CARACTERIZACIN, COMPARACIN DE CROMOSOMAS POLITCNICOS Y UBICACIN DE MARCADORES CROMOSMICOS EN Gigantodax basinflatus Y Gigantodax sp. (DIPTERA: SIMULIIDAE) BOGOT-COLOMBIA. Edison Arvey Alfonso Nio. Slendy Julieth Rodrguez Alarcn. Andrea Johana Lpez Moreno. Leidy Alejandra Rodrguez Aldana.1 1 Estudiantes de Licenciatura en Biologa. Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas. Citogentica. RESUMEN: Los cromosomas politnicos son producidos por repetidos ciclos de ADN sin divisin celular cuyas copias se organizan de manera continua formando un nico cromosoma gigante, manteniendo un permanente estado interfsico. Han sido encontrados en las glndulas salivales de dpteros, ya que el patrn de bandeo de estos cromosomas permite construir un mapa citogentico para un mejor anlisis de especies de importancia econmica, clnica y veterinaria, como los de la familia simuliidae. Se colectaron larvas de Gigantodax sp de la Quebrada la Vieja Bogot-Colombia, identificando sus principales marcadores cromosmicos para compararlos con los registrados de Gigantodax basinflatus. Los cromosomas politnicos de Gigantodax sp se caracterizaron por presentar inversiones en los cromosomas II, diferencindose as las hembras de los machos. Cada cromosoma posee un marcador que le identifica de forma ms conspicua, siendo este en el cromosoma I la regin NOR, en el cromosoma II doble burbuja y en el cromosoma III el telmero festoneado. Palabras Clave: Cromosomas politnicos larvales, interfase, marcadores cromosmicos. ABSTRACT: Polytene chromosomes are produced by repeated cycles of DNA without cell division, copies of which are arranged to form a continuous single giant chromosome, maintaining a permanent interphase state. Has been found in the salivary glands of Diptera, as the pattern banding of these chromosomes can build a cytogenetic map for better analysis of economically important species, clinical and veterinary as the family Simuliidae. Larvae of Gigantodax sp, were collected from Quebrada la Vieja Bogota-Colombia, identifying key markers chromosome for comparison with basinflatus Gigantodax registered. Gigantodax polytene chromosomes were characterized by sp investment in chromosomes II, differing and females of males. Each chromosome has a marker that identifies more conspicuous and this in chromosome I NOR region on chromosome II double bubble and the telomere on chromosome III scalloped. Key Words: Larval polytene chromosomes, interphase chromosome markers.

INTRODUCCION. Los cromosomas politnicos son cromosomas gigantes que estn presentes en algunos ciliados, plantas superiores y principalmente en glndulas salivares de Dpteros. Este tipo de cromosomas debe su tamao, a un fenmeno especifico en el cual los ciclos de replicacin del ADN se repiten continuamente sin que haya una divisin de clula, en consecuencia estos cromosomas aumentan de tamao y son muy fciles de observar al microscopio por la gran cantidad de detalles que ellos presentan (Karp, 2005). Fueron descubiertos en 1881 por Balbiani, siendo comprendido hasta medio siglo ms tarde (Kostoff, 1930; Painter, 1933,1934; Heitz and Bauer, 1933; King and Beams, 1934; Bridges, 1935) donde fueron analizados en las glndulas salivales de larvas de los dpteros (Drosophila, Chironomus, Bibio) (Lacadena, 1996), siendo estos individuos de gran aporte para este tipo de estudios. Los simuliidae son una familia de dpteros con distribucin cosmopolita, encontrndose en Colombia los gneros Simulium de la subfamilia simiuliini, y Gigantodax de la subfamilia prosimuliini. Ambos parecen idnticos, pero Simulium presenta escotadura gular, esclerito anal con un anillo incompleto que rodea los cercos dispuestos all, branquias anales con varias ramificaciones e histoblasto con cuatro filamentos cortos, gruesos y bien definidos (Needham, P.R, 1982). Mientras que Gigantodax no tiene escotadura gular, presenta el anillo completo del esclerito anal, branquias anales con tres ramificaciones bien definidas e histoblasto con ramificaciones muy delgadas y largas (branquiales la mitad largos y la otra mitad cortos) (Roldn, 2003). Estos simulidos tiene gran importancia tanto mdica como veterinaria ms que todo las hembras ya que estas son hematfagas y transmiten la filaria Onchocerca volvulus, los

