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NOMBRE: Sergio de Jesús GÓme2: /f

TELEFONO: 382-08-48.

MATRICULA: 88207118.

LICENCIATURA: Biología Experimental, CBS, Unidad Iztapalapa.

TRIMESTRE : 9 3 -0.

HORAS DE DEDICACION SEMANAL: 40.

TITULO: Caracterización electroforética de pectinasas producidas por Aspergillus niger. I /

ASES0RES:Dr. Gustavo Viniegra González y M. en C. Ma. Elena Acuña

/ I

Argüelles.

LUGAR DE REALIZACION: Depto de Biotecnología, S-159.

FECHA DE INICIO:24. de Marzo de 1993.

FECHA DE TERMINACION:24 de Septiemhre de 1993.

CLAVE: B&.

I

\--

PROYECTO DE SERVICIO SOCIAL"CAKACTER1ZACION ELECTROFORETICA DE PECTINASAS PRODUCIDAS POR Aspergillus nigerii.

7 SERGIO DE JESUS ROMERO GOMEZ. BIOLOGIA EXPERIMENTAL. LABORATORIO DE ENZIMOLOGIA INDUSTRIAL. UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA.

JUSTIFICACION:

La elección de pectinasas como tema de estudio se debe a sus multiples aplicaciones en la industria alimentaria como sistemas de control de gelificación de una amplia variedad de productos, la clarificación de jugos y el aumento en la velocidad de filtrado y enriquecimiento en azúcares de mostos para la fabricación de vinos de alta calidad. Todo esto provoca que Pa demanda de pectinasas de alto rendimiento sea alta no solo a nivel nacional sino a nivel mundial abarcando un mercado calculado en 165 mdti (Fogarty,l982).

Actualmente, se explotan industrialmente las pectinasas producidas por una amplia varj-edad de microorganismos, hongos filamentosos en su mayoría, de los cuales el que mejores resultados a tenido es A. ni.ger, debido a su propiedad de digerir extracelularmente lo que implica que todas sus enzimas las secreta al medio, la facilidad de su manejo y el hecho de que soporta grandes cambios en sus condiciones de cultivo sin disminuir su actividad (Desgrandes, 1991) .

Este analisis propuesto en este estudio es importante debido a que proporcionará conocimientos basicos de procesos como la formación de isoenzimas, su forma de acción y la desrepresión catabolica que ha sido observada en las cepas a estudiar. Los resultados que se obtengan de este estudio forman el primer paso para la apertura de este equipo de trabajo hacia otras áreas de estudio de los fenómenos relacionados con la producción de enzimas de ínteres industrial y el inicio de estudios serios sobre pectinasas a nivel molecular, estudios que forzosamente desembocarán en la utilización de herramientas coino la ingenieria de proteínas y la ingenieria genética para 1.a optimizacion de la actividad enzimática de las pectinasas y otras enzimas.

INTRODUCCION:

Al grupo de enzimas que degradan pectina se les denomina pectinasas y son divididas para su estudio de acuerdo al tipo de ataque que cada una presenta hacia la molécula de pectina, quedando así, dos grupos; las pectinesterasas que atacan el enlace ester entre el metoxilo y el carbono 6 de cada unidad de ácido galacturonico y las, despolimerasas que rompen el enlace glicosidico A 1-4 ya sea por eliminación o por hidrólisis, separandose a su vez en endopolimerasas que cortan la cadena de manera aleatoria formando oligómeros de ácido galacturonico y las exopectinasas que degradan la pectina por los extremos de la cadena produciendo monomeros de ácido galacturonico( Tuttobello,l961; Ward,1985; Maldonad0~1989; Colin,1990;).

Las pectinasas son producidas por una gran variedad de organismos como bacterias, mohos, levaduras y plantas; de los cuales los hongos filamentasos son utilizados a nivel industrial para la producción de pectinasas, debido a que la pectina interviene en una gran cantidad de procesos indutriales como parte fundamental de procesos de gelificación que pueden ser de utilidad o actuar como contaminante del proceso.(Tuttobello,1961;Maldoi~ado,1989; Colin,1990)

ANTECEDENTES:

Estudios realizados en este laboratorio indican que las pectinasas producidas por A. niger resultan ser muy diferentes incluso entre cepas mutantes del mismo existen diferencias de actividad que no pueden ser explicadas por cambios cuantitativos en la produccion de pectinasas, esto apunta a la sospecha de que existen cambios estructurales en las enzimas que se estudiaran en este proyecto, por lo cual se hace necesario un estudio a nivel molecular de las pectinasas como primer paso a para posteriores estudios

En el laboratorio de enzimologia industrial de la UAMI, se han venido realizando estudios sobre la fisiologia y mejoramiento genético de Aspergillus niger, con la intención de obtener mutantes hiperproductores de pectinasas tanto para cultivo líquido como para cult.ivo sólido.

Merece especial atencih el estudio de Antier et a1(1991), en el que se utilizó una cepa silvestre de Aspergillus niger denominada C28B25 que fue aislada de un cafetal por Aquihuatl y colaboradores en 1987 como hiperproductora natural de pectinasas en cultivo sólido, esta cepa fue mutagenizada por medio de radiación ultravioleta en caja petri donde se añadió desoxiglucosa como analog0 toxico de glucosa con el fin de aislar las cepas que no presentaron represión catabólica y etilenglicol como represor de la Aw que

se dejo en valores de 0.99 y 01.96, las esporas que alcanzaron a desarrollarse se separaron( Aquihuatl,l987; Antier;l991)

Posteriormente se realizó a cada cepa aislada una prueba de producción de pectinasas en placa por halo de hidrólisis eligiendose solo a las mejores productoras de cada Aw, para realizarsele la evaluación en fermentación sólida y líquida de los niveles de producción de endopectinasas, presentandose los siguientes resultados; las cepas aisladas a una Aw de 0.99 resultaron ser hiperproductoras en cultivo líquido , mientras que las aisladas a una Aw de 0.96 resultaron hiperproductoras en cultivo sólido. Como reflejan la cepa DGRAW96-3( RESISTENTE A DESOXIGLUCOSA AISLADA EN UN VALOR DE ACTIVIDAD DE AGUA DE 0.96) hiperproductora en sólido que presenta los menores niveles de producción en líquido y la cepa DGRAW99-111( RESISTENTE A DESOXIGLUCOSA AISLADA EN UN VALOR DE ACTIVIDAD DE AGUA DE 0.99) hiperproductora en líquido que presenta niveles de producción bajos en cultivo sólido, en tanto que C28B25 hiperproductora natural que dió origen a cada una de las anteriores presenta en este momento niveles de producción intermedio para ambos sistemas de cultivo. debido al aumento de producción de los mutantes(Antier et a1,1991).

Como metodo de caracterización se eligió la electroforesis en gel de poliacrilamida en placa por que facilita la obtención de pesos moleculares y el analisis de actividad de cada enzima por separado (Cruickshank,l980) (Ried,1985), características que pretendemos conocer por este estudio.

OBJETIVO:

Comparar los patrones electrof oreticos de cepas mutantes de A. niger y correlacionarlns con cambios en la actividad pectinolítica.

Caracterizar las pectinasas producidas por A. niger por medio de su patrón electroforético.

Evaluar la actividad pectholitica in situ.

MATERIAL Y METODO.

El sustrato elegido para fermentación es pulpa de café y las cepas elegidas son DGRAW96-3, C28B25 y DGRAW99-I11 pertenecientes al cepario de este laboratorio. Las condiciones de cultivo se basan en un estudio realizado en este laboratorio, son las siguientes; la pulpa de cafe se esteriliza junto con una solucion de urea 0.07945, sulfato de amonio.0.1478 y fosfato de sodio monobasico 0.09054 g/g de

pulpa seca en todos los casos que se disuelven en el 80% de el agua requerida para una húmedad del 60 % a la que se le ajusta el pH a 4.8. (Antier et a1,1993)

Se hace una solución de esporas suficiente para inocular 2.0 E 7 esporas/g de pulpa seca. Se mezclan las tres y se homegeiniza, inmediatamente se empacan 20 g. en columnas de 20 mm de díametro interno con una densidad de empaque de 0.5 g/cm cubico y se incuba durante 72 hrs a 25 Grados centígrados con aireación constante de 110 mmhg.

Se quita la columna, se extrae el sustrato y se pesa; se agrega un volúmen de agua destilada igual al peso del medio, se mezcla y se exprime en una prensa hidraúlica a 1100 psi. El extracto se recoge, se centrifuga a 7000 rpm durante 10 minutos y se decanta para separar sólidos.

Este extracto se somete a evaluación de su actividad endopectinasa por viscosimetria siguiendo el método descrito en Antier et a1,1991; exopectinasas por el método de DNS modificado descrito en Solis et al(1990); medida del pH y evaluacion de crecimiento descrito en Antier et a1,1991.

