Kultury komórkowe i tkankowe roślin i zwierząt - LABORATORIUM Opracowanie: dr inż. Beata Butruk-Raszeja Ćwiczenie 3

1

ĆWICZENIE3:

Cytotoksycznośćbiomateriału

Zakres:

Oznaczaniacytotoksycznościbiomateriału

WyznaczanieIC50

Przygotowaniepreparatówdomikroskopiifluorescencyjnej

Kultury komórkowe i tkankowe roślin i zwierząt - LABORATORIUM Opracowanie: dr inż. Beata Butruk-Raszeja Ćwiczenie 3

2

Wprowadzenie

1. Hodowlekomórkowe–podstawowepojęciaPojęcie hodowli komórkowych określa proces hodowli komórek wyizolowanych

zorganizmów roślinnych i zwierzęcych w odpowiednio dobranym środowisku,umożliwiającymichprzeżycieoraznamnażaniesię.Najczęściejkomórkiizolowanesąztkanek organizmu metodami enzymatycznymi lub mechanicznymi. Niektóre typykomórek (np. progenitorowe) mogą być izolowane bezpośrednio z krwizzastosowaniemtechnikiwirowaniawgradienciegęstości.

Wyróżniasiędwagłównetypykulturkomórkowych:• hodowlapierwotne–hodowlakomórekpobranychbezpośredniozorganizmu

dawcy, namnażanych w warunkach in vitro aż do momentu osiągnięcia stanupełnej konfluencji (stan, w którym namnożone komórki zajmują całąpowierzchnięwzrostudostępnąwdanymnaczyniuhodowlanym);poosiągnięciuok.80%konfluencjikomórkisąpasażowane(przenoszonedonowegonaczyniahodowlanegozawierającegoświeżemediumhodowlane)

• linie komórkowe – po kilku pasażach hodowla pierwotna staje się liniąkomórkową,wyróżniasięlinie:

o normalne – komórki zdolne do określonej liczby podziałów, można jeutrzymaćprzyżyciuprzezkilkamiesięcy,aczasemlat,leczpookreślonejliczbiepasażykomórkistarzejąsię iobumierają; liczbapodziałówzależyod rodzaju narządu, z którego wywodzi się linia komórkowa, typuhodowanychkomórekorazwiekuorganizmuzktóregopobieranotkankędozakładanialiniikomórkowej

o unieśmiertelnione (ciągłe) linie komórkowe – komórkicharakteryzujące się nieokreślonym czasem życia, najczęściejpoliploidalne ipochodzenianowotworowego,co zapewnia immożliwośćnieokreślonej liczy podziałów; ciągłą linię komórkową można takżeuzyskać z komórek prawidłowych w wyniku ich transformacji, czylizmiany materiału genetycznego, proces transformacji może zachodzićspontanicznie lub być celowo indukowany (chemicznie lub przy użyciuwirusów)

Wzależnościodtypuhodowanychkomórekwyróżniasię:• komórki adherentne – komórki wykazujące zdolność do adhezji do podłoża,

rosnąwformiemonowarstwypokrywającejpowierzchnięwzrostuwnaczyniuhodowlanym,

• komórkinieadherentne–nieprzylegającedopodłoża,rosnącewzawiesinie

Kultury komórkowe i tkankowe roślin i zwierząt - LABORATORIUM Opracowanie: dr inż. Beata Butruk-Raszeja Ćwiczenie 3

3

2. MorfologiakomórekKomórkihodowanewwarunkachinvitrowykazujątrzypodstawowetypymorfotyczne:

• typfibroblastopodobny–komórkiadherentne,owydłużonymkształcie

• typnabłonkowy–komórkiadherentce,ostrukturzekostkibrukowej

• typlimfoblastopodobny–komórkinieadherentne,sferyczne

Kultury komórkowe i tkankowe roślin i zwierząt - LABORATORIUM Opracowanie: dr inż. Beata Butruk-Raszeja Ćwiczenie 3

4

1.Testycytotoksycznościinvitro

Obowiązująceprawowymaga,abywszystkienowezwiązkiocharakterzepotencjalnych

leków, podlegały szeroko zakrojonym badaniom w celu oceny aktywności

cytotoksycznej,przedskierowaniemichdobadańklinicznych.Badaniacytotoksyczności

cząsteczek potencjalnych leków są więc niezbędne do określenia ich prawidłowego

działaniaorazbezpieczeństwa leku.Badania tepozwalająnaustalenie zakresudawek

iuzyskaniedanychnatematmechanizmudziałanialeku.Hodowlekomórkowestanowią

doskonałą alternatywę dla badań na zwierzętach. Zastosowanie badań na liniach

komórkowychpozwalanaszybkieiłatwezbadanieprocesówkomórkowychprzyużyciu

małych ilości badanej substancji, dużą zaletą jest powtarzalność. Bardzo ważny jest

wybór odpowiedniej linii komórkowej, dlatego dla właściwej oceny należy użyć jak

najwięcejliniikomórkowychozróżnicowanejwrażliwości.

