma stimolati alla proliferazione da parte del virus. I linfociti B infetti del sangue periferico sono atipici e presentano forme variabili, un citoplasma decisamente basofilo e un nucleo evidente. Con la progressione della malattia si possono osservare febbre elevata, splenomegalia, linfadenite, trombocitopenia ed epatite. A causa del tipo di disseminazione e trasmissione del virus, che avviene principalmente attraverso la saliva, la mononucleosi infettiva o febbre ghiandolare è anche stata chiamata “malattia del bacio”. Raramente, una mononucleosi acuta può sfociare in una malattia attiva cronica. In tal caso, la sintomatologia può persistere per

italiano 3

periodi considerevoli. La patogenesi di questa complicanza non è nota, ma si sospettano una predisposizione genetica e/o un’infezione dovuta a un ceppo particolarmente litico.

In alcune aree geografiche, il virus EBV è strettamente associato all’incidenza del carcinoma nasofaringeo. Questo carcinoma che interessa faringe, naso e gola è composto da cellule epiteliali non differenziate e tende a metastatizzare. La malattia è diffusa in tutto il mondo, ma è particolarmente comune in determinate regioni della Cina meridionale. La predisposizione genetica e aspetti ambientali come l'alimentazione sono oggetto di discussione come cofattori di questo carcinoma.

Anche il linfoma di Burkitt è un tumore associato al virus EBV, soprattutto in Africa e in Papua Nuova Guinea. Questo tumore monoclonale a cellule B è più frequente in regioni con elevata incidenza della malaria e in oltre il 90% dei tumori è presente il virus EBV. Gli effetti dell’infezione da plasmodio sulla risposta immunitaria rendono oggetto di discussione il ruolo della malaria come cofattore nel linfoma di Burkitt. Casi sporadici di linfoma di Burkitt si osservano anche in altre regioni, ma in questi casi si rileva meno comunemente il virus EBV e si ritiene che altri cofattori, come alterazioni genetiche dovute a traslocazione cromosomica, siano responsabili del tumore.

Nella fase iniziale si osserva la produzione di IgM dirette contro l’antigene precoce (EA) Le concentrazioni massime di anticorpi tendono a coincidere con l’esordio della sintomatologia e, circa due settimane dopo l’infezione iniziale, si assiste alla produzione di IgG anti-EA, IgM anti-VCA (Virus Capsid Antigen) e IgG anti-VCA. La concentrazione massima di IgM anti-VCA si osserva circa tre settimane dopo l’esordio dei sintomi. Le IgG anti-EA sono spesso rilevabili per periodi considerevoli dopo l’infezione. Successivamente, le concentrazioni di IgM anti-VCA e quindi di IgG anti-EA si riducono. Le IgG anti-VCA raggiungono un picco sei settimane dopo l’esordio della sintomatologia e persistono a livelli elevati per tutta la vita. Circa tre settimane dopo la comparsa dei sintomi vengono prodotti gli anticorpi IgG anti-EBNA1, indicatori di un’infezione pregressa, che raggiungono un picco dopo circa sette mesi e persistono a livelli elevati per tutta la vita dopo un’infezione normale da EBV. Una riattivazione del virus (a seguito di immunosoppressione) induce un aumento significativo delle IgG anti-EA, mentre i titoli delle IgM anti-VCA aumentano raramente. Le IgG anti-EBNA1 scompaiono solo occasionalmente dopo immunosoppressione; le IgG anti-EA rappresentano quindi un buon marcatore di riattivazione. Pos : 8 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/T es tprinzip/Tes tpri nzip ELISA classic @ 4\mod_1255342796551_33.doc @ 21211 @ 1

3 PRINCIPIO DEL TEST SERION ELISA classic

Il test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, dosaggio immunoenzimatico) è un immunodosaggio particolarmente indicato per la determinazione degli anticorpi nel campo della sierologia infettiva. La reazione si basa sull’interazione specifica degli anticorpi con gli antigeni corrispondenti. Le strisce reattive della piastra per microtitolazione del test SERION ELISA classic sono rivestite con antigeni specifici dell’agente patogeno di interesse. Se il siero del paziente contiene gli anticorpi specifici, questi si legano all’antigene fissato sulle strisce. Un anticorpo secondario, coniugato con l’enzima fosfatasi alcalina, rileva e lega il complesso immune. Il substrato incolore p-nitrofenilfosfato è quindi convertito nel composto colorato p-nitrofenolo. L’intensità di segnale del prodotto della reazione è proporzionale alla concentrazione dell’analita nel campione e viene misurata con metodo fotometrico. Pos: 9 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für nur ein Dokument/Inhalt und Zusammensetzung/EBV: Inhalt und Zusammensetzung @ 14\mod_1404461827273_33.doc @ 62081 @ 1

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4 COMPONENTI DEL KIT Componenti del test Pezzi /

volume

Strisce reattive per microtitolazione separabili, ciascuna con otto pozzetti singoli rivestiti da antigene, (96 in totale) MTP , 1 telaio. Il materiale di rivestimento è inattivato.

12 pezzi

Siero standard (pronto per l’uso) STD , Siero umano in tampone fosfato contenente proteine; negativo per anti-HIV Ab, HBs-Ag (antigene di superficie del virus dell’epatite B) e anti-HCV Ab; conservante: sodio azide < 0,1 %; colorante: amaranto O

2 x 2 ml

Siero di controllo negativo (pronto per l’uso) NEG , Siero umano in tampone fosfato contenente proteine; negativo per anti-HIV Ab, HBs-Ag (antigene di superficie del virus dell’epatite B) e anti-HCV Ab; conservante: sodio azide < 0,1 %; colorante: verde di lissamina V

2 ml

Coniugato anti- IgA, IgG o IgM umane (pronto per l’uso) APC , Anticorpo policlonale anti-IgA, IgG o IgM umane, coniugato con fosfatasi alcalina, stabilizzato con soluzione stabilizzante contenente proteine; conservanti: metilisotiazolone < 0,1 %, bromonitrodiossano < 0,1 %

13 ml

Soluzione di lavaggio concentrata (sufficiente per 1000 ml) WASH , Soluzione di sodio cloruro con Tween 20 e Tris/HCl 30 mM, pH 7,4; conservante: sodio azide < 0,1 %

33,3 ml

Tampone di diluizione (pronto per l’uso) DILB o tampone di diluizione speciale S1 (pronto per l’uso) DILBS1 (Tampone di diluizione speciale per SERION ELISA classic EBV EA IgG. Agitare immediatamente prima dell’uso!) Tampone fosfato contenente proteine con Tween 20 ( DILB ) e lisato di E. coli ( DILBS1 ); conservante: sodio azide < 0,1 %; colorante: blu di bromofenolo 0,01 g/l.

2 x 50 ml

Soluzione di arresto (pronto per l’uso) STOP , Sodio idrossido < 0,1 N, 40 mM EDTA

15 ml

Substrato (pronto per l’uso) pNPP , Para-nitrofenilfosfato in tampone privo di solvente; conservante: sodio azide < 0,1 %

13 ml

Certificato di controllo qualità con curva standard e tabella di valutazione INFO , (Quantificazione degli anticorpi in UI/ml o U/ml)

2 pagine

Pos: 10 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Zusätzliche benötigte Materialien/Zusätzlich benötigte Materialien (für ALLE Teste) @ 12\mod_1375104535967_33.doc @ 57223 @ 1

italiano 5

5 MATERIALI NECESSARI, MA NON FORNITI

- normale equipaggiamento di laboratorio - per la determinazione delle IgM: adsorbente SERION Rf, n. di ordinazione Z200 (20 ml) - fotometro per piastre da microtitolazione con filtro, lunghezza d’onda 405 nm, lunghezza

d’onda di riferimento consigliata 620 nm - 690 nm (ad es. 650 nm) - dispositivo per il lavaggio delle piastre da microtitolazione - incubatore a 37 °C - camera umida - acqua distillata - Click-Clips (n. di ordinazione VT120) - facoltativo: SERION ELISA control Pos: 11 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Lagerung und Haltbarkeit/Lagerung und Haltbarkeit @ 13\mod_1397031131719_33.doc @ 59211 @ 1

6 CONSERVAZIONE E STABILITÀ

Reagente Conservazione Stabilità

Strisce per microtitolazione (rivestite con antigene)

non aperto

dopo l’apertura a 2 – 8 °C nella busta di alluminio chiusa, con essiccante

vedere data di scadenza

validità minima: quattro settimane

Sieri di controllo / sieri standard

non aperto / dopo l’apertura a 2 – 8 °C vedere data di scadenza

Coniugato non aperto / dopo l’apertura a 2 – 8 °C vedere data di scadenza

Tampone di diluizione

non aperto / dopo l’apertura a 2 – 8 °C


Soluzione di lavaggio

non aperto / dopo l’apertura a 2 – 8 °C

alla diluizione di lavoro a 2 – 8 °C

alla diluizione di lavoro a temperatura ambiente


2 settimane

1 settimana

Substrato non aperto / dopo l’apertura a 2 – 8 °C vedere data di scadenza

Soluzione di arresto non aperto / dopo l’apertura a 2 – 8 °C



7 PROCEDURA PER IL TEST SERION ELISA classic Pos : 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Allgemeine Hi nweise ELISA cl assic @ 12\mod_1379504700667_33.doc @ 57731 @ 2

7.1 Segni di deterioramento

Solo attenendosi scrupolosamente alle istruzioni è possibile ottenere risultati ottimali. Utilizzare solo i reagenti SERION ELISA classic con gli immunodosaggi SERION ELISA classic. I componenti non devono essere sostituiti con reagenti di altri produttori. I sieri standard e di controllo degli immunodosaggi SERION ELISA classic sono destinati esclusivamente all’uso con

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il kit corrispondente e non devono essere utilizzati con altri lotti. La soluzione di lavaggio, il substrato e la soluzione di arresto possono essere utilizzati con tutti gli immunodosaggi SERION ELISA classic, indipendentemente dal numero di lotto e dal test. Ogni test SERION ELISA classic contiene un tampone di diluizione per campioni pronto all’uso. In alcuni casi è necessario utilizzare tamponi di diluizione speciali per ottenere una qualità costante e risultati affidabili. I tamponi di diluizione possono essere utilizzati indipendentemente dal lotto. Sono disponibili tre diverse concentrazioni del coniugato per ogni classe immunoglobulinica (IgA, IgG, IgM), indicate sull’etichetta con + (bassa), ++ (media) e +++ (alta). I coniugati con la stessa concentrazione e della stessa classe immunoglobulinica sono interscambiabili e possono essere utilizzati per altri immunodosaggi SERION ELISA classic indipendentemente dal lotto e dal test. La diluizione o qualsiasi modifica apportata ai reagenti può comportare una perdita di sensibilità. Per evitare contaminazioni, utilizzare tecniche asettiche per prelevare aliquote dalle provette dei reagenti. Per ottenere risultati riproducibili, mescolare con cura i reagenti. Prima dell’uso, agitare i contenitori dei sieri di controllo e tutti i campioni dopo la diluizione (ad es. utilizzando un vortex). Pipettare con attenzione e attenersi ai tempi e alle temperature di incubazione indicati. Se, quando si dispensano i campioni e i sieri di controllo, il coniugato o il substrato, trascorre un arco di tempo significativo tra la pipettata nel primo pozzetto e la pipettata nell'ultimo pozzetto della piastra da microtitolazione, possono derivarne tempi di pre-incubazione differenti, con conseguenti effetti sulla precisione e la riproducibilità dei risultati. Non esporre i reagenti alla luce intensa durante la conservazione e l’incubazione. Un lavaggio corretto consente di evitare risultati non specifici. Pertanto, la procedura di lavaggio deve essere effettuata con cura. Riempire tutti i pozzetti a fondo piatto con volumi uguali di tampone di lavaggio. Al termine di questa procedura, assicurarsi che non rimangano residui del tampone di lavaggio nei pozzetti, per evitare effetti di diluizione non controllabili. Evitare la formazione di schiuma! Dopo l’uso, i reagenti devono essere chiusi saldamente per evitare l’evaporazione e la contaminazione. Prestare attenzione a non scambiare i tappi dei flaconi e/o dei flaconcini. L’immunodosaggio SERION ELISA classic è valido solo se vengono rispettati i criteri di validazione specifici per ogni lotto, riportati nel certificato di controllo qualità. Pos : 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Probenvor ber. und Lager ung (für ALLE Err eger auß er Borreli a, CM V, FSM E, H SV,Masern,Mumps,R öteln,VZ V) @ 8\mod_1263998040982_33.doc @ 28433 @ 2

7.2 Preparazione e conservazione dei campioni

I campioni lipemici, emolitici o itterici (siero o plasma) devono essere analizzati solo con cautela. Campioni contaminati non devono essere analizzati. Sono campioni idonei i campioni di siero o plasma (EDTA, citrato, eparina) prelevati secondo le metodiche standard di laboratorio. I campioni non devono essere sottoposti ad inattivazione termica. Pos : 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Kapi tel überschrift Probenverdünnung @ 0\mod_1184679414434_33.doc @ 2316 @ 3

italiano 7

7.2.1 Diluizione dei campioni

Prima dell’analisi, i campioni dei pazienti (V1) devono essere diluiti nel tampone di diluizione (V2) nel modo seguente: Pos : 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung, T eil 1 @ 5\mod_1256050091616_33.doc @ 22821 @ SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG (tampone di diluizione speciale B231-S1!)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG (tampone di diluizione B231)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG (tampone di diluizione B231) Il tampone di diluizione del test SERION ELISA classic EBV EA IgG (B231-S1) non è intercambiabile con il tampone di diluizione dei test SERION ELISA classic EBV VCA o EBNA1.

V1 + V2 = 1 + 100 aggiungere 10 µl di campione del paziente a ogni 1.000 µl di tampone di diluizione


SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgM Pos: 18 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für mehrere Dokumente/Testdurchführung/Probenverdünnung: Rheumafaktor-Interferenz (für Tests mit IgM-Nachweis) @ 9\mod_1316422765852_33.doc @ 36510 @ Interferenza con i fattori reumatoidi I fattori reumatoidi sono autoanticorpi appartenenti principalmente alla classe IgM, che si legano preferenzialmente ai complessi immuni IgG. La presenza di anticorpi IgM non specifici (fattori reumatoidi) può causare risultati falsamente positivi nel dosaggio delle IgM. Inoltre, esiste la possibilità che gli anticorpi IgG con legame forte competano con gli anticorpi IgM patogeno-specifici con legame debole per il legame all’antigene adeso sulla micropiastra, di conseguenza gli anticorpi IgG si legano all’ antigene al posto degli anticorpi IgM patogeno-specifici ottenendo un risultato falsamente negativo per le IgM. Pertanto, è necessario pretrattare i campioni con un adsorbente del fattore reumatoide prima di determinare le IgM (SERION Rf-Absorbent, n. di ordinazione: Z200 (20 ml/100 test)). Per l’adsorbimento del Rf, incubare il campione del paziente in tampone di diluizione Rf per 15 minuti a temperatura ambiente oppure per una notte a 4 °C. La procedura è descritta in un manuale di istruzioni distinto. Pos : 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung T eil 3 @ 5\mod_1256050082945_33.doc @ 22805 @

Prima dell’analisi, l’adsorbente del fattore reumatoide (V1) deve essere diluito 1+4 nel tampone di diluizione (V2).

V1 + V2 = V3 (1 + 4) aggiungere 200 µl di adsorbente Rf a ogni 800 µl di tampone di diluizione

I campioni dei pazienti (V4) devono essere diluiti in questo tampone di diluizione Rf (V3):

V4 + V3 = 1+100 aggiungere 10 µl di campione del paziente a ogni 1.000 µl di tampone di diluizione Rf Pos : 20 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenver dünnung: Mischung der Proben @ 4\mod_1255343607624_33.doc @ 21291 @

Dopo la diluizione e prima di dispensare i campioni nella piastra per microtitolazione, i campioni devono essere miscelati con cura per ottenere una soluzione omogenea. Pos : 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenlager ung @ 4\mod_1255343526141_33.doc @ 21275 @ 3

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7.2.2 Conservazione dei campioni Non conservare i campioni dei pazienti per più di 7 giorni a 2 – 8 °C. Per una durata più lunga dei campioni conservare a temperature ≤ - 20 °C. Evitare di congelare e scongelare ripetutamente i campioni. I campioni diluiti possono essere conservati per una settimana a 2 – 8 °C. Pos: 22 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Testdurchführung/Reagenzienvorbereitung - KOMPLETT @ 12\mod_1379504953325_33.doc @ 57767 @ 23333333

7.3 Preparazione dei reagenti del kit

Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente prima dell’uso.

7.3.1 Strisce reattive per microtitolazione

Le strisce reattive per microtitolazione, contrassegnate con abbreviazioni per il patogeno e la classe immunoglobulinica, sono confezionate in una sacca di alluminio con un agente essiccante. Per aprire la sacca di alluminio della piastra per microtitolazione, tagliare solo l’estremità del lato appositamente contrassegnato, per poter richiudere correttamente la sacca. Prelevare dal telaio i pozzetti non necessari e riporli nella sacca di alluminio. Chiudere la sacca con cura per garantire la chiusura ermetica. Non utilizzare le strisce reattive se la sacca di alluminio risulta danneggiata o se la sacca contenente le strisce rimanenti e l’agente essiccante non è stata richiusa correttamente.

7.3.2 Sieri di controllo / sieri standard (pronto per l’uso)

I sieri di controllo e i sieri standard sono pronti per l’uso e non devono essere ulteriormente diluiti. I sieri di controllo e i sieri standard devono essere inclusi in ogni analisi, indipendentemente dal numero di strisce reattive per microtitolazione utilizzate. I sieri standard e i sieri di controllo devono essere analizzati in duplicato. Non trattare i sieri di controllo con l’adsorbente Rf.

7.3.3 Coniugato AP anti- IgA, IgG o IgM umane (pronto per l’uso)

La concentrazione necessaria del coniugato (+, ++, +++) è riportata sul certificato di controllo qualità. Fare riferimento anche alle specifiche indicate sull’etichetta.

7.3.4 Soluzione di lavaggio (concentrata)

Diluire la soluzione di lavaggio concentrata (V1) 1:30 con acqua distillata, per un volume finale di V2. Esempio:

Tampone concentrato (V1) Volume finale (V2)

33,3 ml 1000 ml

1,0 ml 30 ml

7.3.5 Tampone di diluizione per campioni (pronto per l’uso)

7.3.6 Substrato (pronto per l’uso)

Il substrato nel flacone chiuso può avere un colore leggermente giallo, che non compromette la qualità del prodotto!

7.3.7 Soluzione di arresto (pronta per l’uso)


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7.4 Schema riassuntivo della procedura



analisi quantitativa Per il rilevamento delle IgM eseguire l’adsorbimento del fattore reumatoide, vedere n. 7.2.1;

Incubare 15 minuti a temperatura ambiente o tutta la notte a 4°C

diluizione del campione1 (campioni dei pazienti)


Dispensare i campioni diluiti e i sieri di controllo / standard pronti per l’uso nei pozzetti per microtitolazione (100 µl)

INCUBAZIONE 60 min/ 37 °C camera umida

LAVARE (4 x 300 µl DIL WASH )²

Dispensare la soluzione di coniugato APC (100 µl)

INCUBAZIONE 30 min./ 37 °C camera umida

LAVARE (4 x 300 µl DIL WASH )²

Dispensare la soluzione di substrato pNPP (100 µl)

INCUBAZIONE 30 min./ 37 °C camera umida

Dispensare la soluzione di arresto STOP (100 µl)

LEGGERE L’ESTINZIONE a 405 nm

1Tamponi di diluizione speciali per i seguenti test SERION ELISA classic: Borrelia burgdorferi IgG, IgM, EBV EA IgG e Hantavirus Puumala IgG, IgM

2Per uso manuale:

al termine della procedura di lavaggio, picchiettare la piastra su carta bibula.


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7.5 Procedura manuale

1. Collocare la quantità necessaria di pozzetti nel telaio e preparare un foglio protocollo. 2. Aggiungere 100 µl di campione diluito o dei controlli pronti per l’uso nei pozzetti

corrispondenti delle strisce reattive per microtitolazione. Lasciare vuoto un pozzetto per il bianco substrato, ad es.:

pozzetto quantitativa ELISA

A1 Bianco substrato

B1 Controllo negativo

C1 Siero standard

D1 Siero standard

E1 Paziente 1....

F1 Paziente 2....

3. Incubare i campioni per 60 minuti (+/- 5 min.) a 37 °C (+/- 1°C) in camera umida 4. Dopo l’incubazione, lavare tutti i pozzetti con la soluzione di lavaggio (con dispositivo

automatico o manualmente): - aspirare o gettare via la soluzione di incubazione rovesciando la piastra per microtitolazione - riempire ogni pozzetto con 300 µl di soluzione di lavaggio - aspirare o gettare via la soluzione di lavaggio rovesciando la piastra per microtitolazione - ripetere per 3 volte la procedura di lavaggio (per un totale di 4 lavaggi!) - asciugare picchiettando la piastra per microtitolazione su carta bibula

5. Aggiunta del coniugato Aggiungere 100 µl del coniugato IgA/IgG/IgM pronto per l’uso ai pozzetti corrispondenti (ad eccezione del bianco substrato)

6. Incubare il coniugato per 30 minuti (+/- 1 min.) a 37 °C (+/- 1 °C) in camera umida. 7. Dopo l’incubazione, lavare tutti i pozzetti con la soluzione di lavaggio (come sopra) 8. Aggiunta del substrato

Aggiungere a ogni pozzetto 100 µl della soluzione di substrato pronta per l’uso (compreso il pozzetto per il bianco substrato!)

9. Incubare il substrato per 30 minuti (+/- 1 min.) a 37 °C (+/- 1 °C) in camera umida. 10. Arresto della reazione

Aggiungere a ogni pozzetto 100 µl di soluzione di arresto e miscelare scuotendo leggermente la piastra per microtitolazione.

11. Determinare l’estinzione Determinare la densità ottica (OD) entro 60 minuti a 405 nm contro il bianco substrato; lunghezza d’onda di riferimento tra 620 nm e 690 nm (ad es. 650 nm).


7.6 Procedura automatica

I SERION ELISA possono essere analizzati con strumenti automatici e validati sia con ImmunomatTM e Gemini, sia con DYNEX DSX® e DS2®. L’analisi automatica viene effettuata analogamente alla procedura manuale. Si prega di notare che, in particolari condizioni di lavoro, possono essere necessarie modifiche interne di laboratorio ai tempi di incubazione del substrato. Pos : 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Positi vkontroll e / Richtigkeitskontroll e @ 8\mod_1260286311409_33.doc @ 27533 @ 2

italiano 11

7.7 Controllo positivo / controllo di accuratezza

Per la verifica periodica del metodo di analisi, in conformità ai requisiti dei sistemi di gestione qualità interni al laboratorio, raccomandiamo l’uso dei controlli SERION ELISA controls per determinare la precisione e l’affidabilità delle analisi effettuate con SERION ELISA classic. L’uso dei SERION ELISA controls è descritto nei manuali di istruzioni specifici. Pos : 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Liquordi agnosti k ( für Borr elia + FSM E + VZV + EBV + Infl uenza) @ 9\mod_1271682242806_33.doc @ 32123 @ 2

7.8 Diagnostica su liquido cerebrospinale I test SERION ELISA classic EBV VCA IgG, EBV EBNA1 IgG sono stati validati per la determinazione degli anticorpi intratecali nella diagnostica su liquido cerebrospinale e sono consigliati per il rilevamento e la differenziazione dei processi infiammatori del sistema nervoso centrale (SNC). La procedura è descritta in un manuale di istruzioni distinto. Un programma software di valutazione basato su Excel aiuta e permette il calcolo degli indici anticorpali secondo lo schema del Prof. Hansotto Reiber. Pos : 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: TESTAU SWER TUNG + Erreg er @ 1\mod_1197038305478_33.doc @ 11389 @ 12

8 VALUTAZIONE DEL TEST


L’adattamento della curva matematica per la quantificazione degli anticorpi con gli immunodosaggi SERION ELISA classic è basato sulla funzione logistica a 4 parametri (4 PL). I 4 parametri A, B, C e D rappresentano l'andamento esatto della curva standard:

Parametro A: Asintoto inferiore (OD) Parametro B: Pendenza della curva Parametro C: Punto di inflessione Parametro D: Asintoto superiore (OD)

Institut Virion\Serion GmbH stabilisce una curva standard 4 PL specifica per lotto per ogni immunodosaggio SERION ELISA classic in diverse serie di test effettuati in condizioni ottimali. I quattro parametri sono indicati nel certificato di controllo qualità di ogni singolo test SERION ELISA classic. Per l’adattamento del livello del test alla curva standard 4 PL si calcola il fattore di correzione F dividendo il valore standard di riferimento OD, indicato dal certificato di controllo qualità, per il valore OD standard misurato e quindi specifico per la serie di test. Moltiplicando i valori OD ottenuti dai campioni con il fattore di correzione F, il livello di ogni serie individuale di test viene adattato alla curva standard 4 PL. In questo modo le deviazioni inter-dosaggio vengono compensate e le attività anticorpali possono essere valutate direttamente dalla curva standard 4 PL. Sottraendo il bianco substrato da tutti i valori OD misurati e calcolando il valore OD medio del siero standard (STD), testati in duplicato, sono disponibili varie possibilità per la valutazione delle

)1)(

ln(1

)/(−

−∗

−−

=AFPatientOD

AD

BC

emlUActivity

valueODSTDmeasured


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attività anticorpali dai segnali di misurazione ottici (OD) dei campioni prelevati. Esse sono descritte in manuali separati. Pos : 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estauswertung/Grenzwertber eich ( für T es te mehrerer Ig-Klassen) @ 12\mod_1375360254888_33.doc @ 57400 @ 2

8.2 Zona grigia

La zona grigia del test SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG, EBV EA IgG è specificata nel certificato di controllo qualità e indica i valori del test della zona grigia. I valori inferiori a questo intervallo indicano un risultato negativo; i valori superiori all’intervallo della zona grigia sono considerati positivi. Pos : 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Quantifi zierungsgrenzen @ 6\mod_1258098664276_33.doc @ 24403 @ 2

8.3 Limiti di quantificazione

I limiti di quantificazione sono specificati nel certificato di controllo qualità del test SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG, EBV EA IgG. La linearità della diluizione in questo ambito è stata dimostrata in ampi studi di validazione. Qualora un campione di un paziente fornisca un risultato superiore al limite di quantificazione superiore, può essere analizzato a una diluizione maggiore. L’attività anticorpale così determinata deve essere moltiplicata per il fattore di diluizione addizionale. Pos : 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Automatische Tes tauswertung @ 12\mod_1375166354143_33.doc @ 57321 @ 2

8.4 Valutazione automatica / Software

Per la valutazione automatica dei segnali ottici sono disponibili su richiesta il software SERION easyANALYZE, il software SERION evaluate e il software basato su Microsoft® Excel SERION activity. Pos : 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: Tes tgültig kei tskriterien @ 12\mod_1375166094763_33.doc @ 57303 @ 2

8.5 Criteri di validità

- Il bianco substrato deve essere < 0,25 OD.

- Il controllo negativo deve fornire un risultato negativo.

- Con i test quantitativi SERION ELISA classic, il valore OD medio (dopo sottrazione del bianco substrato!) del siero standard deve essere compreso nel range di validità, riportato nel certificato di controllo qualità specifico per ogni lotto.

- Test qualitativi SERION ELISA classic: il valore OD del controllo positivo e il valore OD medio del siero cut-off devono essere compresi nei range di validità, riportati nel certificato di controllo qualità specifico per ogni lotto del kit (dopo sottrazione del bianco substrato!)

- Le oscillazioni dei valori OD del siero standard o del siero cut-off non devono superare il 20 %.

Se questi criteri non sono soddisfatti, il test non è valido e deve essere ripetuto. Pos : 36 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: Interpretation der Ergebnisse @ 0\mod_1190013774869_33.doc @ 9943 @ 2

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8.6 Interpretazione dei risultati Pos : 37 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: Inter pretation der Ergebnisse @ 12\mod_1375363155925_33.doc @ 57417 @

Un risultato positivo conferma la presenza di anticorpi specifici. Un risultato negativo indica che nel campione del paziente non sono presenti anticorpi clinicamente rilevanti contro il patogeno, ma non esclude l'eventualità di un'infezione acuta. In caso di risultati compresi nella zona grigia non è possibile una valutazione affidabile. Per una diagnosi definitiva è necessario analizzare in parallelo coppie di sieri prelevati a distanza di una o due settimane. Pos : 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Inter pretation der Ergebnisse @ 15\mod_1421652419778_33.doc @ 66992 @

La diagnosi della mononucleosi infettiva primaria si basa principalmente sulla determinazione degli anticorpi diretti contro l’antigene precoce (EA) e contro il complesso proteico denominato antigene capsidico virale (VCA), la cui importanza è nota da tempo. Poco dopo l’infezione appaiono gli anticorpi IgM diretti contro EA e VCA, che si riducono o scompaiono completamente con la risoluzione dell’infezione acuta. Al contrario, le IgG anti-VCA, che vengono prodotte pressoché contemporaneamente, persistono per tutta la vita, ma i livelli di attività possono variare. In caso di riattivazione (ad esempio dopo immunosoppressione) si assiste a un aumento significativo dei livelli di IgG anti-EA e IgG anti-VCA e, raramente, le IgM anti-VCA possono essere rilevabili. I pazienti con linfoma di Burkitt e carcinoma nasofaringeo presentano gli stessi caratteristici livelli elevati di IgG anti-VCA osservati nelle riattivazioni. Inoltre, la determinazione degli anticorpi IgA anti-VCA è un supporto alla diagnosi di carcinoma nasofaringeo. Livelli aumentati di anticorpi anti-EA sono caratteristici dei pazienti affetti da carcinoma nasofaringeo o che presentano una riattivazione. Diverse settimane dopo l’infezione primaria appaiono gli anticorpi diretti contro l’antigene nucleare 1 del virus EBV (EBNA1), che rimangono rilevabili per tutta la vita, ma possono scomparire in caso di immunosoppressione. Da soli o in combinazione con gli anticorpi IgG anti-VCA, sono considerati un marcatore dell’infezione pregressa. In seguito alla riattivazione virale si assiste spesso a un declino delle IgG anti-EBNA1, in genere accompagnato da un aumento dell’attività IgG anti-VCA e dalla ricomparsa degli anticorpi anti-EA. I risultati compresi nella zona grigia nel test SERION ELISA classic EBNA1 IgG in combinazione con risultati positivi nel test SERION ELISA classic EBV VCA IgG sono considerati positivi e segno di un’infezione pregressa. Nella tabella seguente sono riportate le combinazioni possibili di anticorpi e la relativa interpretazione. Schema interpretativo Questo schema interpretativo serve innanzitutto a distinguere tra sieronegatività, infezione primaria ed infezione pregressa grazie ai quattro marcatori sierologici principali IgG anti-EA, IgG anti-VCA, IgM anti-VCA e IgG anti-EBNA1.

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IgG anti-

EA

IgM anti-

VCA

IgG anti-

VCA

IgG anti-

EBNA1 Interpretazione

- - - - sieronegatività

+ - - -

infezione acuta o recente

- + - -

+ + - -

+ + + -

+ - + -

- + + -

- - + -

- - + + infezione pregressa

- - - +

++ - ++ + riattivazione

++ + ++ +

Non è possibile escludere reazioni incrociate con anticorpi diretti contro altri virus herpes (ad es. CMV, HSV, VZV).


8.7 Valori di riferimento negli individui sani

L’analisi di sieri di donatori di sangue scelti a caso, provenienti dalla Germania meridionale, con i test SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus ha fornito i seguenti risultati. Pos : 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Refer enzbereich gesunder Probanden @ 12\mod_1380024245277_33.doc @ 58093 @

SERION ELISA classic numero negativo zona grigia positivo

EBV VCA IgG 131 3 (2,3 %) 2 (1,5 %) 126 (96,2 %)

EBV VCA IgM 131 131 (100 %) - -

EBV EBNA 1 IgG 131 11 (8,4 %) - 120 (91,6 %)

EBV EA IgG 131 92 (70,2 %) 11 (8,4 %) 28 (21,4 %)


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9 CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE Pos : 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift: Sensiti vität und Spezi fität @ 0\mod_1190013251494_33.doc @ 9928 @ 2

9.1 Sensibilità e specificità Pos : 43 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Sensi ti vität und Spezifi tät @ 15\mod_1421417016940_33.doc @ 66952 @

I test SERION ELISA classic EBV VCA IgG, IgM e SERION ELISA classic EBV-EBNA-1 IgG sono stati convalidati in uno studio interno. Sono stati analizzati 155 sieri di donatori di sangue sierologicamente negativi e di pazienti con infezione da EBV acuta e pregressa, e come riferimento è stato usato un test ELISA di uno dei principali produttori europei. Le caratteristiche di prestazione del test SERION ELISA classic EBV EA IgG sono state valutate in uno studio interno analizzando 96 sieri di donatori di sangue sani e di pazienti con sospetta infezione acuta da EBV. Come test di riferimento sono stati utilizzati due test ELISA ed un test per immunofissazione dei principali produttori europei.

Sensibilità Specificità





I sieri con risultati compresi nella zona grigia non sono stati inclusi nei calcoli di sensibilità e specificità. Pos : 44 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift Präzisi on @ 0\mod_1184676568397_33.doc @ 2121 @ 2

9.2 Riproducibilità Pos : 45 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Präzision @ 14\mod_1404457829683_33.doc @ 62009 @

SERION ELISA classic EBV EA IgG

Campione Valore medio

(OD)

Intrasaggio

CV (%)

Valore medio

(OD)

Intersaggio

CV (%)

Siero 1 0,616 4,5 0,637 5,5

Siero 2 0,746 5,3 0,814 6,6

Siero 3 2,125 3,0 2,191 2,8

SERION ELISA classic EBV VCA IgM


(OD)

Intrasaggio

CV (%)

Valore medio

(OD)

Intersaggio

CV (%)

Siero 1 0,530 8,7 0,551 7,2

Siero 2 1,582 5,1 1,703 6,4

Siero 3 2,249 7,9 2,311 8,7

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SERION ELISA classic EBV VCA IgG


(OD)

Intrasaggio

CV (%)

Valore medio

(OD)

Intersaggio

CV (%)

Siero 1 0,554 2,2 0,644 7,1

Siero 2 1,355 2,4 1,510 4,5

Siero 3 1,437 3,0 1,636 4,5

SERION ELISA classic EBV EBNA1 IgG


(OD)

Intrasaggio

CV (%)

Valore medio

(OD)

Intersaggio

CV (%)

Siero 1 0,305 2,8 0,341 8,4

Siero 2 0,952 2,5 1,093 4,1

Siero 3 1,622 3,1 1,799 4,2 Pos : 46 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Allgemei ne Texte ELISA classic/Sicherheitsmaßnahmen @ 12\mod_1374740573162_33.doc @ 57169 @ 122

10 MISURE DI SICUREZZA

10.1 Avvertenze

Il SERION ELISA classic deve essere utilizzato da personale qualificato che abbia familiarità con la buona pratica di laboratorio. Maneggiare con attenzione tutti i reagenti del kit e i campioni di origine umana, secondo le regole della buona pratica di laboratorio. - Questo kit contiene emoderivati di origine umana. Benché tutti i sieri di controllo e cut-off

siano risultati negativi per gli anticorpi anti-HIV, per HbsAg (antigene di superficie del virus dell’epatite B) e per gli anticorpi anti-HCV, devono essere considerati potenzialmente infetti.

- Non pipettare con la bocca.

- Non fumare, mangiare o bere nelle aree dove vengono maneggiati i campioni o i reagenti del kit.

- Indossare guanti monouso, camici da laboratorio e occhiali di protezione quando si lavora con i reagenti del kit o con i campioni. Al termine, lavarsi accuratamente le mani.

- Decontaminare i campioni dei pazienti e gli altri materiali potenzialmente infetti dopo l’esecuzione del test.

- Conservare i reagenti in luogo sicuro e inaccessibile alle persone non autorizzate, ad es. ai bambini.

10.2 Smaltimento

Rispettare le disposizioni di legge vigenti! Pos : 47 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Liter atur/Liter atur @ 13\mod_1396939862911_33.doc @ 59083 @ 1

11 BIBLIOGRAFIA

La bibliografia per SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus è elencata alla fine delle istruzioni per l’uso.


