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Il conteggio e la identificazione delle cellule ematiche
Malattie ematologiche attese nel Salernitano
Ncasianno
LA Mieloide 25
LA Linfoide 10
Altre 10
Mdi Hodgkin 35
Linfomi non-H 100
Mieloma Multiplo 50
LLinfatica Cronica 70
LMieloide Cronica 15
Totale 315
PROBABILITArsquo DI CURA IN ONCO-EMATOLOGIA
LEUCEMIE ACUTE
ANZIANI 10-20
ADULTI 30-40
GIOVANI 50
LINFOMI NH 30-50
L DI HODGKIN 70-90
MIELOMA MULTIPLO
BMT 20-30
CT 3-4 anni
ABMT x 2 o piugrave
Speranza di guarigione
Remissione Guarigione
LA Mieloide 70 40LA Linfoide bambini 90 70
adulti 80 30Mdi Hodgkin 95 85 Linfomi non-H 70 50Mieloma Multiplo 70 0LLinfatica Cronica 90 0 LMieloide Cronica 95 TMO 60
IFN 15 Inibitori tirosinkinasi
Lrsquoobiettivo della terapia egrave sempre la guarigione
Scelta del trattamento piugrave adeguato vuol dire fare un bilancio fra rischi e benefici attesi
I trattamenti intensivi aumentano le possibilitagrave di guarigione mandash espongono a maggiori rischindash peggiorano la qualitagrave di vita
Quanto costa curarsi 6 mesi di terapia
Leucemia - chlorambucil Euro 72
Linfatica - fludarabina 8622
Cronica - fluda+rituximab 36294- trapianto autologo 40000
3 anni di terapia
Leucemia - idrossiurea Euro 600
Mieloide - interferone alfa 60000
Cronica - trapianto allogenico 60000- Glivec 101304
MORFOLOGIA
CITOFLUORIMETRIA
CITOGENETICA
BIOLOGIA MOLECOLARE
BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE
VALUTAZIONE MASSE (ecografia tachellip)
DIAGNOSTICA DELLE PATOLOGIE ONCOEMATOLOGICHE
Antonj van Leeuwenhoek nel 1674 trasmise in una lettera alla Royal Society di Londra la prima descrizione dei globuli rossi
Ma molto probabilmente Marcello Malpighi di Bologna fu il primo ad osservare i Globuli Rossi nel 1661 nel lume dei capillari di uomo e animaleEgli li descrisse come ldquoglobuli rubescentirdquo e li localizzograve nelle arterie e nelle vene che aveva appena scoperto
Nel 1877 con la scoperta della colorazione triacida comincia lrsquoera della MORFOLOGIA EMATOLOGICA
Giulio BizzozeroGiulio Bizzozero1846 - 19011846 - 1901
Nel Dicembre 1881 comunicograve allAccademia di Medicina la sua grande scoperta le piastrine come terzo componente morfologico del sangue e la loro importanza nel processo della trombosi
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
MCVHct n GBR
MCVHct n GBR
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
NormociticaMCHC 34 gLnormocromicaMCH 29 pg
MacrociticaMCHC 30 gLIpocromicaMCH 29 pg
MicrociticaMCHC 38 gLIpercromicaMCH 29 pg
Indici di WintrobeIndici di Wintrobe
Elettrodo internoElettrodo interno
Elettrodoesterno
Elettrodoesterno
Flusso del diluenteFlusso del diluente
Vuoto regolatoVuoto regolato
Temps
U
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Volume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelle
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
Metodo OtticoMetodo Ottico
Low angle scatter 2o - 3o (Volume)
High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)
Metodo ottico Metodo ottico due parametridue parametri di di riconoscimento per il globulo rosso riconoscimento per il globulo rosso
Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari
Da 10-20 test al giornoDa 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giornoa centinaia di test al giorno
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Malattie ematologiche attese nel Salernitano
Ncasianno
LA Mieloide 25
LA Linfoide 10
Altre 10
Mdi Hodgkin 35
Linfomi non-H 100
Mieloma Multiplo 50
LLinfatica Cronica 70
LMieloide Cronica 15
Totale 315
PROBABILITArsquo DI CURA IN ONCO-EMATOLOGIA
LEUCEMIE ACUTE
ANZIANI 10-20
ADULTI 30-40
GIOVANI 50
LINFOMI NH 30-50
L DI HODGKIN 70-90
MIELOMA MULTIPLO
BMT 20-30
CT 3-4 anni
ABMT x 2 o piugrave
Speranza di guarigione
Remissione Guarigione
LA Mieloide 70 40LA Linfoide bambini 90 70
adulti 80 30Mdi Hodgkin 95 85 Linfomi non-H 70 50Mieloma Multiplo 70 0LLinfatica Cronica 90 0 LMieloide Cronica 95 TMO 60
IFN 15 Inibitori tirosinkinasi
Lrsquoobiettivo della terapia egrave sempre la guarigione
Scelta del trattamento piugrave adeguato vuol dire fare un bilancio fra rischi e benefici attesi
I trattamenti intensivi aumentano le possibilitagrave di guarigione mandash espongono a maggiori rischindash peggiorano la qualitagrave di vita
Quanto costa curarsi 6 mesi di terapia
Leucemia - chlorambucil Euro 72
Linfatica - fludarabina 8622
Cronica - fluda+rituximab 36294- trapianto autologo 40000
3 anni di terapia
Leucemia - idrossiurea Euro 600
Mieloide - interferone alfa 60000
Cronica - trapianto allogenico 60000- Glivec 101304
MORFOLOGIA
CITOFLUORIMETRIA
CITOGENETICA
BIOLOGIA MOLECOLARE
BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE
VALUTAZIONE MASSE (ecografia tachellip)
DIAGNOSTICA DELLE PATOLOGIE ONCOEMATOLOGICHE
Antonj van Leeuwenhoek nel 1674 trasmise in una lettera alla Royal Society di Londra la prima descrizione dei globuli rossi
Ma molto probabilmente Marcello Malpighi di Bologna fu il primo ad osservare i Globuli Rossi nel 1661 nel lume dei capillari di uomo e animaleEgli li descrisse come ldquoglobuli rubescentirdquo e li localizzograve nelle arterie e nelle vene che aveva appena scoperto
Nel 1877 con la scoperta della colorazione triacida comincia lrsquoera della MORFOLOGIA EMATOLOGICA
Giulio BizzozeroGiulio Bizzozero1846 - 19011846 - 1901
Nel Dicembre 1881 comunicograve allAccademia di Medicina la sua grande scoperta le piastrine come terzo componente morfologico del sangue e la loro importanza nel processo della trombosi
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
MCVHct n GBR
MCVHct n GBR
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
NormociticaMCHC 34 gLnormocromicaMCH 29 pg
MacrociticaMCHC 30 gLIpocromicaMCH 29 pg
MicrociticaMCHC 38 gLIpercromicaMCH 29 pg
Indici di WintrobeIndici di Wintrobe
Elettrodo internoElettrodo interno
Elettrodoesterno
Elettrodoesterno
Flusso del diluenteFlusso del diluente
Vuoto regolatoVuoto regolato
Temps
U
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Volume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelle
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
Metodo OtticoMetodo Ottico
Low angle scatter 2o - 3o (Volume)
High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)
Metodo ottico Metodo ottico due parametridue parametri di di riconoscimento per il globulo rosso riconoscimento per il globulo rosso
Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari
Da 10-20 test al giornoDa 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giornoa centinaia di test al giorno
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
PROBABILITArsquo DI CURA IN ONCO-EMATOLOGIA
LEUCEMIE ACUTE
ANZIANI 10-20
ADULTI 30-40
GIOVANI 50
LINFOMI NH 30-50
L DI HODGKIN 70-90
MIELOMA MULTIPLO
BMT 20-30
CT 3-4 anni
ABMT x 2 o piugrave