Zakresbadańwyrobówmedycznychściśleokreślająodpowiednieaktyprawne.Norma

obowiązującaw Polsce przewiduje 3 testy dla oceny działania toksycznegowyrobów

medycznych, w zależności od rodzaju materiału, z którego jest wykonany

iprzeznaczenia a także określa m.in. warunki przygotowania i hodowli do

poszczególnych testów, rekomendowane linie komórkowe, warunki przygotowania

próbybadanejikontroli,kryteriauzyskanychefektów.Opisaneprocedurypozwalająna

jakościowąiilościowąocenętoksycznościwyrobumedycznego.

Miarącytotoksyczności,IC50,jeststężeniezwiązku,przyktórymproliferacjakomórek

zostaje zahamowana w 50%w stosunku do komórek w próbie kontrolnej. Do oceny

cytotoksycznościbadanegozwiązkustosujesiętakżewartości:

-IC10–stężeniezwiązku,przyktórymproliferacjakomórekzostajezahamowanaw10%

wstosunkudokomórekkontrolnych,tzw.pierwszadawkatoksyczna;

-IC90–stężeniezwiązku,przyktórymproliferacjakomórekzostajezahamowanaw90%

wstosunkudokomórekkontrolnych,tzw.dawkaletalna.

Standardowy przebieg krzywej odpowiedzi na dawkę, z której można wyznaczyć

parametrIC50:

Kultury komórkowe i tkankowe roślin i zwierząt - LABORATORIUM Opracowanie: dr inż. Beata Butruk-Raszeja Ćwiczenie 3

5

Standardowo proces oceny cytotoksyczności danego związku polega na kontakcie

związkuprzezokreślonyczasiwokreślonychwarunkachzwybranymtypemkomórek.

Następnie czynnik analizowany jest usuwany i przeprowadzane są testy

cytotoksyczności (bezpośrednio po usunięciu czynnika badanego lub po uprzedniej

kilkudniowejhodowlikomórek)

Najczęściejanalizowanymiparametramipodczaswykonywaniatestówcytotoksyczności

są:

ü Żywotnośćkomórek

ü Aktywnośćmetaboliczną

ü Szybkośćproliferacji

A. Ocenażywotnościkomórek

Krzywa odpowiedzi na dawkę (ang.dose-response curve)

IC50

Kultury komórkowe i tkankowe roślin i zwierząt - LABORATORIUM Opracowanie: dr inż. Beata Butruk-Raszeja Ćwiczenie 3

6

Najprostszym i najczęściej stosowaną metodą oceny żywotności komórek jest

barwienie barwnikami różnicującymi komórki martwe i żywe. Do testów tych

należa:

i) Barwieniebłękitemtrypanu

ii) Barwienieestremkalceiny/jodkiempropidyny

iii) Barwienieczerwieniąneutralną

iv) Barwienieoranżemakrydyny/bromkiemetydyny(rys.1)

Rysunek1:Komórkiwybarwioneparąbarwnikóworanżakrydyny/bromeketydyny

B. Ocenaaktywnościmetabolicznejkomórek

Donajpopularniejszych testówcytotoksycznościoceniającychaktywnośćmetaboliczną

komórek zaliczamy testy wykorzystujące konwersję soli tetrazolowych oraz testy

wykorzystująceredukcjęresazuryny.

i) Testyoparteowykorzystaniesolitetrazolowych

ü testy mierzące aktywności dehydrogenazy mitochondrialnej (testy

MTT/MTS/XTT),opartesąnazdolnościenzymudehydrogenazymitochondrialnejdo

przekształcania,rozpuszczalnejwwodziesolitetrazolowej(MTT,MTS lubXTT)do

kolorowego produktu – formazanu (rys.2); w przypadku testu MTT produkt jest

nierozpuszczalny w wodzie i wymaga rozpuszczenia w rozpuszczalnikach

organicznych, testy MTS i XTT są natomiast wygodniejszą wersją testu, w której

produktreakcjijestwpełnirozpuszczalnywwodzie

Kultury komórkowe i tkankowe roślin i zwierząt - LABORATORIUM Opracowanie: dr inż. Beata Butruk-Raszeja Ćwiczenie 3

7

Rysunek2:KonwersjasoliMTTdoformazanupodwpływemNADH.

Rysunek3:StandardowyprzebiegtestuMTT.