Epstein-Barr Virus VCA IgG/IgM, Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG, Epstein-Barr Virus EA IgG CONTENIDO

1 USO PREVISTO

2 PERTINENCIA DIAGNÓSTICA

3 PRINCIPIO DE LA PRUEBA SERION ELISA classic

4 COMPONENTES DEL KIT

5 MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO

6 CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD

7 PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA SERION ELISA classic

7.1 Evidencia de deterioro

7.2 Preparación y conservación de la muestra

7.3 Preparación de reactivos del kit

7.4 Visión general - procedimiento de la prueba

7.5 Procedimiento manual

7.6 Procedimiento automatizado

7.7 Control positivo / control de exactitud

7.8 Diagnóstico en líquido cefalorraquídeo (LCR)

8 EVALUACIÓN DE LA PRUEBA


8.2 Intervalos dudosos

8.3 Límites de cuantificación

8.4 Evaluación automatizada / Software

8.5 Criterios de validez

8.6 Interpretación de resultados

8.7 Intervalos de referencia de individuos sanos

9 CARACTERÍSTICAS DE FUNCIONAMIENTO

9.1 Sensibilidad y especificidad

9.2 Reproducibilidad

10 MEDIDAS DE SEGURIDAD

10.1 Declaraciones de advertencia

10.2 Eliminación de desechos

11 BIBLIOGRAFÍA

Actualizaciones Nº de la versión actual: V 136.23

Versión anterior: V 22.11/12-1

Actualización en la sección: Actualización general

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Enzimoinmunoensayo para la determinación de anticuerpos humanos Para uso diagnóstico in vitro

Pos : 3 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Bes tell nummern/EBV: Bes tellnummern @ 0\mod_1188368235293_28.doc @ 6492 @ SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG Nº de pedido: ESR1361G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgM Nº de pedido: ESR1361M

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG Nº de pedido: ESR1362G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG Nº de pedido: ESR1363G

Pos: 4 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Allgemeine Texte ELISA classic/Kapitelüberschrift "Anwendungsbereich" @ 0\mod_1177351044007_28.doc @ 172 @ 1 1 USO PREVISTO Pos : 5 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Anwendungsber eich/EBV: Anwendungsbereich @ 14\mod_1404456157024_28.doc @ 61972 @

Las pruebas de SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG, VCA IgG, IgM y EBNA1 IgG son inmunoensayos cuantitativos y cualitativos para la detección de anticuerpos humanos en suero o plasma dirigidos frente a componentes del virus Epstein-Barr (VEB). SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG y SERION ELISA classic EBV VCA IgM se recomiendan para la detección de infecciones agudas o reactivaciones. SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG determina infecciones primarias y recientes. La prueba SERION ELISA classic EBNA1 IgG se recomienda para la determinación de infecciones pasadas. Las pruebas SERION ELISA classic EBV VCA y EBNA1 IgG se han validado para demostrar la presencia de anticuerpos sintetizados en el espacio intratecal en el diagnóstico del LCR. Pos : 6 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/Kapitelüberschrif t "Diag nostische Bedeutung" @ 0\mod_1177351537598_28.doc @ 223 @ 1

2 PERTINENCIA DIAGNÓSTICA Pos : 7 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Di agnostische Bedeutung/EBV: Diagnostische Bedeutung @ 15\mod_1421651635398_28.doc @ 66972 @

El virus de Epstein - Barr (VEB) es un virus humano patógeno que pertenece a la familia Herpesviridae. Se encuentran en todo el mundo y en común con todos los herpesvirus, la prevalencia en la población general es alta, alcanzando del 90 al 95 % en la población adulta. En los llamados paises en desarrollo, la infección primaria se da generalmente en el primer año de vida y es con frecuencia asintomática. Por contra, en paises con altos niveles de higiene, la infección primaria se da principalmente en adolescentes y adultos jóvenes. El pico de edad de infección se encuentra entre los 15 y 20 años y alrededor del 50 % de los infectados desarrollará una mononucleosis infecciosa. La transmisión se produce primariamente a través de un intercambio de saliva aunque son posibles otras rutas como productos derivados de la sangre o trasplante de médula. Durante la infección primaria las glándulas salivares están implicadas inicialmente y los virus alcanzan la nariz y la garganta vía saliva. En este punto, los síntomas de infección son como los de la gripe. El virus es diseminado a través del cuerpo por los linfocitos B infectados, que están regulados normalmente por el sistema inmune pero cuya proliferación es estimulada por el virus. Estos linfocitos B infectados en sangre periférica son característicamente atípicos, con una forma variable, citoplasma claramente basófilo y un núcleo evidente. A medida que la enfermedad avanza puede presentar fiebre alta, esplenomegalia, linfadenitis, trombocitopenia y hepatitis. Debido a la diseminación del virus y la estrategia de transmisión, primeramente vía saliva, la mononucleosis infecciosa (MI) o fiebre glandular se ha dado en llamar también la “enfermedad del beso”. En casos raros una infección aguda de MI puede conducir a un estado de enfermedad activa crónica. En dichos casos los síntomas de MI pueden continuar durante un

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período de tiempo considerable. La patogénesis de esta complicación no está clara aunque se sospecha una predisposición genética y/o infección con una cadena particularmente lítica de virus. En regiones geográficas concretas, el VEB está estrechamente asociado con la prevalencia de carcinoma nasofaríngeo. Este carcinoma de la faringe, nariz y garganta consta de células epiteliales indiferenciadas y tiene propensíon a la metástasis. Esta enfermedad se presenta globalmente pero es particularmente común en ciertas regiones del sur de China. La predisposición genética así como los aspectos ambientales como la dieta están bajo discusión como cofactores. El linfoma de Burkitt (LB), es también un tumor asociado a VEB, primariamente en las regiones geográficas de África y Papúa Nueva Guinea. Este tumor de linfocitos B monoclonales está también ligado a las zonas con alta prevalencia de malaria y por encima del 90 % de dichos tumores presentan evidencia de virus E-B. La influencia de la infección por plasmodium en la respuesta inmune trae a discusión el papel de la malaria como un cofactor de LB. Se dan casos esporádicos de LB en otras regiones, de cualquier forma en dichos casos, el VEB es mucho menos frecuentemente detectado y se piensa que otros cofactores como los cambios genéticos a través de translocación cromosómica son responsables del tumor. IgM se produce muy temprano en la infección contra el antígeno temprano (EA). Las concentraciones máximas de anticuerpos tienden a coincidir con la aparición de los síntomas, y aproximadamente dos semanas después de la infección inicial comienza la producción de IgG para EA, IgM para VCA (Virus Capsid Antigen) e IgG para VCA. Las concentraciones más altas de IgM anti-VCA, se encuentran en torno a tres semanas después de la aparición de síntomas. Las IgG frente a EA son frecuentemente detectables durante un tiempo considerable tras la infección. En consecuencia, las concentraciones de IgM frente a VCA y más tarde de IgG frente a EA decaen. La IgG anti-VCA alcanza un pico unas seis semanas tras la aparición de los síntomas y permanece en un nivel alto durante toda la vida. Alrededor de tres semanas después de la aparición de los síntomas los anticuerpos IgG frente a EBNA1, que son un indicador de una infección pasada, empiezan a producirse y alcanzan un pico en torno al mes siete y permanencen en un nivel alto tras una infección normal por VEB. La reactivación de los virus (como la immunosupresión) normalmente conduce a un significativo incremento de anticuerpos IgG frente a EA mientras que los títulos de IgM frente a VCA aumentan. Sólo muy ocasionalmente, después de la inmunosupresión, IgG frente a EBNA1 desaparece de forma que IgG frente a EA es un buen marcador de reactivación. Pos : 8 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/T es tprinzip/Tes tpri nzip ELISA classic @ 4\mod_1255342796551_28.doc @ 21210 @ 1

3 PRINCIPIO DE LA PRUEBA SERION ELISA classic

La prueba ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas) es un inmunoensayo particularmente apropiado para la determinación de anticuerpos en el campo de la serología infecciosa. La reacción se basa en la interacción específica de anticuerpos con su antígeno correspondiente. Las tiras reactivas de la placa de microtitulación de SERION ELISA classic se recubren con antígenos específicos del agente patógeno de interés. Si los anticuerpos en la muestra de suero del paciente están presentes, se unen al antígeno fijado. Un anticuerpo secundario, que se ha conjugado con la enzima fosfatasa alcalina, detecta y se une al complejo inmune. El sustrato incoloro p-nitrofenolfosfato se convierte entonces en el producto coloreado p-nitrofenol. La intensidad de la señal de este producto de reacción es proporcional a la concentración del analito en la muestra y se mide fotométricamente.

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Pos: 9 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für nur ein Dokument/Inhalt und Zusammensetzung/EBV: Inhalt und Zusammensetzung @ 14\mod_1404461827273_28.doc @ 62080 @ 1

4 COMPONENTES DEL KIT Componentes de la prueba unidades / Volumen

Tiras separables cada una con 8 pocillos de microtitulación recubiertos de antígeno, (En total son 96 pocillos) MTP , 1 bastidor. El material de recubrimiento está inactivado.

12 unidades

Suero patrón (listo para usar) STD , Suero humano en tampón fosfato que contiene proteína; negativo para Ac anti-VIH, Acs HB (HBs-Ag, antígeno de superficie del virus de la hepatitis B) y Ac anti-VHC; conservante: azida sódica < 0,1 %; colorante: Amaranto O.

2 x 2 ml

Suero control negativo (listo para usar) NEG , Suero humano en tampón fosfato que contiene proteína; negativo para Ac anti-VIH, Acs HB (HBs-Ag, antígeno de superficie del virus de la hepatitis B) y Ac anti-VHC; conservante: azida sódica < 0,1 %; colorante: Verde Lissamin Green V

2 ml

Conjugado (fosfatasa alcalina) anti IgA, IgG o IgM humana (listo para usar) APC , Anticuerpo policlonal IgA, IgG o IgM anti-humano, conjugado con fosfatasa alcalina, estabilizado con solución que contiene proteínas; conservante: metilisotiazolona al < 0,1 %, bromonitrodioxano al < 0,1 %

13 ml

Solución de lavado concentrada (suficiente para 1000 ml) WASH , Solución de cloruro de sodio con Tween 20 y 30 mM Tris/HCl, pH 7,4; conservante: azida sódica < 0,1 %

33,3 ml

Solución tampón diluyente (listo para usar) DILB o solución tampón diluyente especial S1 (listo para usar) DILBS1 , (Solución amortiguadora de dilución especial para SERION ELISA classic EBV EA IgG. ¡Agitar inmediatamente antes de usar!) Tampón fosfato con Tween 20 que contiene proteína ( DILB ) y lisado de E. coli ( DILBS1 ); conservante: azida sódica < 0,1 %; colorante: 0,01 g/l de azul de bromofenol.

2 x 50 ml

Solución de parada (listo para usar) STOP , hidróxido de sodio < 0,1 N, 40 mM EDTA

15 ml

Sustrato (listo para usar) pNPP , Para-nitrofenilfosfato en solución amortiguadora sin disolvente; conservante: azida sódica < 0,1 %

13 ml

Certificado de control de calidad con curva patrón y tabla de evaluación INFO , (cuantificación de anticuerpos enUI/ml o U/ml)

2 páginas


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5 MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO

- equipo habitual de laboratorio - Para la detección de IgM: Absorbente Rf SERION, nº de pedido Z200 (20 ml) - fotómetro para placas de microtitulación con filtro, longitud de onda 405 nm,

longitud de onda de referencia recomendada 620 nm - 690 nm (p.ej., 650 nm) - Lavador de la placa de microtitulación - incubador a 37 °C - Cámara húmeda - agua destilada - Clips de cierre por presión (Click-Clips, nº de pedido VT120) - Opcional: SERION ELISA control Pos: 11 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Lagerung und Haltbarkeit/Lagerung und Haltbarkeit @ 13\mod_1397031131719_28.doc @ 59210 @ 1 es

6 CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD

Reactivo Conservación Estabilidad

Tiras de microtitulación (recubiertas con antígeno)

sin abrir

tras la apertura entre 2 – 8 °C en una bolsa de aluminio cerrada con desecante

ver fecha de caducidad

período de conservación mínimo: cuatro semanas

Sueros control / Sueros patrón

sin abrir / tras la apertura entre 2 – 8 °C ver fecha de caducidad

Conjugado sin abrir / tras la apertura entre 2 – 8 °C ver fecha de caducidad

Solución tampón diluyente

sin abrir / tras la apertura entre 2 – 8 °C


Solución de lavado sin abrir / tras la apertura entre 2 – 8 °C

dilución de trabajo entre 2 – 8 °C

dilución de trabajo a temperatura ambiente


2 semanas

1 semana

Sustrato sin abrir / tras la apertura entre 2 – 8 °C ver fecha de caducidad

Solución de parada sin abrir / tras la apertura entre 2 – 8 °C



7 PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA SERION ELISA classic Pos : 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Allgemeine Hi nweise ELISA cl assic @ 12\mod_1379504700667_28.doc @ 57730 @ 2

7.1 Evidencia de deterioro

Solamente se pueden lograr resultados óptimos si se siguen estrictamente las instrucciones. Utilice únicamente reactivos SERION ELISA classic al utilizar inmunoensayos SERION ELISA classic. Los componentes no deben intercambiarse con reactivos de otros fabricantes. Los sueros patrón y control de los inmunoensayos SERION ELISA classic immunoassays están definidos exclusivamente para el kit de pruebas que se va a utilizar y no deben utilizarse en otros lotes. La solución de lavado, el sustrato y la solución de parada se pueden utilizar para todos los inmunoensayos SERION ELISA classic Independientemente del lote y de la prueba.

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Cada prueba SERION ELISA classic contiene un diluyente de muestra tamponado listo para usar. En algunos casos es necesaria la utilización de soluciones amortiguadoras especiales para garantizar una calidad constante y unos resultados fiables. Las soluciones tampón diluyentes pueden utilizarse independientemente de los lotes. Existen tres concentraciones de conjugado diferentes para cada clase de inmunoglobulina (IgA, IgG, IgM), lo que se indica en la etiqueta como + (baja), ++ (media) y +++ (alta). Los conjugados con la misma concentración y de la misma clase de inmunoglobulina son intercambiables y se pueden utilizar para otros inmunoensayos SERION ELISA classic Independientemente del lote y de la prueba. La dilución o alteración de los reactivos puede dar como resultado una pérdida de sensibilidad. Utilice técnicas asépticas al retirar alícuotas de los frascos de reactivos para evitar la contaminación. La reproducibilidad de los resultados de las pruebas es dependiente de una correcta homogenización de los reactivos. Agite los tubos que contienen sueros control antes de usar, también todas las muestras tras la dilución (por ejemplo, utilizando un mezclador de vórtice). Asegúrese de pipetear con cuidado y respetar los tiempos y temperaturas de incubación proporcionados. Diferencias significativas de tiempos entre el pipeteo del primer y el último pocillo de la placa de microtitulación al dispensar muestras de sueros control, conjugado o sustrato pueden dar como resultado diferentes tiempos de preincubación, lo que puede influir en la precisión y reproducibilidad de los resultados. Evite la exposición de los reactivos a la luz intensa durante la conservación e incubación. Un lavado adecuado evita la falta de especificidad de la prueba. Por lo tanto, el procedimiento de lavado se debe llevar a cabo cuidadosamente. Todos los pocillos de fondo plano se deben rellenar con volúmenes iguales de solución amortiguadora de lavado. Al final del procedimiento asegúrese de que los pocillos no tienen nada de solución amortiguadora de lavado para evitar efectos de dilución no controlados. ¡Evite la formación de espuma! Los reactivos deben estar firmemente cerrados tras su uso para evitar evaporación y contaminación. Tenga cuidado para no mezclar los tapones de los frascos y/o viales. El inmunoensayo SERION ELISA classic es válido únicamente si se cumplen los criterios de validación específicos del lote en el certificado de control de calidad. Pos : 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Probenvor ber. und Lager ung (für ALLE Err eger auß er Borreli a, CM V, FSM E, H SV,Masern,Mumps,R öteln,VZ V) @ 8\mod_1263998040982_28.doc @ 28432 @ 2

7.2 Preparación y conservación de la muestra

Las muestras lipémicas, hemolíticas o ictéricas (Suero o plasma) deben analizarse con precaución. No se deben procesar muestras evidentemente contaminadas. El suero o plasma (EDTA, citrato, heparina) recogido de acuerdo con métodos normalizados de laboratorio son muestras apropiadas. Las muestras no deben estar inactivadas por temperatura. Pos : 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Kapi tel überschrift Probenverdünnung @ 0\mod_1184679414434_28.doc @ 2315 @ 3

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7.2.1 Dilución de muestras

Antes de efectuar el análisis, las muestras de los pacientes (V1) se deben diluir en solución amortiguadora (V2) como sigue: Pos : 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung, T eil 1 @ 5\mod_1256050091616_28.doc @ 22820 @ SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG (¡tampón diluyente especial B231-S1!)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG (tampón diluyente B231)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG (tampón diluyente B231)

La tampón diluyente para SERION ELISA classic EBV EA IgG (B231-S1) no es intercambiable por la tampón diluyente de SERION ELISA classic EBV VCA o EBNA1.

V1 + V2 = 1 + 100 añadir 10 µl de la muestra del paciente a 1000 µl de tampón diluyente

Pos : 17 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung, T eil 2 Ü berschrift @ 0\mod_1188369220721_28.doc @ 6552 @ SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgM Pos: 18 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für mehrere Dokumente/Testdurchführung/Probenverdünnung: Rheumafaktor-Interferenz (für Tests mit IgM-Nachweis) @ 9\mod_1316422765852_28.doc @ 36509 @ Interferencia con factores reumatoides Los factores reumatoides son autoanticuerpos, principalmente de tipo IgM, que se unen preferiblemente a complejos inmunes de IgG. La presencia de anticuerpos IgM no específicos (factores reumatoides) puede conducir a resultados falsos positivos en el inmunoensayo de IgM. Además, existe la posibilidad de que anticuerpos IgM de baja afinidad de unión patógeno específicos, puedan quedar desplazados por anticuerpos IgG de mayor afinidad de unión conduciendo a un resultado falso negativo para IgM. Por lo tanto es necesario tratar previamente las muestras con un absorbente de factor reumatoide antes de la detección de IgM. (Absorbente de factor reumatoide SERION, Nº de pedido: Z200 (20 ml/100 pruebas)). La absorción de los factores reumatoideos se realizará mediante incubación de la muestra del paciente en la solución absorbente de RF durante 15 minutos a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C. El procedimiento de la prueba se describe en un manual de instrucciones por separado. Pos : 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung T eil 3 @ 5\mod_1256050082945_28.doc @ 22804 @

Antes de efectuar la prueba, el absorbente del factor reumatoide (V1) se debe diluir 1+4 en tampón diluyente (V2).

V1 + V2 = V3 (1 + 4) añadir 200 µl absorbente de Rf

a 800 µl de tampón diluyente

Las muestras del paciente (V4) se deben diluir en esta tampón diluyente Rf (V3):

V4 + V3 = 1+100 añadir 10 µl de la muestra del paciente

a 1000 µl de tampón diluyente Rf Pos : 20 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenver dünnung: Mischung der Proben @ 4\mod_1255343607624_28.doc @ 21290 @

Tras la dilución y antes de pipetear a la placa de microtitulación, se deben mezclar correctamente las muestras para lograr una solución homogénea. Pos : 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenlager ung @ 4\mod_1255343526141_28.doc @ 21274 @ 3

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7.2.2 Conservación de las muestras

Las muestras de los pacientes no se deben conservar durante más de 7 días a 2 – 8 °C. Es posible ampliar la conservación a ≤ -20 °C. Evite la congelación y descongelación repetida de las muestras. Las muestras diluidas se pueden almacenar a 2 – 8 °C durante una semana. Pos: 22 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Testdurchführung/Reagenzienvorbereitung - KOMPLETT @ 12\mod_1379504953325_28.doc @ 57766 @ 23333333

7.3 Preparación de reactivos del kit

Lleve todos los reactivos a temperatura ambiente antes de realizar las pruebas.

7.3.1 Tiras de pocillos

Las tiras de pocillos etiquetadas con abreviaturas para el patógeno y la clase de inmunoglobulina han sido envasadas junto con un desecante en una bolsa de aluminio. Para abrir la bolsa de aluminio que contiene la placa de microtitulación, por favor corte la parte superior únicamente del lado marcado, para garantizar poder cerrarla de nuevo adecuadamente. Extraiga del bastidor los pocillos no necesarios y póngalos nuevamente dentro de la bolsa de aluminio. Cierre cuidadosamente la bolsa para garantizar condiciones herméticas. No utilice las tiras si la bolsa de aluminio está dañada o si la bolsa con las tiras restantes y el desecante no ha sido cerrada de nuevo adecuadamente.

7.3.2 Sueros control / sueros patrón (listo para usar)

Los sueros control y patrón están listos para usar y no se deben diluir más. Para cada corrida – independientemente del número de tiras que se vayan a utilizarse deben incluir los sueros control y patrón. Los sueros estándar y de corte deberán configurarse por duplicado. No trate los sueros control con absorbente de Rf.

7.3.3 Conjugado FA anti IgA, IgG o IgM humanas (listo para usar)

La concentración de conjugado necesaria (+, ++, +++) se indica en el certificado de control de calidad. Consulte también las especificaciones de la etiqueta.

7.3.4 Solución de lavado (concentrada)

Diluya la solución amortiguadora de lavado concentrada (V1) 1:30 con agua destilada hasta un volumen final de V2. Ejemplo:

Concentrado de solución amortiguadora (V1)

Volumen final (V2)

33,3 ml 1000 ml

1,0 ml 30 ml

7.3.5 Solución amortiguadora diluyente para muestras (lista para usar)

7.3.6 Sustrato (listo para usar)

El sustrato en un frasco sin abrir puede tener una coloración ligeramente amarilla, lo que no reduce la calidad del producto!

7.3.7 Solución de parada (lista para usar)


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7.4 Visión general - procedimiento de la prueba



cuantitativo

En caso de detección de IgM y absorción de factor reumatoide, ver Nº 7.2.1; Incubación 15 minutos a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C

dilución de la muestra1

(muestras de los pacientes) 1 + 100


Pipetear muestras diluidas y control listo para usar/ sueros patrón en los pocillos de micro análisis (100 µl)

INCUBACIÓN 60 Min./ 37 °C cámara húmeda

LAVAR (4 x 300 µl DIL WASH )²

Pipetear solución de conjugado APC (100 µl)


LAVAR (4 x 300 µl DIL WASH )²

Pipetear solución sustrato pNPP (100 µl)


Pipetear solución de parada STOP (100 µl)

LEER EXTINCIÓN a 405 nm

1Soluciones amortiguadoras de dilución especiales para las siguientes pruebas SERION ELISA classic: Borrelia burgdorferi IgG, IgM, EBV EA IgG y Hantavirus puumala IgG, IgM

2Para uso manual:

Ligeros golpecitos al final del procedimiento de lavado sobre toallita de papel. Pos : 26 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/M anuelle Tes tdurchführ ung (für ALLE Erreg er auß er Adeno, Coxi ella, RSV) @ 12\mod_1379505649011_28.doc @ 57784 @ 2

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7.5 Procedimiento manual

1. Coloque el número necesario de pocillos en el bastidor y prepare una hoja de protocolo. 2. Añada 100 µl de muestra diluida o controles listos para usar en los pocillos

apropiados de las tiras de prueba de microtitulación. Reserve un pocillo para el blanco del sustrato, p.ej.:

pocillo cuantitativo ELISA

A1 Sustrato en blanco

B1 Control negativo

C1 Suero patrón

D1 Suero patrón

E1 1…del paciente

F1 2…del paciente

3. Incubación de la muestra durante 60 minutos (+/- 5 min.) a 37 °C (+/- 1°C) en la cámara de humectación

4. Tras la incubación lave todos los pocillos con solución de lavado (mediante dispositivo automatizado o manualmente): - aspire o agite la solución de incubación - Llene cada pocillo con 300 µl de solución de lavado - aspire o agite la solución amortiguadora de lavado - repita el procedimiento de lavado 3 veces (¡en total son 4 veces!) - séquelo dando ligeros golpecitos a la placa de microtitulación sobre una toallita de papel

5. Adición de conjugado Añada 100 µl of del conjugado listo para usar IgA/IgG/IgM a los pocillos apropiados (excepto el sustrato en blanco)

6. Incubación del conjugado durante 30 minutos (+/- 1 min.) a 37 °C (+/- 1 °C) en la cámara de humectación.

7. Tras la incubación lave todos los pocillos con solución de lavado (ver más arriba) 8. Adición de sustrato

Añada 100 µl de solución de sustrato listo para usar a cada pocillo (¡incluyendo el pocillo para el sustrato en blanco!)

9. Incubación del sustrato durante 30 minutos (+/- 1 min.) a 37 °C (+/- 1 °C) en la cámara de humectación.

10. Parada de la reacción Añada 100 µl de solución de parada a cada pocillo, agite suavemente la placa de microtitulación para mezclar.

11. Lectura de la extinción Lea la densidad óptica (DO) en los siguientes 60 minutos a 405 nm frente al sustrato blanco, la longitud de onda de referencia entre 620 nm y 690 nm (p.ej., 650 nm).


7.6 Procedimiento automatizado

SERION ELISA es apto para el procesado en equipos automáticos y ha sido evaluado para su uso con ImmunomatTM y Gemini así como con DYNEX DSX® y DS2®. El proceso automatizado se realiza de manera análoga al uso manual. Se advierte que bajo condiciones de trabajo especiales internas del laboratorio pueden ser necesarias adaptaciones de los tiempos de incubación del sustrato.

español 11

Pos : 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Positi vkontroll e / Richtigkeitskontroll e @ 8\mod_1260286311409_28.doc @ 27532 @ 2

7.7 Control positivo / control de exactitud

Para la verificación periódica del método de prueba, y para satisfacer los requisitos de los sistemas de gestión de calidad internos de laboratorio, recomendamos la utilización de SERION ELISA controls para determinar la precisión y fiabilidad de las corridas de pruebas con SERION ELISA classic. La utilización de SERION ELISA controls se describe en manuales de instrucciones específicos. Pos : 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Liquordi agnosti k ( für Borr elia + FSM E + VZV + EBV + Infl uenza) @ 9\mod_1271682242806_28.doc @ 32122 @ 2

7.8 Diagnóstico en líquido cefalorraquídeo (LCR) Las pruebas de IgG del SERION ELISA classic EBV VCA, EBV EBNA1 han sido evaluadas para la determinación de anticuerpos intratecales en el diagnóstico del LCR y están recomendadas para la detección, así como para la diferenciación de procesos inflamatorios dentro del sistema nervioso central (SNC). El procedimiento de las pruebas se describe en un manual de instrucciones por separado. Un instrumento de software de evaluación basado en Excel proporciona soporte al cálculo de índices de anticuerpos de acuerdo con un diseño del Prof. Hansotto Reiber. Pos : 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: TESTAU SWER TUNG + Erreg er @ 1\mod_1197038305478_28.doc @ 11388 @ 12

8 EVALUACIÓN DE LA PRUEBA

8.1 SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG,EBV EA IgG Pos : 31 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: 4-PL M ethode @ 13\mod_1397031924809_28.doc @ 59230 @

El ajuste de la curva matemática para la cuantificación de anticuerpos con los inmunoensayos SERION ELISA classic se basa en la función logística de cuatro parámetros (4 PL). Los cuatro parámetros A, B, C, y D representan la forma exacta de la curva estándar:

Parámetro A: Asíntota inferior (DO) Parámetro B: Pendiente de la curva Parámetro C: Punto de inflexión Parámetro D: Asíntota superior (DO)

La empresa Institut Virion\Serion GmbH establece una curva estándar 4 PL específica del lote para cada inmunoensayo SERION ELISA classic en múltiples series analíticas que se desarrollen en condiciones de ensayo óptimas. Los cuatro parámetros se especifican en el certificado de control de calidad de cada prueba SERION ELISA classic individual. Para adaptar el nivel de la prueba a la curva 4 PL estándar dada, el factor de corrección F se calcula dividiendo el valor DO de referencia estándar indicado en el certificado de control de calidad entre el valor DO estándar medido y, en consecuencia, específico de la serie analítica en cuestión. Multiplicando los valores DO obtenidos de muestras de pacientes por el factor de corrección F, el nivel de cada serie analítica individual se ajusta a la curva 4 PL estándar dada. Así, las desviaciones entre ensayos se compensan y las actividades de anticuerpos pueden evaluarse directamente a partir de la curva 4 PL estándar.

)1)(

ln(1

)/(−

−∗

−−

=AFPatientOD

AD

BC

emlUActivity

valueODSTDmeasured


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Después de restar el sustrato en blanco de todos los valores DO medidos y de calcular el valor DO medio del suero patrón (STD), analizado por duplicado, surgen diversas posibilidades para evaluar las actividades de anticuerpos a partir de las señales de medición ópticas (DO) de las muestras de pacientes. Estas se describen en manuales independientes. Pos : 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estauswertung/Grenzwertber eich ( für T es te mehrerer Ig-Klassen) @ 12\mod_1375360254888_28.doc @ 57399 @ 2

8.2 Intervalos dudosos

Los intervalos dudosos de las pruebas SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG,EBV EA IgG se especifican en el certificado de control de calidad. Los valores por debajo de este intervalo indican un resultado negativo; los valores por encima del intervalo dudoso se interpretan como positivos. Pos : 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Quantifi zierungsgrenzen @ 6\mod_1258098664276_28.doc @ 24402 @ 2

8.3 Límites de cuantificación

Los límites de cuantificación se especifican en el certificado de control de calidad de la prueba SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG, EBV EA IgG. La linealidad de la dilución dentro de este intervalo ha sido demostrada en estudios de evaluación exhaustivos. En caso de que una muestra del paciente muestre un resultado de la prueba por encima del límite superior de cuantificación, se puede ensayar a una dilución mayor. La actividad de anticuerpo determinada así se debe multiplicar por el factor de dilución adicional. Pos : 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Automatische Tes tauswertung @ 12\mod_1375166354143_28.doc @ 57320 @ 2

8.4 Evaluación automatizada / Software

Para la evaluación automatizada de las señales de medición ópticas, el software SERION easyANALYZE, el software SERION evaluate, así como la herramienta de software basado en Microsoft® Excel, SERION activity, están disponibles bajo pedido. Pos : 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: Tes tgültig kei tskriterien @ 12\mod_1375166094763_28.doc @ 57302 @ 2

8.5 Criterios de validez

- El blanco de sustrato debe ser < 0,25 DO.

- El control negativo debe producir un resultado negativo de la prueba.

- Mediante el uso de pruebas cuantitativas SERION ELISA classic el valor de DO medio (¡después de restar el blanco de sustrato!) del suero patrón debe estar dentro del intervalo de validez, que se proporciona en el certificado de control de calidad específico del lote.

- SERION ELISA classic cualitativo: El valor de DO del control positivo y el valor de DO medio del suero de corte deben quedar dentro de los intervalos de validez, que se proporcionan en el certificado de control de calidad específico del lote del kit (¡después de restar el blanco de sustrato!)

- La variación de valores DO del suero patrón o del suero de corte no pueden ser superiores al 20 %.

Si no se cumplen estos criterios, la prueba no es válida y se debe repetir. Pos : 36 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: Interpretation der Ergebnisse @ 0\mod_1190013774869_28.doc @ 9942 @ 2

español 13

8.6 Interpretación de resultados Pos : 37 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: Inter pretation der Ergebnisse @ 12\mod_1375363155925_28.doc @ 57419 @

Un resultado positivo en la prueba confirma la presencia de anticuerpos específicos. Un resultado negativo indica que no hay anticuerpos clínicamente relevantes frente al patógeno en la muestra del paciente, pero no excluye la posibilidad de que exista una infección aguda. En el caso de que se produzca un resultado dudoso, no es posible una evaluación fiable. Un diagnóstico definitivo únicamente se puede lograr mediante el análisis de muestras de suero pareadas, tomadas con un intervalo de una a dos semanas, en paralelo. Pos : 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Inter pretation der Ergebnisse @ 15\mod_1421652419778_28.doc @ 66991 @

El diagnóstico de la mononucleosis infecciosa primaria (MI), se realiza principalmente por la detección de anticuerpos frente al antígeno temprano (EA, por sus siglas en inglés) y frente al complejo de proteína conocido como el antígeno de la cápside viral (VCA, por sus siglas en inglés), cuya importancia se conoce hace algún tiempo. Poco tiempo después de la infección, aparecen los anticuerpos IgM dirigidos contra EA y VCA y al resolverse la infección, disminuyen o desaparecen completamente. Por contra, la IgG anti-VCA, que se produce casi al mismo tiempo, persiste durante el resto de la vida aunque los niveles de actividad pueden variar. En caso de reactivación (por ejemplo después de una inmunosupresión) hay un incremento significativo en los niveles tanto de IgG anti-EA como IgG anti-VCA, y, en casos raros, se puede detectar IgM frente a VCA. Los pacientes con linfoma de Burkitt y carcinoma nasofaríngeo tienen los mismos característicos altos niveles de IgG frente a VCA como se observa en las reactivaciones. Además, la demostración de anticuerpos IgA frente a VCA proporciona evidencia que soporta el diagnóstico de carcinoma nasofaríngeo. Niveles aumentados de anticuerpos anti-EA son del mismo modo una característica en pacientes que sufren carcinoma nasofaríngeo o experimentan una reactivación. Varias semanas tras la infección primaria, los anticuerpos dirigidos contra el antígeno nuclear VEB 1 (EBNA1, por sus siglas en inglés), aparecen y permanecen detectables durante toda la vida aunque pueden desaparecer si el paciente está inmunodeprimido. Sólo, o en combinación con anticuerpos IgG frente a VCA, son considerados un marcador de la infección pasada. Frecuentemente se observa una disminución en IgG frente a EBNA1 tras la reactivación de virus. Esto viene acompañado normalmente de un incremento en la actividad de IgG anti VCA mientras que los anticuerpos frente a antígeno temprano reaparecen. Los resultados dudosos en la prueba SERION ELISA classic EBNA1 IgG en combinación con resultados positivos en SERION ELISA classic EBV VCA IgG se interpretan como positivos y evidencian una infección pasada hace mucho tiempo En la siguiente tabla se enumeran las posibles combinaciones de anticuerpos y su interpretación. Esquema de interpretación básica Este esquema básico de interpretación es fundamentalmente para diferenciar entre un estado immune seronegativo, infección primaria e infección pasada usando los cuatro marcadores serológicos más importantes: IgG frente a EA, IgG frente a VCA, IgM frente a VCA e IgG frente a EBNA1:

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EA IgG VCA IgM VCA IgG EBNA1 IgG Interpretación

- - - - seronegatividad

+ - - -

infección aguda / reciente

- + - -

+ + - -

+ + + -

+ - + -

- + + -

- - + -

- - + + infección en el pasado

- - - +

++ - ++ + reactivación

++ + ++ +

No se puede descartar la posibilidad de que se produzcan reacciones cruzadas con anticuerpos dirigidos contra otros virus del herpes (como el CMV, el VHS o el VVZ).


8.7 Intervalos de referencia de individuos sanos

Las pruebas de sueros de donantes de sangre elegidos al azar, recogidos en la región del sur de Alemania, con las pruebas SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus, dieron como resultado la distribución siguiente. Pos : 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Refer enzbereich gesunder Probanden @ 12\mod_1380024245277_28.doc @ 58092 @

SERION ELISA classic número negativo dudoso positivo

EBV VCA IgG 131 3 (2,3 %) 2 (1,5 %) 126 (96,2 %)

EBV VCA IgM 131 131 (100 %) - -

EBV EBNA 1 IgG 131 11 (8,4 %) - 120 (91,6 %)

EBV EA IgG 131 92 (70,2 %) 11 (8,4 %) 28 (21,4 %)


español 15

9 CARACTERÍSTICAS DE FUNCIONAMIENTO Pos : 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift: Sensiti vität und Spezi fität @ 0\mod_1190013251494_28.doc @ 9927 @ 2

9.1 Sensibilidad y especificidad Pos : 43 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Sensi ti vität und Spezifi tät @ 15\mod_1421417016940_28.doc @ 66951 @

Las pruebas SERION ELISA classic EBV VCA IgG, IgM y SERION ELISA classic EBV EBNA-1 IgG se validaron en un estudio interno. Se analizaron 155 muestras de suero procedentes de donantes de sangre con resultados negativos en suero, así como de pacientes con infecciones agudas y pasadas por el VEB, y se utilizó como prueba de referencia una prueba ELISA de un importante fabricante europeo.

Las características de funcionamiento de la prueba SERION ELISA classic EBV EA IgG se evaluaron en un estudio interno mediante el análisis de 96 muestras de suero procedentes de donantes de sangre sanos y de pacientes en los que se sospechaba la existencia de una infección aguda por el VEB. Se utilizaron como pruebas de referencia dos pruebas ELISA y una prueba de inmunocoagulación de importantes fabricantes europeos.

Sensibilidad Especificidad





Los sueros clasificados como dudosos no se incluyeron en el cálculo de la sensibilidad y la especificidad. Pos : 44 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift Präzisi on @ 0\mod_1184676568397_28.doc @ 2120 @ 2

9.2 Reproducibilidad Pos : 45 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Präzision @ 14\mod_1404457829683_28.doc @ 62008 @


Muestra Valor de la

media (DO)

Intraensayo

CV (%)

Valor de la media

(DO)

Interensayo

CV (%)

Suero 1 0,616 4,5 0,637 5,5

Suero 2 0,746 5,3 0,814 6,6

Suero 3 2,125 3,0 2,191 2,8


Muestra Valor de la

media (DO)

Intraensayo

CV (%)

Valor de la media

(DO)

Interensayo

CV (%)

Suero 1 0,530 8,7 0,551 7,2

Suero 2 1,582 5,1 1,703 6,4

Suero 3 2,249 7,9 2,311 8,7

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Muestra Valor de la

media (DO)

Intraensayo

CV (%)

Valor de la media

(DO)

Interensayo

CV (%)

Suero 1 0,554 2,2 0,644 7,1

Suero 2 1,355 2,4 1,510 4,5

Suero 3 1,437 3,0 1,636 4,5


Muestra Valor de la

media (DO)

Intraensayo

CV (%)

Valor de la media

(DO)

Interensayo

CV (%)

Suero 1 0,305 2,8 0,341 8,4

Suero 2 0,952 2,5 1,093 4,1

Suero 3 1,622 3,1 1,799 4,2 Pos : 46 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Allgemei ne Texte ELISA classic/Sicherheitsmaßnahmen @ 12\mod_1374740573162_28.doc @ 57168 @ 122

10 MEDIDAS DE SEGURIDAD 10.1 Declaraciones de advertencia El SERION ELISA classic está diseñado para ser utilizado por personal calificado y familiarizado con las buenas prácticas de laboratorio. Todos los reactivos del kit y las muestras humanas deben manipularse con cuidado, de acuerdo a la buena práctica de laboratorio establecida. - Este kit contiene componentes de sangre humana. Aunque todos los sueros de control y

de corte han sido analizados y el resultado ha sido negativo para anti-HIV-ab (anticuerpo anti VIH), HBs-Ag (antígeno de superficie del virus de hepatitis B) y anti-HCV-ab (anticuerpo anti HCV), se deberán considerar como potencialmente infecciosos.

- No pipetear con la boca.

- No fume, coma ni beba en zonas en las que se manipulen muestras o reactivos del kit.

- Utilice guantes desechables, bata de laboratorio y gafas de seguridad mientras manipula reactivos del kit o muestras. Lávese las manos cuidadosamente después.

- El material del paciente y demás material potencialmente infeccioso se debe descontaminar después de la ejecución de la prueba.

- Los reactivos se deben conservar de modo seguro y deben ser inaccesibles a un acceso no autorizado p.ej., niños.

10.2 Eliminación de desechos Cumpla con los requisitos reglamentarios pertinentes. Pos : 47 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Liter atur/Liter atur @ 13\mod_1396939862911_28.doc @ 59082 @ 1

11 BIBLIOGRAFÍA

Encontrará la bibliografía relativa a SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus al final de estas instrucciones de uso. === Ende der Liste für T extmar ke Inhalt ===


Epstein-Barr Virus VCA IgG/IgM, Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG, Epstein-Barr Virus EA IgG ÍNDICE

1 UTILIZAÇÃO PREVISTA

2 RELEVÂNCIA DIAGNÓSTICA

3 PRINCÍPIO DO ENSAIO SERION ELISA classic

4 COMPONENTES DO KIT

5 MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS

6 ARMAZENAMENTO E VALIDADE DOS REAGENTES

7 Execução do teste SERION ELISA classic

7.1 Instruções gerais

7.2 Preparação e armazenamento das amostras

7.3 Preparação dos reagentes do kit

7.4 Execução do teste – apresentação resumida

7.5 Realização do teste pelo método manual

7.6 Realização do teste pelo método automatizado

7.7 Controle positivo / Controle da exatidão

7.8 Diagnóstico do LCR

8 VALIDAÇÃO DO TESTE


8.2 Intervalos “borderline”

8.3 Limites de quantificação

8.4 Validação automática / Softwares

8.5 Critérios de validação do teste

8.6 Interpretação dos resultados

8.7 Intervalo de referência de indivíduos saudáveis

9 CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO

9.1 Sensibilidade e especificidade

9.2 Reprodutibilidade

10 MEDIDAS DE SEGURANÇA

10.1 Advertências e medidas de precaução

10.2 Eliminação de resíduos

11 REFERÊNCIAS

Atualizações Versão atual n.o: V 136.23

Versão anterior n.o: V 22.11/12-1

Atualização na seção: Atualização geral

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Pos : 1 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/U pdate @ 15\mod_1406189600723_38.doc @ 65574 @ Pos : 2 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/Einl eitung " Enzymimmunoassay" @ 4\mod_1255336385816_38.doc @ 21169 @


Ensaio imunoenzimático para a determinação de anticorpos humanos

para uso em diagnóstico in vitro Pos : 3 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Bes tell nummern/EBV: Bes tellnummern @ 0\mod_1188368235293_38.doc @ 6494 @ SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG Código n.o: ESR1361G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgM Código n.o: ESR1361M

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG Código n.o: ESR1362G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG Código n.o: ESR1363G

Pos: 4 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Allgemeine Texte ELISA classic/Kapitelüberschrift "Anwendungsbereich" @ 0\mod_1177351044007_38.doc @ 174 @ 1 1 UTILIZAÇÃO PREVISTA Pos : 5 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Anwendungsber eich/EBV: Anwendungsbereich @ 14\mod_1404456157024_38.doc @ 61974 @

Os testes SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG, VCA IgG, IgM e EBNA1 IgGsão imunoensaios quantitativos e qualitativos para a detecção de anticorpos humanos no soro ou no plasma dirigidos contra componentes do vírus de Epstein-Barr (EBV). O SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG e o SERION ELISA classic EBV VCA IgM são recomendados para a detecção de infecções agudas ou reativações. O SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG determina infecções primárias e recentes. O SERION ELISA classic EBNA1 IgG é recomendado para a determinação de infecções passadas. Os testes SERION ELISA classic EBV VCA e EBNA1 IgG foram validados para a detecção de anticorpos sintetizados a nível intratecal para fins de diagnóstico em líquido cefalorraquidiano (LCR). Pos : 6 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/Kapitelüberschrif t "Diag nostische Bedeutung" @ 0\mod_1177351537598_38.doc @ 225 @ 1

2 RELEVÂNCIA DIAGNÓSTICA Pos : 7 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Di agnostische Bedeutung/EBV: Diagnostische Bedeutung @ 15\mod_1421651635398_38.doc @ 66974 @

O vírus Epstein-Barr (EBV) é um vírus patogênico humano que pertence à família dos vírus de herpes. O vírus está distribuído pelo mundo todo e, em comum com todos os vírus de herpes, a sua prevalência na população em geral é elevada, atingindo os 90% a 95 % na população adulta. Nos chamados países em desenvolvimento, a infecção primária ocorre geralmente no primeiro ano de vida e é frequente ser assintomática. Pelo contrário, em países com padrões de higiene elevados, a infecção primária ocorre sobretudo nos adolescentes e adultos jovens. A idade em que ocorrem mais infecções é entre os 15 e os 20 anos e cerca de 50% dos infectados vêm a desenvolver mononucleose infecciosa. A transmissão dá-se sobretudo por troca de saliva, embora sejam possíveis outras vias, como derivados do sangue ou transplante de medula óssea. Durante uma infecção primária, estão inicialmente envolvidas as glândulas salivares e o vírus atinge o nariz e a garganta através da saliva. Nesta fase, os sintomas da infecção são gripais. O vírus dissemina-se pelo organismo através de linfócitos B infectados, que são normalmente regulados pelo sistema imunitários mas cuja proliferação é estimulada pelo vírus. Estes linfócitos B infectados presentes no sangue periférico são caracteristicamente atípicos, com forma variável, citoplasma distintamente basófilos e um núcleo óbvio. À medida que a doença progride, pode manifestar-se com febre elevada, esplenomegalia, linfadenite, trombocitopenia e hepatite. Devido à disseminação do vírus e à estratégia de transmissão, sobretudo através da saliva, a mononucleose infecciosa (MI) ou febre glandular foi também designada por «doença do beijo». Em casos raros, uma infecção aguda de MI pode provocar um estado patológico ativo crónico. Nestes casos, os sintomas de MI podem prolongar-se por um período de tempo considerável. A

português 3

patogénese desta complicação não é clara, embora se suspeite de predisposição genética e/ou infecção por uma estirpe do vírus particularmente lítica.