Speranza di guarigione
Remissione Guarigione
LA Mieloide 70 40LA Linfoide bambini 90 70
adulti 80 30Mdi Hodgkin 95 85 Linfomi non-H 70 50Mieloma Multiplo 70 0LLinfatica Cronica 90 0 LMieloide Cronica 95 TMO 60
IFN 15 Inibitori tirosinkinasi
Lrsquoobiettivo della terapia egrave sempre la guarigione
Scelta del trattamento piugrave adeguato vuol dire fare un bilancio fra rischi e benefici attesi
I trattamenti intensivi aumentano le possibilitagrave di guarigione mandash espongono a maggiori rischindash peggiorano la qualitagrave di vita
Quanto costa curarsi 6 mesi di terapia
Leucemia - chlorambucil Euro 72
Linfatica - fludarabina 8622
Cronica - fluda+rituximab 36294- trapianto autologo 40000
3 anni di terapia
Leucemia - idrossiurea Euro 600
Mieloide - interferone alfa 60000
Cronica - trapianto allogenico 60000- Glivec 101304
MORFOLOGIA
CITOFLUORIMETRIA
CITOGENETICA
BIOLOGIA MOLECOLARE
BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE
VALUTAZIONE MASSE (ecografia tachellip)
DIAGNOSTICA DELLE PATOLOGIE ONCOEMATOLOGICHE
Antonj van Leeuwenhoek nel 1674 trasmise in una lettera alla Royal Society di Londra la prima descrizione dei globuli rossi
Ma molto probabilmente Marcello Malpighi di Bologna fu il primo ad osservare i Globuli Rossi nel 1661 nel lume dei capillari di uomo e animaleEgli li descrisse come ldquoglobuli rubescentirdquo e li localizzograve nelle arterie e nelle vene che aveva appena scoperto
Nel 1877 con la scoperta della colorazione triacida comincia lrsquoera della MORFOLOGIA EMATOLOGICA
Giulio BizzozeroGiulio Bizzozero1846 - 19011846 - 1901
Nel Dicembre 1881 comunicograve allAccademia di Medicina la sua grande scoperta le piastrine come terzo componente morfologico del sangue e la loro importanza nel processo della trombosi
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
MCVHct n GBR
MCVHct n GBR
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
NormociticaMCHC 34 gLnormocromicaMCH 29 pg
MacrociticaMCHC 30 gLIpocromicaMCH 29 pg
MicrociticaMCHC 38 gLIpercromicaMCH 29 pg
Indici di WintrobeIndici di Wintrobe
Elettrodo internoElettrodo interno
Elettrodoesterno
Elettrodoesterno
Flusso del diluenteFlusso del diluente
Vuoto regolatoVuoto regolato
Temps
U
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Volume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelle
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
Metodo OtticoMetodo Ottico
Low angle scatter 2o - 3o (Volume)
High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)
Metodo ottico Metodo ottico due parametridue parametri di di riconoscimento per il globulo rosso riconoscimento per il globulo rosso
Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari
Da 10-20 test al giornoDa 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giornoa centinaia di test al giorno
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Speranza di guarigione
Remissione Guarigione
LA Mieloide 70 40LA Linfoide bambini 90 70
adulti 80 30Mdi Hodgkin 95 85 Linfomi non-H 70 50Mieloma Multiplo 70 0LLinfatica Cronica 90 0 LMieloide Cronica 95 TMO 60
IFN 15 Inibitori tirosinkinasi
Lrsquoobiettivo della terapia egrave sempre la guarigione
Scelta del trattamento piugrave adeguato vuol dire fare un bilancio fra rischi e benefici attesi
I trattamenti intensivi aumentano le possibilitagrave di guarigione mandash espongono a maggiori rischindash peggiorano la qualitagrave di vita
Quanto costa curarsi 6 mesi di terapia
Leucemia - chlorambucil Euro 72
Linfatica - fludarabina 8622
Cronica - fluda+rituximab 36294- trapianto autologo 40000
3 anni di terapia
Leucemia - idrossiurea Euro 600
Mieloide - interferone alfa 60000
Cronica - trapianto allogenico 60000- Glivec 101304
MORFOLOGIA
CITOFLUORIMETRIA
CITOGENETICA
BIOLOGIA MOLECOLARE
BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE
VALUTAZIONE MASSE (ecografia tachellip)
DIAGNOSTICA DELLE PATOLOGIE ONCOEMATOLOGICHE
Antonj van Leeuwenhoek nel 1674 trasmise in una lettera alla Royal Society di Londra la prima descrizione dei globuli rossi
Ma molto probabilmente Marcello Malpighi di Bologna fu il primo ad osservare i Globuli Rossi nel 1661 nel lume dei capillari di uomo e animaleEgli li descrisse come ldquoglobuli rubescentirdquo e li localizzograve nelle arterie e nelle vene che aveva appena scoperto
Nel 1877 con la scoperta della colorazione triacida comincia lrsquoera della MORFOLOGIA EMATOLOGICA
Giulio BizzozeroGiulio Bizzozero1846 - 19011846 - 1901
Nel Dicembre 1881 comunicograve allAccademia di Medicina la sua grande scoperta le piastrine come terzo componente morfologico del sangue e la loro importanza nel processo della trombosi
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
MCVHct n GBR
MCVHct n GBR
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
NormociticaMCHC 34 gLnormocromicaMCH 29 pg
MacrociticaMCHC 30 gLIpocromicaMCH 29 pg
MicrociticaMCHC 38 gLIpercromicaMCH 29 pg
Indici di WintrobeIndici di Wintrobe
Elettrodo internoElettrodo interno
Elettrodoesterno
Elettrodoesterno
Flusso del diluenteFlusso del diluente
Vuoto regolatoVuoto regolato
Temps
U
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Volume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelle
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
Metodo OtticoMetodo Ottico
Low angle scatter 2o - 3o (Volume)
High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)
Metodo ottico Metodo ottico due parametridue parametri di di riconoscimento per il globulo rosso riconoscimento per il globulo rosso
Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari
Da 10-20 test al giornoDa 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giornoa centinaia di test al giorno
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Lrsquoobiettivo della terapia egrave sempre la guarigione
Scelta del trattamento piugrave adeguato vuol dire fare un bilancio fra rischi e benefici attesi
I trattamenti intensivi aumentano le possibilitagrave di guarigione mandash espongono a maggiori rischindash peggiorano la qualitagrave di vita
Quanto costa curarsi 6 mesi di terapia
Leucemia - chlorambucil Euro 72
Linfatica - fludarabina 8622
Cronica - fluda+rituximab 36294- trapianto autologo 40000
3 anni di terapia
Leucemia - idrossiurea Euro 600
Mieloide - interferone alfa 60000
Cronica - trapianto allogenico 60000- Glivec 101304
MORFOLOGIA
CITOFLUORIMETRIA
CITOGENETICA
BIOLOGIA MOLECOLARE
BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE
VALUTAZIONE MASSE (ecografia tachellip)
DIAGNOSTICA DELLE PATOLOGIE ONCOEMATOLOGICHE
Antonj van Leeuwenhoek nel 1674 trasmise in una lettera alla Royal Society di Londra la prima descrizione dei globuli rossi
Ma molto probabilmente Marcello Malpighi di Bologna fu il primo ad osservare i Globuli Rossi nel 1661 nel lume dei capillari di uomo e animaleEgli li descrisse come ldquoglobuli rubescentirdquo e li localizzograve nelle arterie e nelle vene che aveva appena scoperto