principales transmisores de O. volvulus son complejos de especies como S. damnosum, S. guianense, S. oyapockense, S. ochraceum, S. metallicum y S. exiguum, siendo el principal transmisor para Amrica Latina S. ochraceum s.l (Rodrguez & Prez, 2005). Wygondzinsky y Coscaron reconocen ocho grupos de especies entre Gigantodax, el G. brophyi, G. cilicinus, G. cormonsi, G, cortesi, G, igniculus, G, minor, G, multifilis y G. wrightik los cuales contienen 17,11,10, 4, 2, 4,1 y 15 especies respectivamente (Moulton, 1996). Rothfels (1981) encontr evidencias citolgicas que soportan la hiptesis que dice que estos dpteros retornan a sus cursos de agua natales para ovopositar en especies como Prosimulium mixtum, en tres riachuelos cerrados y encontrando que los riachuelos contienen larvas de esta especie de dpteros, con inversiones especificas para esta poblacin en el brazo del cromosoma IIL y IS. Adems los cromosomas paternos de estas poblaciones especficas se repiten ao tras ao. (Lualon, 2006) Los estudios de los cromosomas de las gandulas salivales han sido de gran importancia en la taxonoma del nmero de dpteros en el mundo. Las diferencias observadas en los patrones de bandeo permiten el reconocimiento de especies hermanas biolgicamente distintas lo cual es til para establecer la identidad de especies y sus relaciones filogenticas (Coscarn, 1998). Por lo cual, el propsito de este estudio fue caracterizar y comparar los cromosomas politnicos de Gigantodax sp. de la Quebrada la Vieja Bogot-Colombia y Gigantodax basinflatus (Vargas, 2002).

MATERIALES Y MTODOS: Las larvas de Gigantodax sp. con el histoblasto negro o gris fueron colectadas en la quebrada de la vieja, ubicada a una altura de 2722 metros, a 4 grados, 39 horas y 23 minutos de latitud norte; y a 74 grados, 2 horas y 47 minutos de longitud oeste, en Bogot. Se sigui la metodologa de Arteaga y Muoz (1999) donde las larvas fueron preservadas en Carnoy (tres partes de etanol al 90% por una de acido actico) y refrigeradas hasta empezar el estudio citogentico. Pasa a diferenciarse los gneros Simulium y Gigantodax, basados en el esclerito anal (completo en Gigantodax e incompleto en Simulium), luego las larvas se abren ventralmente con un corte del sexto al noveno segmento abdominal y se extraen las glndulas salivares que estn al lado del intestino. Estas glndulas se pasan a una IS: IL: 3 basales marcador mayor 3 subterminales Patrn del telmero

lamina con acido actico al 60%, y posteriormente se aplica una gota de OLA (orecina lactoacetica), se deja actuar 10 minutos y se realiza un squash con la laminilla; el acido lctico fluidifica el montaje y facilita el squash, y la orceina es un colorante del grupo de las oxazinas, que tie especficamente la cromatina generando patrones negros en las zonas donde se une con heterocromatina (constitutiva y facultativa), por ello se hace ms fcil la identificacin de los marcadores cromosmicos principales y especficos del genero Simulium. Posteriormente se identificaron y compararon los marcadores universales encontrados en Gigantodax sp. y de Gigantodax basinflatus (familia Simuliidae), con ayuda de la siguiente tabla (Muoz de Hoyos, 1990): Adems de construir el idiograma de Gigantodax sp. (basal 3) (marker) (subterminal 3) (Balbiani ring) (shoestring) (double Hubble) (trapezoide (al)) (3 sharp) (parabalbiani)