Las muestras que preselntan actividad se dialisan por 48 hrs. en un volúmen 100 vpces superior al de la muestra, posteriormente se concentrani las proteínas por precipitacion.

Las muestras así tratadas se someten a electroforesis en gel de poliacrilamida siguiqndo la técnica descrita en Cruishank y Wade,1981; y deqpues se someten a evaluación de actividad in situ por el usd de una capa fina de pectina que se aplica sobre la placa de ,electroforesis primeramente cualitativamente por los tie/mpos diferenciales de acción y posteriormente cuantitativa ente,tanto en su actividad como en su cantidad por el uso de u dngitalizador de imagenes.

LUGAR DE REALIZACION:

El trabajo se llevara cabo en su totalidad en el laboratorio de Enzimologla 9 ndustrial de la Sección de Microbiología, Departamento de Biotecnología, Division de Ciencias Biológicas y de la Salud, UAM-I.

DURACION Y ETAPAS:

Las fechas que se proponen don:

Fecha de iniciación: 24 de Fecha de terminación: 24 de

Se propone su realizactón en una sola etapa que cubrira el tiempo propuesto. I I

RESULTADOS

Debido a problemas de tipo metodológico y personal no fué posible el obtener resultados de la parte electroforética, por lo cual los objetivos se modificaron quedando de la siguiente manera:

Se pretende evaluar la producción de pectinasas de l a s cepa DGRAW99-2, DGRAW96-3 y C28B25 con diferentes valores de a, en cultivo sólido y liquido.

Este cambio dió origen al siguiente trabajo:

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA

DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

‘I EFECTO DE LA aw SOBRE LA PRODUCCION DE PECTINASAS POR :MUTANTES DE A. nigev

EN FERMENTACION SOLIDA Y LIQUIDA //

INFORME DE SERVICIO SOCIAL

SERGIO DE JESUS1 ROMERO GOMEZ -- l//

MEXICO, .D. F. 1994

INDICE GENERAL

1 INTRODUCION

. I Pectina

.2 Pectinasas

.3 Organismos productores de pectinasas

.4 Uso industrial de las pectinasas

.5 Métodos de cultivo para la obtención de pectinasas

.6 Actividad de agua(aw) efectos fisiológicos

2 ANTECEDENTES.

.1 Hipótesis

.2 Objetivos

3 MATERIALES Y METODOS.

. 1 Microorganismos

.2 Medio para fermentación sólida

.3 Medios para fermentación liquida

.4 Modificación de la aw de los medios de cultivo

,5 Extracción enzimática

.6 Determinación de actividad enzimática

1.

1.

1.

2.

3

3.

4.

4.

5.

5.

5.

5.

6 .

6 .

7.

8.

8.

4 RESULTADOS Y DISCUSION 8.

. 1 Diseño y evaluación de un medio de fermentación liquida comparable con el medio sólido 8.

.2 Comparación de la producción de pectinasas por las 3 cepas en cultivo liquido y sólido 11.

.3 Evaluación de los niveles de producción de: endo y exopectinasas por la cepa silvestre C28B25 en cultivo sólido y liquido con diferentes valores de aw 14.

.4 Evaluación de los niveles de producción de endo y exopectinasas por la cepa mutante DGRAW96-3 en cultivo shlido y liquido con diferentes valores de aw 17.

.5 Evaluación de los niveles de producción de endo y exopectinasas por la cepa mutante DGRAW99-2 en cultivo siilido y liquido con diferentes valores de a, 20.

.6 Comparación de exo y endopectinasas por las 3 cepas en cultivo sólido y liquido con diferente a, inicial 23.

5 CONCLUSIONES 25.

6 BIBLIOGRAFIA 26.

1. INTRODUCCI~N.

1.1 PECTINA.

Existen variaciones de la molécul, de acuerdo a SI proporción de ácido galacturónico y metil galacturonato, si existe una proporción alta de ácido galacturónico la molécula de denomina ácido péctico o ácido poligalacturónico y si la proporción mas alta corresponde al metil-galacturonato se denomina protopectina. La pectina es un heteropolisacarido formado por unidades de ácido D-galacturónico y metil-galacturonato en proporción parecida unidas por enlaces a 1-4 glicosídicos, con pequeñas cantidades de ramnosa, xilosa, fúcosa y arabinosa que forman cadenas laterales a la cadena principal; cementante entre las células de los tejidos vegetales, por io que esta ampliamente distribuida en la naturaleza. (fig. l)(Colin, 1990).

COOH COO-CH 3

r COOH COOH COOH COOH

L

L

ACID0 PECTIC0

n

PECTINA

n

FIG. 1 Estructura química del ácido galacturhico y de las “sustancias pecticas”.

1.2 PECTINASAS.

Al grupo de enzimas que degradan pectina se les denomina pectinasas y son divididas para su estudio de acuerdo ai modo de ataque que cada una presenta y el tipo de sustrato, quedando así, varios grupos; las pectinesterasas que atacan el enlace éster entre el metoxilo

1

y el carbono 6 de cada unidad de ácido galacturónico y las despolimerasas que rompen el enlace glicosídico o( 1-4 ya sea por hidratación(hidro1asas) o por formación de doble enlace en el anillo(1iasas) separándose a su vez en endopectinasas que cortan la cadena de manera aleatoria formando oligómeros de ac. galacturónico y las exopectinasas que degradan la pectina por los extremos de la cadena produciendo inonómeros de ac. galacturónico(fig 3)(Tuttobello, 196 1, Ward, 19S5)

ACID0 Pi311- GALACTUBONICO

n

f Eslercsz

L ' A n - p

+ I

F l g u r o 2 Esquema represenlc'tvu de la acc1Oi de algunas pecllnasas sobre la cslructura d e la pec:ina (rnodilicaclo de Ward, 1985)

FIG. 3. Esquema representativo de l a acción de algunas pectinasas sobre la estructura de la pectina.

1 7 ORGANISMOS PRODL~CI'OKES DE PECTINASAS

Dado que la pectina esta ampliamente distribuida en la naturaleza y que las pectinasas son una familia compleja de enzimas resulta normal como lo cita Tuttobello( 1961) que sean producidas e n forma de mezcla por microorganismos fitopatógenos y las propias plantas. que las utilizan en procesos de maduración de frutos, escisión de las hojas y procesos de crecimiento. Según Ward las pectinesterasas son producidas principalmente por bacterias. mohos, levaduras y plantas superiores, las exopectinasas son producen por hongos y bacterias siendo los hongos filamentosos los microorganismos mas utilizados para sil obtención a nivel industrial, debido principalmente a que sus enzimas son extraceliilrircs facilitando así la recuperación, se usa en especial el genero Aspergillus de entre los ciinlcs los inas utilizados son A . Iilger, A . v z r i t i , A . j7avii.s y A. ot.izne (Fogarty, 1979); en el caso especifico de A . tiger se han aislado principalmente exopectinasas, pectinliasas y eiidopcctinas;is por lo que es actualmente el de mayor importancia comercial (Tuttobello. IO6 1 , Wasd, 1985).

2

1.4 USO INDUSTRIAL DE LAS PECTINASAS.

Las pectinasas se usan para una gran variedad de propósitos, entre los principales usos se encuentran el procesamiento de frutas para incrementar el rendimiento en la extracción de jugos, facilitándose además la extracción de sustancias solubles de las células por la acción de las enzimas, ya que estas actúan desintegrando los tejidos vegetales (Colin,1985).

Otro uso es la clarificación de jugos ya que al degradar la pectina presente, se forman precipitados de partículas suspendidas que se separan por centrihgación o por filtrado. También se usan en la clarificación de vinos, en la preparación de bases para néctares y alimentos para bebe, en el tratamiento de la pulpa de coco y para incrementar la producción de aceite de aceituna (Ward, 1985).

1.5 &TODOS DE CULTIVO PARA LA OBTENCI~N DE ENZIMAS.

Existen dos sistemas de cultivo para la obtención de enzimas de hongos filamentosos que son el cultivo líquido o fermentación sumergida en la que la cantidad de agua es tal que el sustrato se halla en suspensión y el cultivo o fermentación sólida en el cual el crecimiento del microorganismo se da sobre una matriz sólida con una cantidad de agua tal que no excede la capacidad de retención de dicha matriz (Heseltine, 1974) Esta definición impide poner un limite exacto entre la fermentación sólida y líquida ya que la cantidad de agua depende de la absorbencia del material, por esto Moon-Young define fermentación sólida como la utilización de materiales insolubles en agua para el crecimiento y metabolismo microbian0 (Moon-Young y col, 1983).