Em certas regiões geográficas, o EBV está intimamente associado à incidência de carcinoma nasofaríngeo. Este carcinoma da faringe, nariz e garganta consistem em células epiteliais indiferenciadas e tem propensão para formar metástases. Esta doença ocorre globalmente, mas é particularmente comum em certas regiões do sul da China. A predisposição genética, assim como aspectos ambientais, como a dieta, estão a ser discutidos como cofatores.

O linfoma de Burkitt (LB) é também um tumor associado a EBV, sobretudo nas regiões geográficas de África e da Papua Nova Guiné. Este tumor dos linfócitos B monoclonais está também associado a áreas com incidência elevada de malária e mais de 90% destes tumores mostram evidências de presença de EBV. A influência da infecção por Plasmodium na resposta imunitária traz à liça o papel da malária como cofator no LB. É verdade que ocorrem casos esporádicos de LB noutras regiões, mas, em tais casos, o EBV é muito menos frequentemente detectado e pensa-se que outros fatores, como alterações genéticas por translocação de cromossomas, são responsáveis pelo tumor.

Numa fase muito inicial da infecção, é produzida IgM contra o antigénio inicial (EA). As concentrações máximas de anticorpos tendem a coincidir com o início dos sintomas e, aproximadamente duas semanas após a infecção inicial, começa a produção de IgG contra EA, IgM contra VCA (Virus Capsid Antigen) e IgG contra VCA. As concentrações de IgM anti-VCA mais elevadas encontram-se cerca de três semanas após o início dos sintomas. A IgG anti-EA é frequentemente detectável por um período de tempo considerável após a infecção. Subsequentemente, as concentrações de IgM anti-VCA e, mais tarde, de IgG anti-EA decrescem. A IgG anti-VCA atinge um pico cerca de seis semanas após o surgimento dos sintomas e o seu nível permanece elevado durante toda a vida. Por volta das três semanas após o aparecimento dos sintomas, começam a ser produzidos anticorpos IgG anti-EBNA 1, que constituem um indicador de infecção passada; estes atingem um pico passados cerca de sete meses e permanecem elevados durante toda a vida após uma infecção normal por EBV. A reativação do vírus (tal como a imunossupressão) leva habitualmente a um aumento significativo de anticorpos IgG anti-EA, enquanto os títulos de IgM anti-VCa raramente aumentam. Após a imunossupressão, a IgG anti-EBNA1 só muito ocasionalmente desaparece, o que a torna um bom marcador de reativação. Pos : 8 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/T es tprinzip/Tes tpri nzip ELISA classic @ 4\mod_1255342796551_38.doc @ 21212 @ 1

3 PRINCÍPIO DO ENSAIO SERION ELISA classic

O teste ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) é um imunoensaio, que é especialmente adequado para a determinação de anticorpos no campo das doenças infecciosas. A reação baseia-se na interação específica de anticorpos com os antígenos correspondentes. As cavidades da microplaca do kit SERION ELISA classic são revestidas com antígenos específicos do agente patogênico de interesse. Se existirem anticorpos na amostra de soro do paciente, eles são ligados ao antígeno fixo. Um anticorpo secundário, que foi conjugado com a enzima fosfatase alcalina, detecta e liga-se ao complexo imune. O substrato incolor p-nitrofenilfosfato é então convertido no produto corado p-nitrofenol. A intensidade do sinal do produto desta reação é proporcional à concentração do analito na amostra e é medido por fotometria. Pos : 9 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Inhalt und Z usammensetzung/EBV: Inhalt und Z usammensetzung @ 14\mod_1404461827273_38.doc @ 62082 @ 1

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4 COMPONENTES DO KIT Componentes do teste Unidades /

volume

Tiras de microplacas quebráveis, cada uma com oito poços individuais revestidos com antígenos, (total de 96 poços) MTP , 1 moldura de microplaca. O material de revestimento está inativado.

12 unidades

Soro padrão (pronto para uso) STD , Soro humano diluído em solução proteica tamponada; negativo para Ac anti-HIV, Ag HBs (antígeno de superfície do vírus da hepatite B) e Ac anti-HCV; conservante: azida de sódio a < 0,1 %; corante: amaranto O

2 x 2 ml

Soro de controle negativo (pronto para uso) NEG , Soro humano diluído em solução proteica tamponada; negativo para Ac anti-HIV, Ag HBs (antígeno de superfície do vírus da hepatite B) e Ac anti-HCV; conservante: azida de sódio a < 0,1 %; corante: verde lissamina V

2 ml

Conjugado anti-IgA, IgG ou IgM humano (pronto para uso) APC , Anticorpo policlonal dirigido contra IgA, IgG ou IgM humanos, conjugado com fosfatase alcalina, estabilizado em solução proteica; conservante: metilisotiazolona a < 0,1 %, bromonitrodioxano a < 0,1 %

13 ml

Concentrado de solução de lavagem (suficiente para 1000 ml) WASH , Solução de cloreto de sódio com Tween 20 e 30 mM Tris/HCl, pH 7,4; conservante: azida de sódio a < 0,1 %

33,3 ml

Tampão de diluição (pronto para uso) DILB ou tampão de diluição especial S1 (pronto para uso) DILBS1 (tampão de diluição especial para o SERION ELISA classic EBV EA IgG. Agitar imediatamente antes de utilizar!) Tampão de fosfato contendo proteína, Tween 20 DILB e lisado de E. coli DILBS1 conservante: azida de sódio a < 0,1 %; corante: azul de bromofenol 0,01 g/l.

2 x 50 ml

Solução de parada (pronto para uso) STOP , < 0,1 N hidróxido de sódio, 40 mM EDTA

15 ml

Substrato (pronto para uso) pNPP , conservante: azida de sódio a < 0,1 %; preservative: < 0.1 % sodium azide

13 ml

Certificado de controle de qualidade com curva padrão e tabela de valores INFO , (quantificação dos anticorpos em UI/ml ou U/ml)

2 páginas


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5 MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS

- equipamentos comuns de laboratório - para a detecção de IgM: absorvente Fr SERION, código n.o Z200 (20 ml) - Leitor de ELISA fotométrico para microplacas com filtro, comprimento de onda 405 nm,

comprimento de onda de referência recomendado na gama de 620 nm a 690 nm (p. ex. 650 nm)

- Lavadora de placas de microtitulação - incubadora 37 °C - câmara úmida - água destilada - clipes de pressão (código n.o VT120) - Opcional: SERION ELISA control Pos: 11 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Lagerung und Haltbarkeit/Lagerung und Haltbarkeit @ 13\mod_1397031131719_38.doc @ 59212 @ 1

6 ARMAZENAMENTO E VALIDADE DOS REAGENTES

Reagente Armazenamento Validade

Tiras de microtitulação (revestidas com antígeno)

Fechadas

Após a abertura, entre 2 e 8 °C no saco de alumínio fechada, junto com o dessecante

ver o prazo de validade

prazo de validade ou 4 semanas

Soros de controle / soros padrão

Fechadas / Após a abertura: entre 2 e 8 °C ver o prazo de validade

Conjugados Fechadas / Após a abertura: entre 2 e 8 °C ver o prazo de validade

Tampão de diluição Fechadas / Após a abertura: entre 2 e 8 °C


Solução de lavagem

Fechadas / Após a abertura: entre 2 e 8 °C C

Diluição de utilização entre 2 e 8 °C

Diluição de utilização à temperatura ambiente


2 semanas

1 semana

Substrato Fechadas / Após a abertura: entre 2 e 8 °C ver o prazo de validade

Solução de parada Fechadas / Após a abertura: entre 2 e 8 °C ver o prazo de validade


7 Execução do teste SERION ELISA classic Pos : 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Allgemeine Hi nweise ELISA cl assic @ 12\mod_1379504700667_38.doc @ 57732 @ 2

7.1 Instruções gerais

Só o cumprimento rigoroso destas instruções garante resultados corretos. Utilizar exclusivamente os reagentes SERION ELISA classic, uma vez que estão otimizados para o sistema, e não os substituir por reagentes de outros fabricantes. Os soros padrão e os soros de controle dos imunoensaios SERION ELISA classic estão ajustados para o lote específico dos testes dos kits e não podem ser utilizados em outros lotes. A solução de lavagem, o substrato e a solução de parada poderão ser utilizados em todos os testes SERION ELISA classic, independentemente do lote e do kit.

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Cada ensaio SERION ELISA classic contém um tampão de diluição fácil de usar. Em alguns casos, é preciso usar tampões de diluição especiais para garantir qualidade consistente e resultados confiáveis. Tampões de diluição de qualquer lote podem ser utilizados. Cada conjugado está disponíveis em três concentrações para cada classe de imunoglobulina (IgA, IgG, IgM), indicados na rotulagem como + (baixo), ++ (médio) e +++ (alto). Conjugados com concentrações idênticas e imunoglobulina da mesma classe podem ser utilizados um no lugar do outro ou para outros imunoensaios SERION ELISA classic, qualquer que seja o lote e o ensaio. Qualquer alteração ou a diluição incorreta dos reagentes poderá causar uma perda da sensibilidade. Para evitar a contaminação, empregar sempre técnicas assépticas para extrair as alíquotas de reagentes. A reprodutibilidade dos resultados depende, dentre outros fatores, da mistura cuidadosa dos reagentes preparados. Antes de utilizar os soros de controle e o conjugado, os recipientes deverão ser bem agitados. As amostras também devem ser bem misturadas após a diluição (p. ex. com um vórtex). A pipetagem deve ser efetuada cuidadosamente, observando-se os tempos e temperaturas de incubação prescritos. Grandes diferenças de tempo entre a pipetagem do primeiro e do último poço na adição de amostras/soros de controle, conjugado e substrato levam a “tempos de pré-incubação” diferentes, o que poderá influenciar consideravelmente a precisão e a reprodutibilidade dos valores medidos. Os reagentes do teste deverão ser protegidos contra a luz forte durante o armazenamento e a incubação. Uma lavagem correta evita testes inespecíficos. Por isso, as instruções de utilização dos aparelhos de lavagem deverão ser observadas. Os poços de fundo plano devem ser enchidos uniformemente com solução de lavagem. Ao fim do procedimento, é importante certificar-se de que a solução de lavagem foi completamente removida dos poços, a fim de evitar efeitos de diluição incontroláveis. Evite a formação de espuma! Após a utilização devem ser bem fechados, a fim de evitar que sequem ou sejam contaminados. Tome cuidado para não trocar as tampas dos frascos. O teste SERION ELISA classic só será válido se forem observados os critérios de validação específicos para o lote. Estes critérios estão indicados no certificado de controle de qualidade contido no kit. Pos : 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Probenvor ber. und Lager ung (für ALLE Err eger auß er Borreli a, CM V, FSM E, H SV,Masern,Mumps,R öteln,VZ V) @ 8\mod_1263998040982_38.doc @ 28434 @ 2

7.2 Preparação e armazenamento das amostras

Amostras lipêmicas, hemolíticas ou ictéricas (soro ou plasma) só deverão ser utilizadas sob cuidado específico. Obviamente, amostras contaminadas não devem ser testadas. As amostras de soro ou plasma (EDTA, citrato, heparina) coletadas de acordo com métodos laboratoriais padronizados são consideradas ideais. As amostras não devem ser inativadas termicamente. Pos : 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Kapi tel überschrift Probenverdünnung @ 0\mod_1184679414434_38.doc @ 2317 @ 3

português 7

7.2.1 Diluição das amostras

Antes do início do teste, diluir as amostras dos pacientes (V1) em tampão de diluição (V2) do seguinte modo: Pos : 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung, T eil 1 @ 5\mod_1256050091616_38.doc @ 22822 @ SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG (tampão de diluição especial B231-S1!)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG (tampão de diluição B231)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG (tampão de diluição B231)

O tampão de diluição para SERION ELISA classic EBV EA IgG (B231-S1) não é permutável pelo tampão de diluição para SERION ELISA classic EBV VCA ou EBNA1.

V1 + V2 = 1 + 100 em 10 µl de amostra do paciente por 1000 µl de tampão de diluição


Interferência de fatores reumatóides Os fatores reumatóides são predominantemente anticorpos da classe IgM, que se ligam de preferência aos imunocomplexos IgG. A presença de anticorpos IgM inespecíficos (fatores reumatóides) pode produzir falsos resultados positivos na prova específica de IgM. Além disso, existe a possibilidade de os anticorpos IgM, de ligação mais fraca, específicos do micróbio patogênico serem suplantados pelos anticorpos IgG, de ligação mais forte. Um despiste IgM pode assim originar um falso resultado negativo. Por esta razão, é necessário submeter as amostras para a determinação de IgM a um tratamento preliminar com absorvente de fator reumatóide (Absorvente SERION de Fator Reumatóide, artigo nº Z200 (20 ml/100 testes)). Para executar a absorção de Fr, a amostra do doente em tampão de diluição Fr é incubada durante 15 minutos à temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 °C. O procedimento encontra-se descrito num manual de instruções específico. Pos : 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung T eil 3 @ 5\mod_1256050082945_38.doc @ 22806 @

Antes do ensaio, é necessário efetuar primeiro uma diluição 1+4 do absorvente de factor reumatóide (V1) com tampão de diluição (V2).

V1 + V2 = V3 (1 + 4) em 200 µl de absorvente-Fr por 800 µl de tampão de diluição

As amostras dos pacientes (V4) terão de ser diluídas neste tampão de diluição Fr (V3):

V4 + V3 = 1+100 em 10 µl de amostra do paciente por 1000 µl de tampão de diluição Fr


Após cada diluição, e antes da pipetagem na microplaca, as amostras devem ser bem misturadas a fim de se obter uma solução homogênea. Pos : 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenlager ung @ 4\mod_1255343526141_38.doc @ 21276 @ 3

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7.2.2 Armazenamento das amostras

As amostras dos pacientes não deverão ser armazenadas entre 2 e 8 °C por um período maior que 7 dias. É possível armazenar as amostras durante mais tempo se as mesmas forem armazenadas a um temperatura menor ou igual a -20 °C. Evitar congelamento e descongelamento repetidas vezes. As amostras diluídas poderão ser guardadas entre 2 e 8 °C durante uma semana. Pos: 22 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Testdurchführung/Reagenzienvorbereitung - KOMPLETT @ 12\mod_1379504953325_38.doc @ 57768 @ 23333333

7.3 Preparação dos reagentes do kit

Deixar todos os reagentes atingirem a temperatura ambiente antes de os utilizar.

7.3.1 Tiras da microplaca

As tiras de teste de microtitulação com abreviaturas indicativas do patógeno e da classe de imunoglobulina vêm embaladas em uma bolsa de alumínio. Para abrir a bolsa de alumínio da placa de microtitulação, corte apenas a parte superior no lado marcado para garantir que a bolsa possa ser fechada novamente. Retire as cavidades desnecessárias do suporte e recoloque-as na bolsa de alumínio. Feche cuidadosamente a bolsa para mantê-la vedada contra entrada de ar. Não utilize as tiras se a bolsa de alumínio estiver danificada ou se a bolsa contendo as tiras e agente dessecante não tiver sido vedada corretamente.

7.3.2 Soros de controle / soros padrão (pronto para uso)

Os controles e padrões são prontos para uso e não deverão ser diluídos. Todos os ensaios devem ser realizados com os soros controle e padrão, independentemente de quantas tiras de teste de microtitulação forem empregadas. Os soros padrão e limítrofe devem ser preparados em duplicata. Não tratar os soros de controle com absorvente de Fr.

7.3.3 Conjugado AP anti-IgA, IgG ou IgM humanos (pronto para uso)

A concentração necessária de conjugado (+, ++ ou +++) é indicada no certificado de controle de qualidade. Consulte também as especificações na rotulagem.

7.3.4 Solução de lavagem (concentrada)

Diluir o concentrado de solução de lavagem (V1) 1:30 com água destilada a um volume final (V2). Exemplo:

Concentrado de solução de lavagem (V1)

Volume final (V2)

33,3 ml 1000 ml

1,0 ml 30 ml

7.3.5 Tampão de diluição para amostras (pronto para uso)

7.3.6 Substrato (pronto para uso)

No frasco ainda fechado o substrato pode apresentar uma coloração ligeiramente amarelada. Isto não compromete a qualidade do produto!

7.3.7 Solução de parada (pronto para uso)


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7.4 Execução do teste – apresentação resumida



quantitativo

No caso de detecção de IgM com absorção de fator reumatóide, ver N.º 7.2.1; Incubação durante 15 minutos à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ºC

Diluição das amostras1 (Amostras dos doentes)


Adição das amostras diluídas e dos soros de controle / padrão prontos a utilizar (100 µl)

INCUBAÇÃO 60 min./ 37 °C câmara úmida

LAVAGEM (4 x 300 µl DIL WASH )²

Adição da solução de conjugado APC (100 µl)


LAVAGEM (4 x 300 µl DIL WASH )²

Adição da solução de substrato pNPP (100 µl)


Adição da solução de parada STOP (100 µl)

LEITURA DA ABSORÇÃO a 405 nm

1Tampões de diluição especiais para os seguintes testes SERION ELISA classic: Borrelia burgdorferi IgG, IgM, EBV EA IgG e Hantavírus Puumala IgG, IgM

2 Para lavagem manual: no fim do procedimento, bata suavemente a placa em toalhas de papel.


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7.5 Realização do teste pelo método manual

1. Colocar o número necessário de poços na moldura da microplaca e preparar a folha de protocolo.

2. Adicionar 100 µl de cada uma das amostras diluídas, ou dos controles prontos para uso, nos respectivos poços das tiras da microplaca. Deixe um poço livre para o Branco do substrato, p. ex.:

poço quantitativo ELISA

A1 branco do substrato

B1 controle negativo

C1 soro padrão

D1 soro padrão

E1 paciente - 1....

F1 paciente - 2....

3. Incubação das amostras durante 60 minutos (+/- 5 min.) a 37°C (+/- 1°C) em câmara úmida.

4. No fim do tempo de incubação, lavar todos os poços (com equipamento automatizado ou manual): - Aspirar ou esvaziar o líquido de incubação dos poços - Encher cada poço com 300 µl de solução de lavagem - Aspirar ou esvaziar a solução de lavagem - Repetir o processo mais 3 vezes (isto é, lavar 4 vezes no total) - Esvaziar a placa, batendo-a sobre toalhas de papel

5. Adição do conjugado Adicionar 100 µl do conjugado IgA/IgG/IgM pronto para uso nos respectivos poços (exceto branco do substrato)

6. Incubação do conjugado durante 30 minutos (+/- 1 min.) a 37°C (+/- 1 °C) em câmara úmida.

7. No fim do tempo de incubação, lavar todos os poços (como descrito acima) 8. Adição do substrato

Adicionar 100 µl do substrato pronto para uso em cada um dos poços (também no do branco do substrato)

9. Incubação do conjugado durante 30 minutos (+/- 1 min.) a 37°C (+/- 1 °C) em câmara úmida.

10. Parada da reação Adicionar 100 µl da solução de parada em cada um dos poços e agitar levemente a microplaca para misturar a solução.

11. Leitura da absorção Dentro de 60 minutos, determinar a densidade ótica (DO) a 405 nm contra o branco do substrato; comprimento de onda de referência entre 620 nm e 690 nm (p. ex. 650 nm).


7.6 Realização do teste pelo método automatizado

Os testes SERION ELISA são adequados para o processamento automatizado, tendo sido validados com os equipamentos ImmunomatTM e Gemini, DYNEX DSX® e DYNEX DS2®. O processamento automatizado é realizado de maneira análoga ao método manual. Leve em

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consideração que, sob condições de trabalho especiais, poderá ser necessário ajustar os tempos internos do laboratório quanto à incubaçãodo substrato. Pos : 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Positi vkontroll e / Richtigkeitskontroll e @ 8\mod_1260286311409_38.doc @ 27534 @ 2

7.7 Controle positivo / Controle da exatidão

Para verificação periódica do método do teste, em conformidade com os requisitos dos sistemas internos de gestão de qualidade do laboratóro, recomendamos a utilização dos Controles SERION ELISA controls para determinar a precisão e a confiabilidade dos testes realizados com os kits SERION ELISA classic. A utilização dos Controles SERION ELISA controls encontra-se descrita em manual de instruções específico. Pos : 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Liquordi agnosti k ( für Borr elia + FSM E + VZV + EBV + Infl uenza) @ 9\mod_1271682242806_38.doc @ 32124 @ 2

7.8 Diagnóstico do LCR Os testes SERION ELISA classic EBV VCA IgG, EBV EBNA1 IgG foram avaliados para a determinação de anticorpos intratecais na análise diagnóstica do LCR, sendo recomendados para a detecção e a diferenciação de processos inflamatórios do sistema nervoso central (SNC). O procedimento encontra-se descrito num manual de instruções específico. Uma ferramenta baseada em Excel auxilia o cálculo do índice de anticorpos de acordo com um esquema elaborado pelo Prof. Hansotto Reiber. Pos : 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: TESTAU SWER TUNG + Erreg er @ 1\mod_1197038305478_38.doc @ 11390 @ 12

8 VALIDAÇÃO DO TESTE


A curva matemática adequada à qualificação de anticorpos com imunoensaios SERION ELISA classic baseia em uma função logística de 4 parâmetros (4 PL). Os 4 parâmetros A, B, C e D representam exatamente o perfil da curva padrão e definem:

Parâmetro A: assímptota inferior (OD) Parâmetro B: declive da curva Parâmetro C: ponto de inflexão Parâmetro D: assímptota superior (OD)

O Institut Virion\Serion GmbH definiu uma curva padrão 4 PL, específica para cada lote dos imunoensaios SERION ELISA classic, em testes múltiplos, realizados sob condições ótimas. Os quatro parâmetros são indicados nos certificados de controle de qualidade do teste SERION ELISA classic. Para a adaptação do nível de teste à curva padrão 4 PL predefinida, o fator de correção F é calculado dividindo o valor de referência padrão OD indicado no certificado de controle da qualidade com o valor padrão OD, medido e, por conseguinte, específico para a execução de teste. Multiplicando os valores OD obtidos das amostras de pacientes com o fator de correção F, o nível de cada teste individual é ajustado à curva padrão 4 PL predefinida. Deste modo, as variações que ocorrem de teste para teste são compensadas e as atividades de anticorpos podem ser avaliadas diretamente com base na curva padrão 4 PL.

)1)(

ln(1

)/(−

−∗

−−

=AFPatientOD

AD

BC

emlUActivity

valueODSTDmeasured


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Após a subtração do branco de substrato de todos os valores OD medidos e o cálculo do valor médio OD do soro padrão (STD), duas vezes testado, uma gama de possibilidades está disponível para a avaliação das atividades de anticorpos a partir dos sinais oticamente medidos (OD) nas amostras de paciente. Estes encontram-se descritos em manuais de instruções separados. Pos : 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estauswertung/Grenzwertber eich ( für T es te mehrerer Ig-Klassen) @ 12\mod_1375360254888_38.doc @ 57401 @ 2

8.2 Intervalos “borderline”

Os intervalos “borderline” dos testes SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG, EBV EA IgG estão especificados nos certificados de controle de qualidade e indicam as gamas dos resultados de teste limites. Valores abaixo deste limite significam um resultado negativo e valores mais elevados são interpretados como positivos. Pos : 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Quantifi zierungsgrenzen @ 6\mod_1258098664276_38.doc @ 24404 @ 2

8.3 Limites de quantificação

Os limites de quantificação estão especificados no certificado de controle de qualidade do teste SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG, EBV EA IgG. A linearidade da diluição dentro deste intervalo foi demonstrada em estudos de avaliação abrangentes. No caso de a amostra do paciente apresentar um resultado acima do limite de quantificação, a amostra poderá ser analisada com uma diluição maior. A atividade de anticorpo determinada deste modo deverá ser multiplicada pelo fator de diluição adicional. Pos : 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Automatische Tes tauswertung @ 12\mod_1375166354143_38.doc @ 57322 @ 2

8.4 Validação automática / Softwares

Os softwares SERION easyANALYZE e SERION evaluate e a ferramenta de avaliação SERION activity para Microsoft® Excel® podem ser usados para avaliação automática de sinais de mensuração óptica. Pos : 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: Tes tgültig kei tskriterien @ 12\mod_1375166094763_38.doc @ 57304 @ 2

8.5 Critérios de validação do teste

- O branco de substrato deverá ter um valor DO < 0.25.

- O controle negativo deverá produzir um resultado de teste negativo.

- Nos testes quantitativos SERION ELISA classic, o valor DO médio do soro padrão (após a dedução do branco de substrato) deverá encontrar-se dentro do intervalo de validade indicado no certificado de controle de qualidade específico para o lote.

- Nos testes qualitativos SERION ELISA classic, o valor DO do controle positivo e o valor DO médio do soro cutt-off deverão encontrar-se dentro dos intervalos de validade indicados no certificado de controle de qualidade do kit, específico para o lote (após a dedução do branco de substrato).

- A variação dos valores DO do soro padrão e do soro cut-off não deverá ser maior que 20%.

Se estes critérios não forem satisfeitos, o teste será inválido e deverá ser repetido. Pos : 36 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: Interpretation der Ergebnisse @ 0\mod_1190013774869_38.doc @ 9944 @ 2

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8.6 Interpretação dos resultados Pos : 37 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: Inter pretation der Ergebnisse @ 12\mod_1375363155925_38.doc @ 57421 @

Um resultado positivo confirma a presença de anticorpos específicos. e um resultado negativo indica que a amostra do paciente não contém anticorpos relevantes contra o patógeno, mas não permite descartar uma infecção aguda. Um resultado limítrofe não permite um diagnóstico confiável. O diagnóstico definitivo requer análise de amostras de sorologia pareada colhidas com intervalo de uma a duas semanas. Pos : 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Inter pretation der Ergebnisse @ 15\mod_1421652419778_38.doc @ 66993 @

O diagnóstico de mononucleose infecciosa (MI) realiza-se sobretudo pela detecção de anticorpos contra o antigénio inicial (EA) e contra o complexo proteico conhecido por viral capsid antigen (VCA), cuja importância se conhece há algum tempo. Pouco depois da infecção, surgem os anticorpos IgM contra EA e VCA, que depois diminuem ou desaparecem totalmente quando a infecção aguda resolve. Pelo contrário, a IgG anti-VCA, produzida praticamente ao mesmo tempo, persiste por toda a vida, embora os níveis de atividade possam variar. Em caso de reativação (por exemplo, após imunossupressão), há um aumento significativo dos níveis tanto de IgG anti-EA como de IgG anti-VCA e, em casos raros, pode detectar-se IgM anti-VCA. Tal como se observa nas reativações, os doentes com linfoma de Burkitt e carcinoma nasofaríngeo possuem os mesmos níveis altos característicos de IgG anti-VCA. Além disso, a demonstração da presença de anticorpos IgA anti-VCA contribui com dados para o diagnóstico de carcinoma nasofaríngeo. O aumento dos anticorpos anti-EA é igualmente uma característica própria dos doentes que sofrem de carcinoma nasofaríngeo ou apresentam reativação. Várias semanas após a infecção primária, aparecem os anticorpos dirigidos contra o antigénio nuclear 1 do EBV (EBNA1) e permanecem detectáveis toda a vida, embora possam desaparecer em caso de imunossupressão do doente. Isoladamente, ou em combinação com os anticorpos IgG anti-VCA, são considerados um marcador de infecção passada. Observa-se frequentemente um decline de IgG anti-EBNA1 após a reativação do vírus. Isto é normalmente acompanhado por um aumento da atividade de IgG anti-VCA, enquanto os anticorpos contra o antigénio inicial reaparecem. Os resultados próximos dos valores-limite no teste SERION ELISA classic EBNA1 IgG, em combinação com resultados positivos no SERION ELISA classic EBV VCA IgG, são interpretados como positivos e comprovam infecções há muito passadas. A tabela que se segue indica as várias combinações possíveis de anticorpos e a sua interpretação. Esquema de interpretação básico Este esquema de interpretação básico destina-se sobretudo à distinção entre um estado imunitário seronegativo, infecção primária e infecção passada, utilizando os quatro mais importantes marcadores serológicos IgG anti-EA, IgG anti-VCA, IgM anti-VCA e IgG anti-EBNA1:

IT

P

T

português 14

EA IgG VCA IgM VCA IgG EBNA1 IgG Interpretação

- - - - seronegatividade

+ - - -

infecção aguda / recente

- + - -

+ + - -

+ + + -

+ - + -

- + + -

- - + -

- - + + infecção passada

- - - +

++ - ++ + reativação

++ + ++ +

Não podem ser excluídas reações cruzadas com anticorpos dirigidos contra outros vírus herpes (por exemplo, CMV, HSV, VZV).


8.7 Intervalo de referência de indivíduos saudáveis

A análise de soros de doadores de sangue aleatórios, coletados na região sul da Alemanha, com o teste SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus revelou a seguinte distribuição. Pos : 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Refer enzbereich gesunder Probanden @ 12\mod_1380024245277_38.doc @ 58094 @

SERION ELISA classic número negativo no valor limite positivo

EBV VCA IgG 131 3 (2,3 %) 2 (1,5 %) 126 (96,2 %)

EBV VCA IgM 131 131 (100 %) - -

EBV EBNA 1 IgG 131 11 (8,4 %) - 120 (91,6 %)

EBV EA IgG 131 92 (70,2 %) 11 (8,4 %) 28 (21,4 %)


português 15

9 CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO Pos : 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift: Sensiti vität und Spezi fität @ 0\mod_1190013251494_38.doc @ 9929 @ 2

9.1 Sensibilidade e especificidade Pos : 43 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Sensi ti vität und Spezifi tät @ 15\mod_1421417016940_38.doc @ 66953 @

Os testes SERION ELISA classic EBV VCA IgG, IgM e SERION ELISA classic EBV EBNA-1 IgG foram validados num estudo interno. 155 amostras de soro, cada uma coletada de dadores negativos em todos os testes serológicos e de pacientes com infecção aguda ou anterior por EBV, foram analisadas usando um teste ELISA de um fabricante principal europeu como referência. As características de desempenho do teste SERION ELISA classic EBV EA IgG foram avaliadas num estudo interno com base na análise de 96 amostras de soro de dadores de sangue saudáveis e de pacientes com suspeita de infecção aguda por EBV. Dois testes ELISA e um teste de immunoblotting de fabricantes principais europeus foram usados como referência.

Sensibilidade Especificidade





Os soros classificados como estando nos valores-limite não foram incluídos no cálculo da sensibilidade e da especificidade. Pos : 44 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift Präzisi on @ 0\mod_1184676568397_38.doc @ 2122 @ 2

9.2 Reprodutibilidade Pos : 45 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Präzision @ 14\mod_1404457829683_38.doc @ 62010 @


Amostra Valor médio

(OD)

Intra-ensaio

CV (%)

Valor médio

(OD)

Interensaio

CV (%)

Soro 1 0,616 4,5 0,637 5,5

Soro 2 0,746 5,3 0,814 6,6

Soro 3 2,125 3,0 2,191 2,8



(OD)

Intra-ensaio

CV (%)

Valor médio

(OD)

Interensaio

CV (%)

Soro 1 0,530 8,7 0,551 7,2

Soro 2 1,582 5,1 1,703 6,4

Soro 3 2,249 7,9 2,311 8,7

IT

P

T

português 16



(OD)

Intra-ensaio

CV (%)

Valor médio

(OD)

Interensaio

CV (%)

Soro 1 0,554 2,2 0,644 7,1

Soro 2 1,355 2,4 1,510 4,5

Soro 3 1,437 3,0 1,636 4,5



(OD)

Intra-ensaio

CV (%)

Valor médio

(OD)

Interensaio

CV (%)

Soro 1 0,305 2,8 0,341 8,4

Soro 2 0,952 2,5 1,093 4,1

Soro 3 1,622 3,1 1,799 4,2 Pos : 46 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Allgemei ne Texte ELISA classic/Sicherheitsmaßnahmen @ 12\mod_1374740573162_38.doc @ 57170 @ 122

10 MEDIDAS DE SEGURANÇA

10.1 Advertências e medidas de precaução

O SERION ELISA classic destina-se a ser utilizado unicamente por pessoal especializado, que domine por completo as técnicas de trabalho. A manipulação dos reagentes do teste e das amostras dos pacientes devem seguir os princípios das boas práticas de laboratório. - Este kit contém componentes de soros humanos. Embora todos os soros de controle

sejam negativos para Ac anti-HIV, Ag HBs (antígeno de superfície do vírus da hepatite B) e Ac anti-HCV, eles deverão ser considerados potencialmente infecciosos.

- Não pipetar com a boca.

- Nas áreas onde se trabalha com reagentes de teste ou com amostras de pacientes, não deverá ser permitido comer, beber ou fumar.

- Na manipulação de reagentes do teste e de amostras de pacientes, deve-se utilizar jaleco de laboratório, luvas descartáveis e óculos de proteção. A seguir, lavar muito bem as mãos.

- As amostras dos pacientes e todos os materiais potencialmente infecciosos deverão ser descontaminados após a realização do teste.

- Guardar os reagentes fora do alcance de crianças.