Nel 1877 con la scoperta della colorazione triacida comincia lrsquoera della MORFOLOGIA EMATOLOGICA
Giulio BizzozeroGiulio Bizzozero1846 - 19011846 - 1901
Nel Dicembre 1881 comunicograve allAccademia di Medicina la sua grande scoperta le piastrine come terzo componente morfologico del sangue e la loro importanza nel processo della trombosi
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
MCVHct n GBR
MCVHct n GBR
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
NormociticaMCHC 34 gLnormocromicaMCH 29 pg
MacrociticaMCHC 30 gLIpocromicaMCH 29 pg
MicrociticaMCHC 38 gLIpercromicaMCH 29 pg
Indici di WintrobeIndici di Wintrobe
Elettrodo internoElettrodo interno
Elettrodoesterno
Elettrodoesterno
Flusso del diluenteFlusso del diluente
Vuoto regolatoVuoto regolato
Temps
U
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Volume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelle
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
Metodo OtticoMetodo Ottico
Low angle scatter 2o - 3o (Volume)
High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)
Metodo ottico Metodo ottico due parametridue parametri di di riconoscimento per il globulo rosso riconoscimento per il globulo rosso
Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari
Da 10-20 test al giornoDa 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giornoa centinaia di test al giorno
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Quanto costa curarsi 6 mesi di terapia
Leucemia - chlorambucil Euro 72
Linfatica - fludarabina 8622
Cronica - fluda+rituximab 36294- trapianto autologo 40000
3 anni di terapia
Leucemia - idrossiurea Euro 600
Mieloide - interferone alfa 60000
Cronica - trapianto allogenico 60000- Glivec 101304
MORFOLOGIA
CITOFLUORIMETRIA
CITOGENETICA
BIOLOGIA MOLECOLARE
BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE
VALUTAZIONE MASSE (ecografia tachellip)
DIAGNOSTICA DELLE PATOLOGIE ONCOEMATOLOGICHE
Antonj van Leeuwenhoek nel 1674 trasmise in una lettera alla Royal Society di Londra la prima descrizione dei globuli rossi
Ma molto probabilmente Marcello Malpighi di Bologna fu il primo ad osservare i Globuli Rossi nel 1661 nel lume dei capillari di uomo e animaleEgli li descrisse come ldquoglobuli rubescentirdquo e li localizzograve nelle arterie e nelle vene che aveva appena scoperto
Nel 1877 con la scoperta della colorazione triacida comincia lrsquoera della MORFOLOGIA EMATOLOGICA
Giulio BizzozeroGiulio Bizzozero1846 - 19011846 - 1901
Nel Dicembre 1881 comunicograve allAccademia di Medicina la sua grande scoperta le piastrine come terzo componente morfologico del sangue e la loro importanza nel processo della trombosi
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
MCVHct n GBR
MCVHct n GBR
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
NormociticaMCHC 34 gLnormocromicaMCH 29 pg
MacrociticaMCHC 30 gLIpocromicaMCH 29 pg
MicrociticaMCHC 38 gLIpercromicaMCH 29 pg
Indici di WintrobeIndici di Wintrobe
Elettrodo internoElettrodo interno
Elettrodoesterno
Elettrodoesterno
Flusso del diluenteFlusso del diluente
Vuoto regolatoVuoto regolato
Temps
U
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Volume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelle
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
Metodo OtticoMetodo Ottico
Low angle scatter 2o - 3o (Volume)
High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)
Metodo ottico Metodo ottico due parametridue parametri di di riconoscimento per il globulo rosso riconoscimento per il globulo rosso
Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari
Da 10-20 test al giornoDa 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giornoa centinaia di test al giorno
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
MORFOLOGIA
CITOFLUORIMETRIA
CITOGENETICA
BIOLOGIA MOLECOLARE
BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE
VALUTAZIONE MASSE (ecografia tachellip)
DIAGNOSTICA DELLE PATOLOGIE ONCOEMATOLOGICHE
Antonj van Leeuwenhoek nel 1674 trasmise in una lettera alla Royal Society di Londra la prima descrizione dei globuli rossi
Ma molto probabilmente Marcello Malpighi di Bologna fu il primo ad osservare i Globuli Rossi nel 1661 nel lume dei capillari di uomo e animaleEgli li descrisse come ldquoglobuli rubescentirdquo e li localizzograve nelle arterie e nelle vene che aveva appena scoperto
Nel 1877 con la scoperta della colorazione triacida comincia lrsquoera della MORFOLOGIA EMATOLOGICA
Giulio BizzozeroGiulio Bizzozero1846 - 19011846 - 1901
Nel Dicembre 1881 comunicograve allAccademia di Medicina la sua grande scoperta le piastrine come terzo componente morfologico del sangue e la loro importanza nel processo della trombosi
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
MCVHct n GBR
MCVHct n GBR
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
NormociticaMCHC 34 gLnormocromicaMCH 29 pg
MacrociticaMCHC 30 gLIpocromicaMCH 29 pg
MicrociticaMCHC 38 gLIpercromicaMCH 29 pg
Indici di WintrobeIndici di Wintrobe
Elettrodo internoElettrodo interno
Elettrodoesterno
Elettrodoesterno
Flusso del diluenteFlusso del diluente
Vuoto regolatoVuoto regolato
Temps
U
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Volume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelle
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
Metodo OtticoMetodo Ottico
Low angle scatter 2o - 3o (Volume)
High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)
Metodo ottico Metodo ottico due parametridue parametri di di riconoscimento per il globulo rosso riconoscimento per il globulo rosso
Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari
Da 10-20 test al giornoDa 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giornoa centinaia di test al giorno
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Antonj van Leeuwenhoek nel 1674 trasmise in una lettera alla Royal Society di Londra la prima descrizione dei globuli rossi
Ma molto probabilmente Marcello Malpighi di Bologna fu il primo ad osservare i Globuli Rossi nel 1661 nel lume dei capillari di uomo e animaleEgli li descrisse come ldquoglobuli rubescentirdquo e li localizzograve nelle arterie e nelle vene che aveva appena scoperto
Nel 1877 con la scoperta della colorazione triacida comincia lrsquoera della MORFOLOGIA EMATOLOGICA
Giulio BizzozeroGiulio Bizzozero1846 - 19011846 - 1901
Nel Dicembre 1881 comunicograve allAccademia di Medicina la sua grande scoperta le piastrine come terzo componente morfologico del sangue e la loro importanza nel processo della trombosi
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
MCVHct n GBR
MCVHct n GBR
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
NormociticaMCHC 34 gLnormocromicaMCH 29 pg
MacrociticaMCHC 30 gLIpocromicaMCH 29 pg