IIS: anillo de Balbiani Cordn de zapato central Doble burbuja Trapezoide tres bandas bien IIL: definidas Parabalbiani

IIIS: grupo de bandas (heavy band Group) pesadas (blister) Ampolla (frazzled end) Telmero festoneado IIIL: banda basal pesada Marcador basal 3 grupos pesados (heavy basal band) (basal marker) (three heavy groups)

RESULTADOS Y DISCUSION: I. MORFOLOGIA

En la quebrada de la Vieja, Bogot Colombia se encuentran larvas de la familia Simuliidae, presentando dos gneros, Simulium y Gigantodax, identificadas para el presente artculo en su totalidad como Gigantodax sp. Estas larvas presentan una longitud de 56 mm. Presentan una cpsula ceflica color marrn, los segmentos abdominales presentan bandas marrones

Fig. 2. ESCLERITO ANAL. Los brazos del esclerito anal forman un anillo y los dientes del submentn se encuentran reunidos en 3 grupos conspicuos (Roldn 2003).

Fig. 3. Filamentos Branquiales. Gigantodax sp. Presenta cinco ramas con 15 filamentos aproximadamente. Fig. 1 Larva Gigantodax sp.

II. COMPLEMENTO CROMOSMICO El complemento cromosmico de todos los gneros de Simulidos estudiados es de tres pares de cromosomas (2n=6) (Rothfles. 1979). El cromosoma I es metacntrico, mientras que el II y el III son submetacntricos con una relacin de 2:1 en el tamao de los brazos (Hirai et al. 1994, tomado de Arteaga & Muos, 1999). Estos cromosomas politnicos tienen gran importancia en la investigacin citogentica y surgi a partir de cundo se demostr la constancia del patrn de bandas (Painter, 1933), lo cual permiti construir los primeros mapas citolgicos (Bridges, 1935, 1938) y contribuir al desarrollo de la teora cromosmica de la herencia por cuanto contribuy a establecer la relacin entre la ordenacin lineal de los genes sobre los cromosomas (Bridges, 1935 Citado en Lacadena, 1996). De esta manera, los idiogramas reflejan de mejor manera los marcadores universales identificados en los Simulidos Gigantodax sp. y Gigantodax basinflatus, donde el cromosoma I de ambos muestra los two blocks (proximal al telmero en IS), el heavy y marker (en IL), junto

con la Regin Organizadora Nucleolar (NOR). En el cromosoma II no se observa ninguna inversin siendo notorio el Antifaz con Eucromatina a lado y lado del Centrmero, en el IIS se observan el Anillo de Balbiani, Trapezoidal y Doble Burbuja con el Cordn de Zapato central a ella, este ultimo ms evidente en Gigantodax sp; en el IIL solo se diferenci el Parabalbiani. En cuanto al cromosoma IIIS fue comn para ambos individuos el telmero festoneado, la Ampolla y el Heavy, y en el brazo largo el 3 heavy group. Cromosoma I. Gigantodax sp. Este es el cromosoma ms largo de los 3 (presenta en su totalidad 43 regiones), su centrmero se encuentra en la mitad del cromosoma (en la regin 22); en su brazo S los marcadores NOR (regin 17 ), y Two Blocks (2B) en la regin 10,el Glazed en la regin 6; y en el brazo L el Marker (regin 33 ) y Heavy Bands (HG) en la regin 36 (figura 4).

Figura N.4 Cromosoma I Gigantodax sp.

Mientras que en Gigantodax basinflatus el centrmero se encuentra ubicado en el brazo corto del cromosoma (en la regin 12); en su brazo IS los marcadores NOR (regin 16 ), y Two Blocks (2B) en la

regin 8,y el Glazed en la regin 6; y en el brazo IL el Marker (regin 33 ) y Heavy Bands (HG) en la regin 36 (figura 5).