10.2 Eliminação de resíduos

Observar as respectivas disposições legais vigentes. Pos : 47 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Liter atur/Liter atur @ 13\mod_1396939862911_38.doc @ 59084 @ 1

11 REFERÊNCIAS As referências para o SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus encontram-se no fim destas instruções de uso. === Ende der Liste für T extmar ke Inhalt ===


Epstein-Barr Virus VCA IgG/IgM, Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG, Epstein-Barr Virus EA IgG ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ

1 ΠΡΟΟΡΙΖΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ

2 ∆ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΣΧΕΤΙΚΟΤΗΤΑ

3 ΑΡΧΗ ∆ΟΚΙΜΑΣΙΑΣ SERION ELISA classic

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΚΑΙ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ KIT

5 ΥΛΙΚΟ ΠΟΥ ΑΠΑΙΤΕΙΤΑΙ ΑΛΛΑ ∆ΕΝ ΠΑΡΕΧΕΤΑΙ

6 ΦΥΛΑΞΗ ΚΑΙ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ

7 ∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ ∆ΟΚΙΜΑΣΙΑΣ SERION ELISA classic

7.1 Ενδείξεις ελάττωσης ποιότητας

7.2 Προετοιµασία δείγµατος και φύλαξη

7.3 Προετοιµασία των αντιδραστηρίων του κιτ

7.4 Επισκόπηση - ∆ιαδικασία δοκιµασίας

7.5 Χειροκίνητη διαδικασία δοκιµασίας

7.6 Αυτόµατη διαδικασία δοκιµασίας

7.7 Θετικός έλεγχος/ Έλεγχος ακρίβειας

7.8 ∆ιαγνωστική ΕΝΥ

8 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ∆ΟΚΙΜΑΣΙΑΣ


8.2 Εύρος οριακών τιµών

8.3 Όρια ποσοτικού προσδιορισµού

8.4 Αυτοµατοποιηµένη Αξιολόγηση / λογισµικό

8.5 Κριτήρια ισχύος δοκιµασίας

8.6 Ερµηνεία των αποτελεσµάτων

8.7 Εύρος αναφοράς υγιών ατόµων

9 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟ∆ΟΣΗΣ

9.1 Ευαισθησία και Ειδικότητα

9.2 Επαναληψιµότητα

10 ΜΕΤΡΑ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ

10.1 Προειδοποιήσεις/ Προφυλάξεις

10.2 ∆ιάθεση

11 ΑΝΑΦΟΡΕΣ

Αναπροσαρµογές Τρέχουσα έκδοση Αριθµ.: V 136.23

Προηγούµενη έκδοση: V 22.11/12-1

Αναπροσαρµογή στην παράγραφο: Γενική αναπροσαρµογή

G

R

Ελληνικά 2



Ενζυµο-ανοσολογική δοκιµή για ανίχνευση ανθρώπινων αντισωµάτων

για διαγνωστική χρήση in vitro Pos : 3 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Bes tell nummern/EBV: Bes tellnummern @ 0\mod_1188368235293_53.doc @ 6497 @

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG Αριθµ. Παραγγελίας: ESR1361G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgM Αριθµ. Παραγγελίας: ESR1361M

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG Αριθµ. Παραγγελίας: ESR1362G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG Αριθµ. Παραγγελίας: ESR1363G

Pos: 4 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Allgemeine Texte ELISA classic/Kapitelüberschrift "Anwendungsbereich" @ 0\mod_1177351044007_53.doc @ 177 @ 1 1 ΠΡΟΟΡΙΖΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Pos : 5 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Anwendungsber eich/EBV: Anwendungsbereich @ 14\mod_1404456157024_53.doc @ 61977 @

Οι δοκιµασίες SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG, VCA IgG, IgM και EBNA1 IgG είναι ποσοτικές και ποιοτικές ανοσολογικές µέθοδοι για την ανίχνευση ανθρωπίνων αντισωµάτων στον ορό ή το πλάσµα τα οποία κατευθύνονται ενάντια σε στοιχεία στου ιού Epstein-Barr (EBV). Τα SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG και SERION ELISA classic EBV VCA IgM συνιστώνται για τον προσδιορισµό οξειών λοιµώξεων ή επανενεργοποιήσεων. Το SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG προσδιορίζει πρωτοπαθείς και πρόσφατες λοιµώξεις. Το SERION ELISA classic EBNA1 IgG συνιστάται για τον καθορισµό προηγούµενων λοιµώξεων. Οι δοκιµασίες SERION ELISA classic EBV VCA και EBNA1 IgG είναι επικυρωµένες για την ανίχνευση αντισωµάτων που παράγονται ενδορραχιαία για διαγνωστική του εγκεφαλονωτιαίου υγρού (ΕΝΥ). Pos : 6 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/Kapitelüberschrif t "Diag nostische Bedeutung" @ 0\mod_1177351537598_53.doc @ 228 @ 1

2 ∆ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΣΧΕΤΙΚΟΤΗΤΑ Pos : 7 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Di agnostische Bedeutung/EBV: Diagnostische Bedeutung @ 15\mod_1421651635398_53.doc @ 66977 @

Ο ιός Epstein - Barr (EBV) είναι ένας ανθρώπινος παθογόνος ιός ο οποίος ανήκει στην οικογένεια των ερπητοϊών. Εµφανίζεται παγκοσµίως και, όπως όλοι οι ερπητοϊιοί, η συχνότητα εµφάνισης στο γενικό πληθυσµό είναι αυξηµένη, φτάνοντας το 90 έως 95% στον ενήλικο πληθυσµό. Στις λεγόµενες υποανάπτυκτες χώρες, η πρωτοπαθής λοίµωξη συµβαίνει γενικά το πρώτο έτος ζωής και είναι συχνά ασυµπτωµατική. Αντιθέτως, σε χώρες µε υψηλά πρότυπα υγιεινής η πρωτοπαθής λοίµωξη συµβαίνει κυρίως σε εφήβους και νέους ενήλικες. Η κορύφωση της πρώτη λοίµωξης σε σχέση µε την ηλικία βρίσκεται σε νέους µεταξύ 15 και 20 ετών και περίπου το 50% των µολυσµένων ατόµων αναπτύσσουν λοιµώδη µονοπυρήνωση. Η µετάδοση γίνεται κυρίως µέσω του σιέλου, ωστόσο είναι πιθανές και άλλες οδοί όπως από προϊόντα αίµατος και µεταµόσχευση µυελού των οστών. Κατά τη διάρκεια της πρωτοπαθούς λοίµωξης προσβάλλονται αρχικά οι σιελογόνοι αδένες και ο ιός φτάνει στη µύτη και τον τράχηλο µέσω του σιέλου. Σε αυτό το στάδιο, τα συµπτώµατα της λοίµωξης είναι όµοια της γρίπης. Ο ιός διασπείρεται σε όλο το σώµα µέσω µολυσµένων Β-λεµφοκυττάρων, τα οποία ρυθµίζονται κανονικά από το ανοσοποιητικό σύστηµα όµως διεγείρονται να πολλαπλασιαστούν από τον ιό. Αυτά τα µολυσµένα Β-κύτταρα στο περιφερικό αίµα είναι χαρακτηριστικά, άτυπα λεµφοκύτταρα µε ποικιλοµορφία, έντονα βασεόφιλο κυτόπλασµα και ορατούς πυρήνες. Στην πορεία της νόσου µπορούν να παρουσιαστούν υψηλός πυρετός, σπληνοµεγαλία, λεµφαδενίτιδα, θροµβοκυτταροπενία και ηπατίτιδα Λόγω του τρόπου εξάπλωσης του ιού κυρίως µέσω του σιέλου, η λοιµώδης µονοπυρήνωση (ΙΜ) ή ο αδενικός πυρετός ονοµάζεται επίσης «νόσος του φιλιού» (kissing disease). Σε σπάνιες περιπτώσεις µπορεί µία

Ελληνικά 3

οξεία λοιµώδη µονοπυρήνωση να οδηγήσει σε χρόνια ενεργή νόσο. Σε αυτές τις περιπτώσεις παραµένουν επί µεγαλύτερο χρονικό διάστηµα τα συµπτώµατα της λοιµώδους µονοπυρήνωσης. Η παθογένεση αυτής της επιπλοκής δεν είναι σαφής, ως πιθανές αιτίες θεωρούνται µία γενετική προδιάθεση και/ή η λοίµωξη µε έντονα λυτικά είδη ιών. Σε ορισµένες γεωγραφικές περιοχές ο EBV σχετίζεται έντονα µε την εµφάνιση του καρκίνου του ρινοφάρυγγα. Αυτός ο καρκίνος του φάρυγγα, µύτης και τραχήλου συνίσταται από αδιαφοροποίητα επιθηλιακά κύτταρα και έχει την τάση τα µεθίσταται. Αυτή η νόσος εµφανίζεται παγκοσµίως, όµως είναι ιδιαίτερα συχνή σε ορισµένες περιοχές της νότιας Κίνας. Η γενετική προδιάθεση όπως επίσης και περιβαλλοντολογικοί παράγοντες όπως η δίαιτα συζητούνται ως συνοδευτικοί παράγοντες. Το λέµφωµα Burkitt (BL) είναι επίσης ένας όγκος ό οποίος σχετίζεται µε τον EBV, κυρίως στις γεωγραφικές περιοχές της Αφρικής και της Παπούα Νέα Γουινέας. Αυτός ο µονοκλωνικός Β-κυτταρικός όγκος συνδέεται επίσης µε περιοχές µε υψηλή εµφάνιση ελονοσίας και πάνω από 90% αυτών των όγκων εµφανίζουν παρουσία ιού E-B. Η επιρροή λοιµώξεων µε πλασµώδιο στην ανοσολογική απάντηση φέρνει το ρόλο της ελονοσίας ως συνοδευτικό παράγοντα για BL στη συζήτηση. Σποραδικές περιπτώσεις BL υπάρχουν και σε άλλες περιοχές, ωστόσο σε αυτές τις περιπτώσεις δεν ανιχνεύεται τόσο συχνά ο EBV και αναζητούνται και άλλοι συνοδευτικοί παράγοντες όπως γενετικές µεταβολές µέσω χρωµοσωµικής µετατόπισης για την αιτία εµφάνισης του όγκου. Πολύ νωρίς στη λοίµωξη παράγονται IgM ενάντια στο πρώιµο αντιγόνο (EA). Μέγιστες συγκεντρώσεις αντισωµάτων τείνουν να συµπίπτουν µε την έναρξη των συµπτωµάτων, και περίπου δύο εβδοµάδες µετά την έναρξη της λοίµωξης αρχίζει η παραγωγή EA IgG, VCA (Virus Capsid Antigen, Αντιγόνο καψιδίου ιού) IgM και VCA IgG. Οι υψηλότερες συγκεντρώσεις αντι-VCA IgM βρίσκονται περίπου τρεις εβδοµάδες µετά από την έναρξη των συµπτωµάτων. EA IgG ανιχνεύονται συχνά για αξιοσηµείωτο χρόνο µετά από τη λοίµωξη. ∆ιαδοχικά πέφτουν οι συγκεντρώσεις των αντισωµάτων VCA IgM και αργότερα των EA IgG. Τα αντι VCA IgG φτάνουν σε µία κορύφωση µετά από έξι εβδοµάδες µετά από την εµφάνιση των συµπτωµάτων και παραµένουν ισόβια σε υψηλά επίπεδα. Περίπου τρεις εβδοµάδες µετά την εµφάνιση των συµπτωµάτων τα αντισώµατα ΕΒNA1 IgG, τα οποία είναι δείκτης για προηγούµενη λοίµωξη, ξεκινούν να παράγονται και φτάνουν σε µία κορύφωση περίπου επτά µήνες µετά και παραµένουν σε θψηλά επίπεδα ισόβια µετά από µία φυσιολογική λοίµωξη EBV. Επανενεργοποίηση του ιού (όπως στην ανοσοκαταστολή) οδηγεί συνήθως σε σηµαντική αύξηση των αντισωµάτων EA IgG ενώ οι τίτλοι VCA IgM αυξάνονται σπάνια. Μόνο πολύ περιστασιακά, µετά από ανοσοκαταστολή, εξαφανίζεται το EBNA1 IgG, έτσι ώστε το EA IgG να είναι ένας καλός δείκτης για την επανενεργοποίηση. Pos : 8 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/T es tprinzip/Tes tpri nzip ELISA classic @ 4\mod_1255342796551_53.doc @ 21215 @ 1

3 ΑΡΧΗ ∆ΟΚΙΜΑΣΙΑΣ SERION ELISA classic

Tο ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) είναι µία ανοσολογική µέθοδος, η οποία είναι ειδικά προσαρµοσµένη για τον προσδιορισµό αντισωµάτων στο πεδίο της λοιµωξιολογικής ορολογίας. Η αντίδρασης βασίζεται στην ειδική αλληλεπίδραση των αντισωµάτων µε τα αντίστοιχα αντιγόνα τους. Οι ταινίες της δοκιµασίας SERION ELISA classic πλάκα µικροτιτλοποίησης είναι επικαλυµµένες µε ειδικά αντιγόνα του παθογόνου ενδιαφέροντος. Εάν υπάρχουν αντισώµατα στον ορό του δείγµατος του ασθενή, αυτά συνδέονται µε το σταθερό αντιγόνο. Ένα δευτερεύον αντίσωµα, το οποίο έχει συµπλεχθεί µε το ένζυµο αλκαλική φωσφατάση, ανιχνεύει και συνδέεται µε το ανοσολογικό σύµπλεγµα. Το άχρωµο υπόστρωµα p-νιτροφαινολοφωσφορικό µετατρέπεται έπειτα στο έγχρωµο προϊόν p-νιτροφαινόλη. Η ένταση

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του σήµατος αυτού του προϊόντος αντίδρασης είναι ανάλογη µε τη συγκέντρωση του αναλύτη στο δείγµα και µετράται φωτοµετρικά. Pos: 9 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für nur ein Dokument/Inhalt und Zusammensetzung/EBV: Inhalt und Zusammensetzung @ 14\mod_1404461827273_53.doc @ 62085 @ 1

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ ΚΑΙ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ KIT Συστατικά της δοκιµασίας Τεµάχια / Όγκος Αποσπάσιµες ταινίες δοκιµασίας µικροτιτλοποίησης µε οκτώ επικαλυµµένες µε αντιγόνο µεµονωµένες κοιλότητες, (συνολικά 96) MTP , 1 πλαίσιο δοκιµασίας. Το υλικό επικάλυψης είναι απενεργοποιηµένο.

12 τεµάχια

Πρότυπος ορός (έτοιµος προς χρήση) STD , Ανθρώπινος ορός σε πρωτεϊνούχο ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών; αρνητικό για αντίσωµα αντι-HIV, αντιγόνο HBs (αντιγόνο επιφάνειας ηπατίτιδας B) και αντίσωµα αντι-HCV; συντηρητικό: < 0.1 % αζίδιο νατρίου; χρωστική: Αµαράνθη O

2 x 2 ml

Αρνητικός ορός ελέγχου (έτοιµος προς χρήση) NEG , Ανθρώπινος ορός σε πρωτεϊνούχο ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών; αρνητικό για αντίσωµα αντι-HIV, αντιγόνο HBs (αντιγόνο επιφάνειας ηπατίτιδας B) και αντίσωµα αντι-HCV; συντηρητικό: < 0.1 % αζίδιο νατρίου; χρωστική: Πράσινη λισσαµίνη V

2 ml

Αντι-ανθρώπινη IgA, IgG ή IgM σύζευξη (έτοιµη προς χρήση) APC , Αντι ανθρώπινο IgA, IgG ή IgM πολυκλωνικό αντίσωµα, συζευγµένο σε αλκαλική φωσφατάση, σταθεροποιηµένο σε πρωτεϊνούχο διάλυµα; συντηρητικό: < 0.1 % µεθυλισοθειαζολινόνη, < 0.1 % βρωµονιτροδιοξάνιο

13 ml

Συµπύκνωµα διαλύµατος πλύσης (επαρκές για 1000 ml) WASH , Χλωριούχο νάτριο µε Tween 20 και 30 mM Tris/HCl, pH 7,4; συντηρητικό: < 0.1 % αζίδιο νατρίου

33.3 ml

Ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης (έτοιµη προς χρήση) DILB ή ειδικό ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης S1 (έτοιµη προς χρήση) DILBS1 , (Ειδικό ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης για SERION ELISA classic EBV EA IgG. Ανακινείστε άµεσα πριν από τη χρήση!) Πρωτεϊνούχο ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών µε Tween 20 ( DILB ) και λύµα από E. coli ( DILBS1 ); συντηρητικό: < 0.1 % αζίδιο νατρίου, χρωστική: 0.01 g/l κυανούν της βρωµοφαινόλης.

2 x 50 ml

∆ιάλυµα διακοπής (έτοιµη προς χρήση) STOP , < 0.1 N υδροξείδιο του νατρίου, 40 mM EDTA

15 ml

Υπόστρωµα (έτοιµο προς χρήση) pNPP , Παρα-νιτροφαινυλοφωσφορικό σε ρυθµιστικό διάλυµα χωρίς διαλύτη; συντηρητικό: < 0.1 % αζίδιο νατρίου

13 ml

∆ίπλωµα ελέγχου ποιότητας µε πρότυπη καµπύλη και πίνακα τιµών INFO , (ποσοτικός προσδιορισµός αντισωµάτων σε IU/ml ή U/ml)

2 σελίδες


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5 ΥΛΙΚΟ ΠΟΥ ΑΠΑΙΤΕΙΤΑΙ ΑΛΛΑ ∆ΕΝ ΠΑΡΕΧΕΤΑΙ

- κοινός εργαστηριακός εξοπλισµός - για την ανίχνευση IgM: απορροφητικό Rf SERION, αριθµ. παραγγελίας Z200 (20 ml) - φωτόµετρο για πλάκες µικροτιτλοποίησης µε φίλτρο, µήκος κύµατος 405 nm, συνιστώµενο

µήκος κύµατος αναφοράς 620 nm - 690 nm (π.χ. 650 nm) - συσκευή πλύσης πλάκας µικροτιτλοποίησης - επωαστήρας 37 °C - θάλαµος υγρασίας - αποσταγµένο νερό - Συνδετήρες Click (αριθµ. παραγγελίας VT120) - Προαιρετικά: SERION ELISA control Pos : 11 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Lag erung und Hal tbar kei t/Lager ung und Haltbar keit @ 13\mod_1397031131719_53.doc @ 59215 @ 1

6 ΦΥΛΑΞΗ ΚΑΙ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ

Αντιδραστήριο Φύλαξη Σταθερότητα

Ταινίες µικροτιτλοποίησης (επικαλυµµένες µε αντιγόνο)

κλειστό

µετά το άνοιγµα στους 2 – 8 °C σε κλειστό περιέκτη αλουµινίου µε αποξηραντικό µέσο

βλέπε ηµεροµηνία λήξης

ελάχιστη διάρκεια ζωής τέσσερις εβδοµάδες

Οροί ελέγχου / Πρότυποι οροί

κλειστό / ΄µετά το άνοιγµα στους 2 – 8 °C βλέπε ηµεροµηνία λήξης

Σύζευξη κλειστό / ΄µετά το άνοιγµα στους 2 – 8 °C βλέπε ηµεροµηνία λήξης

Ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης

κλειστό / ΄µετά το άνοιγµα στους 2 – 8 °C


∆ιάλυµα πλύσης κλειστό / ΄µετά το άνοιγµα στους 2 – 8 °C

αραίωση εργασίας στους 2 – 8 °C

αραίωση εργασίας σε θερµοκρασία δωµατίου


2 εβδοµάδες

1 εβδοµάδα

Υπόστρωµα κλειστό / ΄µετά το άνοιγµα στους 2 – 8 °C βλέπε ηµεροµηνία λήξης

∆ιάλυµα διακοπής κλειστό / ΄µετά το άνοιγµα στους 2 – 8 °C



G

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Ελληνικά 6

7 ∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ ∆ΟΚΙΜΑΣΙΑΣ SERION ELISA classic Pos : 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Allgemeine Hi nweise ELISA cl assic @ 12\mod_1379504700667_53.doc @ 57735 @ 2

7.1 Ενδείξεις ελάττωσης ποιότητας

Τα βέλτιστα αποτελέσµατα µπορούν να επιτευχθούν µόνο εάν τηρούνται αυστηρά οι οδηγίες. Να χρησιµοποιείτε µόνο αντιδραστήρια SERION ELISA classic όταν χρησιµοποιείτε τις ανοσολογικές δοκιµασίες SERION ELISA classic. Τα συστατικά στοιχεία δεν πρέπει να αντικαθιστώνται από αντιδραστήρια άλλων κατασκευαστών. Οι πρότυποι οροί και οι οροί ελέγχου των ανοσολογικών δοκιµασιών SERION ELISA classic έχουν οριστεί ειδικά για το κιτ δοκιµασίας που πρόκειται να χρησιµοποιηθούν και δεν πρέπει να χρησιµοποιούνται µε άλλες παρτίδες. Το διάλυµα πλύσης, το υπόστρωµα και το διάλυµα διακοπής µπορούν να χρησιµοποιηθούν µε όλες τις ανοσολογικές δοκιµασίες SERION ELISA classic ανεξαρτήτως παρτίδας και δοκιµασίας.

Κάθε δοκιµασία SERION ELISA classic περιέχει ένα έτοιµο για χρήση ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης δειγµάτων. Σε ορισµένες περιπτώσεις απαιτείται η χρήση ειδικών ρυθµιστικών διαλυµάτων αραίωσης για τη διασφάλιση σταθερής ποιότητας και αξιόπιστων αποτελεσµάτων. Τα ρυθµιστικά διαλύµατα αραίωσης µπορούν να χρησιµοποιηθούν ανεξαρτήτως παρτίδων.

Υπάρχουν τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις σύζευξης για κάθε κατηγορία ανοσοσφαιρινών (IgA, IgG, IgM), επισηµασµένες στην ετικέτα ως + (χαµηλή), ++ (µέτρια) και +++ (υψηλή). Συζεύξεις µε την ίδια συγκέντρωση και της ίδιας κατηγορίας ανοσοσφαιρινών είναι εναλλάξιµες µεταξύ τους και µπορούν να χρησιµοποιηθούν για άλλες ανοσολογικές µεθόδους SERION ELISA classic ανεξαρτήτως παρτίδας και δοκιµασίας. Αραίωση εναλλαγή των αντιδραστηρίων είναι δυνατό να προκαλέσουν απώλεια της ευαισθησίας. Χρησιµοποιείτε άσηπτες τεχνικές όταν αποµακρύνετε τµήµατα από τους σωληνίσκους αντιδραστηρίων ώστε να αποφεύγεται η επιµόλυνση.

Η δυνατότητα αναπαραγωγής των αποτελεσµάτων της δοκιµασίας εξαρτάται από τη λεπτοµερή µίξη των αντιδραστηρίων . Ανακινείστε τις φιάλες που περιέχουν τους ορούς ελέγχου πριν από τη χρήση και επίσης όλα τα δείγµατα µετά από την αραίωση (π.χ. µε τη χρήση ενός αναµίκτη vortex).

Βεβαιωθείτε ότι πιπετάρετε προσεκτικά και σύµφωνα µε τους δεδοµένους χρόνους και τις θερµοκρασίες επώασης . Σηµαντικές χρονικές διαφορές µεταξύ του πιπεταρίσµατος της πρώτης και της τελευταίας κοιλότητας της πλάκας µικροτιτλοποίησης όταν διανέµονται δείγµατα και οροί ελέγχου, η σύζευξη ή το υπόστρωµα είναι δυνατό να οδηγήσουν σε διαφορετικούς χρόνους προεπώασης, οι οποίοι µπορούν να επηρεάσουν την ακρίβεια και τη δυνατότητα αναπαραγωγής των αποτελεσµάτων. Αποφύγετε την έκθεση των αντιδραστηρίων σε έντονο φως κατά τη διάρκεια της φύλαξης και επώασης.

Η επαρκής πλύση αποφεύγει τις µη ειδικεύσεις της δοκιµασίας. Για το λόγο αυτό, η διαδικασία πλύσης θα πρέπει να διεξάγεται προσεκτικά. Όλες οι κοιλότητες στον επίπεδο πυθµένα θα πρέπει να πληρώνονται µε όµοιους όγκους ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης. Στο τέλος της διαδικασίας εξασφαλίστε ότι οι κοιλότητες είναι πλήρως ελεύθερες από ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης προκειµένου να αποφευχθούν ανεξέλεγκτες επιδράσεις αραίωσης. Αποφύγετε τη δηµιουργία αφρού!

Τα αντιδραστήρια πρέπει να φυλάσσονται καλά κλεισµένα µετά από τη χρήση, ώστε να αποφεύγονται η εξάτµιση και η µόλυνσή τους. Προσέχετε να µη ανταλλάσσετε τα καπάκια των φιαλών και/ ή φιαλιδίων.

Η ανοσολογική µέθοδος SERION ELISA classic ισχύει µόνο εάν εκπληρώνονται τα ειδικά για την παρτίδα κριτήρια επικύρωσης στο πιστοποιητικό ποιοτικού ελέγχου. Pos : 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Probenvor ber. und Lager ung (für ALLE Err eger auß er Borreli a, CM V, FSM E, H SV,Masern,Mumps,R öteln,VZ V) @ 8\mod_1263998040982_53.doc @ 28437 @ 2

7.2 Προετοιµασία δείγµατος και φύλαξη

Λιπαιµικά, αιµολυµένα ή ικτερικά δείγµατα (ορός ή πλάσµα) θα πρέπει να δοκιµάζονται µόνο µε προσοχή. Τα προφανώς µολυσµένα δείγµατα δεν πρέπει να δοκιµάζονται. Ο ορός ή το πλάσµα (EDTA, κιτρικό άλας, ηπαρίνη) που συλλέγονται σύµφωνα µε τις πρότυπες εργαστηριακές µεθόδους είναι κατάλληλα δείγµατα. Τα δείγµατα δεν πρέπει να απενεργοποιούνται θερµικά. Pos : 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Kapi tel überschrift Probenverdünnung @ 0\mod_1184679414434_53.doc @ 2340 @ 3

Ελληνικά 7

7.2.1 Αραίωση των δειγµάτων Πριν τη διενέργεια της δοκιµασίας, τα δείγµατα του ασθενή (V1) πρέπει να αραιώνονται σε ρυθµιστικό διάλυµα (V2) ως εξής: Pos : 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung, T eil 1 @ 5\mod_1256050091616_53.doc @ 22825 @ SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG (ειδικό ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης B231-S1!)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG (ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης B231)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG (ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης B231)

Το ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης για το SERION ELISA classic EBV EA IgG (B231-S1) δεν αντικαθιστάται από το ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης SERION ELISA classic EBV VCA ή EBNA1.

V1 + V2 = 1 + 100 προσθήκη 10 µl δείγµα ασθενή

σε κάθε 1000 µl Ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης Pos : 17 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung, T eil 2 Ü berschrift @ 0\mod_1188369220721_53.doc @ 6557 @

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgM Pos : 18 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Probenver dünnung: R heumafaktor-Interferenz (für T ests mit IgM-Nachweis) @ 9\mod_1316422765852_53.doc @ 36514 @

Αλληλεπίδραση µε τους ρευµατοειδής παράγοντες Οι ρευµατοειδής παράγοντες είναι αυτοαντισώµατα, κυρίως της οµάδας IgM, τα οποία συνδέονται κατά προτίµηση µε τα IgG σε ανοσολογικά συµπλέγµατα. Η παρουσία µη ειδικών αντισωµάτων IgM (ρευµατοειδής παράγοντες) είναι δυνατό να οδηγήσουν σε ψευδώς θετικά αποτελέσµατα στη δοκιµασία IgM. Επιπλέον, υπάρχει η πιθανότητα, αυτά τα ασθενώς συνδεµένα ειδικά παθογόνα αντισώµατα IgM να εκτοπιστούν από ισχυρότερα δεσµευµένα αντισώµατα IgG οδηγώντας σε ψευδώς αρνητικό αποτέλεσµα IgM . Εποµένως είναι απαραίτητο να επεξεργάζονται εκ των προτέρων τα δείγµατα µε απορροφητή του ρευµατοειδή παράγοντα πριν από την ανίχνευση IgM (Απορροφητής ρευµατοειδή παράγοντα (SERION, Αριθµ. παραγγελίας: Z200 (20 ml/100 δοκιµασίες)). Η απορρόφηση Rf (ρευµατοειδή παράγοντα) εκτελείται µέσω επώασης του δείγµατος του ασθενή σε ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης για 15 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου ή κατά τη διάρκεια της νύχτας σε 4 °C. Η διαδικασία της δοκιµασίας περιγράφεται σε ένα ξεχωριστό εγχειρίδιο οδηγιών. Pos : 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung T eil 3 @ 5\mod_1256050082945_53.doc @ 22809 @

Πριν τη διενέργεια της δοκιµασίας, ο απορροφητής ρευµατοειδή παράγοντα (V1) πρέπει να αραιώνεται σε ρυθµιστικό διάλυµα (V2):

V1 + V2 = V3 (1 + 4) προσθήκη 200 µl Απορροφητής Rf

σε κάθε 800 µl Ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης

Τα δείγµατα ασθενών (V4) πρέπει να αραιώνονται σε αυτό το ρυθµιστικό διάλυµα Rf (V3):

V4 + V3 = 1+100 προσθήκη 10 µl δείγµα ασθενή

σε κάθε 1000 µl Ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης Pos : 20 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenver dünnung: Mischung der Proben @ 4\mod_1255343607624_53.doc @ 21295 @

Μετά από την αραίωση πριν το πιπετάρισµα στην πλάκα µικροτιτλοποίησης πρέπει τα δείγµατα πρέπει να αναµιγνύονται καλά, ώστε να προκύπτει ένα οµοιογενές διάλυµα. Pos : 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenlager ung @ 4\mod_1255343526141_53.doc @ 21279 @ 3

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Ελληνικά 8

7.2.2 Φύλαξη δειγµάτων Τα δείγµατα ασθενών δεν πρέπει να φυλάσσονται πάνω από 7 ηµέρες στους 2 – 8 °C. Παρατεταµένη φύλαξη είναι δυνατή ≤ -20 °C. Αποφύγετε επαναλαµβανόµενη ψύξη και απόψυξη των δειγµάτων. Αραιωµένα δείγµατα µπορούν να φυλαχθού στους 2 – 8 °C για µία εβδοµάδα. Pos: 22 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Testdurchführung/Reagenzienvorbereitung - KOMPLETT @ 12\mod_1379504953325_53.doc @ 57771 @ 23333333

7.3 Προετοιµασία των αντιδραστηρίων του κιτ

Προσαρµόστε όλα τα αντιδραστήρια σε θερµοκρασία δωµατίου πριν από τη δοκιµασία.

7.3.1 Ταινίες δοκιµασίας µικροτιτλοποίησης

Οι ταινίες δοκιµασίας µικροτιτλοποίησης που έχουν επισηµανθεί µε συντµήσεις για παθογόνο και κατηγορία ανοσοσφαιρινών, έχουν συσκευαστεί µαζί µε αποξηραντικό µέσο σε έναν περιέκτη αλουµινίου. Για να ανοίξετε τον περιέκτη αλουµινίου της πλάκας µικροτιτλοποίησης κόψτε µόνο την κορυφή στη σηµαδεµένη πλευρά, ώστε να µπορεί να ξανασφραγιστεί κατάλληλα. Πάρτε τις µη απαιτούµενες κοιλότητες από το πλαίσιο και επανατοποθετείστε τις στον περιέκτη αλουµινίου. Κλείστε τον περιέκτη προσεκτικά για να εξασφαλίσετε αεροστεγείς συνθήκες. Μη χρησιµοποιείτε τις ταινίες εάν ο περιέκτης αλουµινίου έχει υποστεί ζηµιά ή εάν ο περιέκτης µε τις υπολειπόµενες ταινίες και το αποξηραντικό µέσο δεν ξανασφραγίστηκε σωστά.

7.3.2 Οροί ελέγχου / Πρότυποι οροί (έτοιµη προς χρήση)

Οι οροί ελέγχου και οι πρότυποι οροί είναι έτοιµοι προς χρήση και δεν πρέπει να αραιωθούν περαιτέρω. Για κάθε κύκλο δοκιµασίας – ανεξαρτήτως του αριθµού ταινιών δοκιµασίας µικροτιτλοποίησης που χρησιµοποιούνται – πρέπει να συµπεριλαµβάνονται οι οροί ελέγχου και οι πρότυποι οροί. Οι πρότυποι οροί και οι οροί Cut off πρέπει να τοποθετούνται εις διπλούν . Μην επεξεργάζεστε τους ορούς ελέγχου µε απορροφητή Rf (ρευµατοειδή παράγοντα).

7.3.3 Αντι-ανθρώπινη IgA, IgG ή IgM σύζευξη AP (έτοιµη προς χρήση)

Η απαιτούµενη συγκέντρωση σύζευξης (+, ++, +++) επισηµαίνεται στο πιστοποιητικό ελέγχου ποιότητας. Ανατρέξτε επίσης στις προδιαγραφές της ετικέτας.

7.3.4 ∆ιάλυµα πλύσης (Συµπύκνωµα)

Αραιώστε το συµπύκνωµα του ρυθµιστικού διαλύµατος πλύσης (V1) 1:30 µε αποσταγµένο νερό σε τελικό όγκο V2. Παράδειγµα:

Συµπύκνωµα ρυθµιστικού διαλύµατος (V1)

Τελικός όγκος (V2)

33.3 ml 1.000 ml

1.0 ml 30 ml

7.3.5 Ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης για δείγµατα (έτοιµο προς χρήση)

7.3.6 Υπόστρωµα (έτοιµο προς χρήση)

Το υπόστρωµα είναι δυνατό να έχει µία ελαφρώς κίτρινη απόχρωση στην κλειστή φιάλη, πράγµα το οποίο δε µειώνει την ποιότητα του προϊόντος!

7.3.7 ∆ιάλυµα διακοπής (έτοιµο προς χρήση)


Ελληνικά 9

7.4 Επισκόπηση - ∆ιαδικασία δοκιµασίας



ποσοτική Σε περίπτωση ανίχνευσης IgM απορρόφηση ρευµατοειδή παράγοντα, βλέπε αριθµ. 7.2.1; Επώαση 15 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου ή κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4°C

αραίωση δείγµατος1 (δείγµατα ασθενών)


Πιπετάρετε αραιωµένα δείγµατα και έτοιµο προς χρήση ορό ελέγχου/ πρότυπο ορό στις κοιλότητες της µικροδοκιµασίας (100 µl)

ΕΠΩΑΣΗ 60 Min./ 37 °C θάλαµος υγρασίας

ΠΛΥΣΗ (4 x 300 µl DIL WASH )²

Πιπετάρετε διάλυµα σύζευξης APC (100 µl)


ΠΛΥΣΗ (4 x 300 µl DIL WASH )²

Πιπετάρετε διάλυµα υποστρώµατος pNPP (100 µl)


Πιπετάρετε διάλυµα διακοπής STOP (100 µl)

ΑΝΑΓΝΩΣΗ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ στα 405 nm

1Ειδικά ρυθµιστικά διαλύµατα αραίωσης για τις παρακάτω δοκιµασίες SERION ELISA classic:

Borrelia burgdorferi IgG, IgM, EBV EA IgG και ιός Hanta Puumala IgG, IgM

2Για χειροκίνητη χρήση:

χτυπήστε την πλάκα στο τέλος της διαδικασίας πλύσης σε µία χαρτοπετσέτα.


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7.5 Χειροκίνητη διαδικασία δοκιµασίας

1. Τοποθετήστε τον απαιτούµενο αριθµό κοιλοτήτων στο πλαίσιο και προετοιµάστε ένα φύλλο πρωτοκόλλου .

2. Προσθέστε από 100 µl αραιωµένου δείγµατος ή έτοιµο προς χρήση έλεγχο στις κατάλληλες κοιλότητες των ταινιών της δοκιµασίας µικροτιτλοποίησης. Αφήστε µία κοιλότητα κενή για το υπόστρωµα, π.χ. .:

κοιλότητα ποσοτική ELISA

A1 Υπόστρωµα ελεύθερο

B1 Αρνητικός έλεγχος

C1 Πρότυπος ορός

D1 Πρότυπος ορός

E1 Ασθενής 1....

F1 Ασθενής 2....

3. Επώαση δείγµατος για 60 λεπτά (+/- 5 min.) στους 37 °C (+/- 1°C) σε θάλαµο υγρασίας 4. Μετά από την επώαση πλύνετε όλες τις κοιλότητες µε διάλυµα πλύσης (µε αυτόµατο

πλύσης ή χειροκίνητα). - αναρροφήστε ή αδειάστε µε ανακίνηση το διάλυµα επώασης. - γεµίστε κάθε κοιλότητα µε 300 µl διάλυµα πλύσης - αναρροφήστε ή αδειάστε µε ανακίνηση το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης. - επαναλάβετε τη διαδικασία πλύσης 3 φορές (συνολικά 4 φορές!) - στεγνώστε χτυπώντας την πλάκα µικροτιτλοποίησης σε µία χαρτοπετσέτα

5. Προσθήκη της σύζευξης Προσθέστε 100 µl από την έτοιµη προς χρήση σύζευξη IgA/IgG/IgM στις κατάλληλες κοιλότητες (εξαίρεση κενό υποστρώµατος)

6. Επώαση σύζευξης για 30 λεπτά (+/- 1 min.) στους 37 °C (+/- 1 °C) σε θάλαµο υγρασίας 7. Μετά από την επώαση πλύνετε όλες τις κοιλότητες µε διάλυµα πλύσης (βλέπε παρακάτω) 8. Προσθήκη του υποστρώµατος

Προσθέστε 100 µl έτοιµο προς χρήση διάλυµα υποστρώµατος σε κάθε κοιλότητα (συµπεριλαµβανοµένου κενό υποστρώµατος!)

9. Επώαση υποστρώµατος για 30 λεπτά (+/- 1 min.) στους 37 °C (+/- 1 °C) σε θάλαµο υγρασίας

10. ∆ιακοπή της αντίδρασης Προσθέστε 100 µl διάλυµα διακοπής σε κάθε κοιλότητα, ανακινείστε ελαφρά την πλάκα µικροτιτλοποίησης για ανάµιξη.

11. Ανάγνωση απορρόφησης ∆ιαβάστε την οπτική πυκνότητα (OD) εντός 60 λεπτών στα 405 nm έναντι κενού υποστρώµατος, µήκος κύµατος αναφοράς µεταξύ 620 nm και 690 nm (π.χ. 650 nm).


7.6 Αυτόµατη διαδικασία δοκιµασίας

Το SERION ELISA είναι προσαρµοσµένο για την επεξεργασία σε αυτόµατα µηχανήµατα και ρυθµισµένα για τη χρήση µε Immunomat TM και Gemini καθώς επίσης και µε DYNEX DSX® και DS2®. Η αυτόµατη διαδικασία είναι ανάλογα σχεδιασµένη µε τη χειροκίνητη χρήση. Παρακαλώ λάβετε υπόψη ότι υπό ειδικές συνθήκες εργασίας, ίσως να είναι απαραίτητες εσωτερικές εργαστηριακές προσαρµογές των χρόνων επωάσεων υποστρώµατος. Pos : 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Positi vkontroll e / Richtigkeitskontroll e @ 8\mod_1260286311409_53.doc @ 27537 @ 2

Ελληνικά 11

7.7 Θετικός έλεγχος/ Έλεγχος ακρίβειας

Για την περιοδική επαλήθευση της µεθόδου δοκιµασίας, προκειµένου να ικανοποιηθούν οι απαιτήσεις συστηµάτων διαχείρισης εσωτερική εργαστηριακής ποιότητας, συνιστούµε τη χρήση ελέγχων SERION ELISA controls για τον καθαορισµό ακρίβειας και αξιοπιστίας των κύκλων δοκιµασίας SERION ELISA classic. Η χρήση ελέγχων SERION ELISA controls περιγράφεται σε ειδικά εγχειρίδια οδηγιών. Pos : 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Liquordi agnosti k ( für Borr elia + FSM E + VZV + EBV + Infl uenza) @ 9\mod_1271682242806_53.doc @ 32127 @ 2

7.8 ∆ιαγνωστική ΕΝΥ Οι δοκιµασίες SERION ELISA classic EBV VCA IgG, EBV EBNA1 IgG προορίζονται για τον προσδιορισµό ενδοραχιαίων αντισωµάτων στη διαγνωστική του ΕΝΥ και συνιστώνται για την ανίχνευση, όπως επίσης και για τη διαφοροποίηση, φλεγµονωδών διαδικασιών εντός του κεντρικού νευρικού συστήµατος (ΚΝΣ). Η διαδικασία της δοκιµασίας περιγράφεται σε ένα ξεχωριστό εγχειρίδιο οδηγιών. Ένα εργαλείο λογισµικού αξιολόγησης βασισµένο σε Excel υποστηρίζει τον υπολογισµό των δεικτών αντισωµάτων σύµφωνα µε ένα σχέδιο του Καθ. Hansotto Reiber. Pos : 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: TESTAU SWER TUNG + Erreg er @ 1\mod_1197038305478_53.doc @ 11393 @ 12

8 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ∆ΟΚΙΜΑΣΙΑΣ


Η προσαρµογή της µαθηµατικής καµπύλης για την ποσοτικοποίηση των αντισωµάτων µε ανοσολογικές µεθόδους SERION ELISA classic βασίζεται στη λειτουργία λογιστικής 4 παραµέτρων (4 PL). Οι 4 παράµετροι A, B, C και D είναι αντιπροσωπευτικές για την ακριβή µορφή της πρότυπης καµπύλης:

Παράµετρος A: Χαµηλότερη ασύµπτωτος (OD) Παράµετρος B: Κλίση της καµπύλης Παράµετρος C: Σηµείο καµπής Παράµετρος D: Ανώτερη ασύµπτωτος (OD)

Το Ινστιτούτο Virion\Serion ΕΠΕ υπολογίζει µία ειδική για την παρτίδα πρότυπη καµπύλη 4 PL για κάθε ανοσολογική µέθοδο SERION ELISA classic σε επαναλαµβανόµενους κύκλους δοκιµασίας υπό ιδανικές συνθήκες. Οι τέσσερις παράµετροι καθορίζονται στο πιστοποιητικό ελέγχου ποιότητας κάθε µεµονωµένης δοκιµασίας SERION ELISA classic. Για την προσαρµογή του επιπέδου δοκιµασίας στη δεδοµένη πρότυπη καµπύλη 4 PL, ο παράγοντας διόρθωσης F υπολογίζεται διαιρώντας την πρότυπη τιµή OD αναφοράς που υποδεικνύεται στο πιστοποιητικό ελέγχου ποιότητας µε τη µετρηµένη, και συνεπώς ειδική για τον κύκλο δοκιµασίας, πρότυπη τιµή OD. Πολλαπλασιάζοντας τις τιµές OD που ελήφθησαν από δείγµατα ασθενών µε τον παράγοντα διόρθωσης F, το επίπεδο κάθε µεµονωµένου κύκλου δοκιµασίας προσαρµόζεται στη δεδοµένη πρότυπη καµπύλη 4 PL. Εποµένως, οι παραλλαγές µεταξύ των µεθόδων αντισταθµίζονται για

)1)(

ln(1

)/(−

−∗

−−

=AFPatientOD

AD

BC

emlUActivity

valueODSTDmeasured


G

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Ελληνικά 12

και οι ενεργότητες αντισωµάτων µπορούν να αξιολογηθούν άµεσα από την πρότυπη καµπύλη 4 PL. Μετά από την αφαίρεση του κενού υποστρώµατος από όλες τις µετρηθείσες τιµές OD και τον υπολογισµό της µέσης τιµής OD του πρότυπου ορού (STD), που υποβάλλεται σε δοκιµασία εις διπλούν, ένα εύρος πιθανοτήτων διατίθεται για την αξιολόγηση των ενεργοτήτων αντισωµάτων από τα σήµατα οπτικής µέτρησης (OD) των δειγµάτων ασθενών. Αυτό περιγράφεται σε ξεχωριστά εγχειρίδια. Pos : 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estauswertung/Grenzwertber eich ( für T es te mehrerer Ig-Klassen) @ 12\mod_1375360254888_53.doc @ 57404 @ 2

8.2 Εύρος οριακών τιµών

Το εύρος οριακών τιµών της δοκιµασίας SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG, EBV EA IgG καθορίζονται στο πιστοποιητικό ελέγχου ποιότητας και εµφανίζουν το εύρος για τα οριακά αποτελέσµατα της δοκιµασίας. Τιµές κάτω από αυτό το εύρος υποδηλώνουν αρνητικό αποτέλεσµα δοκιµασίας, ενώ τιµές πάνω από το εύρος οριακών τιµών ερµηνεύονται ως θετικά. Pos : 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Quantifi zierungsgrenzen @ 6\mod_1258098664276_53.doc @ 24407 @ 2

8.3 Όρια ποσοτικού προσδιορισµού

Τα όρια ποσοτικού προσδιορισµού καθορίζονται στο πιστοποιητικό ελέγχου ποιότητας της δοκιµασίας SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG, EBV EA IgG. Η γραµµικότητα της αραίωσης εντός του εύρους έχει καταδειχτεί σε περιεκτικές µελέτες υπολογισµού. Σε περίπτωση που ένα δείγµα ασθενή παρουσιάζει αποτέλεσµα δοκιµασίας πάνω από το ανώτερο όριο του ποσοτικού προσδιορισµού, το δείγµα θα πρέπει να εξεταστεί σε υψηλότερη αραίωση. Η µε αυτόν τον τρόπο καθορισµένη δραστηριότητα αντισωµάτων πρέπει να πολλαπλασιάζεται µε τον πρόσθετο παράγοντα αραίωσης. Pos : 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Automatische Tes tauswertung @ 12\mod_1375166354143_53.doc @ 57325 @ 2

8.4 Αυτοµατοποιηµένη Αξιολόγηση / λογισµικό

Για την αυτοµατοποιηµένη αξιολόγηση σηµάτων οπτικής µέτρησης, το Λογισµικό SERION easyANALYZE, το λογισµικό SERION evaluate καθώς και το εργαλείο λογισµικού SERION activity που βασίζεται στο Microsoft® Excel®-είναι διαθέσιµα κατόπιν παραγγελίας. Pos : 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: Tes tgültig kei tskriterien @ 12\mod_1375166094763_53.doc @ 57307 @ 2

8.5 Κριτήρια ισχύος δοκιµασίας

- Το κενό υπόστρωµα πρέπει να είναι < 0.25 OD. - Ο αρνητικός έλεγχος πρέπει να παράγει αρνητικό αποτέλεσµα δοκιµασίας. - Κατά τη χρήση ποσοτικών δοκιµασιών SERION ELISA classic η µέση τιµή OD (µετά από

την αφαίρεση του κενού υποστρώµατος!) του πρότυπου ορού πρέπει να βρίσκεται εντός του εύρους ισχύος, το οποίο ορίζεται στο πιστοποιητικό ποιοτικού ελέγχου ειδικό για την παρτίδα.

