Untersuehungen fiber die ehelnisehe Natur der Fermente (ohne die hitminhaltigen Fermente).

Yon

W. LANGENBECK- M f i n s t e r i. W .

I n h a l t s v e r z e i c h n i s . Seite

Li te ra turverze ichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 470 Einle i tung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 472 A. Allgemeine E n z y m t h e o r i e n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47~

I. Theor ien fiber die N a t u r der E n z y m s u b s t r a t b i n d n n g . . . . . . . . . . . . . 474 1. Die Nebenvalenz~heor ie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 474 2. Die Adsorp t ions theor ie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 477 3. Die t t aup tva l enz theo r i e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 478

I I . Theor ien des E n z y m b a u e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 482 1. ]~olloid~ler Tr&ger u n d wirksame Gruppe . . . . . . . . . . . . . . . . . 482 2. Die Zwei-Mfin i t~ ts theor ie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 485 3. Akt ive u n d ak t iv ie rende Gruppen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 486

B. Un te r sue hunge n fiber die K o n s t i t u t i o n einzelner F e r m e n t e . . . . . . . . . . . . 490 1. Dureh Adsorp t ion gereinigte F e r m e n t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 490 2. Kryst~l l is ier te ]~'ermente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 491 3. Dipept idase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 494 4. Carboxylase u n d Carboligase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 495

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68, 943 (1930).

Einleitung. Schon zu der Zeit, als BERZELIUS eine Anzahl chemischer Reaktionen

unter dem Namen Katalyse zusammenfasste, rechnete man auch die Fermente, soweit sic dama]s bekannt waren, zu den Katalysatoren. Dureh Untersuchungen bis auf unsere Zeit hat es sich erwiesen, dass diese Einordnung zu Recht vor- genoInmen wurde. Wenn man es als eine Einsehr~nkung betrachtet, dass die Fermente keine idealen Katalysatoren sind, so gilt dasselbe auch fiir viele andere Katalysatoren, ohne dass man daran denkt, sie theoretiseh gesondert zu be- handeln.

Die Fermente sind n~tmlich insofern keine idealen Katalysatoren, als ihre Wirksamkeit bet l~ngerer Versuehsdauer stets nachl~isst, aueh wenn man die Substratkonzentration konstant hMt. Das Absinken der Wirksamkeit beruht einerseits auf einer irreversiblen ZerstSrung, es gibt keine absolut stabilen Fermente. Noch mehr tritt hervor die tIemmung, die fast alle Fermentreak- tionen durch ihre geaktionsprodukte erleiden. Fiir beide Erseheinungen gibt es Analogien bei den anorganisehen Katalysatoren. Dass die Aktivit~t vieler heterogener Katalysatoren mit tier Zeit nachl~sst, ist bekannt. Ftir die Teehnik ist dieser Vorgang eine der Schwierigkeiten bei der Anwendung katalytischer Prozesse. Aueh die t temmung dureh Reaktionsprodukte ist bet heterogenen

Einleitung. 473

Katalysatoren nicht seRen, sie trRt z. B. bei der technisch so wiehtigen Ver- brennung des Sehwefeldioxyds anf 1. Endlich wird aueh eine der ~ltesten homogenen Katalysen, die Bildung yon Ather ans Alkohol bei Gegenwart yon Sehwefels~iure dureh das eine Reaktionsprodukt (Wasser) gehemmt.

Lange Zeit galt die stereochemisch auswiihlende Wirknng der Fermente als ein Merkmal, das sie yon den anderen Katalysatoren unterscheiden sollte. Abet seit den Arbeiten yon G. BREDm nnd seinen Schiilern (z. B. 6, 30, 7) kennen wir einfaehe Katalysatoren, welehe dieselbe Eigensehaft zeigen.

Wenn also die Stellnng der Fermente im physikalisch-chemisehen System der Katalyse vS!lig klar und eindeutig ist, so kann man das um so weniger von ihrer Einordnung in das System der organischen Chemie sagen. Wit fangen heute erst eben an, das eine oder andere Ferment einer bestimmten organisehen Verbindungsklasse zuzuordnen, wobei betont werden muss, dass die Sieherheit, mit der dies gesehieht, zum Tell noeh nieht denjenigen Grad erreieht hat, den wit sonst bei organisehen Arbeiten als selbstverst~ndlieh betraehten. Der Grund dafiir ist letzten Endes, dass es noeh nieht gelungen ist, Fermente in reinem Zustand zu isolieren nnd der Analyse zu unterwerfen. Die Adsorp- tionsmethoden in der Hand R. WIr,LSTXT~EUs und seiner Sehtiler haben zwar zu sehr stark angereieherten Fermenten geffihrt, aber die Grenze ist gesetzt dutch den Reinheitsgrad, bei dem die Pr~tparate anfangen sehr nnbestandig zu werden (s. unten). Obwohl wit heute eine Anzahl yon krystallinen Eiweiss- stoffen mit Enzymwirkung kennen, so ist es doeh so gut wie sieher, dass das Protein nieht die katalytisehe Wirkung bedingt, sondern ein Begleitstofi des eigentliehen Fermentes ist.

Diese Sehwierigkeiten haben dazu gefiihrt, dass die organiseh-ehemisehe Betraehtungsweise bei den Enzymen yon manehen Forsehern iiberhaupt abgelehnt wird. Es soll nieht eine bestimmte ehemisehe Struktur, sondern ein besonderer kolloidehemiseher Verteilungszustand ftir d i e katalytisehe Wirk-ung verantwortlieh sein. Als besonders eharakteristiseh seien die folgenden S~itze einer Arbeit yon A. FoI)o~ (31) entnommen:

,,Aueh zur Zeit werden noeh wiederholt Versuehe unternommen, in diesem . . . Enzym- molektil ehemisehe Gruppen anzunehmen, die zu bestimmten Gruppen des Substrates in ein ehemisehes Bindungsverh/iltnis treten . . . . Man muss in diesen Versuehen die letzt.en Zuekungen der fiir die Kenntnis enzymatischer Vorg~nge sich als unbrauehbar erweisenden organiseh-ehe- misehen Lehre im alten Sinne erkennen, die his jetzt mit der klassisehen Theorie der verdiinnten L6sungen und des Massenwirkungsgesetzes das ganze Gebiet beherrschte."

Im Gegensatz dazu soll in der vorliegenden f ) b e r s i e h t - ihrem Titel entspreehend - - gerade der rein ehemisehe Gesiehtspunkt in den Vordergrund gerfiekt werden. Es erseheint gewagt, bei den Fermenten die K~KtJLs Strukturtheorie zu verlassen, die bisher bei allen Naturstoffen, aueh den kompliziertesten, die Probe gliinzend bestanden hat. Die Entwieklung der Celluloseehemie in den letzten Jahren gibt ein Beispiel, dass die klassisehe

1 vgi. G. M. settw~t~ (106). l~ber weitere Beispiele daselbst (107).

474 W. LANGENI3ECK: Untersuchungen fiber die chemische N~t~ur der Fermente.

Theorie v611ig ausreieht, um in grossen Zfigen die ehemisehen Eigensehaften yon Naturstofien zum Ausdruek zu bringen. AUch die Erfahrungen an den h~minhaltigen Atmungsfermenten 1 deuten darau~ bin, dass in den Enzymen bestimmte ehemisehe Gruppen wirksam sind.

Andererseits w~re es natiirlieh verfehlt, wenn man nieht dem kolloiden Zustand der Fermente die gleiehe Aufmerksamkeit sehenken wollte. Die Fer- mente geh6ren naeh ihrem Dispersionsgrad zweifellos in das Gebiet der Kolloid- ehemie, abet es ist ein Untersehied, ob man den Verteilungszustand als die Ursache oder nur als eine Vorbedingung ffir die ka~alytisehe Wirkung betraehtet. Es ist verst~indlieh, dass ein Enzym nur dann wirken kann, wenn es dem Sub- strat eine genfigend grosse Oberfl~ehe bietet. Jede Jmderung der Oberf!~iehe muss zu einer Anderung der Wirkung ffihren. Aueh die Adsorption wird insofern eine Rolle spielen, als sie die Konzentration des Substrats in der nn- mittelbaren Umgebung des Ferments regelt. Trotzdem gibt es Grfinde gegen die Annahme, dass die Katalyse allein dutch Adsorption ausgel6st wird.

Bei den Untersuehungen fiber die ehemisehe Konstitution der Fermente hat man sieh wegen der analytisehen Sehwierigkeiten bisher meist indirekter Methoden bedient. Aui dem Gebiet der h~iminhaltigen Fermente ist bekanntlieh die Spektroskopie das wiehtigste ttilfsmittel gewesen. Die anderen Fermente geben abet, soviel man weiss, kein eharakteristisehes Spektrum, und so hat man versueht, einerseits dutch Hemmungsversuehe, andererseits dutch Ver- gleieh mit einfaehen Fermentmodellen fiber die Natur der katalytiseh wirk- samen Gruppen Aufsehluss zu erhalten.

Neben diesen speziellen Betraehtungen fiber die Konstitution einzelner Fermente sind Arbeitshypothesen fiber allgemeine Strukturprinzipien yon Enzymen aufgestellt worden, ferner tIypothesen fiber den Meehanismus der Fermentwirkungen. Da diese Vorstellungen mit der ehemisehen Natur der Enzyme eng zusammenh~ingen, sollen sie bier ebenfalls berfieksiehtigt werden.