Cromosoma II. El centrmero est ubicado en la seccin 55 (submetacntrico). El brazo S evidencia los marcadores Anillo de Balbiani (AB) (prximo al telmero, en la regin 46 ), el Cordn central a la Doble Burbuja (CCDB) ubicada en la parte distal del brazo, entre el centrmero y el anillo de Balbiani (en la seccin 48 ), y el

Trapezoidal (Tp) muy cerca al centrmero. En el brazo IIL se observan3 sharp o 3 bandas ubicadas proximales al telmero (seccin 65 ), constituidas por heterocromatina facultativa y el Parabalbiani (PB) con una banda basal bien definida distal al centrmero (regin 71). (figura 6).

En Gigantodax basinflatus el centrmero se ubica en la seccin 54 (submetacntrico). El brazo IIS evidencia los marcadores Anillo de Balbiani (AB) (prximo al telmero, en la regin 46 ), el Cordn central a la Doble Burbuja (CCDB) ubicada en la parte distal del brazo, entre el centrmero y el anillo de Balbiani (en la seccin 46 ), y el

Trapezoidal (Tp) muy cerca al centrmero en la regin 53. En el brazo IIL se observan3 sharp o 3 bandas ubicadas proximales al telmero (seccin 73), constituidas por heterocromatina facultativa y el Parabalbiani (PB) el cual no se diferencia de manera conspicua ya que se confunde con el cormosoma I. (figura 7).

Fig. 6 Cromosoma II Gigantodax sp., donde se observan los marcadores Trapezoidal, el anillo de Balbiani y el Cordn central a la doble burbuja.

Cromosoma III. En Gigantodax sp., esta caracterizado por presentar el telmero festoneado (TF) que sirve como partida para describir del brazo corto del cromosoma, la FIG 8.A presenta un telmero abierto lo cual indica un polimorfismo flotante ya que la presencia de fenomeno no se encuentra en todas las clulas como se puede observar en la FIG 8.B en el telmero de este cromosoma III, se ubica en la seccin 77.

El cromosoma generalmente es submetacentrico, pero no pudo verse, ya que no se realizo el mtodo de bandeo C, entonces es un poco complejo de ubicarlo en el cromosoma; en el brazo corto (IIIS) se encuentra la Ampolla (Am), constituida por eucromatina empaquetada en la seccin 80, y el marcador Heavy (H) constituido por una serie de bandas compuestas por heterocromatina facultativa en la regin 84. En el brazo largo (IIIL), en la seccin 92 se presenta el Marker (pequea porcin de eucromatina empaquetada), y en la regin 96 las 3 Bandas Pesadas (3HG), con gran cantidad de heterocromatina facultativa (figura 9).

Fig. 8. A. Cromosoma III Gigantodax sp., presenta el telomero festoneado. Perteneciente, a una hembra. B. presenta una inversin, perteneciente a un macho.

Fig. 9. A, el cromosoma III, el brazo ms corto esta caracterizado por un telmero festoneado en la seccin 2, un heavy en la seccin 79, seguido de un blster (BL), y bandas oscuras en la seccin 80. En el brazo IIIL encontramos las tres bandas pesadas en la seccin 95 y un rea plida formada por unas series de bandas marcadas en la seccin 96-98 en la parte distal del brazo. Hay una inversin paracntrica simple flotante entre la seccin 85-90 lo cual indica que esta larva es macho. Mientras que en la figura 7B en el brazo IIIS se observa el heavy en la seccin 79, el blister (BL) en la regin 80, el descondensamiento del DNA lo cual hace que la regin tenga mayor tamao, y al final del brazo largo IIIL encontramos las tres bandas pesadas en la seccin 95. No hay presencia de inversiones por lo tanto esta larva es hembra.