- Ποιοτικό SERION ELISA classic: Η τιµή OD (οπτικής πυκνότητας) του θετικού ελέγχου και η µέση τιµή OD του ορού cut-off πρέπει να βρίσκονται εντός των τιµών ισχύος, οι οποίες ορίζονται από το πιστοποιητικό ποιοτικού ελέγχου του κιτ, ειδικό για την παρτίδα. (µετά από αφαίρεση του κενού υποστρώµατος!).

- Η µεταβολή των τιµών OD του πρότυπου ορού ή του ορού cut-off δεν µπορεί να είναι υψηλότερη από 20 %.

Εάν δεν τηρούνται αυτά τα κριτήρια, η δοκιµασία δεν έχει ισχύ και πρέπει να επαναλαµβάνεται. Pos : 36 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: Interpretation der Ergebnisse @ 0\mod_1190013774869_53.doc @ 9947 @ 2

Ελληνικά 13

8.6 Ερµηνεία των αποτελεσµάτων os: 37 /Arbeitsanleitung en ELISA classic/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Tes tauswertung/T estauswertung: Interpr etation der Ergebnisse @ 12\mod_1375363155925_53.doc @ 57420 @

Ένα θετικό αποτέλεσµα δοκιµασίας επιβεβαιώνει την παρουσία ειδικών αντισωµάτων. Ένα αρνητικό αποτέλεσµα υποδεικνύει απουσία κλινικά σηµαντικών αντισωµάτων κατά του παθογόνου στο δείγµα του ασθενούς, δεν αποκλείει ωστόσο το ενδεχόµενο οξείας λοίµωξης. Σε περίπτωση οριακού αποτελέσµατος, δεν µπορεί να γίνει αξιόπιστη αξιολόγηση. Οριστική διάγνωση επιτυγχάνεται µόνο µε την παράλληλη εξέταση ζευγών δειγµάτων ορού, τα οποία λήφθηκαν σε απόσταση µίας ή δύο εβδοµάδων. Pos : 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Inter pretation der Ergebnisse @ 15\mod_1421652419778_53.doc @ 66996 @

H διάγνωση της πρωτοπαθούς λοιµώδους µονοπυρήνωση (IM) γίνεται κυρίως µε την ανίχνευση αντισωµάτων πρώιµων αντιγόνων (EA) και ενάντια στο σύµπλεγµα πρωτεϊνών, το οποίο είναι γνωστό ως αντιγόνο καψιδίου του ιού (VCA), η σηµαντικότητα του οποίου είναι γνωστή για την ίδια χρονική στιγµή. Λίγο µετά από τη λοίµωξη εµφανίζονται αντισώµατα IgM τα οποία κατευθύνονται ενάντια σε EA και VCA και έπειτα, όταν αποκαθίσταται η οξεία λοίµωξη, ελαττώνονται ή εξαφανίζονται τελείως. Αντιθέτως, τα αντι-VCA IgG, τα οποία παράγονται σχεδόν την ίδια στιγµή, παραµένουν ισόβια, όµως τα επίπεδα της δραστηριότητας µπορεί µα διαφέρουν. Σε περίπτωση επανενεργοποίησης (για παράδειγµα µετά από ανοσοκαταστολή) υπάρχει σηµαντική αύξηση των επιπέδων και των δύο των αντι-EA IgG και αντι-VCA IgG, και σε σπάνιες περιπτώσεις µπορεί να είναι ανιχνεύσιµα VCA IgM. Ασθενείς µε λέµφωµα Burkitt και καρκίνο του ρινοφάρυγγα έχουν τα ίδια χαρακτηρισιτκά υψηλά επίπεδα VCA IgG όπως φαίνονται στις επανενεργοποιήσεις. Επιπλέον, η κατάδειξη αντισωµάτων VCA IgA υποστηρίζει την απόδειξη στη διάγνωση του ρινοφαρυγγικού καρκίνου. Αυξηµένα επίπεδα αντι-EA αντισωµάτων είναι οµοίως χαρακτηριστικά σε ασθενείς που πάσχουν από ρινοφαρυγγικό καρκίνο ή βρίσκονται σε επανενεργοποίηση. Αρκετές εβδοµάδες µετά από την πρωτοπαθή λοίµωξη εµφανίζονται τα αντισώµατα ενάντια στο πυρηνικό αντιγόνο 1 του EBV (EBNA1) και παραµένουν ανιχνεύσιµα ισόβια, αν και εξαφανίζονται σε ανοσοκατεσταλµένους ασθενείς. Μόνα, ή σε συνδυασµό µε τα αντισώµατα VCA IgG, θεωρούνται δείκτες για προηγούµενη λοίµωξη. Μία µείωση του EBNA1 IgG παρατηρείται συχνά µετά από επανενεργοποίηση του ιού. Αυτό συνοδεύεται συνήθως από αυξηµένη δραστηριότητα VCA IgG ενώ επανεµφανίζονται αντισώµατα ενάντια στα πρώιµα αντιγόνα. Οριακά αποτελέσµατα στη δοκιµασία SERION ELISA classic EBNA1 IgG σε συνδυασµό µε θετικά αποτελέσµατα στο SERION ELISA classic EBV VCA IgG ερµηνεύονται ως θετικά και αποδεικτικά για µία πολύ παλιά λοίµωξη. Στον παρακάτω πίνακα απαριθµούνται οι διάφοροι πιθανοί συνδυασµοί αντισωµάτων και η ερµηνεία τους. Βασικό σχήµα ερµηνείας Αυτό το βασικό σχήµα ερµηνείας είναι κυρίως για τη διαφοροποίηση µεταξύ µίας οροαρνητικής ανοσολογικής κατάστασης και προηγούµενης λοίµωξης χρησιµοποιώντας τους τέσσερις σηµαντικούς δείκτες EA IgG, VCA IgG, VCA IgM και EBNA1 IgG:

G

R

Ελληνικά 14

EA IgG VCA IgM VCA IgG EBNA1 IgG Ερµηνεία

- - - - οροαρνητικότητα

+ - - -

- οξεία /πρόσφατη λοίµωξη

- + - -

+ + - -

+ + + -

+ - + -

- + + -

- - + -

- - + + περασµένη λοίµωξη

- - - +

++ - ++ + επανενεργοποίηση

++ + ++ +

∆εν µπορούν να αποκλειστούν διασταυρούµενες αντιδράσεις µε αντισώµατα που κατευθύνονται ενάντια στους ιούς του έρπητα (π.χ. CMV, HSV, VZV).


8.7 Εύρος αναφοράς υγιών ατόµων

Η εξέταση τυχαία επιλεγµένων ορών αιµοδοτών, που συλλέχθηκαν στη νότια Γερµανία, µε δοκιµασίες SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus έδωσαν αποτελέσµατα στην εξής κατανοµή. Pos : 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Refer enzbereich gesunder Probanden @ 12\mod_1380024245277_53.doc @ 58097 @

SERION ELISA classic αριθµός αρνητικά οριακά θετικά

EBV VCA IgG 131 3 (2.3 %) 2 (1.5 %) 126 (96.2 %)

EBV VCA IgM 131 131 (100 %) - -

EBV EBNA 1 IgG 131 11 (8.4 %) - 120 (91.6 %)

EBV EA IgG 131 92 (70.2 %) 11 (8.4 %) 28 (21.4 %)


Ελληνικά 15

9 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟ∆ΟΣΗΣ Pos : 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift: Sensiti vität und Spezi fität @ 0\mod_1190013251494_53.doc @ 9932 @ 2

9.1 Ευαισθησία και Ειδικότητα Pos : 43 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Sensi ti vität und Spezifi tät @ 15\mod_1421417016940_53.doc @ 66956 @

Οι δοκιµασίες SERION ELISA classic EBV VCA IgG, IgM και SERION ELISA classic EBV EBNA-1 IgG επικυρώθηκαν σε µία εσωτερική µελέτη. Αναλύθηκαν 155 δείγµατα ορού, το καθένα από ορολογικά αρνητικούς αιµοδότες, καθώς και από ασθενείς µε οξεία και παρελθούσα λοίµωξη µε EBV, και µια δοκιµασία ELISA ενός κορυφαίου Ευρωπαϊκού κατασκευαστή χρησιµοποιήθηκε ως δοκιµασία αναφοράς. Τα χαρακτηριστικά απόδοσης της δοκιµασίας SERION ELISA classic EBV EA IgG αξιολογήθηκαν σε µια εσωτερική µελέτη µε την ανάλυση 96 δειγµάτων ορού υγιών αιµοδοτών και ασθενών µε πιθανολογούµενη λοίµωξη µε EBV. Ως δοκιµασίες αναφοράς χρησιµοποιήθηκαν δύο ανοσολογικές µέθοδοι ELISA και µια ανοσοστύπωση κορυφαίων Ευρωπαϊκών κατασκευαστών.

Ευαισθησία Εξειδίκευση





Οι οροί οι οποίοι ταξινοµήθηκαν ως οριακοί δεν συµπεριλήφθηκαν στους υπολογισµούς της ευαισθησίας και εξειδίκευσης. Pos : 44 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift Präzisi on @ 0\mod_1184676568397_53.doc @ 2125 @ 2

9.2 Επαναληψιµότητα Pos : 45 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Präzision @ 14\mod_1404457829683_53.doc @ 62013 @


∆είγµα Μέση τιµή

(OD)

Στην ίδια δοκιµασία

CV (%)

Μέση τιµή

(OD)

Μεταξύ δοκιµασιών

CV (%)

Ορός 1 0.616 4.5 0.637 5.5

Ορός 2 0.746 5.3 0.814 6.6

Ορός 3 2.125 3.0 2.191 2.8



(OD)


CV (%)

Μέση τιµή

(OD)


CV (%)

Ορός 1 0.530 8.7 0.551 7.2

Ορός 2 1.582 5.1 1.703 6.4

Ορός 3 2.249 7.9 2.311 8.7

G

R

Ελληνικά 16



(OD)


CV (%)

Μέση τιµή

(OD)


CV (%)

Ορός 1 0.554 2.2 0.644 7.1

Ορός 2 1.355 2.4 1.510 4.5

Ορός 3 1.437 3.0 1.636 4.5



(OD)


CV (%)

Μέση τιµή

(OD)


CV (%)

Ορός 1 0.305 2.8 0.341 8.4

Ορός 2 0.952 2.5 1.093 4.1

Ορός 3 1.622 3.1 1.799 4.2 Pos : 46 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Allgemei ne Texte ELISA classic/Sicherheitsmaßnahmen @ 12\mod_1374740573162_53.doc @ 57173 @ 122

10 ΜΕΤΡΑ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ 10.1 Προειδοποιήσεις/ Προφυλάξεις Το SERION ELISA classic σχεδιάστηκε για τη χρήση από εκπαιδευµένο προσωπικό το οποίο είναι καλά εξοικειωµένο µε τις εργαστηριακές πρακτικές. Όλα τα αντιδραστήρια του κιτ και τα ανθρώπινα δείγµατα θα πρέπει να χειρίζονται µε προσοχή, χρησιµοποιώντας τις καθιερωµένες πρακτικές εργαστηριακές µεθόδους. - Αυτό το κιτ περιέχει στοιχεία ανθρώπινου αίµατος. Αν και όλοι οι οροί ελέγχου και οι οροί

cut-off έχουν εξεταστεί και βρέθηκαν αρνητικοί για το αντίσωµα αντι--HIV, αντιγόνο HBs (αντιγόνο επιφάνειας ιός ηπατίτιδας Β) και αντίσωµα αντι-HCV, θα πρέπει να θεωρούνται δυνητικά µολυσµατικοί.

- Μην πιπετάρετε µε το στόµα.

- Μην καπνίζετε, τρώτε ή πίνετε σε περιοχές στις οποίες χειρίζεστε δείγµατα οι αντιδραστήρια του κιτ.

- Φοράτε γάντια µίας χρήσης, προστατευτικά ρούχα και γυαλιά κατά τη διάρκεια χειρισµού των αντιδραστηρίων του κιτ ή των δειγµάτων. Πλύνετε σχολαστικά τα χέρια σας µετά από το χειρισµό.

- Το υλικό των ασθενών και άλλο δυνητικά µολυσµατικό υλικό θα πρέπει να απολυµαίνεται µετά από κάθε κύκλο δοκιµασίας.

- Τα αντιδραστήρια θα πρέπει να φυλάσσονται µε ασφάλεια και να µη µπορούν να τα προσεγγίσουν αναρµόδια άτοµα, π.χ. παιδιά.

10.2 ∆ιάθεση

Παρακαλώ λάβετε υπόψη τις σχετικές νοµικές απαιτήσεις! Pos : 47 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Liter atur/Liter atur @ 13\mod_1396939862911_53.doc @ 59087 @ 1

11 ΑΝΑΦΟΡΕΣ Αναφορές στη SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus βρίσκονται στο τέλος των οδηγιών χρήσης. === Ende der Liste für T extmar ke Inhalt ===


Epstein-Barr Virus VCA IgG/IgM, Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG, Epstein-Barr Virus EA IgG OBSAH

1 POUŽITÍ

2 DIAGNOSTICKÁ RELEVANCE

3 PRINCIP TESTU SERION ELISA classic

4 SLOŽENÍ KITU

5 POŽADOVANÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ PŘEDMĚTEM DODÁVKY

6 UCHOVÁVÁNÍ A STABILITA

7 SERION ELISA classic - POSTUP PŘI TESTU

7.1 Důkaz o zhoršení kvality

7.2 Příprava vzorku a uchovávání

7.3 Příprava reagencií soupravy

7.4 Přehled – pracovní postup

7.5 Postup při ručním zpracování testu:

7.6 Postup při automatickém zpracování testu

7.7 Pozitivní kontrola/kontrola přesnosti

7.8 Diagnostika mozkomíšního moku (CSF)

8 HODNOCENÍ TESTU


8.2 Hraniční rozpětí

8.3 Meze kvantifikace

8.4 Automatizované hodnocení / Software

8.5 Kritéria validity

8.6 Interpretace výsledků

8.7 Referenční rozsah zdravých jednotlivců

9 CHARAKTERISTIKY VÝSLEDKŮ

9.1 Citlivost a specifičnost

9.2 Reprodukovatelnost

10 BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ

10.1 Výstražná upozornění

10.2 Likvidace

11 ODKAZY

Upřesnění Číslo aktuální verze: V 136.23

Předchozí verze: V 22.11/12-1

Upřesnění v odstavci : Celková aktualizace

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česky 2



Enzymová imunoanalýza ke stanovení humánních protilátek pro použití v diagnostice in vitro

Pos: 3 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für nur ein Dokument/Bestellnummern/EBV: Bestellnummern @ 0\mod_1188368235293_73.doc @ 6501 @ SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG Kat. č.: ESR1361G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgM Kat. č.: ESR1361M

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG Kat. č.: ESR1362G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG Kat. č.: ESR1363G

Pos: 4 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Allgemeine Texte ELISA classic/Kapitelüberschrift "Anwendungsbereich" @ 0\mod_1177351044007_73.doc @ 181 @ 1 1 POUŽITÍ Pos : 5 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Anwendungsber eich/EBV: Anwendungsbereich @ 14\mod_1404456157024_73.doc @ 61981 @

Testy SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG, VCA IgG, IgM a EBNA1 IgG jsou kvantitativní a kvalitativní imunologická stanovení určená k detekci humánních protilátek v séru nebo plazmě proti komponentám viru Epstein-Barrové (EBV). Testy SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG a SERION ELISA classic EBV VCA IgM se doporučují k detekci akutní infekce nebo opakovaných aktivací. Test SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG stanovuje primární a odeznělé infekce. Test SERION ELISA classic EBNA1 IgG se doporučuje ke stanovení minulých infekcí. Testy SERION ELISA classic EBV VCA a EBNA1 IgG se validují k prokázání intratekálně syntetizovaných protilátek v diagnostice mozkomíšního moku (CSF). Pos : 6 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/Kapitelüberschrif t "Diag nostische Bedeutung" @ 0\mod_1177351537598_73.doc @ 232 @ 1

2 DIAGNOSTICKÁ RELEVANCE Pos : 7 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Di agnostische Bedeutung/EBV: Diagnostische Bedeutung @ 15\mod_1421651635398_73.doc @ 66981 @

Virus Epstein-Barrové (EBV) je humánní patogenní virus patřící do čeledi herpesvirů. Vyskytuje se celosvětově a společně se všemi herpesviry je prevalence v celkové populaci vysoká, dosahuje 90 až 95 % dospělé populace. V tzv. rozvojových zemích dochází k primární infekci obecně v prvním roce života a ta je často asymptomatická. Naproti tomu v zemích s vysokými standardy hygieny se primární infekce vyskytuje hlavně u mládeže do 20 let a mladých dospělých. Vrcholovým věkem pro infekci je období od 15 do 20 let a u přibližně 50 % infikovaných osob vzniká infekční mononukleóza. Přenos se uskutečňuje primárně výměnou slin, ačkoliv jsou možné i jiné cesty, například krevní preparáty nebo transplantace kostní dřeně. Během primární infekce jsou nejprve zasaženy slinné žlázy a virus se slinami dostává do nosu a krku. V tomto stádiu symptomy infekce odpovídají chřipkovému onemocnění. Virus se šíří lidským organismem infikovanými B lymfocyty, které jsou normálně regulovány imunitním systémem, ale jsou virem stimulovány k proliferaci. Tyto infikované B lymfocyty v periferní krvi jsou charakteristicky atypické s proměnlivým tvarem, rozlišitelnou bazofilní cytoplazmou a patrným jádrem. S postupujícím rozvojem onemocnění se může projevovat vysoká horečka, splenomegalie, lymfadenitida, trombocytopenie a hepatitida. Díky šíření viru a strategii přenosu primárně slinami, se infekční mononukleóza (IM) nebo glandulární horečka rovněž nazývají „nemoc z líbání“. Ve vzácných případech může infekce IM vést k chronickému stavu aktivní nemoci. V takových případech může IM přetrvávat po velmi dlouhou dobu. Patogeneze této komplikace je nejasná, ačkoliv existuje podezření na genetickou predispozici a/nebo infekci zvláště virulentním kmenem viru.

česky 3

V určitých zeměpisných oblastech je EBV těsně spojen s výskytem nasofaryngeálního karcinomu. Jedná se o karcinom hltanu, nosu a krku, který obsahuje nediferenciované epiteliální buňky a má přirozený sklon k tvorbě metastáz. Toto onemocnění se vyskytuje celosvětově, ale je zvláště časté v určitých oblastech jižní Číny. V současnosti se vedou diskuze o tom, zda genetická predispozice společně s aspekty prostředí, jako je strava, patří mezi spolupůsobící faktory. Burkittův lymfom (BL) je tumor spojovaný s EBV, primárně se vyskytuje v Africe a na Papui Nové Guinei. Tento tumor monoklonálních B-buněk je rovněž spojován s oblastmi vysoké incidence malárie a více než 90 % takových tumorů vykazuje přítomnost viru Epstein-Barrové. Vliv plasmodiové infekce na imunitní odezvu soustřeďuje diskuzi na úlohu malárie jakožto kofaktoru pro BL. Ke sporadickým případům BL dochází i v ostatních regionech, ovšem v takových případech je EBV mnohem méně často detekován a má se za to, že za tumor nesou odpovědnost další kofaktory, jako jsou genetické změny způsobené translokací chromozomu. IgM proti časnému antigenu (EA) jsou produkovány při infekci velmi brzy. Maximální koncentrace protilátek mají tendenci koincidovat s nástupem symptomů a přibližně za dva týdny po počáteční infekci začíná produkce EA IgG, VCA (Virus Capsid Antigen) IgM a VCA IgG. Nejvyšší koncentrace anti-VCA IgM se objevují přibližně za tři týdny od nástupu symptomů. EA IgG jsou často detekovatelné značnou dobu po infekci. Následně klesají koncentrace VCA IgM a později EA IgG protilátek. Anti-VCA IgG dosahují vrcholu za šest týdnů poté, co se objeví symptomy, a zůstávají ve vysokých hladinách po celý život. Přibližně za tři týdny poté, co se objeví symptomy, je zahájena tvorba protilátek EBNA1 IgG, které jsou indikátorem minulé infekce, a dosahují maxima přibližně za sedm měsíců a zůstávají celoživotně ve vysoké hladině po normální infekci EBV. Reaktivace viru (například imunosuprese) obvykle vede k významnému zvýšení protilátek EA IgG, zatímco titry VCA IgM rostou jen zřídka. Pouze velmi vzácně zmizí po imunosupresi EBNA1 IgG, proto jsou EA IgG dobrým markerem reaktivace.

Pos : 8 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/T es tprinzip/Tes tpri nzip ELISA classic @ 4\mod_1255342796551_73.doc @ 21219 @ 1

3 PRINCIP TESTU SERION ELISA classic

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay [enzymová imunosorpční kvantitativní analýza]) je imunologický test, který je zvláště vhodný ke stanovení protilátek v infekční sérologii. Reakce je založena na specifické interakci protilátek s příslušným antigenem. Testovací proužky mikrotitrační destičky SERION ELISA classic jsou pokryty specifickými antigeny vyšetřovaného patogenu. Pokud jsou ve vzorku séra pacienta přítomny protilátky, váží se na fixovaný antigen. Sekundární protilátka, která byla konjugována s enzymovou alkalickou fosfatázou, detekuje imunitní komplex a váže se na něj. Poté je bezbarvý substrát p-nitrofenylfosfát přeměněn na barevný produkt p-nitrofenol. Intenzita signálu tohoto reakčního produktu je přímo úměrná koncentraci analytu ve vzorku a měří se fotometricky. Pos : 9 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Inhalt und Z usammensetzung/EBV: Inhalt und Z usammensetzung @ 14\mod_1404461827273_73.doc @ 62089 @ 1

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4 SLOŽENÍ KITU Složky testu Kusy/ objem Oddělené proužky mikrotitračního testu, každý s osmi oddělitelnými jamkami potaženými antigenem, (společně 96) MTP , 1 rámeček. Materiál pro potažení je inaktivován.

12 kusů

Standardní sérum (připravené k použití) STD , Lidské sérum ve fosfátovém pufru s proteinem; negativní na protilátky proti HIV, HBs-Ag (povrchový antigen viru hepatitidy B) a proti HCV; konzervační prostředek: < 0,1% azid sodný; zbarvení: amaranth O

2 x 2 ml

Negativní kontrolní sérum (připravené k použití) NEG , Lidské sérum ve fosfátovém pufru s proteinem; negativní na protilátky proti HIV, HBs-Ag (povrchový antigen viru hepatitidy B) a proti HCV; konzervační prostředek: < 0,1% azid sodný; zbarvení: lisaminová zeleň V

2 ml

Protilátkový konjugát proti humánním IgA, IgG nebo IgM (připravený k použití) APC , Polyklonální protilátka proti humánním IgA, IgG nebo IgM, Konjugovaná s alkalickou fosfatázou, stabilizovaná roztokem obsahujícím protein; konzervační prostředek: < 0,1 % methylisothiazolon, < 0,1 % bromnitrodioxan

13 ml

Koncentrát promývacího roztoku (dostačuje pro 1000 ml) WASH , Roztok chloridu sodného s Tween 20 a 30 mM Tris/HCL, pH 7,4; konzervační prostředek: < 0,1% azid sodný

33.3 ml

Ředící pufr (připravené k použití) DILB nebo speciální ředící pufr S1 (připravené k použití) DILBS1 , (Speciální ředící pufr pro SERION ELISA classic, IgG EBV EA. Bezprostředně před použitím protřepejte!) Fosfátový pufr obsahující protein s Tween 20 ( DILB ) a lyzát E. coli ( DILBS1 ); konzervační prostředek: < 0,1% azid sodný; zbarvení: 0,01 g/l bromfenolová modř

2 x 50 ml

Zastavovací roztok (připravené k použití) STOP , < 0,1 N hydroxid sodný, 40 mM EDTA

15 ml

Substrát (připravený k použití) pNPP , Para-nitrofenylfosfát v pufru bez rozpouštědla; konzervační prostředek: < 0,1% azid sodný

13 ml

Osvědčení o kontrole kvality se standardní křivkou a vyhodnocovací tabulkou INFO , (kvantifikace protilátek v IU/ml nebo U/ml)

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5 POŽADOVANÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ PŘEDMĚTEM DODÁVKY

- běžné laboratorní vybavení - pro detekci IgM: SERION Rf-Absorbent (kat. č. Z200 (20 ml)) - spektrofotometr pro mikrotitrační desky s filtrem, vlnová délka 405 nm, doporučená

referenční vlnová délka 620 nm - 690 nm (např. 650 nm) - promývačka mikrotitrační desky - inkubátor 37 °C - zvlhčovací komora - destilovaná voda - uzavírací svorky (kat. č. VT120) - volitelné: SERION ELISA control Pos: 11 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Lagerung und Haltbarkeit/Lagerung und Haltbarkeit @ 13\mod_1397031131719_73.doc @ 59219 @ 1

6 UCHOVÁVÁNÍ A STABILITA

Reagens Uchovávání Stabilita

Mikrotitrační proužky (potažené antigenem)

neotevřené

po otevření při 2 - 8 °C v uzavřeném sáčku z hliníkové fólie s desikantem

viz datum exspirace

minimální trvanlivost: čtyři týdny

Kontrolní séra / standardní séra

neotevřené / po otevření při 2 - 8°C viz datum exspirace

Konjugát neotevřené / po otevření při 2 - 8°C viz datum exspirace

Ředící pufr neotevřené / po otevření při 2 - 8°C viz datum exspirace

Promývací roztok neotevřené / po otevření při 2 - 8°C

pracovní ředění při 2 - 8°C

pracovní ředění při pokojové teplotě

viz datum exspirace

2 týdny

1 týden

Substrát neotevřené / po otevření při 2 - 8°C

viz datum exspirace

Zastavovací roztok neotevřené / po otevření při 2 - 8°C

viz datum exspirace


7 SERION ELISA classic - POSTUP PŘI TESTU Pos : 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Allgemeine Hi nweise ELISA cl assic @ 12\mod_1379504700667_73.doc @ 57739 @ 2 Pos : 18 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Allgemeine Hi nweise ELISA cl assic @ 4\mod_1255343318159_73.doc @ 21267 @

7.1 Důkaz o zhoršení kvality

Optimálních výsledků lze dosáhnout pouze v případě, že budete pokyny přesně dodržovat. Při používání kvantitativní imunoanalýzy SERION ELISA classic používejte pouze reagencie SERION ELISA classic. Složky se nesmí vyměnit za reagencie od jiných výrobců. Standardní a kontrolní séra kvantitativních imunoanalýz SERION ELISA classic jsou definovány výlučně pro

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testovací soupravu, která bude použita, a nesmí se použít v jiných šaržích. Promývací roztok, substrát a zastavovací roztok lze používat se všemi kvantitativními imunoanalýzami SERION ELISA classic bez ohledu na šarži a test. Každý test SERION ELISA classic obsahuje ředicí pufr pro vzorky připravený k použití. V některých případech je nutné použít speciální ředicí pufry, aby byla zaručena konzistentní kvalita a spolehlivé výsledky. Ředicí pufry lze použít bez ohledu na šarže. Každá třída imunoglobulinů (IgA, IgG, IgM) má tři různé koncentrace konjugátů, které jsou na štítku označeny jako + (nízká), ++ (střední) a +++ (vysoká). Konjugáty o stejné koncentraci a pro stejnou třídu imunoglobulinů jsou vzájemně zaměnitelné a lze je použít pro ostatní imunoanalýzy SERION ELISA classic bez ohledu na šarži a test. Ředění či pozměňování reagencií může způsobit ztrátu citlivosti. Přemístění alikvotních množství ze zkumavek s reagenciemi provádějte aseptickými postupy, aby se zabránilo kontaminaci. Reprodukovatelnost výsledků testu je závislá na důkladném promíchání reagencií. Před použitím důkladně protřepejte lahvičky obsahující kontrolní séra a stejně tak postupujte u všech vzorků po naředění (např. pomocí vortexu). Dbejte na pečlivé pipetování a dodržování stanovených inkubačních časů a teplot. Významné časové rozdíly mezi pipetováním do první a poslední jamky mikrotitrační desky při dávkování vzorků/kontrolních sér, konjugátu či substrátu, mohou vést k různým „předinkubačním“ dobám, které mohou ovlivnit přesnost a reprodukovatelnost výsledků. Během skladování a inkubace chraňte reagencie před silným světlem. Adekvátní promývání zabraňuje nespecifickým výsledkům testů. Proto je zapotřebí při promývání postupovat pečlivě. Všechny jamky s plochým dnem se musí naplnit stejným objemem promývacího pufru. Na konci promývání dbejte na to, aby byl z jamek odstraněn veškerý promývací pufr, a aby nedošlo k efektům nekontrolovaného ředění. Zabraňte vzniku pěny! Reagencie musí být po použití pevně uzavřeny, aby se zabránilo odpařování a kontaminaci. Dávejte pozor na to, aby se nepomíchaly láhve nebo ampulky. Kvantitativní imunoanalýza SERION ELISA classic je platná pouze v případě, že budou splněna hodnotící kritéria specifická pro danou šarži, uvedená na osvědčení o kontrole kvality. Pos : 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Probenvor ber. und Lager ung (für ALLE Err eger auß er Borreli a, CM V, FSM E, H SV,Masern,Mumps,R öteln,VZ V) @ 8\mod_1263998040982_73.doc @ 28441 @ 2

7.2 Příprava vzorku a uchovávání

Lipemické, hemolytické nebo ikterické vzorky (sérum nebo plazma) by se měly testovat velmi opatrně. Očividně kontaminované vzorky by se testovat neměly. Mezi vhodné vzorky patří sérum nebo plazma (EDTA, citrát, heparin) odebrané podle standardních laboratorních postupů. Vzorky se nesmí tepelně inaktivovat. Pos : 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Kapi tel überschrift Probenverdünnung @ 0\mod_1184679414434_73.doc @ 2344 @ 3

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7.2.1 Ředění vzorků

Před prováděním testu se musí vzorky od pacienta naředit ředícím pufrem (V2) následujícím způsobem: Pos : 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung, T eil 1 @ 5\mod_1256050091616_73.doc @ 22829 @ SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG (speciální ředicí pufr B231-S1!)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG (ředicí pufr B231)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG (ředicí pufr B231) Ředicí pufr pro SERION ELISA classic EBV EA IgG (B231-S1) není zaměnitelný za ředicí pufr pro SERION ELISA classic EBV VCA nebo EBNA1.

V1 + V2 = 1 + 100 přidejte 10 µl vzorku od pacienta k 1000 µl ředícího pufru


SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgM

Pos : 18 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Probenver dünnung: R heumafaktor-Interferenz (für T ests mit IgM-Nachweis) @ 9\mod_1316422765852_73.doc @ 36518 @

Interference revmatoidního faktoru Revmatoidní faktory jsou autoprotilátky převážně třídy IgM, které se přednostně vážou na imunitní komplexy IgG. Přítomnost nespecifických protilátek IgM (revmatoidních faktorů) může vést k falešně pozitivním výsledkům v imunoanalýze IgM. Navíc je možné, že slabě se vážící, patogen specifické IgM protilátky jsou vytěsněny IgG protilátkami se silnější vazbou, což vede k falešně negativním výsledkům pro IgM. Proto je nezbytné vzorky před detekcí IgM předem upravit absorbentem revmatoidního faktoru (SERION Rf-Absorben, kat. č.: Z200 (20 ml/100 testů)). Absorpce Rf se provádí inkubací vzorku pacienta buď v ředícím pufru Rf po dobu 15 minut při pokojové teplotě, nebo přes noc při 4 °C. Postup testu je popsán v samostatném návodu k použití. Pos : 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung T eil 3 @ 5\mod_1256050082945_73.doc @ 22813 @

Před prováděním testu musí být absorbent revmatoidního faktoru (V1) naředěn 4 díly ředícího pufru (V2).

V1 + V2 = V3 (1 + 4) přidejte 200 µl Rf-absorbentu

k 800 µl ředícího pufru

Vzorky od pacienta (V4) musí být naředěny tímto Rf ředícím pufrem (V3):

V4 + V3 = 1+100 přidejte 10 µl vzorku od pacienta

k 1000 µl Rf ředícího pufru Pos : 20 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenver dünnung: Mischung der Proben @ 4\mod_1255343607624_73.doc @ 21299 @

Po naředění a před pipetováním na mikrotitrační destičku se vzorky musí důkladně promíchat, aby vznikl homogenní roztok. Pos : 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenlager ung @ 4\mod_1255343526141_73.doc @ 21283 @ 3

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7.2.2 Uchovávání vzorků Vzorky od pacienta by se neměly uchovávat déle než 7 dní při teplotě 2 až 8°C. Při teplotě ≤ -20 °C lze dobu uchovávání prodloužit. Chraňte vzorky před opakovaným zmrazováním a rozmrazováním. Naředěné vzorky lze skladovat po dobu jednoho týdne při teplotách od 2 do 8°C. Pos : 22 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Reagenzienvorberei tung - KOMPLETT @ 12\mod_1379504953325_73.doc @ 57775 @ 23333333

7.3 Příprava reagencií soupravy

Před prováděním testů nechte všechny reagencie dosáhnout pokojové teploty.

7.3.1 Proužky mikrotitračního testu

Proužky mikrotitračního testu označené zkratkami patogenu a třídy jsou baleny s vysušovacím činidlem v sáčku z hliníkové fólie. Sáček z hliníkové fólie mikrotitrační desky otevřete tak, že oddělíte pouze horní část vyznačené strany, aby bylo zaručeno, že jej bude možné znovu správně uzavřít. Z rámečku odstraňte nežádoucí kavity a vložte je zpět do hliníkového sáčku. Pečlivě sáček uzavřete, aby se zajistila vzduchotěsnost. Proužky nepoužívejte, bude-li hliníkový sáček poškozen nebo nebude-li sáček obsahující zbývající proužky a vysušovací činidlo řádně znovu uzavřen.

7.3.2 Kontrolní séra /standardní séra (připravený k použití)

Kontrolní a standardní séra jsou připravena k použití a nesmí se dále ředit. Do každého provedeného testu – nezávisle na počtu použitých proužků mikrotitračního testu – musí být zahrnuto kontrolní a standardní sérum. Standardní sérum a sérum pro stanovení horní a dolní meze normálních hodnot je třeba vytvořit dvojmo. Kontrolní séra nezpracovávejte Rf absorbentem.

7.3.3 Protilátkový konjugát proti humánním IgA, IgG nebo IgM (připravený k použití)

Potřebná koncentrace konjugátů (+, ++, +++) je vyznačena na osvědčení kontroly kvality. Viz též specifikace na štítku.

7.3.4 Promývací roztok (koncentrát)

Nařeďte koncentrát promývacího pufru (V1) 1:30 destilovanou vodou na konečný objem V2. Příklad:

Koncentrát pufru (V1) Konečný objem (V2)

33,3 ml 1000 ml

1,0 ml 30 ml

7.3.5 Ředící pufr pro vzorky (připravený k použití)

7.3.6 Substrát (připravený k použití)

Substrát v neotevřené lahvi může mít mírně nažloutlé zabarvení, které nesnižuje kvalitu přípravku!

7.3.7 Zastavovací roztok (připravený k použití)


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7.4 Přehled – pracovní postup



kvantitativní V případě detekční IgM absorpce revmatoidního faktoru viz odstavec 7.2.1;

Inkubace 15 minut při pokojové teplotě nebo přes noc při teplotě 4°C.

ředění vzorku 1 (vzorky od pacienta)


Pipetujte naředěné vzorky a kontrolní séra připravená k použití / standardní séra do mikrotitračních jamek (100 µl)

INKUBACE 60 minut /37 °C zvlhčovací komora

PROMÝVÁNÍ (4 x 300 µl DIL WASH )²

Pipetování roztoku konjugátu APC (100 µl)


PROMÝVÁNÍ (4 x 300 µl DIL WASH )²

Pipetování roztoku substrátu pNPP (100 µl)


Pipetování zastavovacího roztoku STOP (100 µl)

ODEČTENÍ EXTINKCE při 405 nm

1 Speciální ředící pufry pro následující testy SERION ELISA classic: IgG, IgM Borrelia burgdorferi, EBV EA IgG a IgG, IgM Hantavirus Puumala

2 Pro ruční použití:

na konci promývacího procesu vyklepněte destičku na papírový ručník.


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7.5 Postup při ručním zpracování testu:

1. Umístěte do rámečku požadovaný počet jamek a připravte si pipetovací protokol. 2. Do příslušných jamek proužků mikrotitračního testu přidejte 100 µl naředěného vzorku a

kontrolní séra připravená k použití. Jednu jamku nechte volnou pro holý substrát (blank), např.:

Jamka kvantitativní ELISA

A1 Holý substrát (blank)

B1 Negativní kontrolní sérum

C1 Standardní sérum

D1 Standardní sérum

E1 Pacient 1....