A. Al lgemeine Enzymtheorien.

I. Theorien fiber die 5tatur der Enzymsubstratbindung.

1. Die Nebenva lenz%heor ie .

~]ber den Reaktionsverlauf zwisehen Stoffen, die sieh nieht rein isolieren lassen, kann im allgemeinen nnr die Untersnehung der Kinetik Aufschluss bringen. So ist es verstgndlieh, dass der Mechanismus yon Fermentreaktionen haupts~iehlieh mit kinetischen Methoden bearbeitet worden ist. Die Mess- resultate liessen sieh deuten dutch die Annahme, dass das Enzym mit dem Substrat eine Zwisehenverbindung eingeht. Die erste wirklieh braaehbare Theorie der Enzymkinetik wurde yon V. HENRI (33, 84) begrfindet und yon MmsAEms nnd MENT~S (80) experimentell nnd theoretiseh ansgebaut. Soweit

z Vgl. den Beitrag yon K. Zsm~ in diesem Band der Ergebnisse der Physiologie.

Allgemeine Enzymtheorien. Theorien fiber die N a t u r der Enzymsubst ra tb i ldung. 475

sie ffir Betrachtungen tiber die chemische Nat nr der Enzymsubstratbindung wesentlieh ist, soll sie im folgenden kurz referiert werden. Um eine einheRliche

und fibersichtliche Darstellung zu erzielen, werden wir in einigen Punkten yon den Originalabhandlungen abweiehen. Das kann nm so eher geschehen, als es bereits eine Anzahl vortrefflieher originalgetreuer Referate fiber diese Arbeiten

gibt [z. B. KuHN (52)]. Zvngehst betrachten wit nieht, wie MICHA~LIS und M~XTEN es getan

haben, die Spaltung des Rohrzuekers dureh Saceharase, sondern den ein- faeheren Fall, dass ein Substrat AB ,rater dem Einflnss des Ferments in die Reaktionsprodukte A und B zerf~illt, wie er z. B. bei der Spaltung der Brenz- traubens~iure dureh Carboxylase verwirklieht ist.

MICHAELIS vnd MENTEN machen zur Bereehnung des Reaktionsverlaufes

zwei Grundannahmen : 1. Das Massenwirkungsgesetz ist auf Fermentreaktionen anwendbar,

2. das Ferment bildet mit dem Substrat einerseits und mR einem Reaktions- produkt andererseits 1 loekere dissoziable Additionsverbindungen. Die Gleieh- gewiehte sollen sich unmessbar raseh einstellen.

Das Schema der Reaktion lautet also, wenn X das Ferment bedeutet: K A ~

a B + x a 1 3 x . ( 1 )

k A 1 3 X --> A + 13 + X . ( ~ )

13 + ,2g: Va---- B X ,

KA~ und K B sind die Gleiehgewiehtskonstanten der betreffenden Reaktion, k ist eine Gesehwindigkeitskonstante, v die Gesehwindigkeit der Ferment- reak~ion. Diese muss proportional sein der Konzentration der reaktions- vermittelnden Enzymsubstratverbindung, welehe sieh naeh dem Massen- wirku13gsgesetz leieht bereehnen l~tsst.

. = a xj. (4 )

[ABX] bereehnet sieh aus folgenden Gleiehungen: [A13] . I X ] = KA~ ~ �9 [ A B X ] ,

[13] �9 [ X ] = K B [ B X ] .

[X'] sei die Gesamtkonzentration des freien nnd gebundenen Ferments, also [x'] = ix] + [2~Bx] + [Bx],

dann ist [x] = ix,] - [a13x] - [13x], also r~B] ( Ex'] - EaBXJ - ~BX]) = ~:A, ~aBX]. (5)

~J (m'] -- ~BX] - ~13x] ) : x , c~x]. (6)

(5) und (6) And zwei Gleiehungen mit zwei Unbekannten, [ABX] und [BX], man findet

1 Die Frage, ob beide Reakt ionsprodukte oder nur eins derselben das Fe rmen t binder, wird in der ,,Zwei-Affinit/~tstheorie" behandeR (vgl. Kap. II , Abs. 2). TaSs/~chlich h e m m t in den genauer untersuchten F/~llen nur ein l~eakt ionsprodukt in der Art , wie es die Theorie yon ~/[ICHAELIS und I~ENTEN v o r s i e h t .

476 W. LANGENBECK: U n t e r suchungen fiber die chemisehe N a t u r der Fermente .

[X'] [AB] [ABX] = KAB

K~B + ~ [B] + [AB]

k- [X'] . [AB] ,, und nach (4) K ~ ~ AB -- - - []3] + [AB]

Die Gleiehung (I) gestattet es, die GrOsse yon KA~ aus Versuehsdaten zu linden, ohne dass man die wahre Enzymkonzentration zu kennen braueht. Zu diesem Zweck bestimmt man die Anfangsgeschwindigkeiten bei verschie- denen Substratkonzentrationen aber konstanter Enzymkonzentration. Zu Anfang ist stets []3] = O. ])er Wert ~iir v

(I a) v = k [ X ' ] + a131

n~ihert sieh dem Werte k [X'], wenn [AB] gegen/Jber Kx~ sehr gross wird. Ist dagegen K~ B = [AB], so erhalten wir v =- k [X'] ~fa~EA~] _ k [x']~ K ~ ist also

gleieh derjen~gen Substratkonzentration, bei der die Reaktionsgesehwindigkeit gleieh der It~lfte der maximal mOgliehen ist. Praktiseh ffihrt man die Be- stimmung yon KaB graphiseh dureh, indem man auf der Absz isse- - log [AB] auftri~gt (Ps), auf der Ordinate die Anfangsgesehwindigkeiten, wobei die maxi- male Gesehwindigkeit gleieh 1 gesetzt wird. Die Ordinate �89 liefert dann die Abszisse - - l o g KaB. Die Kurve wird als Akt iv i t~ts -ps-Kurve bezeiehnet. Sie hat im Idealfalle die Gestalt einer Dissoziationsrestkurve.

MIC~AELIS und MENTE~ haben diese Methode benutzt, um KaB bei der Saeeharase zu bestimmen. Gleiehung (I a) li~sst sieh direkt auf die Spaltung des Rohrzuekers anwenden, denn der Zerfall des Zwisehenstoffes ABX ist hier monomolekular, da Wasser in grossem fJbersehuss zugegen ist. In der Tat ist die Saeeharase flit solehe Messungen besonders geeignet, da ihre Aktiviti~ts- ps-Kurve sehr angen~hert die Gestalt einer Dissoziationsrestkurve hat. Das ist durehaus nicht bei allen Fermenten tier Fall. Besonders die Lipasen zeigen erhebliehe Abweiehungen, bei hSheren Substratkonzentrationen fitllt sogar die Gesehwindigkeit wieder stark ab [vgl. z. B. BA~AN~ nnd SegMELL~R (5)]. Es ist daher wiehtig, dass wenigstens ein Ferment, die Saceharase, der Theorie in erster Ni~herung folgt. So ist man bereehtigt, die Abweichungen bei anderen Fermenten als seknndi~re StSrungen zu betraehten.

Von Bedeutung ist noch eine Beziehung zwischen der Hemmung dureh das Reaktionsprodukt B und der Substratkonzentration. Da namlieh in Glei- chung (I) die GrSsse [B] im Nenner steht, muss die Reaktionsgesehwindigkeit mit waehsendem [B] sinken. Zahlenm~tssig drfiekt man die Hemmung am besten dureh den Hemmungskoeffizienten h arts [MIctIAEI~IS und RoNA (82)].

YO-- VB , ( 7 ) Vo

wobei v o die Anfangsgesehwindigkeit bei Abwesenheit yon B bedeutet ([B]--: 0), v~ bei Gegenwart yon B. Dutch Einsetzen yon Gleiehung (I) in (7) finden wir:

Allgemeine Enzymtheorien. Theorien fiber die Natur der Enzymsubstratbildung. 477

]~AB - - [ B ]

I12 B : ( s )

~AB ~[.kB -}- ~BB [B] + lAB]

Da die Gr6sse lAB] ira Nenner s~eht, i0]gt aus der Gleichung, dass der Hemmungskoeffizient kleiner werden muss rnit steigendem [AB].

Bei den genauer untersuehten Ferrnentreaktionen hat sioh nun gezeigt, dass wirklieh eins der Reaktionsprodukte in Abh~ngigkeit "con der Substrat- konzentration hernrn~, das zweite hernmt entweder gar nieht oder unabh~ngig yon tier Substratkonzentration [z. ]3. K~EN und Mi/rNc~ (55)]. Naeh MIcI~A- ELIS und P~C~STEIX (81) S011en diese ,,HernrnungskSrper zweRer Art" dureh Anderung des Miliens den Zerfall der Enzyrnsubstratverbindung verzSgern (vgl. dazu Kap. II, Absehn. 3).

Die Ubereinstirnrnung zwisehen der Theorie und der wirklieh beobach- teten Kinetik seheint also ffir die Grundannahrnen yon ttENaI und MIe~AELIS- MENT~" Zn sprechen. Wir werden allerdings sehen, dass sieh rnit Hilfe anderer Vorstellungen die Ferrnentkinetik ebensogut and sogar noch befriedigender deuten lgsst.

