Mecanismos Moleculares de Dao y

Reparacin de ADN y Cromosomas

Molcula con una estructura de doble hlice. Consiste en dos hebras unidas por puentes de hidrgeno entre las bases. El esqueleto de cada hebra consiste en grupos fosfato y desoxirribosa(-). La Timina y la Citosina (pirimidinas) se unen a la Guanina y la Adenina (purinas).

DNA Structure.mp4

Fase del ciclo celular que carece de divisin celular

Obtencin de nutrientes

Sntesis de molculas necesarias

Crecimiento Celular

Duplicacin del DNA

G1

Intervalo (Gap) despus de la Mitosis y antes de la Sntesis.

Mayor crecimiento celular.

Sntesis de nuevos Organelos.

Sntesis de Protenas

S

Fase de Sntesis, entre G1 y G2.

Sntesis de DNA (Replicacin).

Sntesis Centrosoma.

G2

Fase inmediata despus de la Sntesis y antes de la Mitosis.

Prepara la clula para mitosis.

Condensacin de la cromatina a cromosomas.

Inicia la migracin de los centrosomas a los polos.

MITOSIS

Fase del ciclo celular donde una clula madre se divide en dos clulas hermanas.

CITOKINESIS: Separacin del Citoplasma para producir 2 clulas

PROMETAFASE

Desaparece la envoltura nuclear

Los microtbulos forman el huso mittico

El huso mittico se une a los cinetocoros del cromosoma.

METAFASE

Los cromosomas se alinean en el plano metafsico o ecuatorial.

ANAFASE

Las protenas que unen las cromtides hermanas se rompen.

Las cromtides son separadas hacia los polos.

TELOFASE

Microtbulos polares siguen creciendo alargan la clula.

Los cromosomas se sitan en polos opuestos de la clula.

Formacin de envoltura nuclear alrededor de cada set de cromosomas.

Los cromosomas se relajan a cromatina dentro de los nuevos ncleos.

Una dosis de radiacin que induce en promedio un evento letal por clula deja el 37 % de clulas viables. A esto se le conoce como dosis D0. Para clulas de los mamferos, la D0 est entre 1 y 2 Gy. El nmero de lesiones de ADN detectado inmediatamente despus de una dosis es:

Dao de Base, >1000 Rompimiento de una sola cadena (SSB), 1000 Rompimiento de doble cadena (DSB), 40

B. El rompimiento de una sola cadena de ADN tiene pocas consecuencias biolgicas, ya que esta es reparada fcilmente usando la cadena opuesta como modelo. C. Si ambas cadenas de ADN estn rotas y estos rompimientos estn considerablemente separados, son reparados como rompimientos independientes. D. Si el rompimiento ocurre en ambas cadenas y estn opuestas o separadas solo uno o algunos pares de bases, ocurre un rompimiento de doble cadena, por lo cual se divide en 2 pedazos.

Radiacin Ionizante

Rompimiento de una sola cadena

de ADN

Reparacin

Reparacin incorrecta

Mutacin

Rompimiento de doble cadena de

ADN

Dao en cromosomas

Dos rompimientos de doble cadena

de ADN

Muerte celular

Mutacin

Carcinognesis

Produce

Principal lesin

Produce

Produce

En el caso de los rayos X o gamma, los fenmenos de interaccin del electrn con el agua en la trayectoria del electrn van desde la formacin de regiones localizadas de reaccin a manera de burbujas donde existe un gran nmero de ionizaciones y que son denominados Spurs con un dimetro de 2 nm donde la energa del electrn es depositada, contiene hasta 100 eV y en promedio 3 pares inicos. Las se caracterizan por presentar un gran nmero de ionizaciones, dimetro de 7 nm que contiene en promedio 12 pares inicos con un rango de energa de 100-500 eV. Spurs ocurren en un 95% de la energa de depsito y son menos frecuentes en rayos X y gamma.

Debido a que Spurs and tienen dimensiones similares a la doble hlice de ADN ocurren ataques de radicales si se sobreponen a la hlice de ADN. El trmino locally multiply damaged site clustered lesion se refiere a este fenmeno. La clustered lesion puede extenderse a 20 pares de bases.