MicrociticaMCHC 38 gLIpercromicaMCH 29 pg
Indici di WintrobeIndici di Wintrobe
Elettrodo internoElettrodo interno
Elettrodoesterno
Elettrodoesterno
Flusso del diluenteFlusso del diluente
Vuoto regolatoVuoto regolato
Temps
U
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Volume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelle
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
Metodo OtticoMetodo Ottico
Low angle scatter 2o - 3o (Volume)
High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)
Metodo ottico Metodo ottico due parametridue parametri di di riconoscimento per il globulo rosso riconoscimento per il globulo rosso
Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari
Da 10-20 test al giornoDa 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giornoa centinaia di test al giorno
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Nel 1877 con la scoperta della colorazione triacida comincia lrsquoera della MORFOLOGIA EMATOLOGICA
Giulio BizzozeroGiulio Bizzozero1846 - 19011846 - 1901
Nel Dicembre 1881 comunicograve allAccademia di Medicina la sua grande scoperta le piastrine come terzo componente morfologico del sangue e la loro importanza nel processo della trombosi
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
MCVHct n GBR
MCVHct n GBR
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
NormociticaMCHC 34 gLnormocromicaMCH 29 pg
MacrociticaMCHC 30 gLIpocromicaMCH 29 pg
MicrociticaMCHC 38 gLIpercromicaMCH 29 pg
Indici di WintrobeIndici di Wintrobe
Elettrodo internoElettrodo interno
Elettrodoesterno
Elettrodoesterno
Flusso del diluenteFlusso del diluente
Vuoto regolatoVuoto regolato
Temps
U
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Volume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelle
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
Metodo OtticoMetodo Ottico
Low angle scatter 2o - 3o (Volume)
High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)
Metodo ottico Metodo ottico due parametridue parametri di di riconoscimento per il globulo rosso riconoscimento per il globulo rosso
Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari
Da 10-20 test al giornoDa 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giornoa centinaia di test al giorno
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Giulio BizzozeroGiulio Bizzozero1846 - 19011846 - 1901
Nel Dicembre 1881 comunicograve allAccademia di Medicina la sua grande scoperta le piastrine come terzo componente morfologico del sangue e la loro importanza nel processo della trombosi
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
MCVHct n GBR
MCVHct n GBR
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
NormociticaMCHC 34 gLnormocromicaMCH 29 pg
MacrociticaMCHC 30 gLIpocromicaMCH 29 pg
MicrociticaMCHC 38 gLIpercromicaMCH 29 pg
Indici di WintrobeIndici di Wintrobe
Elettrodo internoElettrodo interno
Elettrodoesterno
Elettrodoesterno
Flusso del diluenteFlusso del diluente
Vuoto regolatoVuoto regolato
Temps
U
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Volume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelle
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
Metodo OtticoMetodo Ottico
Low angle scatter 2o - 3o (Volume)
High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)
Metodo ottico Metodo ottico due parametridue parametri di di riconoscimento per il globulo rosso riconoscimento per il globulo rosso
Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari
Da 10-20 test al giornoDa 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giornoa centinaia di test al giorno
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
MCVHct n GBR
MCVHct n GBR
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
NormociticaMCHC 34 gLnormocromicaMCH 29 pg
MacrociticaMCHC 30 gLIpocromicaMCH 29 pg
MicrociticaMCHC 38 gLIpercromicaMCH 29 pg
Indici di WintrobeIndici di Wintrobe
Elettrodo internoElettrodo interno
Elettrodoesterno
Elettrodoesterno
Flusso del diluenteFlusso del diluente
Vuoto regolatoVuoto regolato
Temps
U
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Volume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelle
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
Metodo OtticoMetodo Ottico
Low angle scatter 2o - 3o (Volume)
High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)
Metodo ottico Metodo ottico due parametridue parametri di di riconoscimento per il globulo rosso riconoscimento per il globulo rosso
Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari
Da 10-20 test al giornoDa 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giornoa centinaia di test al giorno
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCVpacked cell volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue Si esprime in percentuale (Ht )Egrave evidente che il valore dellrsquoEmatocrito egrave funzione del numero e del volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n GBR
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
Nel 1930 Maxwell Wintrobe standardizza la procedura per lrsquoesecuzione dellrsquoEMATOCRITO
MCVHct n GBR
MCVHct n GBR
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
NormociticaMCHC 34 gLnormocromicaMCH 29 pg
MacrociticaMCHC 30 gLIpocromicaMCH 29 pg
MicrociticaMCHC 38 gLIpercromicaMCH 29 pg
Indici di WintrobeIndici di Wintrobe
Elettrodo internoElettrodo interno
Elettrodoesterno
Elettrodoesterno
Flusso del diluenteFlusso del diluente
Vuoto regolatoVuoto regolato
Temps
U
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Volume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelle
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
Metodo OtticoMetodo Ottico
Low angle scatter 2o - 3o (Volume)
High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)
Metodo ottico Metodo ottico due parametridue parametri di di riconoscimento per il globulo rosso riconoscimento per il globulo rosso
Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari
Da 10-20 test al giornoDa 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giornoa centinaia di test al giorno
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
MCVHct n GBR
MCVHct n GBR
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHHb n dei GBR in milioni
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
MCHCHb Hct (GBR x MCV)
NormociticaMCHC 34 gLnormocromicaMCH 29 pg
MacrociticaMCHC 30 gLIpocromicaMCH 29 pg
MicrociticaMCHC 38 gLIpercromicaMCH 29 pg
Indici di WintrobeIndici di Wintrobe
Elettrodo internoElettrodo interno
Elettrodoesterno
Elettrodoesterno
Flusso del diluenteFlusso del diluente
Vuoto regolatoVuoto regolato
Temps
U
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Volume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelle
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
Metodo OtticoMetodo Ottico