MIC~AELIS selbst hat fiber die Na~u; tier Valenz, die zwisehen Ferment und Substra~ wirksarn is% keine Annahrnen gemaeht. P. PFEIFF~a (99) hat gelegentlich die Enzyrnsubstra~verbindungen als Molekfilverbindungen an- gesproehen. ,,Bei der Wirkung der Enzyme handelt es sieh ja sieher prirngr urn die Bindung des Enzyrns an das nrnznwandelnde Substrat, also nrn die Entstehung yon Molekfilverbindungen" (99). In der Tat entspreehen die EigensehaRen, die Mic~AEsis jenen Verbindnngen beilegt am besten den Molekfilverbindungen vorn Typns des Chinhydrons. Aueh diese bilden sieh rasch and zerfallen in LSsung zum Tell. Da die chernisehen Kr~iRe, die zwisehen den Komponenten einer Molekfilverbindung wirken, als Nebenvalenzen be- zeiehnet werden, isg in dern vorliegenden Referat ffir diejenigen Anschau- ungen, welehe die Kinetik naeh Mm~AELlS und MENTE~ benutzen, der Name ,,Nebenvalenzthe0rie" gew~ihlt worden~ um eine kurze Bezeiehnung zu haben.

2. Die A d s o r p t i o n s t h e o r i e .

Dass die Fermente Kolloide sind, folgt u. a. daraus, dass sie bei der Dialyse nieht dutch Mernbranen wandern. Es liegt deshalb nahe, die Ferrnent- reaktionen nicht als homogene, sondern als rnikroheterogene Katalysen zu betraehten [Hi~miCOCK (38), SCUWAB (103, 109), WEWEN~IAGE~ (131, 130), FlSC~GOnn und A ~ O N (29)]. Naeh dieser Theorie wird angenommen, dass die Reaktionsgeschwindigkeit proportional ist der Substratrnenge, die yon der Oberfl~iehe des Ferments adsorbiert wird. Das Grundgesetz ist dabei nicht das Massenwirkungsgesetz, sondern die LANe~-IBsehe Adsorptionsisotherrne. Diese liefert ffir den Fall, dass zwei Gase urn eine Oberfl~iehe konkurrieren,

4"18 W . LA~O~NB~,eK: U n t e r s u e h u n g e n t i b e r d i e e h e m i s c h e N a t u r d e r F e r m e n t e .

folgende Beziehungen [LANGMUI~ (77), REIGI~INSTEIN (]00), Darstellung zum Tell nach SCHWAB (105)]:

k , . p (1 -- a -- a ' ) = k~ a, (1) k , ' . ~" (1 - o - ~'~ = k0' o ' . ( 2 )

Darin bedeuten p u n d p ' die Drueke der beiden Gase, o u n d o ' die Bruehteile der Oberfliiehe, die yon den Gasen bedeekt sind, kl, k2, k[ und k~ sind Kon- stanten. Dann wird

k~ - p p

k~ + k/p' + k~p k~ k~" k~- + ~2j P' + P

~renn wit zu LSsungen fibergehen und start der Oasdrueke die K.onzentrationen yon AB und B einsetzen, erhalten wit:

a B j ( 8 )

k~

Ist 0 die wirksame 0berfl~ehe des Ferments, so wird v = k . O . a .

= k . o . [AB] ( I I ) k~ _}_ kl" k~ ~[m+[AB]

Ein Vergleieh Yon (I) und (II) zeigt vOllige Analogie dot beiden Formeln, nut ist in Gleiehung (II) die Konzentration des Ferments ersetzt dutch seine Oberfl~ehe, und die Konstanten k~, k~ und k2 sind nieht mehr die Konstanten des Massenwitkungsgesetzes, sondern der Adsorptionsisotherme. Aus (II) ergeben sieh somit dieselben Folgerungen, wie aus (I). Die Aktiviti~ts-ps-Kurve muss die Gestalt einer Dissoziationsrestkurve annehmen und B muss in Ab- h~ngigkeit yon der Substratkonzentration hemmen. Vom kinetisehen Stand- punkt aus sind Adsorptionstheorie und Neben'ealenztheorie vOllig gleieh- bereehtigt.

Die Adsorptionstheorie ist abet nieht eigentlieh eine neue Theorie gegen- fiber der yon MIC~AELIS und MENWE~ 1. Denn das zugrunde liegende Gesetz, die LaNG~vI~sehe Adsorptionsisotherme, ist letzten Endes eine Anwendung des Massenwirkungsgesetzes auf Obetfl~ehen, was man sehon an der Form der Ans~tze (1) und (2) erkennt, die den Ansiitzen (5) und (6) auf S. 475 ganz analog sind. Die Beziehung zwisehen Gleiehung (I) und (II) hat also eine mehr als formale Bedeutung. Dagegen werden wit sehen, dass die Hauptvalenztheotie, die wir nun zu bespreehen haben, yon neuen Voraussetzungen ausgeht.

3. Die t t a u p t v a l e n z t h e o r i e .

Jede Methode zur KonstRutionsaufkl~rung organischer Verbindungen geht zurfiek auf Erfahrungen, die man tibet das chemisehe Verhalten einfaeherer Stoffe gemaeht hat. Wenn man z. B. in einem Natutstoff eine Ketogtuppe nachweisen will, so rut man es auf Grund der bekannten Tatsaehe, dass ein- lathe Ketone mit t tydroxylamin 0xime bilden. Ganz ~thnlich wird man auch

I V g l . S c h w A B (109) .

A l l g e m e i n e E n z y m t h e o r i e n . T h e o r i e n f ibe r d ie N ~ t u r d e r E n z y m s u b s ~ r a ~ b i l d u n g . 479

bei der Aufkliirung der Enzymsubstratverbindungen vorzugehen haben. Die Fermente sind organisehe Katalysatoren unbekannter Zusammense~zung. Wit mtissen uns daher die Frage vorlegen: Wie reagieren die einfachen organi- sehen Katalysatoren mit ihren Substraten, und welehe Analogien zu den Fer- mentreaktionen treten dabei auf ? Es ist ein fast selbstverstiindHeher Gedanke, dass erst eine allgemeine Chemie der organischen Katalysatoren entwickelt werden muss, bevor man an das speziellere und kompliziertere Problem der Enzymwirkungen herangehen kann.

Dieses Prinzip hat denn aueh in der Enzymehemie allm~hlich Geltung erlangt, seitdem B~EDIG und FAJA~S (6) die Ursache tier stereoehemisehen Spezifii~t yon Fermenien an einfaehen Modellen studiert haben.

Unter den verschiedenen Gruppen yon organisehen Katalysatoren (vgl. 63) gibi es nur e ine , die in kinetischer Beziehung zu den (h~iminfreien) Fermenten eine vSllige Analogie zeigt. Sie umfasst diejenigen Katalysatoren, die besonders yon LANCE\BECK und seinen Mitarbeitern (Zusammenfassungen 57, 58, 59, 62) genauer untersueht und als Hauptvalenzkatalysatoren bezeiehnet worden sind. Der Name soll zum Ausdruek bringen, dass die Bindung der Substrate in den Zwisehenstoffen dutch organische tIaupivalenzen bewirkt wird.

Bis jetzt sind folgende tIauptvalenzkatalysen bekannt und in ihrem Mechanismus aufgekliirt worden:

1. Hydratisierung yon Dieyan [LIEBIG (78), LANGE~BECK (60)]. a) N ~ C--C ~--~N § 2 CI:I~ ~ C t t O t t - r C t I ~ - C~2 ~ CI3[--O--C(NIt)--C (NII)--O--CI:I = 1VIcY~, b) CH, = CHO--C (N]~)--C CNH)--OCtt = Ctt,~ + 2 tt~O -+ 2 CtI~ = C~IO~ + K~N--CO--CO--N]~2.

2. Aldehydkondensation [KNoEWNAGEL (45), D~LT~EY (12)]. a) C, ig , -Ct : IO + 2 CsH~oNIH" ~ - C~--CIg(N'C~B'~o)2 + :g20. b) C+tt~--CtI(NC~H~o)~ + C~H~--C]~--CO--C~[~ ~-> 2 C+H~oNt=I + C+H~--C ~ (CH--C~H,)-COC,I~+ ~.

3. Dehydrierung yon Aminos~iuren [LANGENBECK (56) 2].

o. -o.-ooo I o o o o t + ~) ~ + ~ - - c - - c - - I c ~ , - c - c o o ~ Nig NK~ \ / \ / \ / \ / \ / \ /

N I t N l t I~K Ot~ OH

/ \ _~ ;__b / \ / \ - - ~

N / N / N / N / / \ Rr]~ N I t N t I

4. Deearboxylierung yon a-ICetosiiuren [L~NG~NBEOK, HUTSC~Nn~UTE~, JVTTE~ANN und t t ~ a u ~ e (72, 73, 74)].

a) CI%--CO--COOIt § CK,--CI~ = NX ~- CtI~--C COOI~ § CH~--CHO,

N - - X b) CII~--C--COO]~ -+ CII~--C/I = N X + CO~.

NX

5. Umesterung ~. a) I%--O--CO--CH~ + X O H ~ - X--O--CO--CI~I. § I~01~, b) X--O--CO--CI:I . § l Z ' O ~ ~ - X O t t + I:U--O--COCI:[~.

]%eakt ion 2 b v e r l a u f t i n W i r k l i c h k e i t i n z w e i P h a s e n .