La electroforesis en gel consiste en aplicar corriente elctrica a las molculas para que atraviesen una placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la tensin elctrica aplicada a los electrodos en ambos extremos del gel. La electroforesis en gel de agarosa es un mtodo que se utiliza para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. El ADN puede localizarse en el gel tiendo con una concentracin baja de bromuro de etidio, que es un agente intercalante fluorescente que se utiliza como colorante. Cuando se aplica un campo elctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN cargados negativamente lo harn migrar hacia el nodo.

El ADN migra por las matrices de gel. Las molculas ms grandes migran ms despacio debido a la mayor resistencia de friccin y a la menor eficacia del desplazamiento a travs de los poros del gel. En funcin de la concentracin de agarosa o tampn, se pueden separar segmentos de ADN que contengan de 20 a 50 000 pb. En los geles horizontales, la agarosa se emplea por lo general en concentraciones comprendidas entre un 0,7 % y un 3 %. Debe cargarse un ADN marcador de tamao conocido en las ranuras situadas en los extremos derecho e izquierdo del gel. Generalmente un marcador contiene un nmero determinado de segmentos de ADN conocidos, lo cual facilita la labor de determinar el tamao de los ADN desconocidos en caso de que se produjese alguna distorsin sistemtica del gel durante la electroforesis.

El ensayo cometa es utilizada para detectar el dao in vitro o in vivo causado al ADN producidos por un rompimiento simple o doble en la cadena en clulas individuales. Se caracteriza por ser un mtodo sensible, rpido, sencillo, de bajo costo y aplicable a clulas de eucariontes. Se basa en la fragilidad que poseen los sitios daados al ser sometidos a un pH superior a trece (alcalino) y el comportamiento de clulas individuales que son lisadas y sometidas a una electroforesis. Durante la electroforesis los fragmentos de ADN migran fuera del ncleo celular hacia el nodo a una velocidad diferente del resto del material nuclear que, al ser observada con el microscopio de fluorescencia forman la cola del . La magnitud del dao es evaluada de acuerdo al nmero de clulas afectadas, a la longitud de la cola y a la intensidad de la fluorescencia de los fragmentos.

Entrecruzamientos

Daos de Bases

Roturas de Cadena

Desajustes Base-Base

Aductos Voluminosos

Lesiones de ADN

Aberraciones Cromosmicas

Crosslink

Base Damage

Strand Breaks

Base Mismatches

Bulky Aducts

Afectan la secuencia, pero no la estructura total del ADN. Estos cambios ejercen su dao sobre futuras generaciones a travs de las consecuencias del cambio en la secuencia del ADN.

Los pares de bases deben ser complementarios: Adenina(A)-Timina(T), Guanina(G)-Citosina(C). U, representa una mutacin en una sola base. Es removida por una glucosilasa/ADN liasa. Seguido por la eliminacin del residuo del azcar por una Endonucleasa Apurnica 1 (APE1). Se remplaza por el nucletido correcto por ADN polimerasa. Completada por la ligadura mediada ADN ligasa III-XRCC1.

Si ms de un nucletido tiene que ser reparado, el complejo de factor de replicacin C (RFC)/ Antgeno nuclear de clulas proliferantes (PCNA)/ ADN polimerasa llevan a cabo la sntesis de reparacin. La estructura mutada, es removida por FEN1 (Flap Endonuclease 1). Las hebras de ADN son selladas por la ligasa

La radiacin ultravioleta (UV) es el agente que daa el DNA ms estudiado, causa la formacin de enlaces intracadenas (dimerizacin de pirimidinas), en orden de abundancia TT, CT y CC. Causan un impedimento fsico a la replicacin y transcripcin. El dao permanece en el DNA y contina causando problemas estructurales y/o induce mutaciones, hasta que es eliminado. Los daos se han de reparar, de lo contrario aparecen mutaciones que pueden ser letales. Se subdivide en reparacin global de genoma (GGR o GG-NER) y la reparacin de trascripcin acoplada (TCR o TC-NER). GG-NER es en todo el genoma; es decir, las lesiones pueden ser removidas del ADN que codifica o no codifica para genes. TC-NER slo elimina las lesiones en las cadenas de ADN de los genes transcritos activamente. Los pasos esenciales en esta va son: 1. Reconocimiento de dao. 2. Incisiones de ADN que marcan la lesin, entre 24 y 32 nucletidos de longitud. 3. Remocin de la regin. 4. Sntesis de reparacin para llenar el hueco. 5. Ligadura de ADN.