Low angle scatter 2o - 3o (Volume)
High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)
Metodo ottico Metodo ottico due parametridue parametri di di riconoscimento per il globulo rosso riconoscimento per il globulo rosso
Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari
Da 10-20 test al giornoDa 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giornoa centinaia di test al giorno
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Elettrodo internoElettrodo interno
Elettrodoesterno
Elettrodoesterno
Flusso del diluenteFlusso del diluente
Vuoto regolatoVuoto regolato
Temps
U
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
La variazione drsquoImpedenzaPrincipio di Coulter (1956)
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Conta del numero di particelle nellrsquounitagrave di tempo
Volume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelleVolume delle particelle
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
Calcolo automatico del Hct e degli Indici di Wintrobe
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
Metodo OtticoMetodo Ottico
Low angle scatter 2o - 3o (Volume)
High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)
Metodo ottico Metodo ottico due parametridue parametri di di riconoscimento per il globulo rosso riconoscimento per il globulo rosso
Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari
Da 10-20 test al giornoDa 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giornoa centinaia di test al giorno
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
La misura ottica associa la citometria a flusso e la diffrazione luminosa Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti e sulla deviazione che un fascio di luce subisce quando colpisce una particella
Metodo OtticoMetodo Ottico
Low angle scatter 2o - 3o (Volume)
High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)
Metodo ottico Metodo ottico due parametridue parametri di di riconoscimento per il globulo rosso riconoscimento per il globulo rosso
Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari
Da 10-20 test al giornoDa 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giornoa centinaia di test al giorno
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Low angle scatter 2o - 3o (Volume)
High angle scatter 5o - 15o (HGB concentration)
Metodo ottico Metodo ottico due parametridue parametri di di riconoscimento per il globulo rosso riconoscimento per il globulo rosso
Raccolta del segnale a definiti intervalli angolari
Da 10-20 test al giornoDa 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giornoa centinaia di test al giorno
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Da 10-20 test al giornoDa 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giornoa centinaia di test al giorno
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Tutto ciograve rappresentograve la prima rivoluzione della ematologia di laboratorioQuindi negli anni rsquo60 si cominciarono a costruire strumenti che fornivano in tempi brevi misurazioni precise riproducibili ed accurate
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Temps
U
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
bull Occasionalmente 2 o 3 cellule possono passare attraverso lrsquoorificio di conta nello stesso tempo
bull Viene quindi generato un impulso di grande ampiezza
bull La frequenza di questo passaggio in coincidenza egrave statisticamente prevedibile ed egrave funzione del numero delle cellule La correzione viene quindi realizzata automaticamente per gli analizzatori che usano questa tecnologia
Correzione della coincidenzaCorrezione della coincidenza
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Flussodiguaina
Flusso del campione
Focalizzazione IdrodinamicaFocalizzazione Idrodinamica
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Per ottenere degli impulsi coerenti viene utilizzato un principio complementare la focalizzazione idrodinamica Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la zona di conta
Flusso del campione
Flussodi
guaina
Flussodi
guaina
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
I motivi che hanno portato al tentativo di automatizzare la formula leucocitaria sono
bull Alto costo
bull Problemi organizzativi
bull Utilitagrave diagnostica dubbia
bull Scarsa precisione
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
bull errori statisticibull errori statistici
TIPO CELLULARE 100c 500c 1000c 10000c
BASOFILI 0-54 03-23 05-18 08-13
EOSINOFILI 11-99 25-61 29-54 36-45
MONOCITI 42-164 66-119 73-109 84-96
LINFOCITI 35-553 406-495 419-481 440-460
NEUTROFILI 497-697 556-643 569-631 590-610
HOUWEN BLaboratory Hematology 789-100
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
30 100 200 300 400 fL
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
VOLUME
VOLUME
Attivitagrave perossidasicaAttivitagrave perossidasica Densitagrave NucleareDensitagrave Nucleare
Mn Pmn
Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)Volume Citochimica (perossidasi) Citolisi (SIEMENS)
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Diffrazione Superficie granulazioni
Volume
conduttivitagrave
ImpedenzaImpedenza ConduttivitagraveConduttivitagrave ScatterScatter
Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)Volume Conduttivitagrave Scatter (Coulter)
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
ASSORBANZA
ASSORBANZA
VOLUMEVOLUME
Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)Volume Citochimica Citolisi (ABX Pentra)
VOLUMEVOLUME
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
1deg3deg (0deg) dimensione
1deg3deg (0deg) dimensione
10deg Struttura
10deg Struttura
90degPol 90degdep Granulazioni
Fascio laser
Po
larizzazione
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)Scatter Fluorescenza Citolisi Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
Precisione si esprime come Coefficiente di VariazioneEgrave la capacitagrave di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per il metodo manuale
Neutrofili e Linfociti tra 5 e 10Monociti 25Eosinofili 40Basofili 95
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
CV per i metodi automatici
Neutrofili e Linfociti lt 4Monociti lt 10Eosinofili lt 10Basofili lt 50
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Accuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazioneAccuratezza egrave la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Il vero in ematologia egrave rappresentato dal metodo di riferimento che per la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella conta microscopica effettuatabull in condizioni standardizzatebull da operatori qualificatibull su un numero sufficiente di leucociti (400)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