E i n e n a h n l i c h e n V e r l a u f n i m m t v i e l l e i e h t d i e D e h y d r i e r u n g d e r A m i n o s ~ u r e n rai~ m e h r -

w e r t i g e n P h e n o l e n [vg l . z. ]~. K i s c ~ (44)] .

s W . LAI~GEI~BECK u n d 1~. I - I u ~ s c ~ R E V ~ a , b i s h e r u n v e r S f f e n t l i c h t .

480 W.L.a~G~Ec~:: Untersuchungen fiber die chemische Natur der Fermente.

Jede dieser Katalysen besteht aus zwei Teilreaktionen. In der ersten a) wird das Substrat an den Katalysator gebunden. Wenn bet der Katalyse

zwei Reaktionsprodukte entstehen, wird eins davon bereits in der Teilreaktion a) in Freiheit gesetzt. Das ist bet den Reaktionen 2. bis 5. der Fall. Nut bet 1. entsteht lediglich e in Reaktionsprodukt, das in der Teilreaktion b) frei wird 1. Ein Blick aui die Formulierung der Hauptvalenzkatalysen zeigt, dass der Mechanismus ein vSllig anderer ist, als er naeh der Nebenvalenztheorie bet Permentreaktionen sein soll. Gemeinsam ist nut, dass die Bildung yon Zwisehenstoffen nach dem Massenwirkungsgesetz beobaehtet bzw. angenommen wird. Die Untersehiede sind folgende:

1. Die Bindung der Substrate an die Katalysatoren erfolgt stets dureh feste organisehe Hauptvalenzen, nicht dutch lockere Nebenvalenzen.

2. In den meisten F~illen, d. h. dann, wenn mehr als ein l teaktionsprodukt entsteht, ist die Bildung der Zwisehenstoffe keine Additions-, sondern eine Substitutionsreaktion.

3. Siimtliche Teilreaktionen verlaufen mit vergleichbarer Geschwindig- keit, keine Gleiehgewichte stellen sieh unmessbar sehnell ein.

Als Beispiel fiir die Berechnung der Kinetik wiihlen wit Reaktion 4., weil diese besonders eingehend untersucht worden ist. Bezeiehnen wit wieder als AB das Substrat (Brenztraubensiiure), als A und B die Reaktionsprodukte (Kohledioxyd und Aldehyd) und als X den Katalysator (Aldehydimin), so bekommen wit das allgemeine Schema:

kl A B + X ~ A X + ~ , (1 )

A x - , A + x , (~) k

k, k 1 und k~ seien die Gesehwindigkeitskonstanten der betreffenden geaktion. Die Kinetik derartiger Zwisehenstoffkatalysen ist theoretiseh besonders

yon tIERzFELD (86) behandelt und yon SchwAB (104) ergiinzt worden. Die Ableitung yon HEt~ZFELD bezieht sich ursprtinglieh aui gasfSrmige Kata- lysatoren, kann aber ohne weiteres auf verdiinnte LSsungen tibertragen werden.

Die Gesehwindigkeit der Katalyse muss wieder proportional sein der Konzentration des Zwischenstoffes AN:

= k a x l . ( 3 )

[AX] lasst sich bereehnen auf Grund der ~Jberlegung, dass sieh bet der Katalyse rasch ein stationiirer Zustand herausbilden muss, in dem die Reak- tionen, die zur Bildung und zur ZerstSrung yon AX ftihren, sieh die Waage halten. Im Verlaufe liingerer Zeit ~indert sich lAX] zwar, aber far jede kurze Zeitspanne kann man diese GrSsse als konstant betraehten. Es seien v~, v~ und v die Geschwindigkeiten der Teilreaktionen mit den Gesehwindigkeits-

1 I)ie Erseheinung, class bet t t aup tva lenzka ta lysen mi t zwei l~eaktionsprodukten das eine sehon in der ersten Teilreaktion fret wird, 1/isst sieh aueh theoret iseh verst~indlieh maehen [vgl. LA~e~m~CK (61)].

Al lgemeine E n z y m t h e o r i e n . Theor ien fiber d ie N a t u r de r E n z y m s u b s t r a t b i l d u n g . 481

konstanten kl, k~ und k. Dann wird AX mit der Geschwindigkeit vl gebildet, mit der Geschwindigkeit v~ + v verbrancht. Also gilt

. , + (4) Naeh dem Massenwirkungsgese~z giR dann

ks [AB] �9 IX] = kl ' fAX] , [B] + k[AX].

c x ' j = cx~ + r a x j

sei die Gesam~konzentration des Katalysa~ors, d a n n i s t

ix] = tx'l - [Ax] und k~ lAB] ([X'] -- lAX]) = k~" laX] - [B] + k [AX]. kl [X'] [ABJ [X'J fAD] Daraus bereehnet sieh Ax k + E / [B] +k~ lAB] k + k (

k~ k~ []3] + [AB]

k [X'] [ABJ ~ k ~,' (III)

k~ + ~ [B] + CAB]

Vergleichen wir den Ausdruek (III) mR Gieiehung (I) auf S. 476, so ergibt sieh wieder eine genaue Analogie, nur die Konstanten haben zum Teil einen anderen Sinn bekommen [LArGE,BECK (71, 68)]. Die AktivR~ttS-ps-Kurve muss aueh naeh (III) die Gestalt einer Dissozia*ionsrestkurve besitzen, denn flit [ B ] = 0 wird ~ k m ' ~ rA~j

+ ~a~c (III~) kz

k bestimmen, analog wie es MIeI~AELIS und MENTEN Daraus l~isst sieh wieder k for KA~ angegeben haben. G? hat aber bei den Hauptvalenzkatalysen nicht

mehr die Bedeutung einer Dissoziationskonstan*e der Enzymsubstratverbin- bung, wie in der Nebenvalenztheorie, sondern is* das Verhifltnis der Geschwindiff- keitskonstanten zweier Folgereaktionen.

Die Konstante KA~ hat bekanntlieh in der Enzymchemie eine beondere Bedeutnng erlangt, da sie bei Untersuehungen tiber die SpezifR~it der Enzyme vorzugsweise benutz~ wird [z. B. KuH~- (48)3. Nimmt man nun die Arbeits- hypothese yon LANOENBECK (69) an, dass die meisten h~tminfreien Fermente Hauptvalenzkatalysatoren sind, so kann man nicht mehr yon einer Dissozia- tionskonstante der Enzymsubs~ratverbindung spreehen. Will man die Ana- logie zu der ~ilteren Theorie zum Ausdruck bringen, so wird man sie zweek- miissig als ,,scheinbare Dissoziationskonstante" bezeichnen. Im tibrigen kann man mit der neuen Konstanten genau so reehnen wie mit KA~ 1. Der reziproke Weft k~ entsprieht der Affinitiitskonstanten und w~ire ,,scheinbare Affinit~its-

konstante" zu nennen. Aueh in alien anderen Punkten vermag die neue Arbeitshypothese die

Enzymkinetik ebensogut zu deuten, wie die Nebenvalenztheorie. Aus Glei- chung (III) folgt, dass das Reaktionsprodukt hemmt, da [B] im Nenner steht. Die Bereehnung des Hemmungskoeffizienten [LANoE~BECK, Jt~TTE~A~N und H ~ n ~ v ~ o (76)] :

h v~ k~" CBJ v o k + k~" []3] + k~ CAB]

1 I n der L i t e r a t u r z. B. be i Saeeh~rase a ls K s bezeiehne&

Asher-Spiro, Ergebnisse der Physiologie trod exper. ]?harmakologie. 35. 31

482 W. LANGENI~ECX: Untersuchungen fiber die chemische Natur der Fermente.

ergibt, dass dieser mit waehsendem [AB] abnimmt, da [AB] im Nenner steh~. t Iemmung dureh das Reaktionsprodukt muss immer dann zu beobaehten sein, wenn Teilreaktion a) einer Ha~lptvalenzkatalyse (vgl. S. 479) reversibel ist. Das Reaktionsprodukt versehiebt dann das Gleiehgewieht yon a) naeh links, wodureh [AX] kleiner wird. In der Tat ist sowohl bei den earboxylatiseh wirksamen Katalysatoren der Reaktion 4. (S. 479), wie bei der Carboxylase selbst die Hemmung dureh Aldehyd und ihre Abhiingigkeit yon der Substrat- konzentration beobaehtet worden [LANGn~BECK (67)].

Vom Standpunkt der Kinetik sind also die Nebenvalenztheorie (aueh in der Form der Adsorptionstheorie) und die IIauptvalenztheorie vSllig gleieh- wertig. Es fragt sieh nun, ob man nieht doeh zwisehen den beiden Theorien entseheiden kann. Naeh Ansieht des Verfassers mfissen dabei die Erfahrungen mit organisehen Katalysatoren den Aussehlag geben. Manehe anorganisehe Katalysen, z. B. solehe mit Platinsolen, zeigen in ihrer Kinetik zwar Ahnlieh- keit mit den Fermentreaktionen und folgen vielleieht der Adsorptionstheorie (9, 39, 109). Aber da die Fermente organisehe Stoffe sind, kann man sie nur mit den organisehen Katalysatoren vergleiehen. Von metallfreien organisehen Katalysatoren kennt man bis jetzt zwei Gruppen, die basisehen und die Hauptvalenzkatalysatoren (63). Erstere bilden zwar mit dem Substrat eine dissoziable Verbindung [z. B. Chinin@ Camphocarbons~iure, FA~A?cs (30)], abet die Reaktionsprodukte hemmen nieht merklieh. Dutch Adsorption an definierte organisehe Stoffe ist iiberhaupt niemals eine katalytisehe Wirkung erzielt worden. In Wirkliehkeit sind also die Voraus- setzungen der Nebenvalenztheorie und Adsorptionstheorie bisher ehemiseh nieht verwirklieht worden, wi~hrend die Hauptvalenztheorie aueh in dieser Hinsieht gut gestfitzt ist.