La fermentación sumergida se da en una matriz líquida, lo que da homogeneidad al medio facilitando el control de la fermentacibn, además los desechos metabólicos y el calor se dispersan fácilmente por lo que no son un limitante al crecimiento del microorganismo; mientras que el medio de cultivo sólido es heterogéneo dificultando tanto el control como la dispersión de los limitantes de crecimiento, los hongos crecen de manera intima con el sustrato dificultando la estimación de la biomasa (Rimbault, 1981).

La fermentación líquida requiere de grandes cantidades de agua, manipulación estéril para evitar contaminación por bacterias y levaduras y deja una gran cantidad de agua residual que debe ser tratada antes de desecharla; mientras que el cultivo en sustrato sólido utiliza menor cantidad de agua con lo que se reduce la cantidad de agua residual y por ende los gastos de tratamiento y permite disminuir el tamaño de los reactores; además el sistema es mas parecido al medio natural de fermentación. No requiere llevarse a cabo en esterilidad debido a que los niveles de humedad que se manejan están entre el 50 y 80% evitándose así la contaminación por otros microorganismois, acepta muy bien desechos agroindustriales, y da productos mas concentrados. Recientemente se ha reportado que el método de cultivo sólido imparte algunas características diferentes a los microorganismos y a sus enzimas en comparación con el cultivo líquido, entre ellas algunas enzimas que son intracelulares en cultivo líquido se excretan ai medio en cultivo sólido facilitando su recuperación, algunas enzimas no presentan represión catabólica en cultivo sólido y mientras que en líquido sí (Soh y col, 1993) Pero hasta la fecha es el cultivo líquido el que mas emplea a nivel

3

industrial debido a su facilidad de manejo y al amplio conocimiento que de el se tiene.@esgrandes y col, 199 1 ; Hesseltine 1972, Moon-Young, 1983; Pandey, 1992; Tengerdy, 1985; Shankaranand y co1.,1992; Viníegra, 1988).

Muchos microorganismos pueden crecer en fermentación en medio sólido pero los hongos filamentosos han sido los mas empleados a nivel industrial. De entre todos los hongos filamentosos han obtenido importancia económica los phycomicetos (géneros Mucor y Rhizopus), Basidiomicetos y los ascomicetos (Aspergillus y Penicillium), que producen proteínas como biomasa, enzimas (amilasas, pectinasas, galactosidasas e invertasas) y antibióticos (Moon-Young y col., 1983) .

1.6 ACTIVIDAD DE AGUA (a,) EFECTOS FISIOL~GICOS.

La mayor diferencia entre ambos sistemas de cultivo desde el punto de vista fisiológico para los microorganismos lo constituye la cantidad de agua disponible para su crecimiento es decir la actividad de agua(%). Scott en 1950 definió la actividad de agua como el resultado de la división de la presión de vapor de agua de un sustrato entre la presión de vapor del agua, al multiplicar este valor por 100 se obtiene la humedad relativa de la atmósfera que esta en equilibrio con la del sustrato. La razón por la cual es mejor utilizar a,,. que contenido de agua al definir el crecimiento microbian0 es por que los microorganismos no reconocen el contenido de agua del material, sino el contenido de agua utilizable el cual es fácilmente medible con un aparato especifico. (Hahn, 1986)

Los efectos que se derivan de una disminución en la actividad de agua sobre los microorganismos son múltiples y han sido estudiados la acumulación de metabolitos osmorreguladores y compatibles como aminoácidos neutros, KCI y betaina en bacterias y polioles como arabitol, xilitol y glicerol en eucariotes, también se han encontrado modificaciones en el transporte de azúcares, la composición de la pared, la membrana celular y en la actividad enzimática (Grajek & Gerviiis, 1988; Hahn, 1986; Maldonado y col, 1989; Pandey, 1992; Van Zyl & Prior, 1990). Mientras las bacterias y las levaduras requieren de alta actividad de aguas, los hongos filamentosos pueden crecer a a, de hasta 0.85, y son microorganismos favorables para la ferme:ntación sólida. Pandey( 1992) y Hahn( 1986) reportan que una baja a,,, favorece la germiiiación y el crecimiento miceliar de los hongos (Hahn, 1986; Pandey, 1 992; Raimbault, 198 1).

2. ANTECEDENTES.

En el laboratorio de enzimología industrial de la UAM-I se han realizado estudios sobre la fisiología y mejoramiento genético de A. niger para obtener mutantes hiperproductores de pectinasas en fermentación sólida.

Antier y coL(1993) utilizó una cepa silvestre de A. niger denominada C28B25 que fue aislada de un cafetal por Aquiahuatl y col. (1987) como sobreproductora natural de pectinasas en cultivo sólido. Esta cepa fue mutagenizada por medio de radiación W las esporas mutagenizadas se germinaron en dos lotes; uno en agar con a,=0.99 y otro en agar con a,=0.96 deprimida con etilenglicol; a a.mbos lotes se les añadió 2-desoxiglucosa para

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aislar cepas con desrepresión catabólica. A las mutantes obtenidas se les determinó la actividad pectinolítica mediante la detección de halo de hidrólisis en placas de agar con pectina, las que presentaron mejor relación halo de hidrólisidtamaño de colonia heron seleccionadas para determinar sus niveles de producción de las enzimas en medios líquidos y sólidos.

Las cepas aisladas en medio con a,=0.99 resultaron ser hiperproductoras en cultivo líquido mientras que en sólido presentaron niveles de producción menores al de la cepa silvestre (C28B25). En tanto las cepas mutantes aisladas en a, deprimida presentaron hiperproducción en medio sólido y menor producción que la cepa C28B25 en cultivo líquido. Las cepas aisladas en medio con &=0.99 se denominaron serie DGñAW99 (resistentes a desoxiglucosa en medio con a,=:0,99) y las obtenidas en medio con a,=0.96 se les llamó DGRAW96 ( resistentes a desoxiglucosa en medio con &=0.96) (Antier y col, 1993; Minjares, 1992) .

2.2 HIP~TESIS.

De acuerdo a estos resultados parece ser que las cepas hiperproductoras de pectinasas en cultivo sólido son malos prodilictores en cultivo líquido y viceversa. Es por esto que surge la hipótesis de que la actividad de agua va a influir de manera distinta en las cepas seleccionadas para cultivo líquido (serie DGRAW99) y sólido (serie DGRAW96), y los efectos podrán ser distintos a nivel de las actividades pectinolíticas de tipo exo y endo.

2.3 OBJETIVOS.

Por lo tanto en el presente trabajo st: pretende evaluar la producción de pectinasas (endo y exo) de las cepas mutantes DGRAW96-3, DGRAW99-2 y la silvestre C28B25 con diferentes valores de a,,, ianto para cultivo sólido como para cultivo líquido.

3 MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 MICROORGANISMOS.

Las cepas utilizadas en este trabajo fiieron: las mutantes DGñAW96-3, DGñAW99- 2 (Antier y col., 1993) y la cepa silvestre C28B25 (Aquiahuatl y col., 1987); cada cepa se propagó en PDA. y se incubó durante 72 hrs a 30°C.

Los inóculos se prepararon por la suspensión de las esporas provenientes del cultivo de propagación en agua destilada con O. 1% de tween 80 (sigma) como tenso activo a fin de limitar la agregación de las esporas; se usó la cámara de Neubauer para contar las esporas en el microscopio. Para cultivo sólido se utilizaron 2 x IO7 esporas / g de pulpa seca y para líquido 3 x 105 esporas / mL de medio de cultivo.

5

3.2 MEDIO PARA FERMENTACION SOLDA.: Para la fermentación sólida se utilizó el método de cultivo descrito en Raimbault y Alazard (1981) Fig. 3 ; utilizando un medio con la siguiente composición:(g/g de pulpa ~eca).(riIj[4)~SO~ O. 1478, KH2P04 0.0905, UREA 0.0795, PULPA DE CAFE 40% P/P y AGUA 57% P/P. Se disolvieron las sales en la cantidad de agua necesaria para alcanzar una humedad del 50% tomando en cuenta la humedad de la pulpa; ajustando el pH a 4.8, se incorporó la pulpa a la solución salina. Y se esterilizó a 115°C durante 30 minutos. Una vez frío se inoculó, y se empacaron 20 g de medio de fermentación en columnas de vidrio de 2 a 2.3 cm de diámetro con una altura de 25 cm sumergidas en un baño de agua con te:mperatura controlada de 28°C y aireación con aire saturado de agua de 60 mL/min. durante 72 ius.

15 cm

- algodon

papel filtro

iuitraio iolido (pulpa de cafe)

papel filtro

dgodon

tepon de hule

aire filirado

agua deitilada

U 2.0 om

Fig. 3 Diagrama del sistema de Fermentación empleado para el cultivo sólido, el cual va inmerso en un baño de a&a con temperatura, controlada.