Lrsquoaccuratezza degli strumenti analitici piugrave evoluti egravebull molto elevata per Neutrofili Linfociti ed Eosinofilibull meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)bull poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa frequenza di questa classe di leucociti)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali1) Conta e classificazione dei leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomaleSensibilitagrave capacitagrave di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normaliSpecificitagrave capacitagrave di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Valore predittivo positivo indica la probabilitagrave che un risultato positivo segnali realmente la presenza di cellule anomale
Valore predittivo negativo indica la probabilitagrave che un risultato negativo sia indice affidabile della assenza di anomalie
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Campione emolizzatoCampione emolizzato
WBCWBC
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Aggregati piastriniciAggregati piastrinici
WBCWBC PLTPLT
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Tdeg lt 37degCTdeg lt 37degC a 37degCa 37degC
Presenza di crioglobulinePresenza di crioglobuline
PLTPLT
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Presenza di crioagglutininePresenza di crioagglutinine
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
GBR 2400000HCT 243Hb 130 MCV 1015MCH 541MCHC 530CHCM normale
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossiPseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
NeonatiIperazotemiaIperbilirubinemiaHb patologiche
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi enon sono in grado di contare e classificare inmodo accurato le cellule patologicheEssi devono
1) Contare e classificare in modo preciso ed accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Lo striscio di sangue periferico Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Lo striscio di sangue perifericoLo striscio di sangue periferico
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
che ci vuole
niente
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
La quantitagrave di sangue da strisciare egrave entro certi limiti variabile in funzione delle caratteristiche del campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Difficile fare di peggiohellip
Troppo lungoTroppe curve
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Troppo corto e spessoTroppo corto e sottile
Troppo corto
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
I segretiI segreti
1)1)Asciugare beneAsciugare bene2)2)Coprire beneCoprire bene3)3)Sciacquare beneSciacquare bene
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a qualitagrave dellrsquoacqua temperatura ed umiditagrave dellrsquoaria
COLORAZIONECOLORAZIONE
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
bull errori metodologicibull errori metodologici
Area densaArea densa Zona marginaleZona marginale Area sottileArea sottile
TESTA
CORPO
IDEALE
LINFOCITI ++GRANULOCITI ++
MONOCITI ++
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
B Bain NEJM 2005B Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Nuovi parametri ematologici
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Migliorare la capacitagrave del laboratorio nel fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETROFUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale egrave il laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun percorso strutturato e consolidato
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltagrave del laboratorista a comprendere il reale potenziale clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETROOSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Sviluppo della ricercaSviluppo della ricerca
clinicaclinicalaboratoriolaboratorio
industriaindustria
nuovi parametri
nuovi farmaci
sperimentazione preclinica e clinica
PazientePaziente
ldquoclinicirdquo - laboratoristici
sperimentazione
esportazione
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Parametri emocitometrici ldquotradizionalirdquoParametri emocitometrici ldquotradizionalirdquo
ldquoldquoNuovirdquo parametri ematologiciNuovirdquo parametri ematologici
OperatoreOperatore
AnalizzatoreAnalizzatore
OperatoreOperatore
Analizzatore Analizzatore
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
comunicare un allarme comunicare un allarme strumentale vuol dire strumentale vuol dire comunicare incapacitarsquo a comunicare incapacitarsquo a definire la presenza o meno definire la presenza o meno di quanto suggerito dallo di quanto suggerito dallo strumentostrumento
Lrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametroLrsquoallarme strumentale Lrsquoallarme strumentale nonnon egrave un parametro egrave un parametro
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL
SALERNO 1
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI
EMOGLOBINA
ipocromia
macrocitosi
ipercromia
microcitosi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Densitagrave (concentrazione Hb)Densitagrave (concentrazione Hb)
VVOOLLUUMMEE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia e automazione
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche Microcitosi ndash Macrocitosi
Ipocromia ndash Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
MICROSCOPIA AUTOMAZIONE
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA INFERIORE ASL SALERNO
1
Acantocito = aculeo
Codocito = campana
cellula a bersaglio
Dacriocito = lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito = ovale
Cheratocito = corno
Cnizocito = fossetta
Megalocito = gigante
Schizocito = taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito = sfera
emazie a fungo
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
RDWRDWRDWRDW
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
Parametro sintetico (o riduttivo) egrave una rappresentazione numerica della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica pur avendo una univocitagrave terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche con scarso approfondimento fisiopatologico
normalenormalenormalenormale elevatoelevatoelevatoelevato
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Am J Clin Pathol 1983 Sep80(3)322-6Improved classification of anemias by MCV and RDWBessman JD Gilmer PR Jr Gardner FH
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
Arch Intern Med 1988 Apr148(4)822-4Erythrocyte anisocytosis Visual inspection of blood films vs automated analysis of red blood cell distribution widthSimel DL DeLong ER Feussner JR Weinberg JB Crawford JHealth Services Research Field Program Durham Veterans Administration Medical Center NC 27705
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
RDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIARDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac diseaseIncreased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G et al Dig Liver Dis 2000