II. Theorien des Enzymbaues.

1. K o l l o i d a l e r T r ~ g e r u n d w i r k s a m e Gruppe .

WILLSTXTTEP~ ist bei seinen Untersuchungen fiber die Reinigung der Fermente zu der Auffassung gekommen, dass die kaLalytiseh wirksamen Fer- mentmolekfile nicht selbst~ndig in den L6sungen enthalten, sondern auf Kolloiden verankert sind. ,,Die Erscheinungen der Enzymspezifit~t, die Beobaehtungen fiber Zersetzufig und Stabilisierung gereinigter Invertin- 15sungen und besonders die Einflfisse der Verteilung auf die enzymatische Wirkung, die bei anderen Enzymen gefunden wurden, ffihren zu der Auffassung, dass das Molekfil eines Enzyms aus einem kolloiden Tr~ger und einer rein che- miseh wirkenden aktiven Gruppe besteht" (133).

Naeh dieser Anschauung wiirde also jedem Ferment ein eharakteristiseher Trager zugeh5ren, der sieh nicht durch einen anderen ersetzen lasst. Dasselbe wird aueh yon v. EUL~R und JOSEPHSON (9,5) angenommen. WILLSTXTTE~ dagegen hat seine Theorie sparer dahin erganzt, dass das Ferment nieht so

Theorien des Enzymbaues. 483

fes% mi t seinem Tr~iger verkntipft ist. ,,Ein einzelner kolloider Tr~iger ist ent- behrlich, wenn dem Enzym ein anderer geeigneter zur Verf~igung steht; das Enzym vermag seine Aggregate zu wechseln" [WILLSTX~r SCHNEmSR nnd WENZBn (158)]. Neueste Versuche yon WALDSCH~MIDT-LEITZ und KOFRANYI (125) haben bestatigt, dass diese Annahme den Tatsachen besser gerecht wird (vgl. Teil B, Abschn. 2). Z.B. l~tsst sieh Pepsin yon einem krystallisierten Globulin auf ein anderes tibertragen.

Wichtig sind vor allem die Beweise, die WInnSTXTTER f~ir die Bedeutung nnd Fnnktion des Trggers erbracht hat. Die Bestgndigkeit yon Invertin- prgparaten nimmt im Lanfe der Reinigung hgufig ab, wobei allerdings Un- bestandigkeit und Reinheitsgrad durchaus nicht immer parallel gehen. Eine unreine SaceharaselSsung veto Zeitwert 7 blieb 3 Wochen konstant, ein Pr~parat yore Zeitwert 2,4 verlor in 14 Tagen 60 % der Wirkung, wghrend ein reineres yore Zeitwert 0,725 sich 5 Tage lang nicht ver~nderte [WILLSTXTTE~ und RAc~E [150)].

Besonders empfindlich seheinen Fermen~lSsungen zn seth, die durch Adsorption an Bleiphosphat gereinigt wurden, wenn auch manehe yon diesen durchaus bestgndig waren (140). Bet den reinsten Prgparaten, z. B. yore. Saccharasewer~ 11,9, zeigte sich aber stets eine ziemlieh rasche Inaktivie- rung (161).

Gereinigte Fermente werden, im Gegensatz zu den rohen, bet der Ad- sorption an Tonerde zum Tell zerstSrt. W~hrend beim Rohinvertin die Wirk- samkeit im Adsorbat dieselbe ist wie in LSsung, bleibt nach der Reinigung die Aktivit~tt des Adsorbats hinter der adsorbierten Fermentmenge zuriick (153). Dass wirklieh eine Enzymzers~6rnng stattgefunden hat, geht daraus hervor, dass aus solchen Adsorbaten aueh weniger Enzym ehiiert wird.

Wenn durch Entfernnng yon Fremdstoffen die Stabili~gt sinkt, so kann man sie umgekehrt dadureh erh6hen, dass man bestimmte Stoffe zusetzt (144). Z. B. sind Leueylglyein und Hefegummi solche Stabilisatoren.

Wahrend die Versuche mit Invertin niehts darfiber aussagen, ob bestimmte Kolloide als Stabilisatoren besonders geeignet stud, so haben es dagegen KRAFT: und RUB~NBAUE~ (47) bet der Leberesterase 1 wahrscheinlieh gemacht, dass Substanzen, welche die MILLoNsehe Reaktion geben, solehe spezifisehen Trager stud. W~hrend die rohe Leberesterase zu den best~ndigsten Fermenten zahlt, verschwindet ihre Stabilit~tt sehlagartig in dem Augenbliek, wo die millon-: gebende Substanz, wahrscheinlich ein Tyrosinpeptid, dutch Adsorption ent- fernt wird. Solehe Pr~parate verlieren schon beim Stehen tiber Nacht 50 % ihrer Aktivitgt.

Die Unbest~tndigkeit yon weitgehend gereinigten Enzympraparaten bedeutet ftir das Problem der Enzymisolierung eine sehr ernste grundsgtzliehe

1 Auch die ~agenlipase wird bet der l~einigung unbestgndig [W~LsTX~Js~ und BA~A~ (137)].

31"

484 W. LA~GE~ECK: Untersuehungen tiber die chemisehe Na tu r der Fermente~

Schwierigkeit. An sich wttrde wohl aueh die Isolierung und Analyse eines in- aktivierten Ferments einen wesentlichen Fortschritt bedeuten. Abet auch diese Aufgabe liisst sich nicht durehftihren, da man fiir die Kontrolle der priipa- rativen Arbeit kein anderes Hilfsmittel zur Verfiigung hag als die Aktivitgts- bestimmung. Andererseits kann man aus der Analyse eines Ferments, das noeh mit seinem Triiger behaftet ist, keine Schliisse ziehen, da die Menge des Tr~igers iiberwiegt [vgl. auch WILLSTXTTE~ und SCI~NmDE~ (155)].

Dass Invertin einen katalytiseh nnwirksamen Triiger enthglt, folgt aueh aus dem Verhalten des Ferments im adsorbierten Zustand. Die Tonerde- adsorbate rind - - mit den eben erwiihnten Ausnahmen - - ebenso aktiv, wie das Ferment in L6sung (79, 148). Dasselbe war vorher bei tier Peroxydase gefunden worden (182). Bei diesen Fermenten, so nimmt man an, ist also dieVer- kniipfung mit dem Adsorbens durch Vermittlung des kolloidalen Tr~igers erfolgt.

Ahnlich l~isst sich die Tatsaehe erkl~iren, dass die Affinitiitskonstante der Saccharase-Rohrznckerverbindung (s. o.) veto Reinheitsgrad der untersnehten Pr~iparate vNlig unabhiingig ist [Ku~N (50)]. Die analytiseh naehweisbaren Verunreinigungen (Proteine, Kohlenhydrate) assoziieren sich also nnr mit dem kolloidalen Tr~iger und lassen die reaktionsfiihige Gruppe unbertthrt. Es gibt allerdings Verbindungen nnbekannter Art, welche die Affinitiit stark herabsetzen. Solche Stoffe sind in den Koehsiiften yon Itefen enthalten, deren Invertin eine niedrige Affinitiitskonstante besitzt (81). Naeh KUEN (49) sollen es Zersetzungsprodukte des Invertins sein, welche Affinitiit zur reaktions- fghigen Gruppe besitzen.

Manehe Fermente rind im Gegensatz zur Saceharase im adsorbierten Zustand fast oder YSllig nnwirksam. Sie sind aber aueh im Adsorbat noeh unversehrt, denn bei der Elution kehrt die Wirksamkeit zuriiek. Dieses Ver- halten ist besonders bei den Lipasen, z. B. Pankreaslipase, beobachtet worden (166, 162) 1. Man erkliirt es mit der Annahme, dass sich hierbei die reaktions- l~ihige Gruppe an das Adsorbens anlagert.

Dem Untersehied zwischen Invertin und Lipase bei der Adsorption ent- spricht die Abhiingigkeit der Lipasewirkung yon der Konzentration der Begleit- stoffe (165 und spiitere Arbeiten yon WILLSTXTTER und Mitarbeiter). Die Sehwankungen der Aktivit~it sind so stark, dass man lttr die quantitative Enzymbestimmung die Methode der ausgleiehenden Aktivierung anwenden muss. Besonders gOnstig wirkt ein Zusatz yon Calcinmehlorid und Albumin. W~LLSTXTTEa nimmt an, dass dabei Triigersysteme entstehen, die zugleieh auf Enzym nnd Substrat adsorbierend wirken, naeh folgendem Schema:

CMeinm - oleat - - -Albumin

Fett Lipase.

Die Natur des Tr~igers fibt also im Fall der Lipasen einen starken Einfluss auf die Fermentwirknng aus.