3.3 MEDIOS PARA FERMENTACION LIQUIDA: Debido a la presencia de sólidos de pulpa de café durante la fermentación, la inclusión de sales adicionales al sólido y a la presencia de pectina externa que actúa corno un inductor en el medio líquido original Se requirió necesario contar con un medio líquido de composición similar al medio sólido; se formularon y probaron 4 medios extra con el fin de aproximar la composición del medio líquido al sólido sin disminuir la producción de pectinasas.

MEDIO ORIGINAL, MEDIO DE CULTIVO LIQUIDO 1: Para realizar el cultivo en medio líquido se partió de un medio definido por Aifredo Minjares (comunicación personal) consistente en lo siguiente (g/L de medio): (NH4)2S04 0.75, KH,P04 1.0, UREA 0.25, Na2HP04 0.6, MgS04.7(H20) 0.3, CaCI, 0.3, PECTINA 2.0% PN, PULPA DE CAFE 1.0% PN. Las sales se disolvieron en el 80% del volumen total del agua, se agregó la pulpa de café hirviendo por 5 minutos., se filtró con gasa y se centrifugó a 1000 rprn por 3 minutos para separar los sólidos de la pulpa, al sobrenadante se le disolvió la pectina y se le

6

ajustó el pH a 5.5 por adición de H3P04 o NaOH según el caso; después se aforó y se esterilizó a 1 15°C durante 30 minutos.

MEDIO DE CULTIVO LIQUIDO 2: En este medio se omitió la incorporación de pectina externa con la finalidad de determinar el papel inductor de esta en el medio; quedando con la siguiente composición: (en g/L de medio) ("&so4 0.75, KH2P04 1.0, UREA 0.25, Na2HP04 0.6, MgS04-7(H20) 0.3, CaC12 0.3, PULPA DE CAFE 1% PN. El medio se preparó exactamente como el anterior con la diferencia de que no se añadió la pectina externa.

MEDIO DE CULTIVO LIQUIDO 3: En este medio se intentó copiar la composición de sales del medio sólido y se evitó la incorporación de las sustancias solubles de la pulpa de café, pero se añadió pectina al medio para ver si existe un efecto de inducción, se preparó de la siguiente manera(en g/L de medio): ("&so4 2.1, KH2P04 1.35, UREA 1.2, PECTINA 1% PN. Las sales se disolvieron como anteriormente, a continuación se añadió la pectina y se ajustó el pH a 5.5; posteriormente se esterilizó a 115°C durante 3 0 minutos.

MEDIO DE CULTIVO LIQUIDO 4 : En este medio no se incluyó pectina externa y en su lugar se añadió pulpa de café de 60 grados mesh en forma completa, para determinar si es suficiente para inducir la producción de pectinasas, se preparó con la siguiente composición(g/l DE MEDIO): ("&so4 2.1, m2Po4 1.35, UREA 1.2 y PULPA DE CAFE 1% PN. El medio se preparó de la manera anterior, con la diferencia de que en lugar de disolver la pectina, se añadió la pulpa de café y no se retiró durante toda la fermentación.

MEDIO CULTIVO LIQüIDO 5: En este medio se incluyó una mayor cantidad de pulpa de café para tratar de observar si existe una relación entre la cantidad de esta y la inducción de pectinasas(@, de medio): ("&so4 2.1, KH2Po4 1.35, UREA 1.2 y PULPA DE CAFE 1.5% PN. La preparación del medio es igual a la del medio anterior.

Las condiciones de cultivo fueron !las mismas para todos los medios, se usaron matraces Erlenmeyer de 125 mL de capacidad con 25 mL de medio, se incubaron a 25°C las cepas mutantes y a 30°C la cepa silvestre, con agitación constante de 200 rpm durante 120 hrs.

3.4 MODIFICACIÓN DE LA a, DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

La depresión de la aw se realizó por la adición de etilenglicol de acuerdo con lo reportado por Antier y col( 1993). Se realizol de acuerdo con los resultados mostrados en la tabla 1.

La actividad de agua se determinó por medio de un medidor de la actividad de agua marca DECAGON Device Inc. Co. .

7

TABLA 1 DEPRESIÓN DE a,,, DE LOS MEDIOS SOLIDO Y LIQUIDO POR LA ADICIÓN DE E'HLENGLICOL.

% de adición de etilenglicol (plv) a," del medio sólido a, de medio líquido O 0.960. 0.99. 2 0.929. 4 0.911. 5 0.905 8 O. 887

15

0.960.

0.930.

3 .5 EXTRACCI~N ENZIMÁTICA

En cultivo sólido se extrajo la columna y se la agregó 1 mL de agua destilada por g de peso a continuación se prensó envuelta eri gasa en una prensa hidráulica a 1100 psi; se recuperó el liquido del prensado y se centrihgó a 7 x lo3 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante se refrigeró a 4 "C para someterlo a análisis. En cultivo líquido se filtró el medio con papel filtro Whatman 40, el filtrado se centrifugó a 7 x lo3 durante 10 minutos, y el sobrenadante se refrigeró a 4°C para su análisis.

3.6 DETERMINACI~N DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.

El fundamento del método de ensayo enzimatico para actividad endopectinasas esta basado en el hecho de que la viscosidad de una solución de pectina es dependiente del largo de sus cadenas el cual es modificado por la cantidad de enzima endopectinasa en el medio. La viscosidad de la solución de pectina se determinó de la siguiente manera: 1 mL de extracto enzimático se mezclo con 18 mL de un buffer de citrato-fosfato al 0.5 M de pH 5.5 con 2% de pectina y se incubó durante 10 minutos a 45"C, la reducción de la viscosidad se siguió a con un viscosímetro rotatorio (H rookfield enginnerig laboratories, USA). La actividad endopectinasas se expresa en unidades de despectinización (UD), siendo una unidad la cantidad de enzima que reduce al 50% la viscosidad de una solución de pectina al 2% en 1 O minutos bajo las condiciones enunciadas anteriormente La actividad exopectinasa se determinó agregando 0.3 mL del extracto enzimatico a 0.7 mL de buffer de acetatos al 0.1M y 1 mL de solución al 0.9% de pectina, se incubó 30 minutos a 45OC ; los azucares reductores liberados se determinaron por el método de DNS (Miller, 1959). La actividad exopectinasas se expresa como mg de azúcares reductores IiberadodmL de extracto.

4 RESULTADOS Y DISCUSI~N.

4.1 DISEÑO Y EVALUACI~N DE UN MEDIO DE FERMENTACI~N LIQUIDA COMPARABLE CON EL MEDIO SOLIDÓ.

La necesidad de formular un medio líquido diferente al medio original utilizado por Antier y col (1993) se debe a que este poseía diferentes componentes en relación al sólido, es decir el medio de líquido cuenta con 6 sales, adición de pectina y solo utiliza la parte soluble de la pulpa de café; mientras que el medio sólido tiene 3 sales, utiliza la pulpa completa y no tiene pectina añadida. Las diferencias descritas anteriormente impiden que los medios se puedan comparar y esto es el objetivo principal de este trabajo.

Para la formulación de los medios a probarse se pretendió que resultaran comparables al medio sólido, tratando de determinar el papel desempeñado por la pectina externa como inductor de las pectinasas y un posible efecto tóxico de la pulpa de café completa en fermentación líquida.

Los medios se formularon con las siguientes características( ver materiales y métodos para fórmulas completas):

1- Medio l(origina1): 6 sales, adición de pecitina y utilización solo de la parte soluble de la pulpa. 2- Medio 2: 6 sales, utilización de la parte soluble de la pulpa. 3- Medio 3: 3 sales, 1.5% de pulpa completa en suspensión. 4- Medio 4: 3 sales, 1 .O% de pulpa completa (en suspensión. 5- Medio 5: 3 sales, 1 .O% de pulpa en suspen,sión y adición de pectina.

Se evaluó la actividad endopectinasa a las 72 horas tal como se reporta en Antier y col (1 993) y se obtuvo la cinética completa de producción de exopectinasas y el perfil de pH para 48, 72 y 120 horas de fermentación.

TABLA 2 PRODUCCION DE ENDOPECTNASAS POR LA CEPA C28B25 DE A. niger EN DIFERENTES MEDIOS EN FERMENTACION LIQUIDA A LAS 72 HORAS.

MEDIO Medio 1 (Original). Medio 2. Medio 3. Medio 4. Medio 5

uD/mL 0.60. 2.48. 2.81. 3.04. 1.20.

Como puede observarse en el cuadro 1, todas las modificaciones realizadas al medio original indujeron una mayor producción- de endopectinasas pero con algunas diferencias entre ellas, por ejemplo: de los medios que contienen pulpa completa el que tiene pectina externa (medio 5) es el que presenta menor producción, en cambio el medio siH pectina externa y menor cantidad de pulpa (medio 4) es el que presenta mayor producción de todos. Por lo anterior podemos afirmar que la pulpa. de café presenta suficiente pectina para inducir la producción de endopectinasas, y que la adición de pectina externa en lugar de inducir una mayor producción de endopectinasas actúa como inhibidor o represor de esta actividad.