ü testymierząceaktywnościdehydrogenazymleczanowej (testLDH)podobniedo

testów MTT oraz MTS jest testem kolorymetrycznym, oparty na pomiarze ilości

dehydrogenazy mleczanowej (ang. lactate dehydrogenase, LDH),

wewnątrzkomórkowego enzymu cytoplazmatycznego, uwalnianego z komórki do

medium hodowlanego na skutek jej lizy. Badanie polega na określeniu ilości LDH

uwolnionej zmartwychkomórekpoprzezpomiar reakcji enzymatycznejkonwersji

soli tetrazolowej do barwnego formazanu w nadsączach znad komórek

inkubowanychzbadanymczynnikiem(rys.4).

Kultury komórkowe i tkankowe roślin i zwierząt - LABORATORIUM Opracowanie: dr inż. Beata Butruk-Raszeja Ćwiczenie 3

8

Rysunek4:ZasadadziałaniatestuLDH.

ii) Testyoparteowykorzystanieresazuryny

Kolejną grupę testów mierzących aktywność metaboliczną komórek są testy oparte

owykorzystaniekonwersjiresazurynydoresorufiny(rys.5).Resazuryna,maniebieską

barwę oraz posiada zdolność przenikania do komórek. Żywe komórki mają zdolność

przekształcania resazuryny w rezorufinę, która jest ma czerwoną barwę i wykazuje

zdolności fluorescencyjne. Nazwy handlowe testów opratych na resazurynie to m.in.

AlamarBlue®orazPrestoBlue®.

Rysunek5:Konwersjaresazurynydoresorufiny.

C. Ocenaszybkościproliferacjikomórek

Innym sposobem analizy żywotności jest analiza szybkości proliferacji komórek

woparciu o szybkość syntezy DNA. Przykładem takiego testumoże być test BrdU -

(ang. bromodeoxyuridine, BrdU). Bromodeoksyurydyna jest syntetycznym analogiem

nukleozydu tymidyny (rys.6) inkorporowanym do DNA w dzielącej się komórce.

Detekcja BrdU za pomocą specyficznego przeciwciała sprzężonego z enzymem oraz

reakcja enzymatyczna powyższego enzymu z barwnym substratem pozwala na

kolorymetrycznąanalizęzdolnościproliferacyjnychkomórek.

Kultury komórkowe i tkankowe roślin i zwierząt - LABORATORIUM Opracowanie: dr inż. Beata Butruk-Raszeja Ćwiczenie 3

9

Rysunek6:WzorystrukturalnetymidynyorazBrdU.

2.Ocenacytotoksycznościbiomateriału

Mianem biomateriału określa się materiał pochodzenia sztucznego lub naturalnego,

przeznaczony do stosowania w systemach biologicznych w celu leczenia,

diagnozowania, wspomagania lub zastąpienia (częściowego lub całkowitego) chorej

tkanki lub narządu (na podstawie M. Nałęcz „Biocybernetyka i Inżynieria

Biomedyczna”).

Biomateriały obejmują szeroką grupę materiałów, w zależności od materiału

użytegodoichwytworzeniawyróżniasię:

ü Biomateriałymetaliczne–głowniewykonaneztytanuorazjegostopów,stosowane

w ortopedii (endoprotezy, klamry do zespalające złamane kości) oraz

kardiochirurgii(stentynaczyniowe,elementysztucznychzastawekserca),materiały

metaliczne charakteryzują się bardzo korzystnymiwłaściwościamimechanicznymi

(wysokaodpornośćnakorozjęzmęczeniową,pękanie,wytrzymałośćnarozciąganie

izginanie)

ü Biomateriały ceramiczne – oparte głównie o fosforanywapnia, szeroko stosowane

do wypełniania ubytków kostnych i zębowych, charakteryzują się wysoką

biozgodnością i zdolnością do biodegradacji, co umożliwia stopniową odbudowę

ubytkuprzezrozwijającąsiętkankę

BrdU tymidyna

Kultury komórkowe i tkankowe roślin i zwierząt - LABORATORIUM Opracowanie: dr inż. Beata Butruk-Raszeja Ćwiczenie 3

10

ü Biomateriały polimerowe – najliczniejsza i najbardziej zróżnicowana grupa

materiałów,stosowane,jakoprotezy(protezyserca,protezynaczyńkrwionośnych),

systemy terapeutyczne (nośniki leków, opatrunki), elementy wspomagające

wchirurgii (nici i kleje chirurgiczne), obecnie biomateriały polimerowe, co raz

częściejwykorzystywanesąwinżynieriitkankowej,jakorusztowaniawspomagające

rozwójkomórekitkanek

LaboratoriumInżynieriiBiomedycznejWydziałuInżynieriiChemicznejiProcesowej

zajmujesięotrzymywaniemszeregumateriałówwykorzystywanychwmedycynieoraz

analizą ich właściwości, również w modelach in vitro, z wykorzystaniem hodowli

komórkowej. Poniżej zaprezentowano zdjęcia wybranych materiałów wytwarzanych

wLaboratorium(rys.1).