1 Vgl. dagegen die Magenlipase [WILLS~XTW~R und BA~AN~ (138)].

Theor i en des E n z y m b ~ u e s . 485

Besonders ~iberraschend ist die J~ndernng der stereoehemischen Spezifit~t yon Esterasen bei Zusatz yon Fremdstoffen [Rosa und AM~ON (102), BA~ANN und LAEVE~E~Z (3, 4)]. u hat aueh hier die Adsorption der Fremd- stoffe an den Tr~tger einen Einfluss auf das Verhalten des Enzyms. BR~Dm und GE~STNEa (8) haben kfirzlich ein Fermentmodell untersueht, das einen hoehmolekularen Tr~tger, n~mlich Cellulose, enthglt. Der Katalysator wirkte infolge der optischen Aktivit~t des Tr~tgers stereoehemiseh ausw~hlend. Es lag also ebenfalls eine Beeinflussung der reaktionsf~higen Gruppe dutch den Tr~tger vor 1.

2. Die Z w e i - A f f i n i t ~ t s t h e o r i e .

H. v. EuLE~ (23, 16) hat die t typothese aufgestellL dass die hydroly- sierenden Fermente nieht nut eine, sondern zwei spezifische Affinitgten zum Substrat betiitigen. Die Zwei-Affinitgtstheorie wurde am Beispiel der Sac- charase entwiekelt.

Bringen wir Saceharase und Rohrzncker zusammen, so kSnnen sieh naeh v. Eu~Ea drei versch/edene Arten yon Zwischenstoffen bilden, die mii- einander im Gleiehgewieht stehen (I, II, I II) :

Fructose-Glucose Fructose- Glucose Fructose-Glucose I 1 I1 21

i Saeeharase I [ Saecharase~ 2 ['Saeeharase I I II I I I

Ffir die ehemischen Gleichgewiehte Saccharase § :Rohrzucker ~ - I u n d I ~ I I I

folgt nun aus dem Massenwirkungsgesetz, wenn wir I ats Saccharase-Fructose- Glucose und I I I als Saccharase-Rohrzueker bezeiehnen:

[Saccharase-Fructose-Glucosc] [Saccharase] [lgohrzucker] = t~fr ' [ Saceharase-Rohrzueker]

[Saccharase-Fruetose-Glueose] = K~l,

woraus folgt [Saocharase] [/~qhr~IckerJ /iQr [Saccharase-]:~ohrzucker] Kgt

Setzt man [ Saccharase -:Rohrmleker] [Saoeharase] [:Rohrzucker] K ~ ,

so wird K,, = Eft." ~[~gl"

t (~ ist die Affinit~tskonstante der Saecharase-Rohrzuckerverbindung II I ' Kfr die Affinit~ttskonstan~e yon I, Kg~ die yon II.

Nimmt man nun mit v. EULER an, dass die Affinitgten der Saccharase zum Fruetoserest und Glucoserest des Rohrzuckers nieht sehr verschieden sind yon den Affinitaten zur Fructose (K~) und Glucose (K~) selbs% so kOnnen wir setzen :

3 ~ = / i ~ �9 1~: ,a. (1) K~ und K~ kann man, ebenso wie K~, nach Methoden bestimmen, die yon

MIc~a~5is und MENT~N (80, S. 0.) angegeben worden sind. Bei manchen

I m 1V[odell yon B~nDIG u n d G ~ S T ~ R is t e in a s y m m e t r i s e h e s C - A t o m unmittelbar der a k t i v e n Gruppe b e n a e h b a r t , der s t e reoehemisehe E in f lu s s i s t d a h e r besonders le icht zu v e r s t e h e n .

486 W. LA~OEX~EOK: Untersuehungen fiber die chemische Natur der :Fermente.

Saceharasen ist nun tats~chlich die Beziehung (1) durch die Messungen bestatigt worden, bei anderen dagegen haben sich starke Abweichungen ergeben. Vor allem spricht aber gegen die Zwei-Affinitiitstheorie in dieser Form, dass yon den Spaltprodukten des Rohrzuckers nut die Fructose mit dem Rohrzucker um das Ferment konkurriert, w~hrend a-Glucose unabhiingig yon der Substrat- konzentration hemmt [KvIt~ und Mt~c~ (55)]. Aus der Annahme, class beide Affinit~tsstellen, abgesehen yon der Spezifitiit (17), ungef~hr gleichwertig sind, wtirde aber folgen, dass sowohl die Hemmung durch Fructose als durch a-Glu- cose yon der Substratkonzentration abhi~ngen miisste (s. o.).

v. Eu~ER (1.8) hat daher die urspriingl~che Fassung seiner Theorie dahin abgeiindert, dass die Aifinitiitsstellen 1 und 2 eine grundsiitzlich verschiedene Funktion austiben. Zur Bindung des Substrats ist nur Affinit~tsstelle I bef~higt. So entsteht prim~tr das ,,reaktionsvermittelnde Molekfil erster Ordnung" (I), nnd zwar mit nnmessbar grosset Geschwindigkeit, so dass das Gleiehgewicht sieh einstellen kann. Dann folgt die Umwandlung

Fructose-Glucose Fructose-Glucose Fructose-Glucose + @ I1 -+ 11 12

S~cch~r~se I s~coh~sc I I S~och~r~s~ I

in das ,,reaktionsvermittelnde Molektil zweiter Ordnung" (III), welches so labil ist, dass sich ein Gleichgewieht zwischen I und I I I nieht ausbildet. Die Affinit~tt 1 ist streng speziiisch auf lreie oder gebundene Fructose eingestellt, Affinit~t 2 bindet die tibrigen HemmungskSrper. Daher kann durch diese zwar die Konzentration yon I I I vermindert werden, aber die Hemmungs- kSrper lassen sich dutch erhShte Fructosekonzentration nicht yon der Sac- charase abdriingen.

In den letzten Jahren ist die Zwei-Alfinit~tstheorie yon JOSEe~SON und v. Er:LEn (42), WA~DSCHMII)T-LEITZ und BALLS (2, 122) aueh auf die Proteasen angewandt worden. Die Dipeptidase des Darmes sell zu der freien Amino- gruppe und der Iminogruppe des Dipeptids Afiinititt besitzen (vgl. Teit B, Abschn. 3).

Die Zwei-Affinit~tstheorie hat sieh aus der Theorie Yon Miclt~E~is und MENtiON entwickelt. Sie hat mit dieser den Nachteil gemeinsam, dass man keine Katalysatoren kennt, die nach den angenommenen Prinzipien wirken.

3. A k t i v e u n d a k t i v i e r e n d e G r u p p e n .

Wenn man den Gmndsatz annehmen will, dass eine Enzymtheorie nur dann als gesichert gelten kann, wenn sic modellmiissig verwirklicht und damit ehemisch gesttitzt ist, so ist es wohl die Hauptschwierigkeit, die hohe Aktivit~t der Fermente zu erkliiren. Gerade die Hauptvalenzkatalysatoren, die in der Kinetik den Fermenten am niichsten stehen, bleiben in ihrer Aktivitiit besonders weit hinter diesen zurtick. Erst in den letzten Jahren hat man gelernt, aus den einfachsten, wenig wirksamen Katalysatoren solche YOn komplizierterem Bau abet mit verhiiltnismiissig hoher Aktivit~tt zu entwiekeln. Die Aktivierung

Theorien des Enzymbaues. 487

sttitzt sich auf Erfahrungen, die man in der organisehen Chemie seit langem gemacht hat.

Ges~ittigte organisehe Verbindungen sind melstens wenig reaktionsf~ihig, aber man kann sie dadureh aktivieren, dass man sie mit einer unges~ittigten Gruppe verkniipR. So ist die Methylgruppe im allgemeinen nieht geneigt, sieh mit Aldehyden zu kondensieren. Erst wenn wit sie mit einer Carboxyl- gruppe verbinden, wird sie aktiv; Essigs~iure l~isst sieh mit Aldehyden zu un- ges~ttigten Siiuren vereinigen. Ausser solehen Kondensationen lassen sieh aueh andere Reaktionen aktivieren. In der Essigs~iure ist die Carboxylgruppe ziemlieh lest verankert, fiihren wit aber in die Methylgruppe der Essigs~iure eine Carbonylgruppe ein, so wird das Carboxyl leieht abgespalten, die fl-Keto- siiuren sind labil. Es seheint sieh also bei der Aktivierung um eine verbreRete Erseheinung zu handeln. .

Wie wir sehen werden, ist e s ffir die Zweeke d er Katalyse besonders gtinstig, dass die aktivierende Grnppe nieht nnmRtelbar neben der Gruppe zu stehen braueht, die aktiviert werden sell. Zwar nimmt in einer gesiittigten Kohlenstoffkette die Aktivierung mR waehsender Entfernung raseh ab. In der Propionsiiure z. B. ist die endst~tndige Methylgruppe nieht mehr besonders reaktionsfiihig. Man kennt abet Gruppen, die gee~gnet sind, die Aktivierung weiterzuleiten, niimlieh die Kohlenstoffdoppelbindungen und die aromatisehen Kerne [ANGELI (1)]. Z. B. verh~ilt sieh der Glutaeons~iureester (I) iihnlieh wie Malonester (II) (35), nnd DinRrotoluol (III) 15sst sieh wie NRromethan (IV) mit Aldehyden kondensieren (121) 1. Man kann also

(I) mc~ooc - c~r = e~ - c m - cooc~m (III) o , ~ , - ( ~ ) c~r+

(II) mc,ooc - c m - cooc~m ~o~ (IV) o:x - e m

zwisehen die aktive und die akfivierende Gruppe einen Athylenrest oder einen Benzolkern einsehieben, ohne dass die Wirkung versehwindet.