9

Además parece ser que el MgS04, el CaC12 y el Na2W0.1 no son necesarios para la producción y el crecimiento de A. niger. La razón por la que en los medios con pulpa mas pectina se obtuvo una menor producción, pralbablemente se debe a la presencia de azúcares reductores en la pectina añadida que actuarían como represores.

ACTIVIDAD (mg de az red lib/mL (de ext)

O 24 . 48 72 96 120 HORAS

MEDIO 1 -+ MEDIO 2 -)c MEDIO 3 -Q- MEDIO 4 --w- MEDIO 6 - GRAFICA 1 PRODUCCION DE EXOPECTINASAS POR LA CEPA C28B25 EN

DIFERENTES MEDIOS DE PULPA DE CAFE PARA FERMENTACION LIQUIDA.

Al observar la gráfica 1 se ve que ;las modificaciones realizadas al medio original (medio 1) ocasionan un efecto drástico sobre la producción de exopectinasas y su comportamiento es diferente al de la endopectinasa, ya que en el medio original se obtiene mayor producción a las 72 hrs, sin embarga la producción decrece después de ese tiempo, en cambio en los medios 4 y 5 aumenta la producción después de las 72 has para terminar a las 96 has. con mayor producción que el resto de los medios. Aquí no se presenta el fenómeno de represión de síntesiS por la adición de pectina externa pudiendo deberse a que la regulación de la exopectinasa sea diferente (3 bien a que estas enzimas son menos sensibles que las endopectinasas.

La tendencia general del pH en la ligura 2 es a disminuir, siendo el cultivo en el medio original el que presenta un pH mas bajo de todos a 72 a partir de ese punto todos los medios presentan un aumento para terminar en valores de pH muy similares, esta tendencia corresponde con lo reportado por Solís y co1.(1993) quienes observan el mismo efecto utilizando A. niger C& con diferentes fuentes de carbono.

Al comparar las gráficas de producción de endo y exopectinasas podemos observar que en la fase final la producción mas alta se presenta en el medio 4 la cual en el caso de las exopectinasas no es muy diferente de la del medio original, por lo que podemos considerar el medio 4 como el mejor para realizar los experimentos subsecuentes.

De acuerdo con estos resultados en el medio 4 se obtiene una producción 5 veces mayor de enáopectinasa y el doble de exopectinasas que con el medio original, esto junto con su mayor parecido ai medio sólido permitieron su uso a lo largo del resto del trabajo.

10

MEDIOS

MEDIO 1 + MEDIO 2 * MEDIO 3 -a- MEDIO 4 - -MEDIO 6 - GRAFICA 2 PERFIL DE pH DE CULTIVOS LÍQUIDOS DE C28B25 EN

DIFERENTES MEDIOS DE PULPA DE CAFE.

4.2 COMPARACIÓN DE LA PRODUCCION DE PECTINASAS POR LAS 3 CEPAS EN CULTIVO SOLIDO Y LIQUIDO.

Este experimento permitió evaluar la estabilidad genética de las mutantes, ampliar las observaciones de Antier con la evaluación de la producción de exopectinasas y corroborar el comportamiento de la producción de endopectinasas en las cepas representativas de cada serie (DGRAW96 y DGRAW99), en cultivo sólido como en cultivo líquido. El objetivo de este experimento fúe reproducir los resultados de Antier y col(l993) y obtener las cinéticas de producción de endo y exopectinasas en cultivo sólido y líquido con aw de 0.96 y 0.99 que son respectivamente los valores normales a los medios de cultivo.

DQRAW 98-2 C213ü26 I DQRAW 80.3

a mg A2 RED Ll8lmL UOlrnL

60

HORAS HI1 RAS I HORAS

-EXO-P +ENDO-P 'EXO-P +ENDO-P 'EXO-P ENDO-P

GRAFICA 3. PRODUCCION DE ENDOPECTINASAS Y EXOPECTINASAS POR LAS CEPAS DGRAW96-3, DGRAW99-2 Y C128B25 EN FERMENTACION SOLIDA DE PULPA DE CAFE CON aw= 0.96.

11

En la gráfica 3 se muestra la producción de pectinasa por las 3 cepas en cultivo sólido, como puede verse la cepa DGRAW96-3 es hiperproductora tanto de endopectinasas en un 80% como de exopectinasas en 10% con respecto a la silvestre C28B25, mientras que la mutante DGRAW99-2 mostró niveles de producción del 30 y 20% de endo y exopectinasas respectivamente de los de C281325 en ambas actividades. esto demuestra que si una cepa es liiperproductora de endopectinasas no necesariamente lo será de exopectinasas. Tanto los niveles como la proporción de producción de endopectinasas a 72 horas corresponden con lo reportado por Antier y col.( 1992).

DQRAW 9 6 3 C281126 DüRAW 99.2

RED LlBIrnL UDlmL

-IS 1 ‘O

24 48 72 90 120 HORAS

mg A2 RED LIBImL

8r120

HORAS

UDlmL mg A2 RED LlBlrnL

8 -

6 -

4 -

- 6

HORAS

‘EXO-P t E N D 0 . p -EXO-P 4- ENDO-P -EXO-P +ENDO-P

GRAFICA 4 PRODUCCIÓN DE ENDOPECTINASAS Y EXOPECTINASAS POR LAS

PULPA DE CAFE COMO SUSTRATO CEPAS DGRAW96-3, DGRAW99-2 Y C2EIB25 EN FERMENTACION LIQUIDA CON

En la gráfica 4 se muestra la cinética de producción de pectinasas por las 3 cepas en cultivo líquido donde se muestra que la cepa DGRAW99-2 es hiperproductora de endo y exopectinasas durante todo el tiempo de fermentación además de que es hiperproductora tanto de una como de otra en niveles finales del 200% corespecto a C28B25. Es de notarse que l a cepa DGRAW96-3 produce mas exopectinasas que la C28B25 pero menos endopectinasas, y presentan la mayor actividad exopectinasa a 48 horas, mientras que la cinética de producción de endopectinasas es continua

Resulta importante resaltar que si Antier hubiera medido exopectinasas en fermentación sólida en lugar de medir endopectinasas no podría haber aislado a DGRAW96- -3 como una buena hiperprodcictora dada l a diferencia de solo el 10% existente entre la producción de exopectinasas con C28B3S

En la Fig. SA se muestra la producción de endopectinasas obtenida en este trabajo con las 3 cepas en ambos métodos de cultivo y se comparan con la reportada por Antier y col., 1993 (Fig 9 3 ) se observa que tanto los niveles de producción de endopectinasas encontrados como las proporciones de producción tanto para sóido como para líquido siguen siendo ¡cuales entre las cepas, estodemuestra que las cepas son estables geneticamente y na han sufrido cambios apreciables desde el trabajo de Antier y col. (1993)

12

UD/rnL SOLIDO UD/rnL LIQUIDO

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

60 A)

60

40

30

20

10

O

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

E N D 50 O P E C T 40 I N A

30 S

S

I D O

D / rn

f 20

u 'O

L o

CEPA

20

16

C~SOLIDO OLIQUIDO I O

I I

6

o

CEPAS

1 m

II I 3 c

v

serle dgrA'yV99

Ill

E N D O P

20 E C T I N

15 A

'0 I

S

L

O U I D

5 0

U D m

O L

GRAFICA 5 COMPARACI~N DE LA PRODUCCION DE ENDOPECTINASAS POR LAS 3 CEPAS(A) CON LOS RESULTADOS REPORTADOS POR ANTIER Y COL (1993)(B) EN CULTIVO SOLIDO ( O ) Y E N LIQUIDO ( O ).

13

4.3 EVALUACION DE LOS NIVELES DE PRODUCCION DE END0 Y EXOPECTINASAS POR LA CEPA SILVESTRE C28B25 EN CULTIVO SOLIDO y LIQUIDO CON DIFERENTES VALORES EL ,.

La cepa C28B25 fue utilizada por Antier y co1.(1993) para obtener las cepas mutantes que dieron origen a este trabajo. El obtener la cinética de producción permitirá SU

uso como patrón de referencia de la producción de pectinasas en cultivo sólido y líquido a diferentes valores de a, inicial, para poder compararlo con el de las cepas mutantes.

Se evaluó la producción de endo y exopectinasas en cultivo sólido y líquido con a, iniciales entre 0.99 y 0.89, así como los perfiles de pH y a, durante la fermentación..

A B

mp DE A L RED. LIB.lmL DE EXT.

6 1 O0 mp DE AL RED. LIB./mL DE EXT.