Rysunek 7: Przykładowe biomateriały otrzymywane lub modyfikowanewLaboratoriumInżynieriiBiomedycznejWICHiPPW.

Biozgodnośćmateriałumedycznego jestoceniana in vitro poprzezkontaktmateriału z

komórkami. Szczegółowe zasady przeprowadzania testów określa norma ISO. Testy

mogąbyćprzeprowadzone:

ü metodą bezpośrednią – bezpośredni kontakt analizowanegomateriału z warstwą

komórek,

ü metodąpośrednią–zużyciemekstraktówmateriałuuzyskanychpoprzezinkubację

materiałuzmediumhodowlanym,najczęściejwtemperaturze37°Cprzezokres24

godzin

Implanty kostne Nanocząstki

Protezy naczyń krwionośnych

Stenty naczyniowe Protezy serca

Kultury komórkowe i tkankowe roślin i zwierząt - LABORATORIUM Opracowanie: dr inż. Beata Butruk-Raszeja Ćwiczenie 3

11

Po określonym czasie kontaktu (na ogół 24 godziny) analizowana jest żywotność

komórek z zastosowaniem testów cytotoksyczności określających wpływ czynnika

toksycznego na żywotność komórek. Testy te wykorzystują aktywność enzymatyczną

enzymów znajdujących się w żywych komórkach, które katalizują przemiany

metaboliczne określonych związków dodawanych do medium, powodując zmianę

wabsorbancjiroztworu.

Wykonaniećwiczenia1.AnalizacytotoksycznościzwykorzystaniemtestuPrestoBlueOdczynniki:-roztwórPrestoBlue(10xstężony)-roztwórczynnikatoksycznego(5%)Wykonaniećwiczenia:

1. Przygotować roztworybadanych substancjiwstężeniach:0,0125;0,025;0,05;0,1%wmediumhodowlanym,każdyroztwórwobjętości1ml

2. Usunąćpożywkęzdołkówpłytki96-dołkowej3. PrzepłukaćkomórkiPBS4. Dokolumny3dodaćmediumhodowlane(100ul/dołek)5. Do kolumn 4-7 dodać roztwór analizowanej substancji (wzrastające stężenia do

kolejnychkolumn)6. Płytkęumieścićwinkubatorzenaokres1h7. Usunąćroztwory8. PrzepłukaćkomórkiPBS9. PrzygotowaćroztwórPrestoBlue+mediumwstosunku1:9(3ml)10. DodaćroztwórPrestoBluedokolumn2-711. Inkubowaćw37°Cprzez1,5h12. Odczytaćabsorbancjęprzydługościfali570nmoraz600nm

0,01

25

0,02

5

0,05 0,1KB

Kultury komórkowe i tkankowe roślin i zwierząt - LABORATORIUM Opracowanie: dr inż. Beata Butruk-Raszeja Ćwiczenie 3

12

Analizawyniku1. Od wartości absorbancji odczytanej przy dł. fali 570nm odjąć wartość absorbancji

odczytanejprzydł.fali600nm2. Uśrednićwartośćotrzymanądlablanku3. Od otrzymanychwartości absorbancji dla badanych próbek odjąć uśrednionąwartość

blanku4. Wyznaczyćkrzywązależnościabsorbancjiodstężeniaskładnikatoksycznego,oszacować

IC50.

2.Cytotoksycznośćmateriałówcz.2-barwieniedoobserwacjiadhezji

Materiały:- Płytka48-dołkowazkomórkamirosnącyminapowierzchnimateriałów- Roztwórparaformaldehydu- RoztwórDAPI- RoztwórTriton- PBS- klejutrwalający

Wykonanie:

1. Materiały polimerowe wraz z rosnącymi na ich powierzchni komórkami wyjąć zinkubatora

2. Usunąćmediumhodowlane,materiałydelikatnie(!)przepłukaćPBS(2x)UWAGA:przypłukaniupostępowaćdelikatnie,uważać,żebymateriałynieprzekręciłysięnadrugastronę(komórkirosnąnagórnejpowierzchnimateriału)3. MateriałyzalaćroztworemPFA4. Płytkęowinąćparafilmemiinkubowaćwtemperaturzepokojowej15minut5. PłukaniePBS4x5min,RT,wytrząsarka6. Permeabilizacjaw0,2%TritonX-100,8min,RT7. PłukaniePBS4x5min,wytrząsarka8. Materiałyzalać100ulroztworuDAPI,6minut,RT,wciemności9. PłukaniePBS4x5min,RT,wytrząsarka,wciemności10. Naszkiełkonakrywkowe(cienkie)nałożyćkroplęklejuutrwalającegozDAPI,nakropli

umieścić materiały stroną z komórkami do kropli, przykryć drugim szkiełkiemnakrywkowym, zabezpieczyć lakierem do paznokci. Zawinąć w folię, trzymać wciemności.