El centrmero de este cromosoma en Gigantodax basinflatus tampoco se pudo ubicar, debido a que no se realiz el bandeo C; en el brazo corto (IIIS) se encuentra el telomero festoneado en la seccin 81 la Ampolla (Am), constituida por eucromatina empaquetada en la seccin 80, y el marcador Heavy (H) constituido por una serie de bandas compuestas por heterocromatina facultativa en la regin 79. En el brazo largo (IIIL), en la seccin 86 se presenta el Marker (pequea porcin de eucromatina empaquetada), y en la regin 98 las 3 Bandas Pesadas (3HG),

con gran cantidad de heterocromatina facultativa (figura 10). Tambin se ha reportado la Regin organizadora Nucleolar en este cromosoma de especies como Simullium sumapazaense y G.basinflatus (Vargas, 2002), demostrando la gran movilidad de este marcador, probablemente en relacin con su funcin de sntesis del ARNr, pues los genes que codifican esta molcula son muy especficos para cada especie y debido a esto necesitan una asociacin especifica con un cromosoma en particular.

Comparacin de Idiogramas Gigantodax sp. y G. basinflatus.

de

se identifico y ubico los marcadores cromosmicos universales encontrndose las siguientes diferencias:

En el ideograma diseado para Gigantodax sp y Gigantodax basinflatus

A. Gigantodax sp.

Fig. 11. Distribucin de secciones del complejo cromosmico: A. Idiograma Gigantodax sp. Cromosoma I 41%, Cromosoma II 32% y Cromosoma III 29%. B. Idiograma Gigantodax basinflatus Cromosoma I 43%, Cromosoma II 32% y Cromosoma III 25%.

B. Gigantodax basinflatus.

FIG 12. Distribucin de secciones del complejo cromosmico: A Ideograma Gigantodax basinflatus. Cromosoma I 43%, Cromosoma II 32% y Cromosoma III 25%.

En el cromosoma I: IL el marcador two blocks (2B) est en una posicin ms proximal con respecto al telmero en

Gigantodax sp que en G. basinflatus, en este ultimo el 2b se ubica ms cercano al telmero. En IS se encuentra el NOR

en la posicin especfica para todo el gnero Gigantodax (Coscaron. 1998). En cuanto al cromosoma II se observa una inversin paracentrica en Simulium sp. desde el trapezoidal (Tp) hasta un poco antes del parabalbiani (PB). El NOR puede encontrarse en IIS para la especie Simulium metallicum (Arteaga & Muoz . 1999). Finalmente en el cromosoma III, observa una inversin pericntrica en brazo S y el NOR puede encontrase este brazo para la especie sumapazense (Vargas. 2002). CONCLUSIONES A partir de la extraccin, montaje de cromosomas politnicos de Gigantodax sp y ubicacin de marcadores universales y especficos, se compar con la especie G. basinflatus con la ayuda de un diseo de ideogramas para el complemento cromosmico de cada uno, encontrndose principalmente que las diferencias en la ubicacin de los marcadores tanto de Gigantodax sp.y Gigantodax basinflatus se ven en pequeas distancias de dos o mximo tres secciones separadas una de la otra, segn sea el marcador, estas distancias estn posiblemente dadas por las caractersticas de cada una de las especies o por una adaptacin al medio. Gigantodax sp. Presenta cromosomas politnicos que permiten realizar estudios de marcadores universales con bastante facilidad, estos marcadores han sido descritos y ubicados en su mayora, cabe destacar que el cromosoma II de se en en S.

la muestra posee inversin incluyendo tambin el cromosoma III lo que indica que la muestra es de un macho, contrastndose con el de una hembra, los cuales ninguno de los dos cromosomas presentan inversiones.

En el cromosoma III se hace imposible la identificacin del centrmero en el caso de los cromsomas III, trabajandose con la posicin de los marcadores para indicar cul es el brazo largo o corto del cromosoma. Cada cromosoma posee un marcador que le identifica de forma ms conspicua, siendo este en el cromosoma I la regin NOR, en el cromosoma II doble burbuja y en el cromosoma III el telmero festoneado.

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