ó - 80 -

4 - 60 -

3 -

40 -

20 -

O 4 8 72

O 24

HORAS 48 72 120 24

HORAS

- AW 0.90 + AW 0.93 + m 0.91 4 AW 0.89 - m 0.99 f- m 0.06 --e m 0.93

GRAFICA 6 PRODUCCION DE EXOPECTINASAS POR LA CEPA C28B25 EN FERMENTACION LIQUIDA(A) Y SOLIDAQ3) CON PULPA DE CAFE Y DIFERENTES VALORES DE aw INICIAL.

Al analizar la producción de exopectiinasas en la gráfica 6A se observa que todos los cultivos en líquido a las 72 horas alcanzan su máxima producción, en ese momento presenta un orden de que a mayor a, inicial se producen mas exopectinasas; durante el tiempo restante desciende la producción y es el cultivo de a, 0.96 el que presenta una mayor nivel de exopectinasas a las 120 horas. En fermentación sólida (b), no se presenta este efecto observándose por el contrario que a 24 hrs todos los cultivos tienen niveles de producción por debajo del 5% del valor final, el cultivo con a, =0.96 pasa de tener la mitad de la producción del cultivo de a, 0.93 a tener el doble de esta a 120 hrs en este momento se presenta un orden en el que a mayor a, inicial se presenta una mayor producción de exopectinasas. Se puede notar que la producción de exopectinasas en sólido es 20 veces mayor que la producción en líquido esto ya ha sido reportado por Pandey, 1990 y por Solis y col (1993) quienes afirman que el cultivo sólido permite obtener productos de fermentación mas concentrados que el cultivo líquido.

A B

- AW 0.06 + AW 0.93 + m 0.01 +- AW 0.89 - m o.oe +- m 0.06 + m 0.03

GRAFICA 7 PRODUCCION DE ENDOPECTINASAS POR LA CEPA C28B25 EN FERMENTACION LIQUIDA(A) Y SOLIDA(B) CON PULPA DE CAFE Y DIFERENTES VALORES DE a,, INICIAL

Al revisar la producción de endopectinasas se ve que para cultivo Iíquido(A) el cultivo de a,, 0.96 alcanza la máxima producción a las 72 hrs de fermentación y lo mismo sucede con el de 0.99 ambos cultivos no presentan aumento posterior, mientras el cultivo con a,, 0.93 no presenta producción en ningún inomento de la fermentación. En la gráfica (B) se observa que en cultivo sólido la producción de endopectinasas presenta una dependencia del valor de la a,,, de tal modo que durante toda la fermentación a una mayor a, se presenta una malyor producción en todos los cultivos. y el cultivo de a,, 0.96 presenta una producción de endopectinasas del doble de los niveles del de a,, 0.93.

El que entre mayor sea la a, inicial mayor es la producción de exo y endopectinasas en fermentación sólida, coincide con lo reportado por Oriol y col.( 1988) quienes dicen haber encontrado que a mayor a, se presenta un mayor Crecimiento de A. iiiger. en cultivo sólido, pudiendo este crecimiento explicar en parte la. producción enzimática.

Si se comparan los perfiles de producción de sólido y líquido se ve algo muy interesante, el máximo de producción siempre corresponde a los cultivos con a, 0.96 a pesar de que la producción de las enzimas en sólido es 20 veces mayor que en líquido, este fenómeno podría indicar que la producción esta controlada de algún modo tanto por el valor de a, del medio como por el tipo de cultivo mismo, el que la producción máxima se modifiqué por el valor de a,, corresponde con lo reportado por Sarrete(l992), quien encontró que en Z¿ltizopa.s oligo.sporm al modificar disminuir la a, en un rango entre 0.99 y 0.97 se presenta una disminución de entre el 50 y 90% en la producción de polisacaridasas entre las que se encuentran la galactosidasa, la ainilasa y la poligalacturonasa, esta pertenece a la familia de las pectinasas.

15

TABLA 3 VALORES DE a, DURANTE LA FERMENTACION SOLIDA Y LIQUIDA DE PULPA DE CAFE POR LA CEPA SILVESTRE C28B25.

SOLIDO LIQUIDO

a, INICIAL a, FINAL(72 hrs) a, INICIAL a, FINAL( 120 hrs) 0.96 0.96 0.990 0.987

0.93 1 0.960 0.960 0.930 0.91 1 0.910 0.930 0.93 1 0.887 0.889

En la tabla 3 se muestra que los valores de a, inicial y final de la fermentación en cultivo sólido y líquido de la cepa C28B25, no varían significativamente con el tiempo. Este comportamiento no coincide con lo reportado por Grajek y Gervais(l987) quienes afirman

metabolismo microbiano. que la a, de una fermentación sólida tiende a aumentar por la producción de agua por el .c

A B

5oo Y HORAS u I1

'AW0.96 +AWO.93 "AW0.91 *AW0.89

I 24 u 72 ¶e 120

2.5'

HORAS

'AW 0.99 -I- AW 0.96 * AW 0.93

GRAFICA 8 EVOLUCIÓN DEL pH DURANTE LA FERMENTACION SOLIDA(A) y LIQUIDA(B) DE PULPA DE CAFE POR LA CEPA C28B25 CON DIFERENTES VALORES DE ACTIVIDAD DE AGUA.

En la gráfica 8A se muestra la evolución de los valores de pH de los extractos de la cepa silvestre C28B25 en fermentación sólida. Durante la fermentación se observa que a mayor a, inicial mayor es el aumento en el pH del extracto, pero los lotes con a, inicial de 0.96 y 0.93 a las 48 horas dejan de aumentar su pH e inician un pequeño descenso. En el cultivo líquido 8Bel pH a a, 0.99 disminuye hasta alcanzar el valor de 2.7 a las 72 horas para iniciar un aumento después, el de a, O 96 aumenta hasta 6.3 para las 48 horas disminuyendo poco en lo que resta de la fermentación; y el de a, 0.93 se mantiene cercano a 4.4 durante toda la fermentación en esta gráfica no hay una tendencia lógica sino que cada cultivo sigue una tendencia distinta. y podría explicar los :perfiles de producción de pectinasas en cultivo líquido pues al reunir las gráficas de pH y producción se observa que la disminución en la

16

disminución en la producción de exo y endopectinassa en el lote de a,, 0.99 coincide con su baja de pH hasta niveles que son limitantes para el crecimiento microbian0 y en el caso de el lote de a, 0.96, Solís y col.( 1993) reportan 'que en la cepa de A. niger CH4 al alcanzar el valor de pH 6.5 se detiene la síntesis de pectiriasas.

4.4 EVALUACION DE LOS NIVELES DE PRODUCCION DE END0 Y

LIQUIDO CON DIFERENTES VALORES ;I ,,., .

EXOPECTmASAS POR LA CEPA MUTANTE DGRAW96-3 EN CULTIVO SOLIDO y

La cepa DGRAW96-3 es la mejor rnutante hiperproductora de endopectinasas en fermentación sólida, la cual fue obtenida y aislada a una a, de O 96 Antier y col (1993), esto la hace un sujeto de estudio para este trabajo y se pretende determinar si el cambio en la a,,, influye en su producción de endo y exopectinasas en cultivo sólido y líquido y comparar este efecto con el observado en la prodciccion de la cepa silvestre Se evaluó la producción de endo y exopectinasas en solido v en liquido, se obtuvo el perfil de pH y a,,,

A

I I

,r----L O

24 40 72 06 120 HORAS

M O O 0 + W O O 6 " A V O 9 3 -

B

mg DE AL. RED. LIü./mL DE EXT. 1 O0 I

/

,/"' /"

GRAFICA 9 PRODUCCION DE EXOPECTINASAS POR LA CEPA DGRAW96-3 EN FERMENTACIOK LIQUIDA(A) Y SOLIDA(B) DE PULPA DE CAFE CON DIFERENTES VALORES DE a,, INICIAL

En la gráfica 9 se reporta la producción de exopectinasas en cultivo líquido(A) y sólido(B), en la primera se observa que el cultivo con a,, 0.99 alcanza su máxima producción a las 48 hrs y desciende a lo largo del tiempo restante de fermentación mientras el cultivo de a, 0.96 presenta un aumento continuo en la producción de exopectinasas para terminar la fermentación con mayor producción que el de O 99, el cultivo de O 93 no presenta producción. En cultivo sólido el lote de a, 0.96 presenta un nivel de producción 4 veces superior al de los cultivos con valores de a , iniciales de 0.93, 0.91 y 0.89 que producen aproximadamente la misma cantidad de exopectinasas.

17

-M 0.99 +<w 0.96 4- AV 093 - AW 0.96 + AW 0.93 +- <w 0.91 4 AW 0.89

GRAFICA 10 PRODUCCION DE ENDOF’ECTINASAS POR LA CEPA DGRAW96-3 E N FERMENTACION LIQUIDA(A) Y SOLIDA(B) DE PULPA DE CAFE CON DIFERENTES VALORES DE a, INICIAL.