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave Lrsquoincremento di RDW risulta la piugrave frequente anormalitagrave ematologica (579 - 67) in adulti CDematologica (579 - 67) in adulti CD
Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed Lrsquoincremento di RDW puograve essere considerato predittivo di CD ed autorizzare alla ricerca di anticorpi specificiautorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei LrsquoRDW elevato egrave piugrave frequente dellrsquoanemia sideropenica nei pazienti CDpazienti CD
LrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutineLrsquoRDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW new screening test for coeliac diseaseRDW new screening test for coeliac disease
Guglielmi V et al Minerva Med 2002
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHERDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
Am J Cardiol 2010 Oct 1106(7)988-93 Epub 2010 Aug 11Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events
Zalawadiya SK Veeranna V Niraj A Pradhan J Afonso LDepartment of Internal Medicine Wayne State University Detroit Medical Center
Detroit Michigan USA
In conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD riskIn conclusion a higher RDW appears to be a powerful independent predictor of future CHD risk
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Exp Clin Cardiol 2010 Fall15(3)37-40High red blood cell distribution width is closely associated with risk of carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension
Wen YWen Y
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
Arch Intern Med 2009 Mar 9169(5)515-23Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged and older adults
Patel KV Ferrucci L Ershler WB Longo DL Guralnik JMLaboratory of Epidemiology Demography and Biometry National Institute on
Aging 7201 Wisconsin Ave Ste 3C309 Bethesda MD 20814 USA
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
CONCLUSION Red blood cell distribution width is a widely available test that is a strong predictor of mortality in the general population of adults 45 years or older
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
RDWRDWRDWRDW
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
ReticolocitiReticolociti
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Egrave una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione ribosomiale)Questi precipitano per effetto dei coloranti sopravitali formando un reticolo di granuli e filamenti basofili che egrave alla base della loro denominazione
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Definizione morfologicaDefinizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che contengono 2 o piugrave particelle (o anche una particella legata ad un filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a particelle di RNA ribosomiale
Reticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di HeinzReticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
sono piugrave grandi dei globuli rossiMCVr gt MCVgbr
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
possono avere un diverso contenuto di RNA (cioegrave un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
DrsquoOnofro e Zini ldquoMorfologia del Sanguerdquo
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es M-G-G) i reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico)
Quando la sostanza filamentosa egrave abbondante possono assumere lrsquoaspetto di emazie policromatofile con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
Anche la punteggiatura basofila egrave un aspetto dei residui di RNA ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di eritropoiesi anomala
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
EritroblastiOrtocromatici
EritroblastiOrtocromatici
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
ReticolocitiMidollari
Tempo diPermanenza 2-3 giorni
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
BarrieraEMATO- MIDOLLARE
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
Reticolociti nel Sangue Periferico
Tempo di permanenza
1-15 giorni
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
hellipstrisci non troppo sottili ma non con cellule sovrappostehellip
oculare con diaframma regolabile o diaframma di cartone con foro rettangolare di circa 4mmhelliphellipfattori importanti sono lrsquoacutezza visiva la pazienza del tecnico la qualitagrave ed il potere risolvente del microscopiohellip
hellipnel caso che ci siano pochi reticolociti egrave necessario contare un numero elevatissimo di cellulehellip
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie amp Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Metodi manuali-visualiMetodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
I coloranti hanno la capacitagrave di indurre lrsquoaggregazione e la precipitazione dei ribosomi in modo da renderli visibili sullo sfondo chiaro del citoplasma
I coloranti oggi in uso sonobull Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)bull il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)bull lrsquoAzur B
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
PLT
ReticolocitiRBC
Metodi citofluorimetriciMetodi citofluorimetrici
Auramina-OAuramina-O
Arancio di TiazoloArancio di Tiazolo
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad una data lunghezza drsquoonda ed emettono ad una lunghezza drsquoonda maggiore
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non dedicati sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
I parametri misurati sonobull lrsquointensitagrave della diffusione luminosa frontale (FSC) proporzionale alle dimensioni cellularibull lrsquointensitagrave della fluorescenza proporzionale al contenuto di RNA
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di fluorescenza crescente in rapporto con la maturazione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Vantaggibull notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manualibull obiettivitagrave piugrave elevatabull velocitagrave di esecuzione
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Svantaggibull la mancanza di calibratori stabili e affidabilibull la mancanza di materiale di riferimentobull autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un ldquozerordquo)bull Interferenze
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Leucocitosi specieLinfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
Aggregati piastrinici emacrotrombociti
HeinzHeinz JollyJolly plasmodiplasmodi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Nuovo blu di metileneNuovo blu di metilene
Oxazina 750Oxazina 750
Medodi ottici (coloranti sopravitali)Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