F1 Pacient 2....

3. Inkubace vzorku po dobu 60 minut (+/- 5 minut) při 37 ° C (+/- 1°C) ve zvlhčovací komoře 4. Po inkubaci promyjte všechny jamky promývacím roztokem (automatickou promývačkou

nebo manuálně): - odsajte nebo vytřepte inkubační roztok - naplňte každou jamku 300 µl promývacího roztoku - odsajte nebo vytřepte promývací pufr - opakujte promývací proces 3krát (dohromady 4krát!) - vysušte odkapáním mikrotitrační desky na filtračním papíru

5. Přidání konjugátu Přidejte 100 µl konjugátu IgA/IgG/IgM do příslušných jamek (s výjimkou holého substrátu (blanku))

6. Inkubace substrátu po dobu 30 minut (+/-1 minuta) při 37 °C (+/- 1 ° C) ve zvlhčovací komoře.

7. Po inkubaci promyjte všechny jamky promývacím roztokem (viz výše) 8. Přídavek substrátu

Přidejte 100 µl roztoku substrátu připraveného k použití do každé jamky (včetně jamky pro holý substrát (blank)!)

9. Inkubace substrátu po dobu 30 minut (+/-1 minuta) při 37 °C (+/- 1 °C) ve zvlhčovací komoře.

10. Zastavení reakce Přidejte 100 µl zastavovacího roztoku do každé jamky, jemně třepejte mikrotitrační destičkou pro lepší promíchání.

11. Odečtení extinkce Odečtěte optickou denzitu (OD) během 60 minut při vlnové délce 405 nm proti holému substrátu (blanku), referenční vlnová délka 620 nm a 690 nm( např. 650 nm).


7.6 Postup při automatickém zpracování testu

SERION ELISA je vhodná pro zpracování na automatech, vyhodnocení použití pomocí přístroje Immunomat™ a Gemini i DYNEX DSX® a DS2®. Automatické zpracování se provádí analogicky jako při manuálním použití. Prosím, nezapomeňte, že za zvláštních pracovních podmínek může být v laboratoři nezbytná vnitřní úprava inkubační doby substrátu. Pos : 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Positi vkontroll e / Richtigkeitskontroll e @ 8\mod_1260286311409_73.doc @ 27541 @ 2

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7.7 Pozitivní kontrola/kontrola přesnosti

Pro stanovení přesnosti a spolehlivosti průběhu testů SERION ELISA classic a periodické ověření testovací metody doporučujeme používat SERION ELISA controls, aby byly splněny požadavky vnitřních systémů řízení kvality laboratoře. Používání SERION ELISA controls je popsáno v příslušných návodech k použití. Pos : 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Liquordi agnosti k ( für Borr elia + FSM E + VZV + EBV + Infl uenza) @ 9\mod_1271682242806_73.doc @ 32131 @ 2

7.8 Diagnostika mozkomíšního moku (CSF) Testy SERION ELISA classic EBV VCA IgG, EBV EBNA1 IgG byly vyhodnoceny z hlediska stanovení intratekálních protilátek při diagnostice CSF a doporučují se k detekci a zároveň i diferenciaci zánětlivých procesů v centrálním nerovovém systému (CNS). Postup testu je popsán v samostatném návodu k použití. Výpočet indexů protilátek podle schématu profesora Hansotto Reibera je podporován vyhodnocovacím softwarem založeným na programu Excel. Pos : 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: TESTAU SWER TUNG + Erreg er @ 1\mod_1197038305478_73.doc @ 11397 @ 12

8 HODNOCENÍ TESTU


Matematické vyjádření křivky popisující kvantifikaci protilátek pomocí imunoanalýzy SERION ELISA classic je založeno na 4parametrové logistické funkci (4 PL). 4 parametry A, B, C a D jsou pro přesný tvar standardní křivky vypovídající:

Parametr A: Dolní asymptota (OD) Parametr B: Sklon křivky Parametr C: Bod zlomu Parametr D: Horní asymptota (OD)

Institut Virion\Serion GmbH stanoví 4 PL standardní křivku specifickou pro šarži pro každou imunoanalýzu SERION ELISA classic ve více chodech testu za optimálních podmínek testu. Čtyři parametry jsou uvedeny na osvědčení kontroly kvality každého jednotlivého testu SERION ELISA classic. Korekční faktor F pro úpravu úrovně testu na danou 4 PL standardní křivku se vypočítá vydělením standardní referenční hodnoty OD vyznačené na osvědčení kontroly kvality naměřenou a následně standardní hodnotou OD specifickou pro běh testu. Vynásobením hodnot OD získaných ze vzorků pacienta korekčním faktorem F se upraví úroveň každého individuálního chodu testu podle dané 4 PL standardní křivky. Tím se vykompenzují odchylky mezi analýzami a aktivity protilátek lze hodnotit přímo ze 4 PL standardní křivky. Po odečtení holého substrátu od všech naměřených hodnot OD a výpočtu průměrné hodnoty OD standardního séra (STD), které se testuje dvojmo, bude k dispozici rozsah možností pro vyhodnocení aktivit protilátek ze signálů optického měření vzorků pacienta. Ty jsou popsány v samostatných příručkách. Pos : 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estauswertung/Grenzwertber eich ( für T es te mehrerer Ig-Klassen) @ 12\mod_1375360254888_73.doc @ 57408 @ 2

)1)(

ln(1

)/(−

−∗

−−

=AFPatientOD

AD

BC

emlUActivity

valueODSTDmeasured


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8.2 Hraniční rozpětí

Hraniční rozpětí testu SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG, EBV EA IgG jsou stanovena na osvědčeních kontroly kvality a indikují rozpětí hraničních výsledků testů. Hodnoty pod tímto rozpětím indikují negativní výsledek testu; hodnoty nad hraničním rozpětím jsou vykládány jako pozitivní. Pos : 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Quantifi zierungsgrenzen @ 6\mod_1258098664276_73.doc @ 24411 @ 2

8.3 Meze kvantifikace

Meze kvantifikace jsou uvedeny na osvědčení kontroly kvality testu SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG, EBV EA IgG. Linearita ředění byla v tomto rozsahu prokázána komplexními hodnotícími studiemi. V případě, že vzorek pacienta dává výsledek testu nad horní mezí kvantifikace, vzorek lze testovat při vyšším ředění. Takto stanovená aktivita protilátek se musí vynásobit faktorem dodatečného ředění. Pos : 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Automatische Tes tauswertung @ 12\mod_1375166354143_73.doc @ 57329 @ 2

8.4 Automatizované hodnocení / Software

Software SERION easyANALYZE, software SERION evaluate a softwarový nástroj na bázi aplikace Microsoft® Excel® SERION activity jsou na požádání k dispozici pro automatické hodnocení signálů optického měření. Pos : 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: Tes tgültig kei tskriterien @ 12\mod_1375166094763_73.doc @ 57311 @ 2

8.5 Kritéria validity

- OD holého substrátu (blanku) musí být < 0,25

- Negativní kontrola musí dát negativní výsledek testu.

- Při použití kvantitativních testů SERION ELISA classic musí být průměrná hodnota extinkce standardního séra (po odečtení holého substrátu (blanku)!) v rozmezí validity, které je určeno konkrétním osvědčením kontroly kvality pro danou šarži

- Kvalitativní SERION ELISA classic: Hodnota extinkce pozitivní kontroly a průměrná hodnota OD séra pro stanovení dolní a horní meze normálních hodnot (cut-off) musí být (po odečtení holého substrátu (blanku)!) v rozmezí validity, které je určeno osvědčením kontroly kvality specifickým pro danou šarži

- Odchylka hodnot OD standardního séra nebo cut-off séra nesmí být vyšší než 20 %. Pokud tato kritéria nebudou splněna, test není platný a musí být opakován. Pos : 36 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: Interpretation der Ergebnisse @ 0\mod_1190013774869_73.doc @ 9951 @ 2

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8.6 Interpretace výsledků Pos : 37 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: Inter pretation der Ergebnisse @ 12\mod_1375363155925_73.doc @ 57423 @

Pozitivní výsledek potvrzuje přítomnost specifických protilátek. Negativní výsledek ukazuje, že ve vzorku od pacienta nejsou přítomny žádné klinicky významné protilátky proti patogenu, nevylučuje však možnost akutní infekce. Hraniční výsledek neumožňuje spolehlivé vyhodnocení. Definitivní diagnózu lze stanovit pouze paralelním testováním spárovaných vzorků séra odebraných v intervalech jednoho až dvou týdnů. Pos : 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Inter pretation der Ergebnisse @ 15\mod_1421652419778_73.doc @ 67000 @

Diagnóza primární infekční mononukleózy (IM) spočívá převážně v detekci protilátek proti časnému antigenu (EA) a proti proteinovému komplexu známému jako virový kapsidový antigen (VCA), jehož význam je již určitou dobu znám. Krátce po infekci se objeví protilátky IgM působící proti EA a VCA a poté, jakmile ustoupí akutní infekce, buď poklesnou nebo zcela vymizí. Naproti tomu anti-VCA IgG, které jsou produkovány téměř souběžně, přetrvávají celoživotně, ačkoliv se hladiny aktivity mohou měnit. V případě opakované aktivace (například po imunosupresi), dochází k významnému zvýšení hladin jak anti-EA IgG, tak anti-VCA IgG a ve vzácných případech je možno detekovat i VCA IgM. Pacienti s Burkittovým lymfomem a nasofaryngeálním karcinomem mají tytéž charakteristické vysoké hladiny VCA IgG, jaké lze pozorovat u reaktivací. Kromě toho prokázání protilátek VCA IgA slouží jako podpůrný důkaz při diagnostice nasofaryngeálního karcinomu. Zvýšené hladiny protilátek proti EA jsou podobně charakteristickým prvkem u pacientů trpících nasofaryngeálním karcinomem nebo reaktivací. Za několik týdnů po primární infekci se objeví protilátky působící proti nukleárnímu antigenu 1 EBV (EBNA1) a zůstanou celoživotně na detekovatelné úrovni, i když mohou vymizet u pacientů s potlačenou imunitou. Ať již samostatně, nebo v kombinaci s protilátkami VCA IgG, považují se za známku minulé infekce. Po reaktivaci viru je často pozorován pokles EBNA1 IgG. Je to obvykle doprovázeno zvýšením aktivity VCA IgG, zatímco se znovu objeví protilátky proti časnému antigenu. Hraniční výsledky u testu SERION ELISA classic EBNA1 IgG v kombinaci s pozitivními výsledky testu SERION ELISA classic EBV VCA IgG jsou interpretovány jako pozitivní a jako důkaz dávno minulé infekce. V následující tabulce jsou uvedeny různé možné kombinace protilátek a jejich interpretace. Základní interpretační schéma Toto základní interpretační schéma slouží hlavně k diferenciaci mezi séronegativním imunitním stavem, primární infekcí a minulou infekcí a využívá čtyři nejdůležitější sérologické indikátory IgG EA, IgG VCA, IgM VCA a IgG EBNA1:

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česky 14

IgG EA IgM VCA IgG VCA IgG EBNA1 Interpretace

- - - - séronegativita

+ - - -

akutní nebo nedávná

infekce

- + - -

+ + - -

+ + + -

+ - + -

- + + -

- - + -

- - + + dřívější infekce

- - - +

++ - ++ + reaktivace

++ + ++ +

Zkřížené reakce s protilátkami proti jiným herpes virům (např. CMV, HSV, VZV) nelze vyloučit.


8.7 Referenční rozsah zdravých jednotlivců

Testování náhodně vybraných sér dárců krve shromážděných v oblasti jižního Německa testy SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus poskytlo následující rozdělení. Pos : 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Refer enzbereich gesunder Probanden @ 12\mod_1380024245277_73.doc @ 58101 @

SERION ELISA classic počet negativní mezní pozitivní

EBV VCA IgG 131 3 (2,3 %) 2 (1,5 %) 126 (96,2 %)

EBV VCA IgM 131 131 (100 %) - -

EBV EBNA 1 IgG 131 11 (8,4 %) - 120 (91,6 %)

EBV EA IgG 131 92 (70,2 %) 11 (8,4 %) 28 (21,4 %)


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9 CHARAKTERISTIKY VÝSLEDKŮ Pos : 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift: Sensiti vität und Spezi fität @ 0\mod_1190013251494_73.doc @ 9936 @ 2

9.1 Citlivost a specifičnost Pos : 43 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Sensi ti vität und Spezifi tät @ 15\mod_1421417016940_73.doc @ 66960 @

Testy SERION ELISA classic EBV VCA IgG, IgM a SERION ELISA classic EBV EBNA-1 IgG byly validovány pomocí vnitřní studie. Bylo analyzováno 155 sérových vzorků, každý od sérologicky negativních dárců krve a dále od pacientů s akutní a dříve proběhlou infekcí EBV, a jako referenční test byla použita imunoesej ELISA od předního evropského výrobce. Charakteristiky chování testu SERION ELISA classic EBV EA IgG byly vyhodnoceny ve vnitřní studii analýzou 96 sérových vzorků od zdravých dárců krve a pacientů s podezřením na akutní infekci EBV. Jako referenční testy byly použity dva testy ELISA a imunoblot od předních evropských výrobců.

Citlivost Specificita





Séra klasifikovaná jako hraniční nebyla do výpočtu citlivosti a specificity zahrnuta. Pos : 44 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift Präzisi on @ 0\mod_1184676568397_73.doc @ 2129 @ 2

9.2 Reprodukovatelnost Pos : 45 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Präzision @ 14\mod_1404457829683_73.doc @ 62017 @


Vzorek Průměrná hodnota

(OD)

Intra-assay CV (%)

Průměrná hodnota

(OD)

Inter-assay CV (%)

Sérum 1 0,616 4,5 0,637 5,5

Sérum 2 0,746 5,3 0,814 6,6

Sérum 3 2,125 3,0 2,191 2,8



(OD)

Intra-assay CV (%)

Průměrná hodnota

(OD)

Inter-assay CV (%)

Sérum 1 0,530 8,7 0,551 7,2

Sérum 2 1,582 5,1 1,703 6,4

Sérum 3 2,249 7,9 2,311 8,7

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česky 16



(OD)

Intra-assay CV (%)

Průměrná hodnota

(OD)

Inter-assay CV (%)

Sérum 1 0,554 2,2 0,644 7,1

Sérum 2 1,355 2,4 1,510 4,5

Sérum 3 1,437 3,0 1,636 4,5



(OD)

Intra-assay CV (%)

Průměrná hodnota

(OD)

Inter-assay CV (%)

Sérum 1 0,305 2,8 0,341 8,4

Sérum 2 0,952 2,5 1,093 4,1

Sérum 3 1,622 3,1 1,799 4,2 Pos : 46 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Allgemei ne Texte ELISA classic/Sicherheitsmaßnahmen @ 12\mod_1374740573162_73.doc @ 57177 @ 122

10 BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ

10.1 Výstražná upozornění SERION ELISA classic je určena k používání kvalifikovaným personálem, který je obeznámen se správnou laboratorní praxí. Se všemi reagenciemi v soupravě a vzorky humánních biologických materiálů se musí pečlivě nakládat s uplatněním zásad zavedené správné laboratorní praxe. - Tato souprava obsahuje složky lidské krve. Ačkoliv všechna kontrolní séra a séra pro

stanovení horní a dolní hranice normálních hodnot (cut-off séra) byla negativní s ohledem na protilátky proti HIV, HBs-Ag (povrchový antigenu viru hepatitidy B) a HCV , je zapotřebí je považovat za potenciálně infekční.

- Nepipetujte ústy.

- Nekuřte, nejezte ani nepijte v místech, kde se nakládá se vzorky nebo reagenciemi kitu.

- Používejte rukavice na jedno použití, laboratorní plášť a bezpečnostní brýle při práci s reagenciemi v kitu nebo se vzorky. Poté si důkladně omyjte ruce.

- Materiál od pacienta a další potenciálně infekční materiál musí být po dokončení testu dekontaminován.

- Reagencie musí být uchovávány na bezpečném místě a chráněny před neoprávněnými osobami, např. dětmi.

10.2 Likvidace Prosím, dodržujte příslušné zákonné požadavky! Pos : 47 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Liter atur/Liter atur @ 13\mod_1396939862911_73.doc @ 59091 @ 1

11 ODKAZY Odkazy na SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus jsou uvedeny na konci tohoto návodu k použití. === Ende der Liste für T extmar ke Inhalt ===


Epstein-Barr Virus VCA IgG/IgM, Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG, Epstein-Barr Virus EA IgG SPIS TREŚCI

1 PRZEZNACZENIE

2 ISTOTNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA

3 ZASADA TESTU SERION ELISA classic

4 SKŁADNIKI ZESTAWU S

5 MATERIAŁY WYMAGANE, NIE DOSTARCZANE

6 PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ

7 PROCEDURA TESTOWA SERION ELISA classic

7.1 Oznaki degradacji

7.2 Przygotowanie i przechowywanie próbek

7.3 Przygotowanie odczynników zestawu

7.4 Przegląd – Procedura testowa

7.5 Manualna procedura testowa

7.6 Automatyczna procedura testowa

7.7 Kontrola pozytywna / Kontrola dokładności

7.8 Diagnostyka płynu mózgowo-rdzeniowego

8 OCENA TESTU


8.2 Zakresy graniczne

8.3 Ograniczenia oznaczeń ilościowych

8.4 Automatyczna ocena / Oprogramowanie

8.5 Kryteria walidacji

8.6 Interpretacja wyników

8.7 Zakresy referencyjne dla osób zdrowych

9 CHARAKTERYSTYKA WYKONANIA

9.1 Czułość i specyficzność

9.2 Powtarzalność

10 ŚRODKI BEZPIECZEŃSTWA

10.1 Ostrzeżenia

10.2 Usuwanie

11 BIBLIOGRAFIA

Aktualizacja

Nr aktualnej wersji: V 136.23

Wersja poprzednia: V 22.11/12-1

Aktualizacja w sekcji: ogólna aktualizacja

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Test immunoenzymatyczny do oznaczania ludzkich przeciwciał do stosowania w diagnostyce in vitro

Pos : 3 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Bes tell nummern/EBV: Bes tellnummern @ 0\mod_1188368235293_58.doc @ 6498 @

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG Nr katalogowy: ESR1361G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgM Nr katalogowy: ESR1361M

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG Nr katalogowy: ESR1362G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG Nr katalogowy: ESR1363G

Pos: 4 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Allgemeine Texte ELISA classic/Kapitelüberschrift "Anwendungsbereich" @ 0\mod_1177351044007_58.doc @ 178 @ 1 1 PRZEZNACZENIE Pos : 5 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Anwendungsber eich/EBV: Anwendungsbereich @ 14\mod_1404456157024_58.doc @ 61978 @

Testy SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG, VCA IgG, IgM i EBNA1 IgG są ilościowymi i jakościowymi testami immunoenzymatycznymi do oznaczania ludzkich przeciwciał skierowanych przeciwko składnikom wirusa Epstein-Barr (EBV) w surowicy i osoczu. Testy SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG oraz SERION ELISA classic EBV VCA IgM zalecane są do wykrywania ostrych zakażeń lub reaktywacji. Test SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG określa obecność pierwotnych i świeżych zakażeń. Test SERION ELISA classic EBNA1 IgG zalecany jest do diagnozowania przebytych zakażeń. Testy SERION ELISA classic EBV VCA i EBNA1 IgG zostały zwalidowane pod kątem wykrywania syntetyzowanych wewnątrzoponowo przeciwciał w ramach diagnostyki płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). Pos : 6 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/Kapitelüberschrif t "Diag nostische Bedeutung" @ 0\mod_1177351537598_58.doc @ 229 @ 1

2 ISTOTNOŚĆ DIAGNOSTYCZNA Pos : 7 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Di agnostische Bedeutung/EBV: Diagnostische Bedeutung @ 15\mod_1421651635398_58.doc @ 66978 @

Wirus Epstein-Barr (EBV) jest wirusem z rodziny Herpesvirus, patogennym dla ludzi. Występuje na całym świecie i tak jak pozostałe herpeswirusy często występuje w ogólnej populacji, do 90 – 95 % w populacji dorosłych. W tak zwanych krajach rozwijających się zakażenie pierwotne występuje z reguły w pierwszym roku życia i przebiega często bezobjawowo. Inaczej jest w krajach o wysokim standardzie higieny, gdzie zakażenie pierwotne rozwija się wśród nastolatków i młodych dorosłych. Szczyt zachorowań przypada pomiędzy 15 a 20 rokiem życia; około 50 % zakażonych choruje na mononukleozę zakaźną. Przenoszenie dokonuje się przede wszystkim poprzez ślinę, choć możliwe są także inne drogi - poprzez produkty krwiopochodne lub przeszczep szpiku kostnego. W trakcie zakażenia pierwotnego dochodzi do zajęcia ślinianek a wirus dostaje się do nosa i gardła wraz ze śliną. W tym stadium objawy zakażenia przypominają objawy grypy. Wirus rozprzestrzenia się po organizmie przez zainfekowane limfocyty B, stymulowane do podziałów przez wirusa, ale normalnie regulowane przez układ odpornościowy. Zakażone limfocyty B w krwi obwodowej są w sposób charakterystyczny atypowe, ze zmianą kształtu, wyraźnie bazofilną cytoplazmą i wyraźnym jądrem. W miarę postępu choroby może się ona objawiać wysoką gorączką, splenomegalią, zapaleniem węzłów chłonnych, trombocytopenią i zapaleniem wątroby. Z racji sposobu rozprzestrzeniania się i przekazywania wirusa głównie ze śliną, mononukleoza zakaźna (MZ) lub gorączka gruczołowa zwana była również „chorobą pocałunków”. W rzadkich przypadkach ostre zakażenie MZ może prowadzić do przewlekłej aktywnej choroby. W takich przypadkach objawy MZ mogą utrzymywać się przez dłuższy okres czasu. Niejasna jest

polski 3

patogeneza tego powikłania, jednak podejrzewa się predyspozycję genetyczną i/lub zakażenie szczególnie litycznym szczepem wirusa. W niektórych rejonach geograficznych, EBV jest ściśle związany z występowaniem raka nosogardzieli. Ten rak gardła, nosa i gardła złożony jest z niezróżnicowanych komórek nabłonkowych i ma tendencję do przerzutów. Choroba ta występuje na całym świecie, ale szczególnie często w niektórych rejonach południowych Chin. Predyspozycje genetyczne jak i warunki środowiskowe takie jak dieta rozważane są jako dodatkowe czynniki ryzyka. Chłoniak Burkitta (CB) również jest guzem związanym z EBV, występującym głównie w rejonach Afryki i Papui-Nowej Gwinei. Jest to guz z monoklonalnych komórek B powiązany z rejonami dużej zapadalności na malarię; ponad 90 % guzów wykazuje obecność EBV. Wpływ zakażenia zarodźcowego na odpowiedź immunologiczną sugeruje rolę malarii jako dodatkowego czynnika ryzyka CB. Zdarzają się sporadyczne przypadki CB w innych rejonach geograficznych, jednak w takich przypadkach rzadziej wykrywa się EBV i uważa się, że za pojawienie się guza odpowiadają inne dodatkowe czynniki ryzyka, takie jak zmiany genetyczne związane z translokacją chromosomową. W bardzo wczesnym etapie zakażenia produkowane są przeciwciała klasy IgM przeciwko wczesnemu antygenowi (EA - early antigen). Najwyższe stężenia przeciwciał stwierdza się często w momencie pojawienia się objawów; około dwóch tygodni po początkowym zakażeniu rozpoczyna się produkcja przeciwciał IgG przeciw EA, IgM przeciw VCA (Virus Capsid Antigen - antygen kapsydu wirusa) i IgG przeciw VCA. Najwyższe stężenia IgM anty-VCa występują około trzy tygodnie po pojawieniu się objawów. IgG EA są często wykrywalne przez dłuższy czas po zakażeniu. W dalszym przebiegu choroby spada stężenie IgM VCA, a jeszcze później – IgG EA. IgG anty-VCA osiąga szczyt około sześciu tygodni po pojawieniu się objawień i pozostaje na wysokim poziomie przez całe życie. Około trzech tygodni po pojawieniu się objawów rozpoczyna się produkcja przeciwciał IgG EBNA1, które są wskaźnikiem przebytego zakażenia; ich poziom osiąga szczyt około siedem miesięcy po zakażeniu i po przebyciu niepowikłanego zakażenia EBV pozostaje wysoki przez całe życie. Reaktywacja wirusa (np. z powodu immunosupresji) prowadzi zazwyczaj do znacznego wzrostu przeciwciał klasy IgG przeciw EA, natomiast rzadko dochodzi do zwiększenia poziomu IgM VCA. Wyjątkowo rzadko, np. z powodu immunosupresji, zanika IgG EBNA1, tak więc IgG EA jest dobrym markerem reaktywacji. Pos : 8 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/T es tprinzip/Tes tpri nzip ELISA classic @ 4\mod_1255342796551_58.doc @ 21216 @ 1

3 ZASADA TESTU SERION ELISA classic

ELISA (test immunoenzymatyczny) to test immunologiczny, który znajduje szczególne zastosowanie do oznaczania przeciwciał w dziedzinie serologii czynników zakaźnych. Reakcja opiera się na swoistej interakcji przeciwciał z odpowiadającym im antygenem. Paski testowe na płytce mikrotitracyjnej SERION ELISA classic są opłaszczone swoistymi antygenami danych patogenów. Jeśli w próbce surowicy pacjenta są obecne przeciwciała, ulegają one związaniu z antygenem w fazie stałej. Przeciwciało drugorzędowe, sprzężone z enzymem fosfatazą alkaliczną, wykrywa i wiąże się z kompleksem immunologicznym. Wówczas bezbarwny substrat p-nitrofenylofosforan ulega konwersji do barwnego produktu – p-nitrofenolu. Intensywność sygnału produktu tej reakcji jest proporcjonalna do stężenia analitu w próbce i jest mierzona fotometrycznie. Pos : 9 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Inhalt und Z usammensetzung/EBV: Inhalt und Z usammensetzung @ 14\mod_1404461827273_58.doc @ 62086 @ 1

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4 SKŁADNIKI ZESTAWU Składniki zestawu Ilość / Objętość Testowe paski mikrotitracyjne do odrywania z ośmioma pojedynczymi studzienkami opłaszczonymi antygenem (razem 96) płytka MTP , 1 ramka. Materiał opłaszczający jest inaktywowany.

12 sztuk

Surowica standardowa (gotowa do użycia) STD , Ludzka surowica w buforze fosforanowym z białkiem; negatywna w kierunku przeciwciał anty-HIV, antygenu HBs (antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby B) oraz przeciwciał anty-HCV; konserwant: < 0,1 % azydek sodu; barwnik: amarant O

2 x 2 ml

Negatywna kontrola (surowica gotowa do użycia) NEG , Ludzka surowica w buforze fosforanowym z białkiem; negatywna w kierunku przeciwciał anty-HIV, antygenu HBs (antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby B) oraz przeciwciał anty-HCV; konserwant: < 0,1 % azydek sodu; barwnik: zieleń lizaminowa V

2 ml

Koniugat antyludzkich immunoglobulin IgA, IgG lub IgM (gotowy do użycia) APC , Antyludzkie przeciwciało poliklonalne IgA, IgG lub IgM, skoniugowane z fosfatazą alkaliczną, stabilizowane roztworem zawierającym białka; konserwant: < 0,1 % metyloizotiazolon, < 0,1 % bromonitrodioksan

13 ml

Stężony roztwór do płukania (wystarcza na 1000 ml) WASH , Roztwór chlorku sodu z buforem Tween 20 i 30 mM Tris/HCl, pH 7,4; konserwant: < 0,1% azydek sodu

33,3 ml

Bufor do rozcieńczania (gotowa do użycia) DILB lub specjalny bufor do rozcieńczania (gotowa do użycia) DILBS1 (Specjalny bufor do rozcieńczania dla testu SERION ELISA classic EBV EA IgG. Bezpośrednio przed użyciem wstrząsnąć!) Bufor fosforanowy z białkiem i buforem Tween 20 ( DILB ) oraz lizat E. coli ( DILBS1); konserwant: < 0,1% azydek sodu; barwnik: 0,01 g/l błękit bromofenolowy.

2 x 50 ml

Roztwór zatrzymujący reakcję (gotowa do użycia) STOP , < 0,1 N wodorotlenek sodu, 40 mM EDTA

15 ml

Substrat (gotowy do użycia) pNPP , Para-nitrofenylofosforan w buforze bez rozpuszczalnika; konserwant: < 0,1% azydek sodu

13 ml

Certyfikat kontroli jakości wraz z krzywą standardową oraz tabelą do obliczenia wartości INFO , (miano przeciwciał w IU/ml lub U/ml)

2 strony


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5 MATERIAŁY WYMAGANE, NIE DOSTARCZANE

- typowy sprzęt laboratoryjny - do oznaczania IgM: absorbent czynnika reumatoidalnego SERION, nr katalogowy Z200

(20 ml) - fotometr do płytek mikrotitracyjnych z filtrem, długość fali 405 nm, zalecana długość fali

referencyjnej 620 nm – 690 nm (np. 650 nm) - płuczka do płytek mikrotitracyjnych - cieplarka 37 °C - komora wilgotna - woda destylowana - Click-Clips (nr katalogowy VT120) - Opcjonalnie: SERION ELISA control Pos: 11 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Lagerung und Haltbarkeit/Lagerung und Haltbarkeit @ 13\mod_1397031131719_58.doc @ 59216 @ 1

6 PRZECHOWYWANIE I TRWAŁOŚĆ

Odczynnik Przechowywanie Trwałość

Paski mikrotitracyjne (opłaszczone antygenem)

nieotwarty

po otwarciu w temperaturze 2 – 8°C w zamkniętym woreczku aluminiowym ze środkiem osuszającym

patrz data ważności

minimalny okres trwałości: cztery tygodnie

Surowice kontrolne / Surowice standardowe

nieotwarty / po otwarciu w temperaturze 2 – 8 °C patrz data ważności

Koniugat nieotwarty / po otwarciu w temperaturze 2 – 8 °C patrz data ważności

Bufor do rozcieńczania

nieotwarty / po otwarciu w temperaturze 2 – 8 °C


Roztwór do płukania


roztwór roboczy w temperaturze 2 – 8 °C

roztwór roboczy w temperaturze pokojowej


2 tygodnie

1 tydzień

Substrat nieotwarty / po otwarciu w temperaturze 2 – 8 °C patrz data ważności

Roztwór zatrzymujący reakcję




7 PROCEDURA TESTOWA SERION ELISA classic Pos : 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Allgemeine Hi nweise ELISA cl assic @ 12\mod_1379504700667_58.doc @ 57736 @ 2

7.1 Oznaki degradacji

Optymalne wyniki można osiągnąć tylko w przypadku, gdy instrukcja SERION ELISA classic jest ściśle przestrzegana. Do oznaczania stosować wyłącznie odczynniki SERION ELISA classic. Składniki zestawu nie mogą być wymieniane na odczynniki innych producentów. Surowice standardowe i kontrolne zostały zaprojektowane wyłącznie do stosowania w tym zestawie. Nie stosować w zestawach o innych numerach serii. Roztwór do płukania, roztwór substratu oraz

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polski 6

roztwór zatrzymujący reakcję mogą być stosowane we wszystkich zestawach SERION ELISA classic niezależnie od numeru seryjnego oraz rodzaju testu. Każdy test SERION ELISA classic zawiera próbkę gotowego do użycia buforu do rozcieńczania. W niektórych przypadkach konieczne jest zastosowanie specjalnych buforów do rozcieńczania, aby zapewnić stałą jakość i wiarygodne wyniki. Bufory do rozcieńczania mogą być używane niezależnie od serii produkcyjnej. Dostępne są trzy stężenia koniugatu dla każdej klasy immunoglobulin (IgA, IgG i IgM) opisane na etykiecie jako + (małe), ++ (średnie) i +++ (duże). Koniugaty o tym samym stężeniu i tej samej klasy immunoglobulin mogą być stosowane zamiennie z innymi immunologicznymi testami SERION ELISA classic niezależnie od serii produkcyjnej i typu testu. Rozcieńczanie lub zmiana właściwości odczynników może spowodować zmniejszenie czułości. Przy przenoszeniu równych objętości roztworów z probówek z odczynnikami, należy stosować techniki aseptyczne, aby zapobiec kontaminacji. Powtarzalność wyników zależy od dokładnego wymieszania odczynników. Przed użyciem wstrząsnąć buteleczkami zawierającymi surowice kontrolne oraz wymieszać wszystkie próbki po rozcieńczeniu (np. stosując mieszadło typu vortex). Pipetować ostrożnie i zgodnie z przedstawionymi czasami i temperaturami inkubacji. Znaczne różnice w czasie między dodaniem roztworu do pierwszej i ostatniej studzienki płytki mikrotitracyjnej w trakcie pipetowania próbek / surowic kontrolnych, koniugatu lub substratu mogą spowodować powstanie różnych czasów preinkubacji, które mogą mieć wpływ na dokładność i powtarzalność wyników. Unikać ekspozycji odczynników na silne światło w czasie przechowywania i inkubacji. Dokładne wypłukanie umożliwia uniknąć niejednoznacznych wyników testów. Procedurę płukania należy wykonywać ostrożnie. Do wszystkich studzienek należy wprowadzić taką samą objętość buforu do płukania. Na końcu procedury należy sprawdzić, czy w studzienkach nie pozostał bufor do płukania, aby uniknąć niekontrolowanego rozcieńczenia. Unikać tworzenia piany! Odczynniki muszą być szczelnie zamknięte, aby zapobiec parowaniu i kontaminacji. Zwrócić uwagę, aby nie pomylić korków butelek i/lub probówek. Test SERION ELISA classic jest ważny tylko, jeśli spełnione są kryteria wiarygodności specyficzne dla danej serii przedstawione na certyfikacie kontroli jakości. Pos : 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Probenvor ber. und Lager ung (für ALLE Err eger auß er Borreli a, CM V, FSM E, H SV,Masern,Mumps,R öteln,VZ V) @ 8\mod_1263998040982_58.doc @ 28438 @ 2

7.2 Przygotowanie i przechowywanie próbek

Próbki lipemiczne, hemolityczne lub żółtaczkowe (surowica lub osocze) powinny być badane ostrożnie. Próbki widocznie zanieczyszczone nie powinny być badane. Odpowiednimi próbkami są surowica lub osocze (EDTA, cytrynian, heparyna) pobrane według standardowych metod laboratoryjnych. Nie należy inaktywować próbek metodą termiczną. Pos : 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Kapi tel überschrift Probenverdünnung @ 0\mod_1184679414434_58.doc @ 2341 @ 3

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7.2.1 Rozcieńczanie próbek

Przed wykonaniem testów próbki pobrane od pacjentów (V1) należy rozcieńczyć buforem (V2) do rozcieńczania w następujący sposób: Pos : 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung, T eil 1 @ 5\mod_1256050091616_58.doc @ 22826 @ SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG (specjalny bufor do rozcieńczania B231-S1!)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG (bufor do rozcieńczania B231)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG (bufor do rozcieńczania B231)

Bufor do rozcieńczania do testu SERION ELISA classic EBV EA IgG (B231-S1) nie jest wymienny z buforami do rozcieńczania do SERION ELISA classic EBV VCA lub EBNA1.

V1 + V2 = 1 + 100 dodać 10 µl próbki surowicy pacjenta na każde 1000 µl buforu do rozcieńczania


SERION ELISA classic EBV VCA IgM Pos : 18 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Probenver dünnung: R heumafaktor-Interferenz (für T ests mit IgM-Nachweis) @ 9\mod_1316422765852_58.doc @ 36515 @

Zakłócenia związane z czynnikiem reumatoidalnym Jako czynnik reumatoidalny określane są autoprzeciwciała należące głównie do klasy IgM, które wiążą się preferencyjnie z kompleksami immunologicznymi IgG. Obecność niespecyficznych przeciwciał IgM (czynnika reumatoidalnego) może prowadzić do fałszywie pozytywnych wyników w trakcie oznaczania IgM. Ponadto istnieje możliwość zastąpienia przeciwciał IgM słabo wiążących się z patogenem przez silniej wiążące przeciwciała IgG, w takim przypadku mogą pojawić się fałszywie negatywne wyniki oznaczania IgM. Dlatego jest istotne, aby przed testem oznaczającym IgM dodać do próbek absorbenty czynnika reumatoidalnego (absorbent czynnika reumatoidalnego SERION Rf-Absorbent, numer katalogowy: Z200 (20 ml/100 testów)). Absorpcja czynnika reumatoidalnego następuje poprzez inkubację próbki pacjenta w rozcieńczonym buforem odczynniku RF-absorbent przez 15 minut w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C. Procedura testowa opisana jest w oddzielnej instrukcji. Pos : 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung T eil 3 @ 5\mod_1256050082945_58.doc @ 22810 @

Przed rozpoczęciem badania należy rozcieńczyć absorbent czynnika reumatoidalnego (V1) w buforze do rozcieńczania (V2) w proporcji 1+4.

V1 + V2 = V3 (1 + 4) dodać 200 µl absorbentu RF na każde 800 µl buforu do rozcieńczania

Próbki pobrane od pacjenta (V4) należy rozcieńczyć w roztworze buforu RF (V3):

V4 + V3 = 1+100 dodać 10 µl próbki surowicy pacjenta na każde 1000 µl roztworu buforu RF Pos : 20 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenver dünnung: Mischung der Proben @ 4\mod_1255343607624_58.doc @ 21296 @

Po rozcieńczeniu a przed rozpipetowaniem na płytkę mikrotitracyjną należy dokładnie wymieszać próbki, aby powstał homogenny roztwór. Pos : 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenlager ung @ 4\mod_1255343526141_58.doc @ 21280 @ 3

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7.2.2 Przechowywanie próbek Próbki pobrane od pacjenta można przechowywać do 7 dni w temperaturze 2 – 8°C. Dłuższe przechowywanie jest możliwe w temperaturze ≤ -20°C. Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania próbek. Próbki rozcieńczone można przechowywać w temperaturze 2 – 8°C przez tydzień. Pos: 22 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Testdurchführung/Reagenzienvorbereitung - KOMPLETT @ 12\mod_1379504953325_58.doc @ 57772 @ 23333333

7.3 Przygotowanie odczynników zestawu

Wszystkie odczynniki powinny mieć temperaturę pokojową przed wykonaniem oznaczenia.

7.3.1 Mikrotitracyjne paski testowe

Mikrotitracyjne paski testowe oznaczone skrótem nazwy patogenu i klasą immunoglobulin zapakowane są razem ze środkiem osuszającym w kopertę z folii aluminiowej. Otwierając aluminiową kopertę z płytką mikrotitracyjną proszę odciąć krawędź tylko po zaznaczonej stronie, aby zapewnić szczelność po ponownym zamknięciu. Wyjąć niepotrzebne dołki z ramki i włożyć z je z powrotem do koperty. Zamknąć szczelnie kopertę, aby chronić zawartość przed dostępem powietrza. Nie używać pasków z uszkodzonej koperty ani z częściowo opróżnionej koperty z paskami i środkiem osuszającym, która nie została ponownie szczelnie zamknięta.

7.3.2 Surowice kontrolne / Surowice standardowe (gotowy do użycia)

Surowice kontrolne i standardowe są gotowe do użycia i nie należy ich rozcieńczać. Podczas każdego testu zastosować surowice kontrolne i standardowe, niezależnie od liczby wykorzystanych testowych pasków mikrotitracyjnych. Surowice standardowe i cut-off należy stosować w dwóch powtórzeniach. Nie dodawać absorbentu czynnika reumatoidalnego do surowic kontrolnych.

7.3.3 AP-Koniugat antyludzkich immunoglobulin IgA, IgG lub IgM (gotowy do użycia)

Wymagane stężenie koniugatu (+, ++, +++) podane jest w certyfikacie kontroli jakości. Proszę sprawdzić także specyfikację podaną na etykiecie.