En la Fig I O se grafica la producción de endopectinasas en cultivo Iíquido(A) y sólido(B) y se observa que el cultivo con a,, 0.99 presenta mayor producción hasta las 120 hrs, pero el cultivo de a,, 0.96 presenta mayor producción a las 120 hrs y el de a,, 0.93 no presenta actividad. En cultivo sólido se repiti: el perfil de producción de exopgctinasas pues el cultivo con a,v 0.96 tiene una producción 4 veces mayor a los demás que presentan una producción parecida entre sí. AI analizar las gráficas de producción en líquido vemos que los cultivos con a,. 0.96 en ambos casos alcanza la máxima producción al final de la fermentación, a pesar que los de a, 0.99 presentan los mejores niveles intermedios esto puede deberse a que los cultivos de a,. 0.96 tarden mayor tiempo en adaptarse al medio líquido, ya que se trata de una cepa especializada en cultivo sólido.

El hecho de que en sólido los cultivo con a,v 0.93, 0.91 y 0.89 tienen una producción de aproximadamente 10 UD/inL y 20 ing de AZ RED LIB/mL (ambos valores mayores a la máxima producción en líquido), mientras que en líquido los cultivos con a,, 0.93 ya no tengan producción de exopectinasas y endopectinasas, indica que la cepa DGRAW96-3 es mas resistente a valores bajos de a,, solamente en cultivo sólido, lo que apoya la idea de que se trata de una cepa especialmente adaptada para cultivo sólido, apoyando así lo reportado por Antier y col (1993).

En la gráfica 1 IA se muestra como varia la a,, de los lotes de fermentación sólida de la cepa DGRAW96-3 a través del tiempo, a excepción del valor O 96 que se mantiene sin cambios, los demás cultivos increinentan su valor de a,, a través del tiempo de la fermentación, en especial el auiiiento en la a,, del cultivo con valor inicial de O 89 es muy grande pues termina con valor de O O1 que e!; el mismo que alcanza la de O 93 L a gráfica de fermentación líquida (8B) no presenta ningún cambio significativo en la a,, de los cultivos durante la fermentación lo cual contrasta con lo observado en el cultivo sólido para la misma cepa

18

O w U 12 _,__

non&s

'AW 0.96 +AW 0.93 *AW 0.91 +AW 0.89

GRAFICA 1 1 PERFIL DE a, DEL CULTIVO SOLIDO Y LIQUIDO DE LA CEPA DGRAW96-3 USANDO COMO SUSTRATO LA PULPA DE CAFE.

Por todo lo anterior lo que resulta interesante de explicar es el aumento en la actividad de agua del medio que puede deberse a dos fenómenos, el primero lo reportan Grajek y Gervais(l987) como la acumulación de agua producto del metabolismo microbiano o bien que de algún modo DGRAW96-3 consuma el etilenglicol del medio provocando así el aumento de la a, del medio (Minjares, comunicación personal) aunque esta ultima explicación contradice a Maldonado que afirma que A. niger no consume etilenglicol.. El que no haya cambios en el valor de a, se explica por que el cultivo líquido utiliza una mayor proporción de agua lo que podría dificultar la manifestación de los cambios observados en cultivo sólido. Todos los aumentos de la producción de exo y endopectinasas en cultivo sólido coinciden con el aumento de la a, de los lotes de actividad de agua inicial baja, por lo que es posible que los altos niveles de producción se deban a este cambio en el valor de la actividad de agua.

A B

-.- I I

O 24 41 i a O w 4(1 12 SO 120

n o u s non*.

'AW096 +AWO93 w A W O 9 1 +AWO89 'AWOS9 +AW096 *CAW093

GRAFICA 12 EVOLUCI~N DEL PH DURANTE LA FERMENTACION SOLIDA(A) Y LIQUIDA@) DE PULPA DE CAFE POR LA CEPA DGRAW96-3 CON DIFERENTES VALORES DE ACTIVIDAD DE AGUA.

i 3$ ; zQ

19

En la gráfica 12 se presenta el cambio de los valores de pH de los extractos de la cepa mutante DGRAW96-3. Durante la fermentación sólida(A) se observa que a mayor a, inicial mayor es el aumento en el pH del extracto, mientras los lotes con a, inicial de O 96 y O 93 a las 48 horas dejan de aumentar su pH e inician u n pequeño descenso, el valor de pH de los cultivos con a, inicial de O 91 y O 89 no dejan de aumentar alcanzando valores mas altos que los de los otros cultivos para el final de la fermentación En el cultivo líquido (1 2B) la cepa DGRAW96-3 muestra un pH muy diferente a los valores de a, evaluados, a a, O 99 disminuye el pH hasta las 48 hrs para iniciar un aumento hacia el final de la fermentación, a valores de a,b O 93 presenta un comportamiento diferente al de los demás ya que el pH tiende a aumentar de manera sostenida durante la lkrmentacion de 5 5 a 8 O Esta tendencia en el pH podría deberse a la acumulacion de in2tabolitos básicos no identificados y una baja producción de ácidos orgánicos Todo lo anterior muestra que la adaptación a un valor de a% en u n medio es independiente a la adaptación al mismo valor en otro medio tal como se reporta en Oriol( 1988)

4 5 EVALUACION DE LOS NIVELES DE PRODUCCION DE E N D 0 Y

LIQUIDO CON DIFERENTES VALORES a,, EXOPECTINASAS POR LA CEPA MUTANTE DGRAW99-2 EN CULTIVO SOLIDO y

L a cepa DGRAW99-2 es la mejor hiperproductora de endopectinasas en fermentación líquida líquida; que fue aislada por Antier y co1.(1993). Es por esto que se utilizó para este trabajo y se pretende determinar si el cambio en la a, influye en su producción de endo y exopectinasas en cultivo sólido y líquido, se compara este efecto con el observado en la produccion de la cepa silvestre Se evaluó la producción de endo y exopectinasas con a,, inicial de O 96,O 93 en sólido y a,, de 0.99, 0.96 y O 93, se obtuvo el perfil de pH y a,,,

A

ma DE AZ. RED. LIB./mL DE EXT. 8 í -

6

mg DE AZ. RED. LlB./mL DE EXT.

4 t

I . _--

O-- -___ ,- O 24 48 72 98 120

HORAS

- W o o 9 W O O 6 + - W O O 3

24 48 72 HORAS

O-

- AW 0.98 + AW 0.93 ++ W 0.91 -8 AW 0.89

GRAFICA 13 PRODUCCION DE EXOPECTINASAS POR LA CEPA DGRAW99-2 EN FERMENTACION LIQUIDA(;\) Y SOLIDA(B) DE PULPA DE CAFE CON DIFERENTES VALORES DE a,, INICIAL

20

En la gráfica 13 se presenta la producción de exopectinasas en fermentación Iíquida(A) y sólida@), en cultivo líquido se observa que el cultivo con a,,. 0.99 alcanza su máxima producción a las 72 horas sin aumento posterior, mientras que el cultivo de a, 0.96 inicia la producción rápidamente y a 48 horas es el que tiene mayor producción , pero termina la fermentación por debajo del nivel de 0.99, la producción del cultivo de 0.93 es muy pequeña pero a diferencia de las otras cepas si se presenta. En cultivo sólido@) se puede observar que la producción de exopectinasas para todos los cultivos es minina a las 24 hrs. y aumenta posteriormente siguiendo una relación de que a mayor a, inicial se da una mayor producción de exopectinasas.

A B

* ~ , VD./mL DE EXT. , lo[DimL DE EXT. , ,

HORAS

Ui 0.09 +ffl 0.90 * Ui 0.93 - AW 0.00 + AW 0.93 y m 0.91 8 AW 0.89 -

GRAFICA 14 PRODUCCION DE ENDOPECTINASAS POR LA CEPA DGRAW99-2 EN FERMENTACION LIQUIDA(A) Y SOLIDA@) DE PULPA DE CAFE CON DIFERENTES VALORES DE a, JNICIAL.

En la gráfica 14 se muestra la prodiucción de endopectinasas en cultivo líquido(A) donde se observa que la producción de exopectinasas es dependiente del valor de a,,. mostrando que el cultivo de a, 0.99 tiene unla producción 5 veces mayor que el de 0.96 y el de 0.93 es a su vez 5 veces menor que el de 0.96. La producción de endopectinasas en sólido@) muestra que los cultivos de a, 0.99 y 0.96 alcanzan su máxima producción a las 48 horas de cultivo, mientras el de a, 0.89 no presentan producción a lo largo de toda la fermentación.

La producción de pectinasas en sólidlo y líquido presenta un comportamiento que es directamente inverso al de la cepa DGRAM196-3, pues DGRAW99-2 es la Única cepa que produce exo y endopectinasas en cultivo líquido con a, 0.93 y no produce endopectinasas en cultivo sólido con a, 0.89, esto podría iridicar que la cepa DGRAW99-2 es una cepa adaptada a cultivo líquido tal como DGRAW96-3 lo es para sólido.