Diese bekannten Erseheinnngen wurden nun yon LANeE~BECK und Mit- arbeitern (72, 73, 59, 74, 66) auf die organisehe Katalyse angewendet. Der Versueh, dureh systematisehe Einffihrung mehrerer aktivierender Gruppen stark wirksame Kaialysatoren zu gewinnen, wurde besonders am Beispiel der Carboxylasemedelle durehgefiihrt (vgl. Reaktion 4, S. 479). Als Katalysatoren dienten prim~ire Amine, die sieh w~ihrend der Reaktion in Aldehyd-imine umwandeln (s. Formel V--VII) . (V) x - ~ = e~ - ~ + ~ - co - cooH ~ ~c~o Die a-Ketos~ture (Brenztrauben- (VI) co, ~ f n - c - eootr s~ure oder Phenylglyoxyls~ure) ~ - x

t verbindet sieh mit dem Amin (VII) x - xE~ + n - co - e o o ~ - -

X - - N H ~ zu einer substitnierten Iminos~ture (VII). Dies ist die einleitende Reaktion, yon da ab beginnt die eigent]iehe Katalyse. Die Iminos~ure spaltet Kohlendioxyd ab (VI), geht dabei in Aldehyd-iminfiber, und dieses

1 i)ber weitere Beispiele vgl. bei W I ~ m (168).

488 W. LA~QE~rBECK: Un te r suchungen fiber die chemische N a t u r der Fe rmen te .

setzt sich mit tibersehiissiger Ketos~ture wieder zur Iminosiiure um (V). Das Aldehyd-imin wird also stets rogeneriert und ist deshalb der wahre Kata- lysator.

Boim einfachsten primiiren Amin, dem Methylamin, war die Anfangs- geschwindigkoit noch sehr klein. Ffihrte man in die Methylgruppe Sub- stituenten ein, so wuchs die Aktivit~it mehr odor weniger, je nach der Natur der neuen Gruppo. Einftihrung der Carboxylgmppe bewirkte die stiirkste Akti- vierung, beim Glykokoll war die Anfangsgeschwindigkeit auf den 20faehen Wert gestiegen. Nun wurde an der Methylengruppe wetter substituiert. Die Phenylaminoessigsiiure zeigte das gfinstigste Ergebnis. In die Phenylgruppe liessen sich leieht neue aktivierende Gruppen einfiihren. Am wirksamsten erwies sieh eine Aminogruppe in 0rthostellung. Diese Substitution war ver- knfipft mit einer intramolekularen Wasserabspaltung, sie ffihrte zum 3-Amino- oxkndol, das etwa 20mal so wirksam war wie Amino-oxindol. Endlieh gab 6,7-Benzo-3-amino-oxindol die doppelte Kohlendioxydmenge wie Amino- oxindol (Formeln VI I I - -XI I ) . Somit war die Aktivierung 4mal gelungon, mit ether Gesamtzunahme der Aktivit~it aug das 20001ache.

CH~--NH2 -~ CH~--NH2 -+ H--NH2 -+ I ] C O --> ] ] CO I

co OH CO oI{ \/\/ /\/\ / NH

(VIII) (IX) (X) ~/J (xi) (XlI)

Man dari vermuten, dass die Akfiviemngsreihe damit noeh nieht ab- gesehlossen ist. Gin g'rundsgtzliehes Hindernis wfirde es sein, wenn die akti- vierenden Gruppen, um wirksam zu sein, in unmittelbarer N~ihe der aktiven Gruppen stehen mfissten, denn dann kSnnte man nur eine besehriinkte Anzahl in das Molektil einftihren. Glticklicherweise ist das, wie wir gesehen haben, nieht der Fall. Man kann Aktivierungen dureh Benzolkerne hindurch iiber- tragen, wodureh Raum ffir neue aktivierende Gruppen gesehaffen wird. Sehon im Benzo-amino-oxindol (XII) ist sine aktivierende Gruppe, der kondensierte Benzolkern, ziemlieh weir yon der Aminogruppe entfernt. Allerdings waehsen die Sehwierigkeiten sehr sehnell an, sobald man zu gr6sseren Molekfilen kommt. Da die Zahl der Isomeren mit der Molekfilgr6sse wiiehst, hat man zwisehen vielen M6gliehkeiten die Wahl zu treffen. Ferner troten hiiufig priiparative Sehwierigkeiten aug. So kann der Fortschritt in diesem Stadium nur langsam seth, zumal es vorl~iufig keine exakten Beziohungen zwisehen Konstitution und Reaktionsgesehwindigkeit gibt, die es gestatten wfirden, die Wirkung ein'er aktivierenden Gruppe vorauszusagen [vgl. HOC~EL (40)].

Auf Grund dieser Versuehe stellt LANOn~BnCK (64) fiber den B a u d e r Fermente folgendo Arbeitshypothese auf: Im Sinne der WiLLSTX~mnnschon Theorie ist mit einem kolloiden Tr~iger das eigentliehe Fermentmolekfil ver- bunden. Dieses wird als prosthetische Gruppe bezeiehnet, ein Name, der aueh

Theorien des Enzymbaues. 489

fr(iher schon h~iufig gebraucht worden ist. ,,Die prosthetische Gruppe enth~ilt eine oder wenige aktive Gruppen, die unmRtelbar mit dem Substrat in Reaktion treten. Sie werden reaktionsf~hig gemacht durch eine grSssere Zahl yon aktivierenden Gruppen. Diese reagieren nicht unmRtelbar mR dem Substrat, sie bleiben w~hrend der Fermentreaktion vSllig unverandert und wirken auf den Reaktionsverlauf nur mRtelbar ein, indem sie der aktiven Gruppe die hohe Wirksamkeit verleihen, die ftir die Fermente charakteristisch ist."

Neben den synthetischen Ergebnissen sprechen auch manche Hemraungs- versuche an den Fermenten selbst far die AnwesenheR yon aktiven und akti- vierenden Gruppen (65). Wohl nur mit Hilfe der nenen ttypothese zu deuten sind diejenigen Hemmungen, die in gewissen Grenzen unabh~ingig yon der Konzentration des HemmungskOrpers sind nnd bei denen nur ein ganz be- stimmter Prozenisatz der WirksamkeR verschwindet. Erepsin wird durch Phenylhydrazin nur etwa zur II/ilRe gehemmt [JosEPIISON und v. EULEB (43)],

auch Saceharase wird durch Jod momentan um 50 % geschwgcht, unabh~ingig

yon tier zugegebenen Jodmenge; vOllige Inaktivierung finder dann viel lang- samer start Iv. Eun~B nnd MRarbeRer (28, 19)]. Die Hemmung der Carboxylase durch Phenylhydrazin schein~ ebenfalls zu dieser Gmppe zn gehSren 1. Im Sinne der neuen Arbeitshypothese reagieren die HemmungskSrper mit den aktivierenden Gruppen und vermindern damit deren Wirkung. So ist es ver- stiindlich, dass Hemmungen dieser Art aueh bei hoher Konzentration des tIemmungskSrpers nicht vollst•ndig sind, sondern nut bis zu einem bestimmten Grenzwert gehen. Da viele aktivierende Gruppen im Fermentmolekiil ent- halten sind, legt die Aussehaltung einer oder weniger derselben die aktive Gruppe nicht vSllig lahm, sondern vermindert nut ihre ReaktionsighigkeR. So kann man vermuten, dass z. B. diejenigen Fermente, die dutch Phenyl- hydrazin zu einem gewissen Prozentsatz gehemmt werden, eine oder mehrere aktivierende Carbonylgruppen im Molektil tragen.

Als Modell far diese Art Hemmung kann es geRen, dass Amino-oxindol (XI) bei der Methylierung der NIL Gruppe (XIII) an Wirksamkeit einbiisst (74).

/ \ - - c ~ - x m ( \ - - c u - c e ~ Wenn wit die frfiher abgeleRete Ge- l I ~o -~ J r co schwindigkeRsgleichung \ / \ / " , , / \ /

N H N k [X'J - [ABJ l v~ k kq C t ~ k~- + ~ []3] + lAB]

(XI) (XIII) aui diese t temmungen anwenden, linden wir fiir den Fall, dass beide Teilreaktionen gleiehm~issig gehemmt werden, kks also unveriindert bleibt, den ttemmungskoeffizienten unabh~ingig yon der Substratkonzentration, denn dann gilt flit die AnfangsgesehwindigkeRen ([B] = o):

Vo -- v" k- k" h

vo k

1 W. LA~rG1S~CK (bisher unver5ffentlieht).

490 W. LANGENBECK: Untersuchungen fiber die ehemische Natur der Fermente.

V' ist die Gesehwindigkei~ der gehemmten Reaktion, k' die Gesehwindigkeits- konstante der gehemmten Teilreaktion (2) (vgl. S. 480) 1. Vielleicht gehSren aueh manehe reversiblen ,,Hemmungen zweiter Art" zu diesem neuen Hem- mnngstyp. Man mtisste dann annehmen, dass sieh der HemmungskSrper locker an die aktivierenden Grnppen anlagert%

B. Untersuchungen fiber die Konstitution einzelner Fermente.

1. Dureh A d s o r p t i o n g e r e i n i g t e F e r m e n t e .

W~LLSrXTTER und seinen Sehtilern verdanken wir die Ausarbeitang yon Methoden der Adsorption und Elution, mit denen es gelingt, die Fermente yon analytiseh naehweisbaren Verunreinigungen aus der Gruppe der Proteine und Kohlenhydrate zu befreien. Bezfiglieh der Methodik set auf andere Refe- rate verwiesen [z. B. KaAvr (46)], bier mtissen wir nns mit einem ttinweis auf die Literaturstellen begnfigen, naeh denen Fermente fret Yon Kohle- hydraten und Eiweiss erhalten wurden.