7.3.4 Roztwór do płukania (Stężony)

Rozcieńczyć stężony bufor do rozcieńczania (V1) w stosunku 1:30 wodą destylowaną do końcowej objętości V2. Przykład:

Stężony bufor (V1) Objętość końcowa (V2)

33,3 ml 1000 ml

1,0 ml 30 ml

7.3.5 Bufor do rozcieńczania próbek (gotowy do użycia)

7.3.6 Substrat (gotowy do użycia)

Substrat znajdujący się w nieotwartej butelce może mieć lekko żółte zabarwienie, nie wpływa to na jakość produktu!

7.3.7 Roztwór zatrzymujący reakcję (gotowy do użycia)


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7.4 Przegląd – Procedura testowa



ilościowy W przypadku stwierdzenia absorbcji przeciwciał IgM czynnika reumatoidalnego patrz 7.2.1; Inkubacja przez 15 minut w temperaturze pokojowej lub przez całą noc w temperaturze 4°C

rozcieńczenie próbki1

(próbki surowicy pacjenta) 1 + 100


Rozpipetować rozcieńczone próbki oraz gotowe do użycia surowice kontrolne / surowice standardowe do studzienek mikrotestowych (100 µl)

INKUBACJA 60 min / 37°C komora wilgotna

PŁUKANIE (4 x 300 µl DIL WASH )²

Nanieść pipetą roztwór koniugatu APC (100 µl)


PŁUKANIE (4 x 300 µl DIL WASH )²

Nanieść pipetą roztwór substratu pNPP (100 µl)


Nanieść pipetą roztwór zatrzymujący reakcję STOP (100 µl)

ODCZYT EKSTYNKCJI PRZY DŁUGOŚCI FALI 405 nm

1Specjalne bufory rozcieńczające dla następujących zestawów SERION ELISA classic: Borrelia burgdorferi IgG, IgM, EBV EA IgG oraz Hantavirus Puumala IgG, IgM

2Przy oznaczeniach manualnych:

po zakończeniu procedury płukania osuszyć płytkę ostukując ją na ręczniku papierowym Pos : 26 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/M anuelle Tes tdurchführ ung (für ALLE Erreg er auß er Adeno, Coxi ella, RSV) @ 12\mod_1379505649011_58.doc @ 57790 @ 2

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7.5 Manualna procedura testowa

1. Umieścić żądaną liczbę dołków w ramce i przygotować arkusz protokołu. 2. Dodać po 100 µl rozcieńczonych próbek lub gotowych kontroli do odpowiednich

studzienek na mikrotitracyjnych paskach testowych. Zostawić jedną wolną studzienkę jako próbę ślepą substratu, np.:

studzienka ilościowe ELISA

A1 Próba ślepa

B1 Kontrola negatywna

C1 Surowica standardowa

D1 Surowica standardowa

E1 Pacjent 1....

F1 Pacjent 2....

3. Inkubować próbki przez 60 minut (+/- 5 min.) w temperaturze 37°C (+/- 1°C) w komorze wilgotnej

4. Po inkubacji przepłukać wszystkie studzienki roztworem do płukania (metodą automatyczną lub ręczną): - zaaspirować lub wytrząsnąć roztwór inkubacyjny - napełnić każdą studzienkę 300 µl roztworu do płukania - zaaspirować lub wytrząsnąć bufor do płukania - powtórzyć procedurę płukania 3 razy (razem 4 razy!) - osuszyć, ostukując płytkę mikrotitracyjną na papierowym ręczniku

5. Dodawanie koniugatu Dodać 100 µl koniugatu IgA/IgG/IgM (gotowego do użycia) do odpowiednich studzienek (za wyjątkiem próby ślepej substratu)

6. Inkubować z koniugatem przez 30 minut (+/- 1 min.) w temperaturze 37°C (+/- 1°C) w komorze wilgotnej.

7. Po inkubacji przepłukać wszystkie studzienki roztworem do płukania (patrz powyżej) 8. Dodawanie substratu

Dodać 100 µl roztworu substratu (gotowego do użycia) do każdej studzienki (również do studzienki z próbą ślepą substratu!)

9. Inkubować z substratem przez 30 minut (+/- 1 min.) w temperaturze 37°C (+/- 1°C) w komorze wilgotnej.

10. Zatrzymanie reakcji Dodać 100 µl roztworu zatrzymującego reakcję do każdej studzienki, następnie w celu wymieszania delikatnie wstrząsnąć płytką mikrotitracyjną.

11. Odczyt ekstynkcji Odczytać wartość OD w trakcie 60 minut przy długości fali 405 nm względem próby ślepej substratu, przy fali odniesienia o długości między 620 nm i 690 nm (np. 650 nm).


7.6 Automatyczna procedura testowa

Testy SERION ELISA mogą być stosowane w automatach i są kompatybilne z urządzeniami ImmunomatTM i Gemini oraz DYNEX DSX® i DS2®. Procedura zautomatyzowana jest wykonywana analogicznie do manualnej. Należy zwrócić uwagę, że w określonych warunkach pracy konieczne może być wewnętrzne dostosowanie czasów inkubacji substratu w laboratorium.

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Pos : 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Positi vkontroll e / Richtigkeitskontroll e @ 8\mod_1260286311409_58.doc @ 27538 @ 2

7.7 Kontrola pozytywna / Kontrola dokładności

W celu okresowej weryfikacji sposobu przeprowadzania badania oraz spełnienia wymogów wewnętrznej kontroli jakości laboratorium zalecane jest stosowanie produktów SERION ELISA controls, określających dokładność i wiarygodność przebiegu testów SERION ELISA classic. Sposób korzystania z produktów SERION ELISA controls opisany jest w szczegółowych instrukcjach użycia. Pos : 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Liquordi agnosti k ( für Borr elia + FSM E + VZV + EBV + Infl uenza) @ 9\mod_1271682242806_58.doc @ 32128 @ 2

7.8 Diagnostyka płynu mózgowo-rdzeniowego Przydatność testów SERION ELISA classic EBV VCA IgG, EBV EBNA1 IgG do wykrywania przeciwciał w płynie mózgowo-rdzeniowym została zweryfikowana i uzyskały one rekomendację w zakresie wykrywania i różnicowania procesów zapalnych toczących się w centralnym układzie nerwowym. Procedura testowa opisana jest w oddzielnej instrukcji. Aplikacja działająca pod kontrolą programu Excel ułatwia obliczenia wskaźnika przeciwciał zgodnie z metodą prof. Hansotto Reibera. Pos : 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: TESTAU SWER TUNG + Erreg er @ 1\mod_1197038305478_58.doc @ 11394 @ 12

8 OCENA TESTU


Metoda matematycznego dopasowywania krzywej do ilościowego oznaczania przeciwciał za pomocą testów immunoenzymatycznych SERION ELISA classic wykorzystuje 4-parametrową funkcję logistyczną (4 PL). Za dokładny kształt krzywej standardowej odpowiadają 4 parametry — A, B, C i D:

Parametr A: dolna asymptota (OD) Parametr B: nachylenie krzywej Parametr C: punkt przegięcia Parametr D: górna asymptota (OD)

Firma Institut Virion\Serion GmbH ustala krzywą standardową 4 PL charakterystyczną dla danej serii dla każdego testu immunoenzymatycznego SERION ELISA classic na podstawie wielokrotnych oznaczeń w optymalnych warunkach testowych. Te cztery parametry są podane w certyfikacie kontroli jakości każdego testu SERION ELISA classic. W celu dostosowania poziomu testu do krzywej standardowej 4 PL obliczany jest współczynnik korekcji F, który stanowi iloraz standardowej wartości referencyjnej OD podanej w certyfikacie kontroli jakości i zmierzonej, charakterystycznej dla danego oznaczenia standardowej wartości OD. Poziom każdego oznaczenia jest dostosowywany do danej krzywej standardowej 4 PL w wyniku pomnożenia wartości OD uzyskanych z próbek pacjenta przez współczynnik korekcji F. W ten sposób wariancje między oznaczeniami są kompensowane, a aktywność przeciwciał można bezpośrednio ocenić z wykorzystaniem krzywej standardowej 4 PL.

)1)(

ln(1

)/(−

−∗

−−

=AFPatientOD

AD

BC

emlUActivity

valueODSTDmeasured


P

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Po subtrakcji wartości dla próby ślepej bez substratu od wszystkich zmierzonych wartości OD i obliczeniu średniej wartości OD dla surowicy standardowej (STD), testowanej w duplikatach, ocenę aktywności przeciwciał z wykorzystaniem optycznych sygnałów pomiarowych (OD) z próbek pacjentów można przeprowadzić na wiele sposobów. Są one opisane w oddzielnych podręcznikach. Pos : 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estauswertung/Grenzwertber eich ( für T es te mehrerer Ig-Klassen) @ 12\mod_1375360254888_58.doc @ 57405 @ 2

8.2 Zakresy graniczne

Zakresy graniczne dla testu SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG, EBV EA IgG są podane na certyfikatach kontroli jakości i wskazują zakres granicznych wyników testów. Wartości, które mieszczą się poniżej tego zakresu wskazują ujemny wynik testu; wartości powyżej zakresu granicznego interpretowane są jako wynik dodatni. Pos : 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Quantifi zierungsgrenzen @ 6\mod_1258098664276_58.doc @ 24408 @ 2

8.3 Ograniczenia oznaczeń ilościowych

Ograniczenia oznaczeń ilościowych wyszczególnione zostały na certyfikacie kontroli jakości testu SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG, EBV EA IgG. Liniowość rozcieńczeń w tym zakresie została potwierdzona w licznych badaniach. W przypadku, gdy próbka pobrana od pacjenta przekracza górną granicę oceny ilościowej, można zbadać próbkę przy wyższym rozcieńczeniu. Uzyskaną w ten sposób aktywność przeciwciał należy pomnożyć przez dodatkowy współczynnik rozcieńczenia. Pos : 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Automatische Tes tauswertung @ 12\mod_1375166354143_58.doc @ 57326 @ 2

8.4 Automatyczna ocena / Oprogramowanie

Na życzenie dostępne jest oprogramowanie do automatycznej oceny optycznych sygnałów pomiarowych: SERION easyANALYZE, SERION evaluate jak również oparte na platformie Microsoft® Excel® oprogramowanie SERION activity. Pos : 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: Tes tgültig kei tskriterien @ 12\mod_1375166094763_58.doc @ 57308 @ 2

8.5 Kryteria walidacji

- Wartość OD próby ślepej musi wynosić < 0,25.

- Kontrola negatywna musi dać wynik negatywny.

- Ilościowe oznaczenie SERION ELISA classic: średnia wartość OD dla surowicy standardowej (po odjęciu wartości dla próby ślepej substratu!) musi mieścić się w zakresie istotności, który podany jest na certyfikacie kontroli jakości dla danej serii.

- Jakościowe oznaczenie SERION ELISA classic: wartość OD kontroli pozytywnej oraz średnia wartość OD surowicy cut-off musi mieścić się w zakresie istotności, co jest podane na certyfikacie kontroli jakości dla serii (po odjęciu wartości dla próby ślepej substratu!)

- Różnice w wartościach OD surowicy standardowej lub surowicy cut-off nie mogą być większe niż 20 %.

Jeśli kryterium nie zostanie spełnione test musi być powtórzony. Pos : 36 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: Interpretation der Ergebnisse @ 0\mod_1190013774869_58.doc @ 9948 @ 2

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8.6 Interpretacja wyników Pos : 37 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: Inter pretation der Ergebnisse @ 12\mod_1375363155925_58.doc @ 57426 @

Dodatni wynik testu potwierdza obecność konkretnych przeciwciał. Ujemny wynik testu wskazuje na brak w próbce pacjenta klinicznie znaczącej ilości przeciwciał przeciwko danemu patogenowi, ale nie wyklucza możliwości ostrego zakażenia. W razie wyniku granicznego niemożliwa jest wiarygodna ocena. Pewne rozpoznanie można osiągnąć przez testowanie par próbek surowicy pobranych równolegle w odstępach jednego do dwóch tygodni. Pos : 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Inter pretation der Ergebnisse @ 15\mod_1421652419778_58.doc @ 66997 @

Rozpoznanie mononukleozy zakaźnej (MZ) stawiane jest zazwyczaj na podstawie wykrycia przeciwciał przeciwko antygenowi wczesnemu (EA) i przeciw kompleksowi białek znanemu jako antygen kapsydu wirusa (VCA); ich znaczenie jest znane od pewnego czasu. W krótkim czasie po zakażeniu pojawiają się przeciwciała klasy IgM przeciw EA i VCA; po wyleczeniu z ostrego zakażenia ich poziom zmniejsza się lub zanikają one całkowicie. W przeciwieństwie do nich, przeciwciała klasy IgG anty-VCA, które wytwarzane są prawie w tym samym czasie, utrzymują się przez całe życie, choć na zmiennym poziomie. W przypadku reaktywacji (na przykład wskutek immunosupresji), następuje znaczący wzrost poziomu przeciwciał IgG anty-EA oraz IgG anty VCA; w rzadkich przypadkach można również wykryć IgM VCA. Chorzy na chłoniaka Burkitta i raka nosogardzieli mają również charakterystyczne wysokie poziomy IgG VCA – tak jak w przypadku reaktywacji. Dodatkowo, wykazanie przeciwciał IgA VCA dostarcza dowodów na istnienie raka nosogardzieli. Podwyższone poziomy przeciwciał anty-EA są również charakterystyczną cechą chorych na raka nosogardzieli lub przechodzących reaktywację wirusa. Kilkanaście tygodni po zakażeniu pierwotnym pojawiają się przeciwciała skierowane przeciwko antygenowi jądrowemu EBV (ESBNA1); można je wykryć przez całe późniejsze życie, choć czasem mogą one zaniknąć pod wpływem immunosupresji. Samodzielnie lub w połączeniu z przeciwciałami klasy IgG przeciw VCA są uznawane za marker przebytego zakażenia. Do spadku poziomu IgG EBNA1 dochodzi często w trakcie reaktywacji wirusa. Towarzyszy temu z reguły wzrost aktywności IgG VCA, przy równoczesnym pojawieniu się na nowo przeciwciał przeciw wczesnemu antygenowi. Wyniki graniczne w teście SERION ELISA classic EBNA1 IgG w połączeniu z dodatnimi wynikami testu SERION ELISA classic EBV VCA IgG interpretuje się jako dodatnie i świadczące o dawno przebytym zakażeniu. W poniższej tabeli wymieniono możliwe kombinacje wyników przeciwciał i ich interpretacje. Podstawowy schemat interpretacji: Ten podstawowy schemat interpretacji służy głównie do odróżnienia seronegatywnego stanu odporności, zakażeń pierwotnych i przebytych zakażeń za pomocą czterech najważniejszych markerów - IgG EA, IgG VCA, IgM VCA i IgG EBNA1:

P

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IgG EA IgM VCA IgG VCA IgG EBNA1 Interpretacja

- - - - seronegatywność

+ - - -

ostre lub świeże zakażenie

- + - -

+ + - -

+ + + -

+ - + -

- + + -

- - + -

- - + + przebyte zakażenie

- - - +

++ - ++ + reaktywacja

++ + ++ +

Nie można wykluczyć reakcji krzyżowych przeciwciał skierowanych przeciwko innym herpeswirusom (np. CMV, HSV, VZV). Pos : 39 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: Refer enzbereiche gesunder Pr obanden @ 8\mod_1258644290978_58.doc @ 26758 @ 2

8.7 Zakresy referencyjne dla osób zdrowych

Badanie surowic losowo wybranych dawców krwi z regionu południowych Niemiec za pomocą testów SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus dało następujące wyniki: Pos : 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Refer enzbereich gesunder Probanden @ 12\mod_1380024245277_58.doc @ 58098 @

SERION ELISA classic ilość negatywna graniczna pozytywna

EBV VCA IgG 131 3 (2,3 %) 2 (1,5 %) 126 (96,2 %)

EBV VCA IgM 131 131 (100 %) - -

EBV EBNA 1 IgG 131 11 (8,4 %) - 120 (91,6 %)

EBV EA IgG 131 92 (70,2 %) 11 (8,4 %) 28 (21,4 %)


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9 CHARAKTERYSTYKA WYKONANIA Pos : 42 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift: Sensiti vität und Spezi fität @ 0\mod_1190013251494_58.doc @ 9933 @ 2

9.1 Czułość i specyficzność Pos : 43 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Sensi ti vität und Spezifi tät @ 15\mod_1421417016940_58.doc @ 66957 @

Testy SERION ELISA classic EBV VCA IgG i IgM oraz SERION ELISA classic EBV EBNA-1 IgG zostały zwalidowane w ramach badania wewnętrznego. Analiza objęła 155 próbek surowicy pochodzących od seroujemnych dawców krwi, oraz od pacjentów z ostrym lub przebytym zakażeniem EBV; jako test referencyuy zastosowano test ELISA wiodącego producenta europejskiego. W wewnętrznym badaniu oceniono charakterystykę testu ERION ELISA classic EBV EA IgG przez analizę 96 próbek surowicy od zdrowych dawców krwi i pacjentów z podejrzeniem ostrego zakażenia EBV. Jako testy referencyjne zastosowano dwa testy ELISA oraz test typu immunoblot wiodących producentów europejskich.

Czułość Swoistość

SERION ELISA classic EBV VCA IgM > 99% 94,2%

SERION ELISA classic EBV VCA IgG > 99% > 99%

SERION ELISA classic EBV EBNA 1 IgG 96,2% 94,4%

SERION ELISA classic EBV EA IgG 84,0% 95,0%

Przy obliczeniach czułości i swoistości nie uwzględniono próbek surowicy zaklasyfikowanych jako graniczne. Pos : 44 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift Präzisi on @ 0\mod_1184676568397_58.doc @ 2126 @ 2

9.2 Powtarzalność Pos : 45 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Präzision @ 14\mod_1404457829683_58.doc @ 62014 @


Próbka Wartość średnia (OD)

Powt. wewnątrz serii

CV (%)

Wartość średnia (OD)

Powt. między seriami CV (%)

surowica 1 0.616 4.5 0.637 5.5

surowica 2 0.746 5.3 0.814 6.6

surowica 3 2.125 3.0 2.191 2.8


Próbka Wartość średnia

(OD)


CV (%)



surowica 1 0.530 8.7 0.551 7.2

surowica 2 1.582 5.1 1.703 6.4

surowica 3 2.249 7.9 2.311 8.7

P

L

polski 16



(OD)


CV (%)



surowica 1 0.554 2.2 0.644 7.1

surowica 2 1.355 2.4 1.510 4.5

surowica 3 1.437 3.0 1.636 4.5



(OD)


CV (%)



surowica 1 0.305 2.8 0.341 8.4

surowica 2 0.952 2.5 1.093 4.1

surowica 3 1.622 3.1 1.799 4.2 Pos : 46 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Allgemei ne Texte ELISA classic/Sicherheitsmaßnahmen @ 12\mod_1374740573162_58.doc @ 57174 @ 122

10 ŚRODKI BEZPIECZEŃSTWA

10.1 Ostrzeżenia

Testy SERION ELISA classic są przeznaczone do stosowania tylko przez wykwalifikowany personel znający zasady dobrej praktyki laboratoryjnej. Ze wszystkimi odczynnikami w zestawie i próbkami od pacjentów należy obchodzić się ostrożnie, stosując zasady dobrej praktyki laboratoryjnej. - Zestaw zawiera składniki krwi ludzkiej. Mimo iż wszystkie surowice kontrolne i surowice

cut-off zostały przebadane i dały wyniki negatywne na obecności przeciwciał anty-HCV i anty-HIV oraz antygenu HBs, powinny być traktowane jako potencjalnie zakaźne.

- Nie pipetować ustami.

- Nie należy palić, pić ani jeść w miejscach obróbki próbek i odczynników.

- Nosić jednorazowe rękawice laboratoryjne, ubiór ochronny oraz okulary ochronne w trakcie pracy z odczynnikami z zestawu lub próbkami. Po pracy umyć dokładnie ręce.

- Po przeprowadzeniu oznaczenia należy przeprowadzić dekontaminację materiału od pacjenta i innych potencjalnie zakaźnych materiałów.

- Odczynniki powinny być przechowywane bezpiecznie i poza zasięgiem osób nieupoważnionych np. dzieci.

10.2 Usuwanie Należy przestrzegać odpowiednich przepisów. Pos : 47 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Liter atur/Liter atur @ 13\mod_1396939862911_58.doc @ 59088 @ 1

11 BIBLIOGRAFIA

Bibliografia dotycząca testów SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus jest dostępna na końcu niniejszej instrukcji użytkowania. === Ende der Liste für T extmar ke Inhalt ===


Epstein-Barr Virus VCA IgG/IgM, Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG, Epstein-Barr Virus EA IgG ОГЛАВЛЕНИЕ

1 ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

2 ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

3 ПРИНЦИП РАБОТЫ SERION ELISA classic

4 СОСТАВ НАБОРА

5 ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ

6 ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ

7 ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА SERION ELISA classic

7.1 Общие указания

7.2 Подготовка и хранение проб

7.3 Приготовление реагентов

7.4 Схема проведения анализа

7.5 Проведение анализа вручную

7.6 Проведение теста в автоматическом режиме

7.7 Положительный контроль / контроль достоверности

7.8 Ликворная диагностика

8 ОБРАБОТКА ДАННЫХ ТЕСТА


8.2 Области пограничных значений

8.3 Диапазон количественных измерений

8.4 Автоматическая оценка теста / программное

8.5 Критерии валидности

8.6 Интерпретация результатов

8.7 Референсный диапазон значений, полученный для здоровой популяции людей

9 ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ

9.1 Чувствительность и специфичность

9.2 Воспроизводимость

10 МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ

10.1 Предостережения и меры предосторожности

10.2 Утилизация

11 ЛИТЕРАТУРА

Обновления

Номер версии: V 136.23

Предыдущая версия: V 22.11/12-1

Изменение в главе: полностью переработано

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Pos : 1 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/U pdate @ 15\mod_1406189600723_78.doc @ 65582 @ Pos : 2 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/Einl eitung " Enzymimmunoassay" @ 4\mod_1255336385816_78.doc @ 21177 @


Иммуноферментный набор для определения человеческих

антител для диагностики in vitro Pos : 3 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Bes tell nummern/EBV: Bes tellnummern @ 0\mod_1188368235293_78.doc @ 6502 @

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG для заказа: ESR1361G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgM для заказа: ESR1361M

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG для заказа: ESR1362G

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG для заказа: ESR1363G Pos : 4 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/Kapitelüberschrif t " Anwendungsber eich" @ 0\mod_1177351044007_78.doc @ 182 @ 1

1 ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ Pos : 5 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Anwendungsber eich/EBV: Anwendungsbereich @ 14\mod_1404456157024_78.doc @ 61982 @

Иммуноферментные тест-наборы SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG, VCA IgG/IgM и EBNA1 IgG это качественные и количественные тесты для выявления антител человека к вирусу Эпштейна-Барра (EBV) в сыворотке или плазме. Тесты SERION ELISA classic EBV EA IgG и SERION ELISA classic VCA IgM применяют для определения наличия острой или реактивированной инфекции. Тест SERION ELISA classic EBV VCA IgG служит для определения первичной или уже перенесенной инфекции. Тест SERION ELISA classic EBV EBNA1 IgG служит только для выявления прошедших инфекций. Тесты SERION ELISA classic EBV VCA и EBNA1 IgG были утверждены для выявления интратекально образующихся антител для ликворной диагностики. Pos : 6 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/Allgemei ne T exte ELISA cl assic/Kapitelüberschrif t "Diag nostische Bedeutung" @ 0\mod_1177351537598_78.doc @ 233 @ 1

2 ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ Pos : 7 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für nur ein Dokument/Di agnostische Bedeutung/EBV: Diagnostische Bedeutung @ 15\mod_1421651635398_78.doc @ 66982 @

Вирус Эпштейна-Барра (EBV) является патологическим для человека ДНК-вирусом из семейства герпесных вирусов. Вирус Эпштейна-Барра распространен во всем мире. Как у всех герпесных вирусов степень зараженности очень высока и достигает у взрослых от 90 % до 95 %. В так называемых развивающихся странах первичная инфекция появляется в первые годы жизни и протекает часто субклинически. Наоборот, в странах с высоким уровнем гигиены первичная инфекция происходит не так рано. Чаще всего она встречается у подростков и молодых людей. Возрастной пик приходится на 15-20-летних. У прим. 50 % инфицированных картина заболевания развивается как при инфекционном мононуклеозе. Заражение в основном происходит через контакт со слюной. Занесение инфекции через консервы крови или при пересадке костного мозга не так часты.

В рамках первичной инфекции сначала заражаются слюнные железы. Через слюну затем заражаются клетки носовой полости. На этой стадии заболевание протекает с похожими на грипп симптомами. Через последующее заражение В-лимфоцитов вирус распространяется по всему организму. В-лимфоциты стимулируются вирусом к пролиферации, которая обычно контролируется иммуной системой. Инфицированные В-клетки можно выявить как характерные атипичные лимфоциты в периферийной крови. Эти клетки имеют изменчивые формы с заметной базофильной цитоплазмой и явно выраженным ядром клетки. При дальнейшем развитие заболевания возможна высокая температура, спленомегалия, лимфаденит, тромбоцитопения и гепатит. Из-за способа распространения заболевания, происходящего в основном через слюну, клиническую картину первичной инфекции, инфекционный мононуклеоз (IM или железистая лихорадка), называют также «болезнь поцелуев». В редких случаях острый инфекционный мононуклеоз может перейти в хроническую активную инфекцию. При этом симптомы

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инфекционного мононуклеоза сохраняются длительное время. Патогенез данного заболевания еще не выяснен до конца. В качестве возможной причины рассматривается генетическая предрасположенность и/или инфекция с сильным литическим родом вируса.

В определенных районах вирус Эпштейна-Барра тесно связан с проявлением заболевания карциномы носоглотки. Эта опухоль носоглоточной полости состоит из недифференцированных эпителиальных клеток и очень склонна к метастазам. Заболевание широко распространено, однако чаще всего встречается в определенных южных районах Китая. Наряду с генетической предрасположенностью обсуждается в качестве сопровождающего фактора так же возможность влияния окружающей среды, например определенного питания.

Еще одну опухоль, Буркитт-лимфома (BL), так же связывают с вирусом Эпштейна-Барра. Эта моноклональная В-клеточная опухоль часто встречается в Африке и на Папуа Новой Гвинее, т.е. в регионах с высокой степенью заболеваемости малярией. В более чем 90% этих лимптом выявляется вирус Эпштейна-Барра. Поскольку плазмодийные инфекции оказывают влияние на иммунную реакцию, наличие малярии обсуждается, как возможный сопровождающий фактор при возникновении Буркитт-лимфомы. Отдельными случаями BL может возникать и в других частях света. В таких случаях вирус очень редко бывает установлен в опухолях, что делает возможным предположение наличия других сопутствующих факторов (напр. генетические изменения хромосомной транслокации) для возникновения лимфомы.

Сразу после заражения вирусом Эпштейна-Барра в организме пациента образуются антитела IgM к ранним антигенам Early Antigen (EA). Максимальная концентрация антител наблюдается в то время, когда появляются симптомы заболевания. Через 2 недели после заражения начинают вырабатываться антитела EA IgG, VCA(Virus Capsid Antigen) IgM и VCA IgG. Наибольшая концентрация антител VCA IgM бывает три недели после появления симптомов. Антитела EA IgG можно часто установить спустя длительное время после инфекции. После этого сначала понижается концентрация антител VCA IgM и позже EA IgG. Антитела VCA IgG достигают максимальной концентрации через 6 недель после появления симптомов и сохраняются на этом уровне всю жизнь. Через 3 недели после появления симптомов начинается образование антител EBNA 1 IgG, которые служат показателем прошедшей EBV-инфекции. Максимального значения они достигают примерно через семь месяцев. Концентрация антител EBNA 1 gG остается при нормальном течении EBV-инфекции всю жизнь на высоком уровне. При реактивировании, напр. через иммунную супрессию, титр антител EA IgG в большинстве случаев значительно возрастает, в то время как титр VCA IgM в большинстве случаев не повышается. Только в редких случаях после иммунной супрессии может произойти утрата антител EBNA 1 IgG, так что наличие антител EA IgG является надёжным показателем реактивирования. Pos : 8 /Arbeitsanl eitung en ELISA classi c/Gültig für alle D okumente/ELISA cl assic/T es tprinzip/Tes tpri nzip ELISA classic @ 4\mod_1255342796551_78.doc @ 21220 @ 1

3 ПРИНЦИП РАБОТЫ SERION ELISA classic

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) - это иммунологический метод, широко используемый в инфекционной серологии для выявления антигенов и антител. Реакция основывается на специфическом взаимодействии соотвествующих друг другу антител и антигенов. Стрипы микротитровального планшета SERION ELISA classic покрыты специфическими антигенами диагностируемого возбудителя инфекции. Если в сыворотке пациента присутствуют антитела к возбудителю, то они связываются с антигенами стрипов. Для

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детекции образовавшихся таким образом иммунных комплексов, используются вторичные антитела, меченные щелочной фосфатазой. Фермент катализирует реакцию, в результате которой бесцветный субстрат нитрофенилфосфат-р преобразуется в окрашенный продукт нитрофенол-р. Интенсивность окраски продукта реакции пропорциональна концентрации антител в пробе и измеряется фотометрическим методом. Pos: 9 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für nur ein Dokument/Inhalt und Zusammensetzung/EBV: Inhalt und Zusammensetzung @ 14\mod_1404461827273_78.doc @ 62090 @ 1 4 СОСТАВ НАБОРА Компоненты набора Колич./

объём

8-луночные стрипы; лунки с иммобилизованными антигенами (всего 12 стрипов по 8 лунок), MTP , 1 рамка держатель. Напыленный материал деактивирован.

12 кусок

Стандартная сыворотка (готовая к использованию) STD , Человеческая сыворотка в фосфатном буфере с протеином; отрицательная в отношении антител к HIV, антигенов HBs -Ag (поверхностных антигенов вируса гепатита B) и антител к HCV; консервант: < 0,1 % азид натрия; Краситель: Amaranth O

2 x 2 мл

Отрицательная контрольная сыворотка (готовая к использованию) NEG , Человеческая сыворотка в фосфатном буфере с протеином; отрицательная в отношении антител к HIV, антигенов HBs –Ag (поверхностных антигенов вируса гепатита B) и антител к HCV; консервант: < 0,1 % азид натрия; Краситель: Lissamin-зеленый V

2 мл

Конъюгаты к человеческим IgG, IgA, IgM (готовые к использованию) APC Поликлональные антитела к человеческим IgG, IgA, IgM, конъюгированные со щелочной фосфатазой, стабилизированные протеиновым стабилизирующим раствором; Консервант: < 0.1 % метилизотиазолон, < 0.1 % бромнитродиоксан

13 мл

Концентрат раствора для промывания (доводится до 1000 мл) WASH , Раствор хлорида натрия с Tween 20, 30 mM Tris/HCl, pH 7,4; Консервант: < 0,1 % азид натрия

33,3 мл

Буфер для разведения (готовая к использованию) DILB или специальный буфер для разведения S1 (готовая к использованию) DILBS1 (специальный буфер для разведения для SERION ELISA classic EBV EA IgG. Встряхнуть непосредственно перед использованием!) Фосфатный буфер с протеином, Tween 20 ( DILB ) и лизатом E. coli; ( DILBS1 ); Консервант: < 0,1 % азид натрия; Краситель: 0,01 г/л бромфеноловой голубой.

2 x 50 мл

Стоп-реагент (готовые к использованию) STOP , < 0,1 Н гидроксид натрия, 40 мM EDTA

15 мл

Субстрат (готовый к употреблению) pNPP , паранитрофенилфосфат; Консервант: < 0,1 % азид натрия

13 мл

Сертификат контроля качества со стандартной кривой и таблицей значений INFO , (количественное выражение антител в мЕд/мл или Ед/мл)

2 стр.


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5 ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ

- Обычное лабораторное оборудование - Для определения IgM: SERION Rf-Absorbent (кат.номер Z200 (20 ml)) - Фотометр для микротитровальных планшетов со светофильтром на 405 нм и с

референтным сфетофильтром на 620 - 690 нм (например, 650 нм) - Устройство для промывки микротитровальных планшетов - Инкубатор 37°C - Влажная камера - Дистиллированная вода - Зажимы ( для заказа VT120) - Дополнительно: SERION ELISA control Pos : 11 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Lag erung und Hal tbar kei t/Lager ung und Haltbar keit @ 13\mod_1397031131719_78.doc @ 59220 @ 1

6 ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ

Реактив Хранение Срок годности

8-луночные стрипы микротитровального планшета (покрытые антигеном)

в закрытом виде

после вскрытия хранить в закрытой алюминиевой упаковке с влагопоглотителем при 2-8 °C

До истечения срока годности

Минимальный срок годности 4 недели

Контрольные/ стандартные сыворотки

в закрытом виде / после вскрытия упаковки при 2-8°C


Конъюгат в закрытом виде / после вскрытия упаковки при 2-8°C


Буфер для разведения



Раствор для промывки


Готовый раствор при 2 – 8 °C

Готовый раствор при комнатной температуре


2 недели

1 неделя

Субстрат в закрытом виде / после вскрытия упаковки при 2-8°C


Стоп-раствор в закрытом виде / после вскрытия упаковки при 2-8°C


Pos: 12 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Testdurchführung/Überschrift: Durchführung @ 0\mod_1184679699953_78.doc @ 2485 @ 1

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7 ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА SERION ELISA classic Pos : 13 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Allgemeine Hi nweise ELISA cl assic @ 12\mod_1379504700667_78.doc @ 57740 @ 2

7.1 Общие указания

Лишь строгое соблюдение рабочей инструкции обеспечивает правильность результатов. При использовании набора SERION ELISA classic необходимо работать исключительно с реагентами SERION ELISA classic, и не заменять их реагентами других производителей. Стандартные и контрольные сыворотки, в зависимости от лота адаптированы к конкретному набору и не могут использоваться в наборах других лотов. Буфер для промывывания, субстрат и стоп-реагент могут использоваться во всех тестах SERION ELISA classic независимо от лота и наборов.

В каждом наборе SERION ELISA classic имеется готовый к использованию буфер для разбавления проб. При использовании некоторых тестов SERION ELISA classic необходимо применение специального буфера для разбавления, чтобы добиваться неизменно высококачественных результатов. Буферы для разбавления применяются вне зависимости от лота.

Для каждого класса иммунноглобулинов (IgA, IgG, IgM) имеются три разные концентрации конъюгата, которая указана на этикетке соответственно + как (низкая), ++ (средняя) и +++ (высокая). Конъюгаты одинаковой концентрации и класса иммунноглобулина могут использоваться с другими тестами SERION ELISA classic независимо от лота и набора. Неправильное разведение реагентов может привести к понижению чувствительности. При аликвотировании реактивов следует соблюдать правила стерильности для предотвращения микробной контаминации.

Воспроизводимость результатов зависит, кроме прочего, от тщательного перемешивания реагентов. Контрольные сыворотки и разведенные сыворотки пацентов необходимо тщательно перемешать перед использованием (например, с помощью вортекса).

При постановке анализа необходимо следить за аккуратным раскапыванием лунок и соблюдать указанные в инструкции время и температуру инкубации. Значительные различия во времени между заполнением первой и последней лунок при внесении проб пациентов, контрольных сывороток, конъюгата и субстрата приводят к различиям инкубационного периода, которые могут значительно повлиять на точность и воспроизводимость измеренных значений. Реагенты при хранении и использовании необходимо защищать от прямых лучей солнца.

Правильная промывка предовтращает неспецифическое взаимодействие. Поэтому необходимо следовать руководству по применению используемых приборов для промывания. Важно равномерное заполнение промывающим буфером и опорожнение лунок планшета во время промывки. Следует избегать образования пены!

После использования плотно закрыть упаковку, во избежание высыхания и бактериального загрязнения. Необходимо следить за тем, чтобы флаконы закрывались своими крышками.

Результаты теста SERION ELISA classic можно учитывать лишь в том случае, если соблюдены все критерии валидности, приведенные в сертификате контроля качества, прилагаемом к набору. Pos : 14 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Probenvor ber. und Lager ung (für ALLE Err eger auß er Borreli a, CM V, FSM E, H SV,Masern,Mumps,R öteln,VZ V) @ 8\mod_1263998040982_78.doc @ 28442 @ 2

7.2 Подготовка и хранение проб

Липидные, гемолизированные, а также иктеричные пробы (сыворотка или плазма) следует использовать с особым вниманием. Пробы, загрязненные бактериями, использовать не следует. Пригодными для исследований материалами являются пробы сыворотки или плазмы (EDTA, цитрат, гепарин), полученные стандартными лабораторными методами. Пробы нельзя деактивировать термическим способом. Pos : 15 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Kapi tel überschrift Probenverdünnung @ 0\mod_1184679414434_78.doc @ 2345 @ 3

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7.2.1 Разведение проб

Перед началом теста пробы (V1) развести в буфере для разведения (V2) Pos : 16 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung, T eil 1 @ 5\mod_1256050091616_78.doc @ 22830 @ SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EA IgG (специальный разбавляющий буфер B231-S1!)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG (разбавляющий буфер B231)

SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG (разбавляющий буфер B231)

Разбавляющий буфер SERION ELISA classic EBV EA IgG (B231-S1) нельзя заменять разбавляющим буфером SERION ELISA classic EBV VCA и EBNA1.

V1 + V2 = 1 + 100 по 10 мкл пробы пациента на каждые 1000 мкл разбавляющего буфера


SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgM Pos: 18 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für mehrere Dokumente/Testdurchführung/Probenverdünnung: Rheumafaktor-Interferenz (für Tests mit IgM-Nachweis) @ 9\mod_1316422765852_78.doc @ 36519 @ Интерференция с ревматоидным фактором Ревматоидные факторы – это аутоантитела, главным образом, относящиеся к антителам класса M (IgM), связывающие иммунные комплексы IgG антител. Присутствие неспецифических антител IgM (ревматоидных факторов) может привести к ложноположительным результатам при определении специфических антител IgM. Более того, существует вероятность вытеснения IgM-антител с более слабыми связями IgG-антителами с более сильными связями. Результаты по IgM в этом случае окажуться ложноотрицательными. По этой причине пробы для определения IgM необходимо предварительно обработать абсорбентом ревматоидного фактора SERION-Rheumafaktor-Absorbens (кат. номер Z200 (20 мл/100 определений)). Абсорбция ревматоидного фактора происходит путем инкубирования пробы пациента в Rf-буфере в течение 15 минут при комнатной температуре или в течение ночи при температуре 4° C. Данная процедура описана в специальной инструкции по применению. Pos : 19 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/Probenverdünnung/EBV: Pr obenver dünnung T eil 3 @ 5\mod_1256050082945_78.doc @ 22814 @ 0\mod_1190033756400_78.doc @ 10752 Сначала производится разбавление абсорбента ревматоидного фактора (V1) разбавляющим буфером (V2) в соотношении 1+4.

V1 + V2 = V3 (1 + 4) по 200 мкл Rf-абсорбента на каждые 800 мкл разбавляющего буфера

Затем пробы пациента (V4) разбавляются в смеси Rf и разбавляющего буфера (V3):

V4 + V3 = 1+100 по 10 мкл пробы пациента на каждые 1000 мкл Rf -разбавляющего буфера Pos : 20 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenver dünnung: Mischung der Proben @ 4\mod_1255343607624_78.doc @ 21300 @

После каждого разведения и перед отбором пробы следует хорошо размешать мономиксером (например, Vortex) для получения гомогенного раствора. Pos : 21 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Pr obenlager ung @ 4\mod_1255343526141_78.doc @ 21284 @ 3

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7.2.2 Хранение проб Пробы пациентов должны храниться не более 7 дней при температуре 2-8°C. Более длительное хранение проб возможно при температуре ≤ -20°C. Следует избегать повторных циклов замораживания и оттаивания. Разведенные пробы могут храниться при 2-8°C в течение одной недели. Pos : 22 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Reagenzienvorberei tung - KOMPLETT @ 12\mod_1379504953325_78.doc @ 57776 @ 23333333

7.3 Приготовление реагентов Перед использованием все реагенты должны быть прогреты до комнатной температуры.