Fanno uso di coloranti sopravitali con metodiche conosciute da tempo e modificate per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
La presenza di RNA nei reticolociti viene individuata mediante misurazione dellrsquoassorbimento luminoso
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Viene costruito cosigrave un citogramma bidimensionale sul quale vengono visualizzate
bull le soglie automatiche che separano i reticolociti dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
bull le soglie che suddividono la popolazione reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensitagrave di assorbimento crescente in rapporto con la maturazione
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Lo studio dei reticolociti in automazione Lo studio dei reticolociti in automazione fornisce 3 tipi di informazionifornisce 3 tipi di informazioni
1)1)Valori numericiValori numerici ( e assoluti) ( e assoluti)
2)2) Indici di maturazioneIndici di maturazione (LFR MFR HFR e IRF) (LFR MFR HFR e IRF)
3)3) Indici qualitativi Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetricia) prevalentemente volumetrici
(MCVr MRVhellip)(MCVr MRVhellip)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di b) prevalentemente indicanti il contenuto di emoglobinaemoglobina
(CHr Ret Hehellip)(CHr Ret Hehellip)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (BcrAbl)
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Traslocazioni cromosomiche
bull Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un cromosoma allrsquoaltro
bull Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle delezioni dalle inversioni e dalle inserzioni)
bull Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro gene presente su un altro cromosoma e ciograve puograve comportare conseguenze se il gene trasferito egrave un oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone ad un gene normalmente e attivamente trascritto puograve risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
bull Questa egrave la situazione in molte delle traslocazioni descritte fino ad oggi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
bull Deregolazione dellrsquoespressione genicaDeregolazione dellrsquoespressione genica
overespressione o espressione aberrante in un overespressione o espressione aberrante in un tessuto che normalmente non esprime quel gene tessuto che normalmente non esprime quel gene
bull Espressione di una proteina di fusioneEspressione di una proteina di fusione
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di giustapposizione di sequenze geniche codificanti di due geni localizzati su differenti cromosomidue geni localizzati su differenti cromosomi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Specificitagrave delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una malattia si trovano nella gran maggioranza dei casi e non si trovano nella popolazione normale esempio tipico la t(1517) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in particolari patologie come la t(1418) nel linfoma follicolare ma egrave presente anche in altri NHL e nei soggetti normali sebbene il numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di I geni coinvolti sono per lo piursquo fattori di trascrizione ma anche tirosin o serin trascrizione ma anche tirosin o serin protein protein chchinasi recettori di membrana inasi recettori di membrana cellulare fattori di crescita con ruoli cellulare fattori di crescita con ruoli critici nella differenziazione e sviluppo critici nella differenziazione e sviluppo cellulare cellulare
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
BCR
22
9
ABL BCR-ABL
ABL-BCR
Ph 22q-
9q+
Traslocazione
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Gene di fusione BCRABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato nelle braccia lunghe del cromosoma 9 con sequenze geniche normalmente situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta ldquobreakpoint cluster regionrdquo (BCR) percheacute egrave in essa che avvengono con maggiore frequenza le rotture del cromosoma
Il gene di fusione BCRABL egrave specifico di queste cellule neoplastiche e ne costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale totipotente stanno nella dimostrazione che lrsquoalterazione cromosomica Ph1 e genica (BCRABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le linee ( granulomonocitica eritrocitica piastrinica e linfocitica B)
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Nelle leucemie acute mieloblastiche
la traslocazione t(821) induce il riarrangiamento AML1-ETO e la formazione di una proteina ibrida
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
t(1517)(q22q21)
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
La traslocazione t(1517) coinvolge il gene che codifica per il recettore alfa dellacido retinoico (RAR) sul cromosoma 17 ed il gene PML (promielocitica) sul cromosoma 15
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Inversione (16) gene di fusione CBFβ-MYH11
LAM M4LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica convenzionale in oncoematologia egrave strettamente correlato alla quantitagrave e alla qualitagrave delle metafasi che si ottengono dal campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce lrsquoorigine e la natura di cromosomi marcatori e di cariotipi complessi
- Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci polimorfici
- Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere cellulari sono coinvolte in un determinato disordine oncoematologico se impiegata insieme allrsquoimmunofenotipo
- Valuta la risposta ad una terapia evidenziando unrsquoeventuale Malattia Minima Residua
- Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificitagrave sensibilitagrave e rapiditagrave
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza ()
Citogenetica FISH
Trisomia 12 10-15 15
13q14 10 53
11q21 8 19
6q 6 9
17p 4 8
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
MALATTIA MINIMA RESIDUADEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche
Tali elementi neoplastici sono spesso in grado di espandersi e dare origine alla recidiva
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
Metodi per lo studio della MRD
Metodo Caratteristiche SensibilitagravebullMorfologia bassa sensibilitagrave e 5
specificitagravebullImmuno scarsa specificitagrave 1-5
Fenotipizzazione
bullCitogenetica lento richiede 1
preparazione metafasibullFISH lento applicabile ai nuclei in 03-5
Iinterfasebull PCR conoscenza delle sequenze gt0001
falsi positivi
![· Conteggio di COMUNICAZIONE [La comunicazione con il DGSA è agevole] NO ABBASTANZA 25% NON SAPRE . Conteggio di PERCEZIONE RELATIVA AL ... Conteggio di FORMAZIONE ED AGGIORNAMENTO](https://img.pdfslide.net/doc/110x75/5c6734a309d3f2034d8b93ee/-conteggio-di-comunicazione-la-comunicazione-con-il-dgsa-e-agevole-no-abbastanza.jpg)