Transcription-Couple Repair

Global-Genome Repair

Se corta la cadena de azcar - fosfato. En el paso de reconocimiento de daos, GGR utiliza los complejos de protenas XPC-XPE mientras que en el TCR, las protenas NER son reclutados por la ARN polimerasa en colaboracin con CSB y CSA. Cuando una cadena de ADN que est siendo transcrito activamente se daa, la ARN polimerasa puede bloquear el acceso al sitio del dao y por lo tanto impide la reparacin del ADN. TC-NER evita este bloqueo por la ARN polimerasa mediante la eliminacin de manera eficaz del sitio del dao para permitir el acceso a protenas de reparacin. Tras el reconocimiento, la lesin est marcada por la unin del complejo de factor de transcripcin IIH (TFIIH), XPA y el RPA. La funcin del complejo helicasa TFIIH desenrolla el ADN y genera un tramo abierto alrededor de la lesin.

Las endonucleasas XPG y la XPF-ERCC1 hacen incisiones en los extremos, y cortan un oligmero de 24-32 nucletidos de longitud. El espacio resultante se llena por las polimerasas ayudado por RFC y PCNA y la cadena es finalmente ligada.

La mutacin en genes NER no conduce a la sensibilidad a la radiacin ionizante. Sin embargo, NER defectuoso aumenta la sensibilidad al dao de ADN inducido por UV y agentes anticncer. Mutaciones germinales en genes NER conducen a trastornos de deficiencia de reparacin del ADN humano como xeroderma pigmentoso en el que los pacientes son hipersensibles a la luz ultravioleta.

En las clulas eucariotas, las roturas de doble cadena de ADN pueden ser reparados por dos procesos bsicos: reparacin por recombinacin homloga (HRR), que requiere una cadena de ADN en buen estado como molde para la reparacin, y extremo de unin No-Homloga (NHEJ), que une extremo con extremo. En clulas de mamferos, la eleccin de la reparacin est indicado por la fase del ciclo celular y por la abundancia de ADN replicado. HRR se produce principalmente a finales del S/fase G2 del ciclo celular, cuando una cromtida hermana no daada est disponible para actuar como molde, mientras que NHEJ se produce en la fase G1 del ciclo celular, cuando no existe modelo. NHEJ y HRR, se han encontrado para ser activos al final de la fase S/G2 del ciclo celular, lo que indica an hay factores no identificados.

NHEJ es propenso a errores y probablemente explica muchas de las lesiones mutagnicas en el ADN de las clulas humanas por la radiacin ionizante. Se encuentra principalmente en la fase G1 del ciclo celular, donde no hay cromtida hermana. ATM y Rad3 relacionada (ATR), son protenas quinasas que pertenecen al fosfatidilinositol-3-quinasa (PIKK) y son reclutados a los sitios de roturas de cadenas de ADN inducidos por la radiacin ionizante. La competencia para la reparacin por HRR frente NHEJ es parcialmente regulado por la protena 53BP-1.

NHEJ puede ser dividido en 5 pasos: 1. Reconocimiento del extremo por la unin de Ku (Heterodmeros 70/80). 2. Reclutamiento de la protena quinasa dependiente de ADN de la subunidad cataltica(DNA PKcs). 3. Preparacin de los extremos. 4. Puenteo de extremos. 5. Ligadura

ATM promueve el procesamiento de rompimiento de los extremos de ADN y las reconoce mediante la regulacin de la actividad del complejo de protenas MRN, y esta actividad de reseccin de ATM se ve disminuida por 53BP-1. Los extremos daadas de ADN no pueden ser simplemente ligados entre s; deben ser modificados antes de que puedan unirse nuevamente por una reaccin de ligacin. El Reconocimiento final se produce cuando el heterodmero Ku(subunidades 70-kDa y 83 kDa), y DNA-PKcs se une a los extremos de DSB del ADN. Una protena adicional, Artemis, que posee actividad endonucleasa, forma un complejo con DNA-PKcs. El complejo Ku/DNA-PKcs que est unido a los extremos de ADN puede fosforilar Artemis y activar su actividad endonucleasa en los extremos de la DSB.

Ends Ends