7.3.1 Стрипы планшета

Тестовые стрипы, помеченные сокращениями для обозначения возбудителя и класса иммунноглобулина, упакованы с осушителем в закрытом пакете из алюминиевой фольги. Пакет следует разрезать только вдоль спаянного шва, чтобы можно было опять закрыть его. Ненужные стрипы и лунки следует извлечь из рамки и снова положить в герметически закрывающийся алюминиевый пакет с осушителем. При повреждении или неплотной упаковке микротитровальные стрипы не следует больше использовать.

7.3.2 Контрольные сыворотки / стандартные сыворотки (готовый к использованию)

Контрольная и стандартная сыворотки готовы к использованию, их не следует разбавлять или обрабатывать абсорбентом ревматоидного фактора. При каждом тесте независимо от количества используемых тестовых стрипов должны проводиться у контрольных сывороток простой, а у стандартных и Cut off – сывороток двойной анализ.

7.3.3 Конъюгат к человеческим IgA, IgG или IgM АР-конъюгат (готовый к использованию)

Концентрация конъюгата (+, ++, +++) указана в сертификате контроля качества. Обращайте дополнительно внимание на данные на этикетке.

7.3.4 Раствор для промывки (концентрат)

Концентрат раствора для промывки (V1) разбавить дистиллированной водой в соотношении 1:30 до конечного объема (V2). Пример:

Концентрат раствора для промывки (V1)

Конечный объем (V2)

33,3 ml 1000 ml

1,0 ml 30 ml

7.3.5 Буфер для разведения проб (готовый к использованию)

7.3.6 Субстрат (готовый к использованию)

Возможно лёгкое жёлтое окрашивание неоткрытого субстрата, не влияющее на качество!

7.3.7 Стоп-реагент (готовый к использованию)

eis) @ 0\mod_1184741119299_78.doc @ 2882 Pos: 23 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Testdurchführung/Testablauf/Überschrift Testablauf @ 0\mod_1180955922843_78.doc @ 745 @ 2

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7.4 Схема проведения анализа Pos : 24 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testdurchführ ung/T establauf/EBV: T establ auf @ 5\mod_1256047227345_78.doc @ 22686 @


количественный Для выявления IgM антител провести предварительную Rf-абсорбцию проб, см. пункт

7.2.1; инкубировать 15 минут при комнатной температуре или ночь при 4°C.

Разбавление проб1

(пробы пациентов) 1 + 100


Внесение разведенных проб пациентов и

готовых к использованию контрольных/стандартных сывороток в лунки планшета (100 мкл)

ИНКУБАЦИЯ 60 мин./37°C влажная камера

ПРОМЫВКА (4 x 300 мкл DIL WASH ]) 2

Внесение раствора конъюгата APC (100 мкл)


ПРОМЫВКА (4 x 300 мкл DIL WASH ]) 2

Внесение раствора субстрата pNPP (100 мкл)


Внесение стоп-реагента STOP (100 мкл)

ИЗМЕРЕНИЕ ПОГЛОЩЕНИЯ при 405 нм

1Специальный буфер для разведения для следующих наборов SERION

ELISA classic: Borrelia IgG, IgM, EBV EA IgG, Hantavirus Puumala IgG, IgM. 2При проведении анализа вручную: после промывки хорошо вытряхнуть планшет на бумажные салфетки.


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7.5 Проведение анализа вручную

1. Установить необходимое количество лунок в рамку держатель и составить протокол маркировки лунок.

2. Внести по 100 мкл разведенных проб и готовых к использованию контрольных образцов в соответствующие лунки планшета. Оставьте одну лунку пустой для субстратного бланка, например:

Лунка количественный ELISA

A1 Субстратный бланк

B1 Отрицательный контроль

C1 Стандартная сыворотка

D1 Стандартная сыворотка

E1 Пациент 1....

F1 Пациент 2....

3. Инкубация проб 60 минут (+/- 5 мин.) при 37°C (+/-1°C) во влажной камере.

4. По истечении времени инкубации, промойте планшет (в промывателе или вручную): - аспирируйте содержимое лунок или удалите ее из лунок вытряхиванием - в каждую лунку внесите по 300 мкл промывочного раствора - аспирируйте промывочный раствор или удалите его вытряхиванием - повторите процедуру 3 раза (т.е. всего 4 раза) - удалите остатки жидкости постукиванием планшета в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.

5. Добавление конъюгата Внести по 100 мкл готового к использованию IgA/IgG/IgM конъюгата в соответствующие

лунки планшета (кроме лунок для определения субстратного бланка). 6. Инкубация конъюгата в течение 30 минут (+/-1 мин.) при 37°C

(+/-1°C) во влажной камере.

7. По истечении времени инкубации промойте лунки (см. выше).

8. Добавление субстрата

Внести по 100 мкл готового к использованию раствора субстрата во все лунки (в т.ч. и в лунку для субстратного бланка).

9. Инкубация субстрата в течение 30 минут (+/- 1 мин.) при 37°C

(+/1°C) во влажной камере.

10. Остановка реакции Внесите по100 мкл стоп-раствора во все лунки, слегка встряхните планшет.

11. Измерение поглощения Измерить оптическую плотность в лунках при длине волны 405 нм в течении 60 минут против бланка по субстрату. Референтная длина волны в пределах 620-690 нм (например, 650 нм).


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7.6 Проведение теста в автоматическом режиме

Наборы SERION ELISA пригодны для применения с приборами ImmunomatTM и Gemini а также DYNEX DSX® и DS2® и с приборами, построенными по их типу. Автоматический процесс аналогичен ручному анализу. Учтите, что при особых условиях работы может возникнуть необходимость в лабораторной адаптации времени инкубации субстратом. Pos : 28 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estdurchführung/Positi vkontroll e / Richtigkeitskontroll e @ 8\mod_1260286311409_78.doc @ 27542 @ 2

7.7 Положительный контроль / контроль достоверности

Для проведения внутрилабораторного контроля качества исследований, проведенных с использованием наборов SERION ELISA classic, мы рекомендуем использовать контрольные материалы SERION ELISA control. Процедура применения контрольных материалов описана в отдельной инструкции по использованию. Pos : 29 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estdurchführ ung/Liquordi agnosti k ( für Borr elia + FSM E + VZV + EBV + Infl uenza) @ 9\mod_1271682242806_78.doc @ 32132 @ 2

7.8 Ликворная диагностика

Набор SERION ELISA classic EBV VCA IgG, EBV EBNA1 IgG предназначен для обнаружения интратекальных антител и пригоден для ликворной диагностики. Он также служит для выявления и дифференцирования воспалительных процессов в центральной нервной системе (ЦНС). Проведение теста описано в особой инструкции по использованию. Программное обеспечение по обработке данных теста дает возможность расчета показателей антител по схеме проф. Ганзотто Райбера (Prof. Hansotto Reiber). Pos : 30 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: TESTAU SWER TUNG + Erreg er @ 1\mod_1197038305478_78.doc @ 11398 @ 12

8 ОБРАБОТКА ДАННЫХ ТЕСТА


Математическая кривая калибровки для определения количества антител с помощью тест-наборов SERION ELISA classic основана на логистической функции с 4-мя параметрами (4 PL) .

Четыре параметра А, В, С, и Д характеризуют точное прохождение стандартной кривой: Параметр A: нижняя асимптота (OD) Параметр B: возрастание кривой Параметр C: точка перегиба Параметр D: верхняя асимптота (OD)

Институт Вирион\Serion ГмбХ (Virion\Serion GmbH) для каждой партии наборов SERION ELISA classic определяет стандартные кривые 4 PL по результатам нескольких тестов при соблюдении оптимальных условий. Четыре параметра указаны в сертификате контроля качества теста SERION ELISA classic.

Поправочный фактор F для адаптации уровня теста пользователя к заданной стандартной кривой 4 PL расчитывается из данного в сертификате контроля качества показателя референтного OD и замеренного специфического OD хода теста стандартной сыворотки (STD):

)1)(

ln(1

)/(−

−∗

−−

=AFPatientOD

AD

BC

emlUActivity

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Путем умножения всех оптических измеренных сигналов (OD) на поправочный коэффициент F уровень теста пользователя адаптируется к заданной 4 PL стандартной кривой. Внутритестовые колебания выравниваются и таким образом возможно количественное определение антител с помощью заданной стандартной кривой. Для расчета активности антител из оптических сигналов (OD) проб пациентов после вычета значения холостого субстрата из всех измеренных значений и выведения средней величины OD (mean value, MV) стандартной сыворотки (STD) двойного нанесения, имеются различные возможности, которые описаны в отдельной инструкции. Pos : 32 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für mehrer e D okumente/T estauswertung/Grenzwertber eich ( für T es te mehrerer Ig-Klassen) @ 12\mod_1375360254888_78.doc @ 57409 @ 2

8.2 Области пограничных значений

Области пограничных значений SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG, EBV EA IgG указаны в сертификате контроля качества и обозначают области пограничных результатов измерения. Оценка пробы пациента ниже области пограничных значений характеризует отрицательный результат теста; оценка пробы пациента выше области пограничных значений интерпретируется как положительный результат теста. Pos : 33 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Quantifi zierungsgrenzen @ 6\mod_1258098664276_78.doc @ 24412 @ 2

8.3 Диапазон количественных измерений

Диапазон количественных измерений, указанный в сертификате по контролю качества SERION ELISA classic EBV VCA IgG/IgM, EBV EBNA1 IgG, EBV EA IgG, является диапазоном, в котором сохраняется линейность разведений. Если значение поглощения образца выше верхней границы диапазона измерений, сыворотку необходимо развести и измерить повторно. Полученное значение нужно умножить на коэффициент разведения. Pos : 34 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Automatische Tes tauswertung @ 12\mod_1375166354143_78.doc @ 57330 @ 2

8.4 Автоматическая оценка теста / программное

Для автоматической оценки теста оптических сигналов измерения мы охотно поставим Вам программное обеспечение SERION easyANALYZE, программное обеспечение SERION evaluate, а также базирующуюся на Microsoft® Excel® помошника для оценки SERION activity . Pos : 35 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: Tes tgültig kei tskriterien @ 12\mod_1375166094763_78.doc @ 57312 @ 2

8.5 Критерии валидности

- Значение OD субстратного бланка < 0,25. - Отрицательный контроль дает отрицательный результат - При количественном методе SERION ELISA classic, полученное среднее значение OD

стандартной сыворотки, после вычета значения субстратного бланка, должно быть в пределах диапазона валидности, указанного в сертификате контроля качества данного лота.

- При качественном методе SERION ELISA classic полученное среднее значение OD положительного контроля и среднего значения Cut off сыворотки, после вычета значения субстратного бланка, должно быть в пределах диапазона валидности, указанного в сертификате контроля качества данного лота.

- Отдельные значения OD стандартной сыворотки или Cut off сыворотки не должны расходиться более чем на 20 % (CV<20%).

Если эти критерии не выполняются, тест является недействительным и его необходимо повторить.

valueODSTDmeasured


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Pos : 36 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: Interpretation der Ergebnisse @ 0\mod_1190013774869_78.doc @ 9952 @ 2

8.6 Интерпретация результатов Pos : 37 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Testauswertung: Inter pretation der Ergebnisse @ 12\mod_1375363155925_78.doc @ 57418 @

Положительный результат подтверждает наличие специфических антител. Отрицательный результат показывает, что в сыворотке нет клинически релевантной активности антител к возбудителю, но не исключает свежей инфекции. В случае пограничного результата невозможна точная оценка пробы пациента. В таком случае следует повторить тест через одну-две недели на новой сыворотке (парные сыворотки). Pos : 38 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Inter pretation der Ergebnisse @ 15\mod_1421652419778_78.doc @ 67001 @ Диагноз первичной инфекции (Infektiöse Mononukleose, IM) основывается в основном на выявлении антител к ранним антигенам (Early Antigen) и протеиновым комплексам вирусных капсидных протеинов (Virus-Capsid-Antigen, VCA). Значение и проявление антител к VCA уже давно доказано. Вскоре после инфицирования вирусом появляются IgM-антитела к EA и VCA, которые исчезают с затуханием острой инфекции или существуют с незначительной активностью. Напротив, IgG-антитела к VCA, возникающие почти одновременно или с легким запозданием, персистируют всю жизнь, при этом их активность вариируется. В случае реактивирования (напр. после иммунной супрессии) заметно увеличиваются антитела VCA IgG и ЕА IgG. В редких случаях можно опять выявить наличие VCA IgM антител. После реактивирования, а так же при лимфоме Буркитта или карциноме носоглотки характерен очень высокий уровень антител VCA IgG. Кроме того, диагноз карциномы носоглотки дополнительно подтверждается при выявлении антител VCA IgА. Повышенный уровень антител ЕА так же характерен у пациентов с диагнозом карциномы носоглотки и после реактивирования. Спустя много недель после первичной инфекции образуются антитела к ЕВV ядерному антигену 1 (EBNA 1), которые персистируют до конца жизни. При иммунной супрессии может произойти утрата антител к EBNA 1. Наряду с антителами VCA IgG они служат признаком имеющейся давней инфекции. Констелляция EBNA 1 IgG и VCA IgG рассматривается как прошедшая инфекция. После реактивирования, напр. после пересадки органов, часто наблюдается резкое снижение антител EBNA 1 IgG. При этом часто опять возрастают VCA специфические антитела IgG и опять образуются антитела к раннему антигену. Пограничные результаты в тесте SERION ELISA classic EBNA 1 IgG при одновременном положительном результате SERION ELISA classic EBV VСА IgG расцениваются как положительные, поскольку серологическая констелляция антител указывает на давнюю инфекцию. В следующей таблице представлены возможные констелляции антител и их диагностическое значение.

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Общая схема интерпретации: Общая схема интерпретации в первую очередь служит помочь отличить серонегативность, первичную инфекцию и давнюю инфекцию при помощи четырех важных серологических признаков EA IgG, VCA IgG, VCA IgM и EBNA 1 IgG.

EA IgG VCA IgM VCA IgG EBNA1 IgG Оценка

- - - - серонегативность

+ - - -

Свежая инфекция

- + - -

+ + - -

+ + + -

+ - + -

- + + -

- - + -

- - + + Давняя инфекция

- - - +

++ - ++ + реактивирование

++ + ++ +

Перекрёстные реакции с антителами к другим герпесным вирусам (напр. CMV, HSV, VZV) не могут быть исключены. Pos : 39 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/T estauswertung/Kapi tel überschrift: Refer enzbereiche gesunder Pr obanden @ 8\mod_1258644290978_78.doc @ 26762 @ 2

8.7 Референсный диапазон значений, полученный для здоровой популяции людей

Исследование сывороток случайных доноров из южной области Германии тестом SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus дало следующее распределение: Pos : 40 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Testauswertung/EBV/EBV: Refer enzbereich gesunder Probanden @ 12\mod_1380024245277_78.doc @ 58102 @

SERION ELISA classic число отрицательная пограничная положительная

EBV VCA IgG 131 3 (2,3 %) 2 (1,5 %) 126 (96,2 %)

EBV VCA IgM 131 131 (100 %) - -

EBV EBNA 1 IgG 131 11 (8,4 %) - 120 (91,6 %)

EBV EA IgG 131 92 (70,2 %) 11 (8,4 %) 28 (21,4 %)


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9 ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ Pos: 42 /Arbeitsanleitungen ELISA classic/Gültig für alle Dokumente/ELISA classic/Leistungsmerkmale/Kapitelüberschrift: Sensitivität und Spezifität @ 0\mod_1190013251494_78.doc @ 9937 @ 2 9.1 Чувствительность и специфичность Pos : 43 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Sensi ti vität und Spezifi tät @ 15\mod_1421417016940_78.doc @ 66961 @

Тесты SERION ELISA classic EBV VCA IgG, IgM и SERION ELISA classic EBV EBNA-1 IgG были утверждены в рамках внутриинститутского исследования каждый на 155 сыворотках серологически отрицательных доноров, а также пациентов со свежей и прошедшей инфекцией вируса Эпшнейна-Барр в сравнении с тестом ELISA одного из конкурентов. Определение функциональных параметров теста SERION ELISA classic EBV EA IgG проводилось в рамках внутриинститутского исследования на 96 пробах сывороток здоровых доноров и пациентов со свежей инфекцией Эпштейна-Барр в сравнении с двумя Элизами и одним иммуноблотом ведущего конкурента.

Чувствительность Специфичность





Пограничные результатаы при расчетах чувствительности и специфичности во внимание не принимались. Pos : 44 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Leis tungsmer kmale/Kapi tel überschrift Präzisi on @ 0\mod_1184676568397_78.doc @ 2130 @ 2

9.2 Воспроизводимость Pos : 45 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für nur ein D okument/Leistungsmer kmal e/EBV/EBV: Präzision @ 14\mod_1404457829683_78.doc @ 62018 @


Проба

Среднее значение

поглощения (OD)

Внутрисе-риный VK (%)



Межсерий-ный VK (%)

Сыворотка 1 0,616 4,5 0,637 5,5

Сыворотка 2 0,746 5,3 0,814 6,6

Сыворотка 3 2,125 3,0 2,191 2,8


Проба







Сыворотка 1 0,530 8,7 0,551 7,2

Сыворотка 2 1,582 5,1 1,703 6,4

Сыворотка 3 2,249 7,9 2,311 8,7

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Проба







Сыворотка 1 0,554 2,2 0,644 7,1

Сыворотка 2 1,355 2,4 1,510 4,5

Сыворотка 3 1,437 3,0 1,636 4,5


Проба







Сыворотка 1 0,305 2,8 0,341 8,4

Сыворотка 2 0,952 2,5 1,093 4,1

Сыворотка 3 1,622 3,1 1,799 4,2 Pos : 46 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Allgemei ne Texte ELISA classic/Sicherheitsmaßnahmen @ 12\mod_1374740573162_78.doc @ 57178 @ 122

10 МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ

10.1 Предостережения и меры предосторожности

Тест SERION ELISA classic предназначен только для использования специалистами, безупречно владеющими необходимыми навыками. При обращении с реагентами теста и пробами пациентов необходимо выполнение общепринятых лабораторных правил: - Упаковка теста содержит человеческие сыворотки. Хотя все контрольные сыворотки

отрицательны на anti-HIV-Ab, HBs-Ag (Hepatitis B-Virus-surface Antigen) и anti-HCV-Ab их следует рассматривать, как потенциально инфекционно опасные материалы.

- Не набирайте растворы в пипетку при помощи рта.

- В помещениях, где ведется работа с реагентами набора и пробами пациентов, не разрешается принимать пищу, пить или курить.

- При обращении с реагентами теста и пробами пациентов следует избегать прямого контакта, поэтому следует использвать лабораторный халат, одноразовые перчатки и защитные очки. Руки по окончании работы следует тщательно вымыть.

- Пробы пациентов и все потенциально инфекционные материалы после проведения теста следует подвергнуть обеззараживанию.

- Реагенты необходимо хранить в месте, недоступном для детей.

10.2 Утилизация Пожалуйста, выполняйте предписания, предусмотренные действующим законодательством! Pos : 47 /Ar bei tsanl eitungen ELISA cl assic/Gültig für all e D okumente/ELISA classic/Liter atur/Liter atur @ 13\mod_1396939862911_78.doc @ 59092 @ 1

11 ЛИТЕРАТУРА Список литературы по SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus Вы найдёте в конце данной Инструкции по применению. === Ende der Liste für T extmar ke Inhalt ===

LITERATUR / REFERENCES / RÉFÉRENCES / BIBLIOGRAFIA / BIBLIOGRAFÍA / REFERÊNCIAS / ΑΝΑΦΟΡΕΣ / ODKAZY / BIBLIOGRAFIA / ЛИТЕРАТУРА / REFERENCER / REFERENSER / REFERENCIE / REFERENCE / REFERANSER / REFERENCIÁK [1] Aalto, S. M. (1998) Immunoreactivation of Epstein-Barr Virus Due to Cytomegalovirus

Primary Infection. J. Med. Virol. 56, 186 – 91. [2] Bauer, G. (2001) Simplicity Through Complexity: Immunoblot With Recombinant Antigens

as the New Gold Standard in Epstein-Barr Virus Serology. Clin. Lab. 47, 223 – 30. [3] Dobson, R,, Topping, J., Giovannoni, G. (2013) Comparison of two commercial ELISA

systems for evaluating anti-EBNA1 IgG titers. J. Med. Virol. 85, 128 – 31. [4] Linde, A. (1992) Diagnosis and pathogenesis of infectious mononucleosis and other

Epstein Barr virus-associated disease. Rev. Med. Microbiol. 3, 43 – 51.

8°C

96 96

SERION ELISA classic (V 14/08-1)

Symbole auf den Etiketten/ symbols on labels/ symboles et étiquettes/ simboli sulle etichette/ символы на этикетках/símbolos sobre las etiquetas/ σύµβολα στις ετικέτες/ símbolos nos rótulos / Symboly na štítcích / symboler på etiketter/ symboler på etiketterna/ Symbole na etykietach/ symboly na označení/ Simboli na oznakah/ symbol på etiketter

Hersteller/ Manufacturer/ Fabricant/ Produttore/Производитель/ Fabricante/ Κατασκευαστής/ Fabricante/ Výrobce/ Fremstiller/ Tillverkare/ Producent/ Výrobca/ Izdelovalec/ Produsent

Ausreichend für 96 Tests/ sufficient for 96 tests/ suffisant pour 96 tests/ sufficiente per 96 test/ достаточно для 96 тестов / suficiente para 96 pruebas/ επαρεκεί για 96 δοκιµασίες/ suficiente para 96 ensaios/ stačí na 96 testů/ nok til 96 test/ tillräckligt för 96 tester/ Wystarcza na 96 testów/ postačuje na 96 testov/ Zadostuje za 96 testov/ Tilstrekkelig til 96 tester

LOT Charge/ lot/ lot / lotto/ lote/ παρτίδα/ lote/ šarže/ lot/ lot/ seria/ šarža/ serija/ lot /lot

REF Referenz oder Bestellnummer/ reference or order number/ numéro de référence ou de commande/ numero di riferimento o ordinazione/ ссылка или номер для заказа / referencia o número de pedido/ Αριθµός αναφοράς ή παραγγελίας/ referência ou número para encomenda/ reference nebo číslo objednávky/ reference eller bestillingsnummer/ referens eller beställningsnummer/ Numer referencyjny lub numer zamówienia/ referenčné číslo alebo číslo objednávky/ referenčna ali kataloška številka/ Referanse eller ordrenummer

Lagern zwischen 2 und 8 Grad Celsius/ store between 2 and 8 degree celsius/ entre 2 et 8 degré celsius/ conservare a temperatura compresa tra 2 e 8 gradi centigradi/ хранить при температуре от 2 до 8 градусов цельсия / conservar entre 2 y 8 grados celsius/ Φύλαξη µεταξύ 2 και 8 βαθµούς Κελσίου/ Armazenar entre 2º e 8º Celsius/ uchovávejte při teplotě 2 až 8 °C/ opbevares mellem 2 og 8 grader celsius/ förvara vid 2 till 8 grader Celsius/ Przechowywać w temp. pomiędzy 2 a 8 stopni Celsjusza/ skladovať pri teplote 2 až 8 stupňov Celzia/ Shranjujte pri temperaturi od 2 do 8 C/ Oppbevares mellom 2 og 8 grader Celsiu

CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79 EG/ CE marking according to IVD guideline 98/79 EC/ Étiquetage CE selon les directives DIV/ marcatura CE in conformità alla direttiva IVD 98/79 EC/ маркировка СЕ согласно директивам IVD 98/79 /marca CE según la directiva IVD 98/79 CE/ Σήµανση CE σύµφωνα µε την οδηγία IVD 98/79 EΕ/ Marcação CE de acordo com a Directiva 98/79/ značení CE podle směrnice IVD 98/79/ES/ CE-mærkning iht. IVD-retningslinje 98/79/EF/ CE-märkning enligt riktlinjerna för IVD i direktiv 98/79/EC/ Oznakowanie CE zgodne z wytycznymi dot. diagnostyki in vitro 98/79 EC/ označenie CE podľa smernice IVD 98/79/ES/ oznaka CE, skladna s smernico IVD 98/79/ES/ CE-merking i henhold til IVD-retningslinjer 98/79/EØF

0197 CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79 EG gemäß Anhang II, Liste B/ CE marking according to IVD guideline 98/79 EC according to annex II, list B/ Étiquetage CE selon les directives DIV 98/79 CE selon l'annexe II, liste B/ marcatura CE in conformità alla direttiva IVD 98/79 EC secondo l’allegato II, elenco B/ маркировка СЕ согласно директивам IVD 98/79, приложение II, список В / marca CE según la directiva IVD 98/79 CE de acuerdo con el anexo II, lista B/ Σήµανση CE σύµφωνα µε την οδηγία IVD 98/79 EΕ, σύµφωνα µε το παράρτηµα ΙΙ, κατάλογο Β/ Marcação CE de acordo com a Directiva 98/79/ CE relativo aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro, segundo a lista B do anexo II/ značení CE podle směrnice IVD 98/79/ ES podle příloh II, seznamu B/ CE-mærkning iht. IVD-retningslinje 98/79 /EF iflg. anneks II, liste B/ CE-märkning enligt riktlinjerna för IVD i direktiv 98/79/EC, bilaga II, lista B/ Oznakowanie CE zgodne z wytycznymi dot. diagnostyki in vitro 98/79 EC, zgodnie z aneksem II, lista B/ označenie CE podľa smernice IVD 98/79 ES v znení dodatku II, zoznam B/ oznaka CE, skladna s smernico IVD 98/79/ES in seznamom B v Dodatku II/ CE-merking i henhold til IVD-retningslinjer 98/79/EØF, tillegg II, liste B

Verfallsdatum/ expiry date/ date d'expiration/ data di scadenza/ срок годности до /fecha de caducidad/ ηµεροµηνία λήξης/ data de validade/ datum exspirace/ udløbsdato/ förfallodatum/ data upływu ważności/ dátum exspirácie/ datum izteka roka uporabnosti/ utløpsdatp

MTP Mikrotiterplatte (brechbare Streifen)/ microtiter plate (breakable strips)/ plaque de microtitration (bandelettes détachables)/ piastra per microtitolazione (strisce separabili)/ микротитровальная панель (отрывные стрипы) /placa de microtitulación (tiras rompibles)/ Πλάκα µικροτιτλοποίησης (αποσπωµενες ταινίες)/ placa de microtitulação (tiras quebráveis)/ mikrotitrační deska (rozlomitelné proužky)/ mikrotiterplade (afbrækkelige strimler)/ mikrotiterplatta (brytbara strips)/ Płytka mikrotitracyjna (paski do odrywania)/ mikrotitračná platnička

2°C

(rozlomiteľné prúžky)/ vsebnik za mikrotitriranje (z razdelki, ki jih je mogoče odlomiti)/ Mikrotiterplate (avbrytbare strips)

AG Antigen/ antigen/ Antigène/ antigene/ антиген /antígeno/ αντιγόνο/ antigénio/ antigen/ antigen/ antigen/ Antygen/ antigén/ antigen/ Antigen

AK Antikörper/ antibodies/ Anticorps/ anticorpi/ антитела / anticuerpos/ αντίσωµα/ anticorpos/ protilátky/ antistoffer/ antikroppar/ Przeciwciała/ protilátky/ protitelesa/ Antistoffer

CAG Kontrollantigen/ control antigen/ antigène de contrôle/ antigene di controllo/ контрольный антиген /antígeno de control/ αντιγόνο ελέγχου/ antígeno de controre/ kontrolní antigen/ kontrolantigen/ kontrollantigen/ antygen kontrolny/ kontrolný antigén/ kontrolni antigen/ kontrollantigen

STD Standardserum/ standard serum/ Sérum standard/ siero standard/ стандартная сыворотка /suero patrón/ πρότυπος ορός/ soro padrão/ standardní sérum/ standardserum/ standardserum/ Surowica standardowa/ štandardné sérum/ standardni serum/ Standardserum

POS Positivkontrolle/ positive control/ Contrôle positif/ controllo positivo/ положительные контроли /control positivo/ θετικός έλεγχος/ controlo positivo/ pozitivní kontrola/ positiv kontrol/ positiv kontroll/ Kontrola pozytywna/ pozitívna kontrola/ pozitivna kontrola/ Positiv kontroll

C/O Grenzwertiges Serum/ cut-off serum/ Sérum seuil/ siero cut-off/ сомнительные сыворотки (пограничные)/suero de corte/ οριακός ορός (cut-off)/ soro cut-off/ cut-off sérum/ cutoff-serum/ cutoff-serum/ Surowica „cut-off"/ sérum na určenie hraničnej hodnoty/ mejni serum/ Stoppserum

NEG Negativkontrolle/ negative control/ Contrôle négatif/ controllo negativo/ отрицательные контроли /control negativo/ αρνητικός έλεγχος/ controlo negativo/ negativní kontrola/ negativ kontrol/ negativ kontroll/ Kontrola negatywna/ negatívna kontrola/ negativna kontrola/ Negativ kontroll

APC Alkalisches Phosphatase Konjugat antihuman/ alkaline phosphatase conjugate anti-human/ conjugué phosphatase alcaline anti-humain/ coniugato con fosfatasi alcalina anti-umano/ античеловеческий щелочной конъюгат фосфатазы / conjugado anti humano de fosfatasa alcalina/ Σύζευξη αλκαλικής φωσφατάσης/ conjugado anti-humano com fosfatase alcalina/ konjugát alkalické fosfatázy anti-humánní/ alkalisk phosphatase konjugat antihumant/ antihumant alkaliskt fosfatas-konjugat/ Anty-ludzki koniugat fosfatazy alkalicznej/ konjugát antihumánnej alkalickej fosfatázy/ konjugat alkalne fosfataze, antihumani/ Alkalisk fosfatase-konjugat, anti-humant

++++ niedrig-konzentriertes Konjugat/ conjugate with low concentration/ conjugué à faible concentration/ coniugato

a concentrazione bassa/ конъюгат низкой концентрации /conjugado con concentración baja/ Σύζευξη χαµηλής συγκέντωσης/ conjugado de baixa concentração/ konjugát s nízkou koncentrací/ konjugat med lav koncentration/ konjugat med låg koncentration/ koniugat o niskim stężeniu/ konjugát so strednou koncentráciou/ konjugat z majhno koncentracijo/ Konjugat med lav konsentrasjon

++- mittel-konzentriertes Konjugat/ conjugate with medium concentration/ conjugué à concentration moyenne/

coniugato a concentrazione media/ конъюгат средней концентрации /conjugado con concentración media/ Σύζευξη µέτριας συγκέντρωσης/ conjugado de concentração intermédia/ konjugát se střední koncentrací/ konjugat med medium koncentration/ konjugat med medelhög koncentration/ koniugat o średnim stężeniu/ konjugát so strednou koncentráciou/ konjugat s srednjo koncent/ Konjugat med middels konsentrasjon

++++ hoch-konzentriertes Konjugat/ conjugate with high concentration/ conjugué à concentration élevée/ coniugato a concentrazione alta/ высококонцентрированный конъюгат/ conjugado con concentración alta/ σύζευξη υψηλής συγκέντρωσης/ conjugado de elevada concentração/ konjugát s vysokou koncentrací/ konjugat med høj koncentration/ konjugat med hög koncentration/ koniugat o wysokim stężeniu/ konjugát s vysokou koncentráciou/ konjugat z veliko koncentracijo/ Konjugat med høy konsentrasjon

RF Rheumafaktor-Absorbens (Rf-Absorbens)/ rheumatoid factor absorbent (rf-absorbent)/ absorbant de facteur rhumatoïde (rf-absorbant)/ adsorbente del fattore reumatoide (adsorbente Rf)/ абсорбент ревматоидного фактора (Rf-абсорбент) /absorbente de factor reumatoide (material absorbente de Rf)/ Απορροφητής ρευµατοειδούς παράγοντα (απορροφητής Rf)/ absorvente de factor reumatóide (absorvente de Fr)/ absorbent revmatoidního faktoru (rf-absorbent)/ reumafaktor- absorptionsmiddel (rf-absorptionsmiddel)/ reumafaktor-absorptionsmedel (rf-absorptionsmedel)/ Absorbent czynnika reumatoidalnego (absorbent RF)/ absorbent reumatoidného faktora (absorbent rf)/ absorbent revmatoidnega faktorja (absorbent RF)/ Revmatoid faktor-absorbent (rf-absorbent)

Verdünnungspuffer für Serum/ dilution buffer for sera/ sérum pour le tampon de dilution/ tampone di diluizione per sieri / разбавляющий буфер для сыворотки / solución amortiguadora para los sueros/ ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης για ορούς/ tampão de diluição para soro/ ředicí pufr pro séra/ fortyndingsbuffer til sera/ spädningsbuffert för serum/ bufor rozcieńczający do surowic / pufor na riedenie sér/ pufer za redčenje seruma/ Fortynningsbuffer til serum

DILB

DILBS1

DILBS2

WASH Waschlösungskonzentrat/ washing solution concentrate/ concentré de solution de lavage / soluzione di lavaggio concentrata / промывочный концентрат /concentrado de solución de lavado/ συµπύκνωµα έκπλυσης/ concentrado de solução de lavagem/ koncentrát promývacího roztoku/ vaskeopløsningskoncentrat/ tvättlösningskoncentrat/ Stężony roztwór do płukania/ koncentrát premývacieho roztoku/ koncentrat za raztopino za izpiranje/ Vaskeløsningskonsentrat

pNPP pNPP Substrat/ pNPP substrate/ substrat Pnpp/ substrato pNPP/ pNPP субстрат / sustrato pNPP/ Υπόστρωµα pNPP/ substrato pNPP/ pNPP substrát/ pNPP-substrat/ pNPP-substrat/ Substrat pNPP/ substrát pNPP/ substrat pNPP/ pNPP-substrat

STOP Stopplösung/ stopping solution/ solution d'arrêt/ soluzione di arresto/стоп-раствор/ solución de parada/ διάλυµα διακοπής/ solução de paragem/ zastavovací roztok/ stopopløsning/ stopplösning/ roztwór zatrzymujący reakcję/ ukončovací roztok/ raztopina za ustavitev reakcije/ stoppeløsning

INFO Gebrauchsanweisung, Zertifikat (Standardkurve und Auswertetabelle), CD/ instructions, certificate (standard curve and evaluation table), CD/ instructions, certificat (courbe de référence et tableau d'évaluation), CD/ istruzioni per l’uso, certificato (curva standard e tabella interpretativa), CD/ Инструкция по применению, сертификат (стандартная кривая и таблица для оценки), компактный диск /instrucciones, certificado (curva patrón y tabla de evaluación), CD/ Οδηγίες χρήσης, Πιστοποιητικό (πρότυπη καµπύλη και πίνακας υπολογισµού), CD/ instruções, certificado (curva padrão e tabela de avaliação), CD/ (standardní křivka a vyhodnocovací tabulka), CD/ brugsanvisning, certifikat (standardkurve og evalueringstabel), CD/ instruktioner, certifikat (standardkurva och utvärderingstabell), CD/ Instrukcje, certyfikat (krzywa standardowa i tabela do określania wyników/ CD/ pokyny, certifikát (štandardná krivka a hodnotiaca tabuľka), disk CD/ navodila, certifikat (standardna krivulja in ocenjevalna tabela), CD/ Instruksjoner, sertifikat (standardkurve og evalueringstabell), CD

RTU gebrauchsfertig/ ready-to-use/ prêt à l'emploi/ pronto per l'uso/ готовый к использованию /listo para usar/ έτοιµο προς χρήση/ pronto a utilizar/ připravený k použití/ klar til brug/ bruksfärdig/ gotowy do użycia/ pripravené na použitie/ pripravljen za uporabo/ klar til bruk

CONC Konzentrat/ concentrate/ concentré/ concentrato/ концентрат / concentrado/ Συµπύκνωµα/ concentrado/ koncentrát/ koncentrat/ koncentrat/ Koncentrat/ koncentrát/ koncentrat/ Konsentrat

DIL verdünnen oder lösen in/ dilute or disolve in/ diluez ou dissoudre dans/ diluire o sciogliere in/ разбавить или растворить в /diluir o disolver en/ αραίωση ή διάλυση σε/ diluir ou dissolver em/ nařeďte nebo rozpusťte v/ fortynd eller opløs i/ späd eller lös i/ Rozcieńczyć lub rozpuścić w/ rozriediť alebo rozpustiť v/ razredčite ali raztopite v/ Fortynnes eller løses opp i

AQUA destilliertes Wasser/ aqua detillata/ eau distillée/ acqua distillata/ дистиллированная вода /agua destilada/ αποσταγµένο νερό/ água destilada/ destilovaná voda/ destilleret vand/ destillerat vatten/ woda destylowana/ destilovaná voda/ destilirana voda/ Destillert vann

IVD In-vitro Diagnostik Anwendung/ in-vitro diagnostic use/ utilisation en diagnostic in-vitro/ uso diagnostico in vitro/ использование в диагностике ин-витро /uso diagnóstico in-vitro/ ∆ιάγνωση, χρήση in-vitro/ para diagnóstico in vitro/ diagnostické použití in-vitro/ til in-vitro diagnostik/ in vitro-diagnostisk användning/ do diagnostyki in vitro/ diagnostické použitie in-vitro/ uporaba pri diagnostiki in vitro/ In vitro-diagnostisk bruk


102 Masern Virus / Measles Virus / Rougeole 126 Parainfluenza Virus

103 Mumps Virus / Parotitis virus / Oreillons 127 Mycoplasma pneumoniae

104 Varicella-Zoster Virus (VZV) 128 Adenovirus

105 Herpes simplex Virus 1/2 129 Röteln Virus / Rubella virus / virus de rubéole

1051 Herpes simplex Virus 1 130 Diphtherie / Diphtheria

1052 Herpes simplex Virus 2 1311 Coxiella burnetii (Q-Fieber) Phase 1 / Coxiella burnetii (Q-fever) phase 1

106 Legionella pneumophila 1-7 1312 Coxiella burnetii (Q-Fieber) Phase 2 / Coxiella burnetii (Q-fever) phase 2

107 Echinococcus 132 Aspergillus fumigatus

108 Tetanus 133 Enterovirus

109 Cytomegalovirus 134 Coxsackievirus

110 Toxoplasma gondii 135 Echovirus

112 FSME Virus / TBE Virus 1361 Epstein-Barr Virus VCA

113 Resp. Syncytial Virus (RSV) 1362 Epstein-Barr Virus EBNA 1

114 Dengue Virus/ Dengue 1363 Epstein-Barr Virus Early Antigen

116 Brucella 137 Chlamydia

117 Candida albicans 1371 Chlamydia pneumoniae

118 Helicobacter pylori 1372 Chlamydia trachomatis

120 Bordetella pertussis 138 Yersinia

1201 Bordetella pertussis Toxin 139 Campylobacter jejuni

121 Borrelia burgdorferi 140 Bacillus anthracis

122 Parvovirus B19 141 West Nile Virus

1231 Influenza A Virus 142 Francisella tularensis

1232 Influenza B Virus 145 Hantavirus Puumala

125 Leptospira 147 Leishmania

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Hersteller Manufacturer Fabricant SERION ELISA classic ... · SERION ELISA classic Epstein-Barr Virus VCA IgG/IgM, Epstein-Barr Virus EBNA1 IgG, Epstein-Barr Virus EA IgG INHALTSVERZEICHNIS