Se muestran los valores iniciales y finales de a,,. de los lotes de cultivo de DGRAW99-2 y su variación a través el tiiempo de fermentación. En esta gráfica no se observan cambios significativos de la a, de los cultivos durante la fermentación. El que no haya cambios en el valor de a, repite el patr6n observado para todas las cepas en líquido.

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TABLA 4 VALORES DE a, DURANTE LA FERMENTACION SOLIDA Y LIQUIDA DE PULPA DE CAFE POR LA CEPA DGIWW99-2.

SOLIDO LIQUIDO

a, INICIAL a, FMAL a, INICIAL a, FMAL 0.957 0.961 0.990 0.990 0.932 0.93 1 0.962 0.961 0.91 1 0.91 1 0.93 1 0.930 0.887 0.890

B A

H0R.S

' AW 0.96 4- AW 0.93 -X AW 0.91 * AW 0.89

- \

I O 41 72 S. 130 24

HORAS

'AW 0.99 4- AW 0.96 * AW 0.93

GRAFICA 15 EVOLUCIÓN DEL pH DURANTE LA FERMENTACION SOLIDA(A) Y

VALORES DE ACTIVIDAD DE AGUA. LIQUIDA(B) DE PULPA DE CAFE POR LA CEPA DGRAW99-2 CON DIFERENTES

En la gráfica 15 se reporta el cambio de los valores de pH de los extractos de la cepa mutante DGRAW99-2 en cultivo sólido(A) y líquido@) . Durante la fermentación sólida se observa que el valor de pH tiende a aumentar durante la parte inicial de la fermentación para todos los cultivos, pero los de a, 0.96 y0.93 muestran un descenso a las 48 horas, y íos de a, 0.91 y 0.89 continúan el aumento. Llama la atención ver que la caída de pH de los cultivos con a, mayor es muy grande alcanzando valores por debajo del punto de partida. En B se presenta la evolución del pH del cultivo liquido de la cepa DGRAW99-2. el perfil que presenta el pH muestra que los cultivos siguen tendencias muy distintas entre si mismos y también si se les compara con otras cepas, imientras el cultivo con a, 0.99 disminuye su pH hasta las 72 hrs para iniciar un aumento hacia el final de la fermentación, los otros cultivos de comportan aumentando el pH, esto ya se observo en C28B25 pero no para 0.93 de a, la cual en el cultivo de C28B25 no producía cambio de pH. Lo que en este cultivo resulta interesante explicar es el descenso del pH después de las 24 horas para las cepas de actividad de agua mas alta al reunir este efecto con la producción de endopectinasas podemos observar el cambio en la tendencia del pH corresponde en ambas cepas con la perdida de

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producción de las endopectinasas lo que indica una posible inhibición de la síntesis de endopectinasas por el pH, tal como reportan S o h y co1.(1993).

L a variación en el pH resulta interesante por que el comportamiento de los cultivos con pH mayor es como los que presenta la cepa C28B25 en líquido pero el de 0.96 y 0.93 son diferentes a los que presenta la cepas C28B25, esto podría deberse a la adaptación de DGRAW99-2 a menores niveles de h. 'La explicación a esto podría ser un cambio metabólico que favorezca la acumulación de sales de tipo alcalino, aun cuando no hay reporte al respecto.

4.6 COMPARACIÓN DE LA PRODUCCION DE EX0 Y ENDOPECTINASAS POR LAS TRES CEPAS EN CULTIVO SOLIDO Y LIQUIDO CON DIFERENTE a, INICIAL.

Se presentan los resultados integrados, con el fin de comparar el efecto de la a, en las 3 cepas sobre la producción de endo y exopectinasas en cultivo sólido a 72 hrs y líquido a 120 hrs.

-mIm +u0

GRAFICA 16 EFECTO DE a, EN LA P'RODUCCION DE ENDO( ) Y EXO( + ) SOLIDO. PECTINASAS POR LAS CEPAS DGRAW96-3, C28B25 Y DGRAW99-2 EN CULTIVO

Podemos observar que la cepas DGRAW96-3 disminuye su producción de endo y exopectinasas casi en un 70% al pasar de 0.96 a0.93 en la a, , mientras que las otras cepas presentan una relación directaentre la a, inicial y la producción de endo y exopectinasas, de tal modo que a una mayor a, se presenta una mayor producción, siendo su caída de actividad mucho menor. Esto podría resultar extraño debido a la suposición de que al ser DGRAW96-3 una cepa hiperproductora en sólido debería soportar mejor la caída de la h, la explicación la da el reporte de Gervais y r,o1.(1988) quienes reportaron que PeniciZZium roquefortii que se encontraba en su valor de av Óptimo de crecimiento (h 0.97) presentó una caída drástica de crecimiento al modificar de manera pequeña este valor y la caída disminuía al irse alejando de este valor ya era mucho menor, al reunir esta cita con lo

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reportado por Sarrette y col(l992) quienes afirma que la a, optima de producción es muy cercana a la optima de crecimiento, esta caída podría provocar la baja de producción; por lo tanto el hecho de que las otras cepas no presenten una caída drástica se debe probablemente a que en a, 0.96 ya están lejos del valor óptimo de crecimiento para ellas.

3.k

0.99 0.w 0 . n 0.- 0.w 0.99

.i

- m o +oro

0.ao 0.91 0 3 3 0.- 0.17 0.99

L.

- m o + n o

GRAFICA 17 EFECTO DE a, EN LA PRODUCCION DE ENDO( ) Y EXO( + )

LIQUIDO. PECTINASAS POR LAS CEPAS DGRAW96-3, C28B25 Y DGRAW99-2 EN CULTIVO

En la gráfica 17 se presenta la producción de exo y endo pectinasas en fermentación sólida por la 3 cepas de A. niger se puede ver que es la cepa DGRAW99-2 la que presenta una comportamiento diferente al de las otras cepas, puesto que mientras C28B25 y DGRAW96-3 presentan mayor producción en a, 0.96, DGRAW99-2 muestra mayor producción a mayor a, , la explicación en este caso es análoga a la anterior y apoyándonos en Gervais y col (1988) quienes reportan que para existen diferentes valores óptimos de a, donde el crecimiento es mayor para diferentes cepas de hongo, podríamos establecer un valor aproximado de el valor de a, Óptimo para cada cepa que sería diferente en cada medio de cultivo, esto resulta muy claro sí comparamos el comportamiento de C28B25 en ambas gráficas y seria de 0.96 para C28B25 en líquido apoyado por la caída drástica de producción en este medio al cambiar la a, , y mayor a 0.96 en sólido, para DGRAW96-3 el valor seria de 0.96 en sólido y líquido aun cuando la caída de producción es mucho menor que la de C28B25 al aumentar a, , para DGRAW99-2 el óptimo de a, estaría cercano a 0.99 en líquido y en sólido es dificil afirmar algo pues el cultivo se lleva muy lejos de este valor pero la caída de actividad que no es grande podría indicar que se esta lejos de el valor óptimo, esta afirmación debe tomarse con precaución pues este efecto puede deberse inhibición enzimática debida la a,. tal como afirma Hahn(1986) quien reporta inhibición de hidrolasas por la caída de la a, del medio.

Es en DGRAW99-2 donde se observa que el valor de a, no solo afecta el crecimiento de los hongos sino que afecta también cada producción enzimática por separado pues la caída de endopectinasas es siempre mas grande que la de exopectinasas.

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5 CONCLUSIONES.

Al analizar los resultados reunidos observa que las cepas mutantes mantuvieron su estabilidad genética a pesar del tiempo transcurrido desde el trabajo de Antier y col (1993) y este trabajo que fiieron aproximadamente 2 años deinostrandose que las cepas son estables geneticamente.

Se observa además que la a,* tiene un efecto diferente sobre la producción de pectinasas de cada cepa que depende del método de cultivo utilizado para la obtención enzimática

Por lo tanto se concluye que:

a) Los cambios de a,% en el intervalo de 0.99 a 0.93 afectan de manera distinta la producción de endo y exopectinasas por cada cepa

b) Las cepas estudiadas responden con distinto patrón de producción de pectinasas a la presentación sólida o líquida del misino medio de cultivo, mostrándose mas sensibles a una disminución de la a,, las endopectinasas que las exopectinasas y ambas mas sensibles en líquido que en sólido.

c) Las cepas tienen distinto patrón de reacción ácido-base con el mismo medio sólido o líquido, sugiriendo diferencias importantes en la excreción de productos metabólicos o la asimilación de substratos.

También resulta interesante al analizar los datos corroborar que la selección de hiperproducción realizada por Antier y col( 1993) produjo cepas que responden de manera diferente al cambio de a, permitiendo pensar que se seleccionó un tipo metabólico propio para sólido y uno propio para líquido.

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