Besonders eingehend ist die Saeeharase untersueh~ worden. WILLSTXTTE~ hat sieh bewusst darauf besehr~nk% ,,das Enzym immer yon denjenigen Begleit- stoffen zu befreien, die auf Grund yon Analysen weniger reiner Pri~parate als wesentlieh ftir die Zusammensetzung und Natur des Enzyms galten" (135). So hatten v. EVSER und JosE~msoN (20, 21, 22, 24) ein tryptophanhaltiges Protein als wesentlichen Bestandteil der Saeeharase angesproehen. Demgegen- fiber konnten WILLSTXTTEa und Mi~arbeiter (157, 160, 134) zeigen, dass sieh Saeeharase ohne Sehaden ffir die Aktivitiit vom Tryptophan befreien l~sst. Solehe negativen Fes~stellungen sind fiir die Kenntnis der Fermente ungemein wiehtig. Sie entziehen yon vornherein allen denjenigen Hypothesen den Boden, welehe die Fermente als bekannte Stoffe yon besonderem Verteilungszustand betraehten wollen.

Saecharase wurde ferner befrei~ yon anderen Eiweissstoffen und dem Tr~ger der MiLLON-Reaktion (149, 151, 142, 167, 154, 156), yon tIefegummi (167, 156, 159) und yon fast allem Phosphorgehalt (141), Peroxydase yon Eiweiss (146) und der t tauptmenge des Phosphors (147), Pankreaslipase yon Eiweiss, Kohlehydraten und der Hauptmenge Phosphor (163), Magenlipase yon den Tr~gern der MiLsox- und Tryptophanreaktion (139), Leberesterase yon Kohle- hydraten und den Tri~gern der MILLO~- und Biuretreaktion (47), Pankreas- amylase yon Eiweiss und fast allen Kohlehydraten (164, 127).

Enthalten nun solehe weitgehend gereinigten Pri~parate sehon einen hohen Prozentsatz yon aktivem Ferment, oder bestehen sie noeh zur tiberwiegenden Menge aus Verunreinigungen ? WILLSTXTTER (136) i~ussert sieh dazu folgender-

k 1 Bleibt ~ dagegen nieht unver~ndert, so muss h yon der Substratkonzentra~ion ab- h&ngen.

2 Vgl. die verwandten Anschauungen anderer Forscher [G!~ASSM~t~-~ (32), B),MANN und LAEW~E~Z (4)].

Untersuehungen fiber die Konstitution einzelner Fermente. 49i

massen: ,,Es ist wat~rseheinlieher, dass die Enzympr~parate, die sieh der Best~ndigkeitsgrenze n~hern, die keine Eiweiss- und keine anderen Gruppen- reaktionen mehr geben, die aber noeh nahe verwandte Stoffe enthaRen mtissen, Vorstufen und Zersetzungsprodukte der aktiven Substanzen, sehon stark angereiehert sind 1.,,

2. K r y s t a l l i s i e r t e Fe r rnen te .

SUMNER (110, 111, 115, 116, 117, 118, 119, 112, 113) gelang es im Jahre 1926, aus Jaekbohnen ein .kryst~llisiertes Protein darzustellen, das starke Ureasewirkung besass. Die Darstellung beruhte auf der LSsliehkeit des Fer- ments in w~tssrigem Aceton. Beim Abkfihlen der ges~ttigten LSsung auf 0 ~ krystallisierte die Urease aus. Das Produkt liess sieh umkrystallisieren dureh LSsen in Wasser und Zugabe yon Aeeton und Phosphatpuffer.

Die EigensehaRen des Ferments sind etwa folgende: Es krystallisiert seharf in kleinen Oktaedern yon 4--5 # Durehmesser. Die Krystalle sind zwar in reinem Wasser ]Sslieh, aber doeh als Globulin zu betraehten, da sie in der N~ihe ihres isoelektrisehen Punktes erst naeh Zusatz yon Salzen in LSsung gehen. Das Pr~parat gibt alle Proteinreaktionen und koaguliert beim Erhitzen. Es ist ~usserst empfindlieh gegen Spuren yon Sehwermetallionen. LSst man es in Wasser, das dutch ein verzinntes Kupferrohr destilliert worden war, so versehwindet die Wirksamkeit sehr raseh.

Die Zusammensetzung ~indert sieh beim Umkrystallisieren nur wenig, naeh zweimaligem UmlSsen finder man: C 51,6, H 7,1, N 16,0, S 1,2%. Das ist die typisehe Zusammensetzung eines Proteins.

1 g krystallisierte Urease enth~lt etwas mehr als 100000 Ureaseeinheiten. Die Ureaseeinheit wird definiert als diejenige Fermentmenge, die bei 20 ~ und p~ 7,0 in 5 Minuten 1 mg Ammoniakstiekstoff aus Harnstoff in FreiheR setzt.

Die Gewinnung der krystallisierten Urease gelang infolge des hohen Gehaltes der Jaekbohnen an Ferment. Gute Bohnen enthalten etwa 0,12%, Sojabohnen dagegen nut 0,01% und Hanfsamen gar nur 10-5%. Aus diesen Zahlen geht hervor, wie wiehtig es ist, das riehtige Ausgangsmaterial zu w~hlen.

Mit ~hnliehen Methoden konnte No~T~mOP (88--92) im Jahre 1929 krystallines Pepsin gewinnen. Als Ausgangsmaterial diente ein k~ufliehes Pepsinpr~parat (,,U.S.P.-Pepsin 1:10000"), das zun~ehst naeh PEKEL~A~INe (97) in saurer L6sung dialysiert ~vurde. Das ausfallende Produkt war sehon kSrnig und gut filtrierbar, also seheinbar halbkrystallin. Eine w~ssrige Sus- pension wurde auf 450 erw~rmt, filtrierg und das Filtrat langsam abgek~ihlt. Damit ersehienen die Krystalle, kleine zu Gruppen vereinigte Hexaeder.

Sparer wurde zur Herstellung grSsserer Mengen die Dialyse vermieden. Start dessen wurde das Ausgangsmaterial in Wasser getSst und mit Sehwefel-

Neuere Untersuehungen, besonders an den h~minhMtigen Fermenten, spreehen gegen diese Ansieht.

492 W. LANGI~NBECK: Untersuchungen fiber die ehemisehe Natur der lq'ermente.

siure und Magnesiumsulfa% mehrmals umgef~llt. Endlieh wurde das Ferment bet 450 gelOs%, filtriert, mit Pepsinkrystallen angeimpft und langsam ab- gekfihlt. Auf diese Weise hat No~T~OP im ganzen etwa 2 kg krystallines Pepsin dargestellti Die Zusammensetzung war: C 52,3, H 6,66, N 15,5, S 0,88, P 0,078, C1 0,23%.

Das Ferment wird in alkaliseher LSsung raseh, in saurer langsam inaktiv. Dabei wird das inaktivierte Ferment dutch das noeh wirksame hydrolysiert, es krystallisiert Tyrosin aus. Aus den friseb bereiteten LSsungen fallen 98 bis 99 % des Gesamtstickstoffes als Eiweissstickstoff aus, wenn man mit Sehwefel- siure and Natriumsulfat bet p~ 3 erhitzt oder mit Ammonsulfat s~ttigt.

Die Aktivit~tt wurde ira allgemeinen dureh Formoltitration bestimmt. Die proteolytisehe Einheit (proteolytic unit, P.U.) ist diejenige Fermentmenge, die bet 35,5 e, optimalem p~ (2,0--2,5) und 5 % Substratkonzentration 1 Milli- ~quivalent C00Ig in der Minute freimacht. Die Aktivit~t wurde ausgedriiekt in proteolytisehen Einheiten pro g Fermentpr~parat ([P.U.]gm). Diese Werte weehselten mit dem angewandten Substrat. Mit krystallinem Pepsin wurden folgende Zahlen erhalten (eingeklammerte Zahlen sind die [P.U.]gm-Werte fttr das Ausgangsmaterial):

Casein . . . . . 14 (2,5) Gelatine . . . . . 0,17 (0,075) Edestin . . . . . 28 Eieralbumin . . . 9 (4,5)

Aus Diifusionsversuchen wurde das Molekulargewicht des Ferments zu 30000 bestimmt. Daraus bereehnet sich, dass ein Pepsinmolek/il in 1 Minute 1000 - -C0--NH-Bindungen spaltet, wenn Edestin als Substrat gewiihlt wird.

Aktivitat und Zusammensetzung des Ferments blieben bei mehrmaligem Umkrystallisieren innerhalb der Fehlergrenzen konstant. Aueh sonst verhielt sieh das Pepsin wie ein einheitlieher Stoff, z. B. ging die Aktivit~t and die optisehe Drehung der LSsungen genau parallel ihrem Stiekstofigehalt. Die Inaktivierung der Fermentwirkung war der Denaturierung des Ferment- proteins dureh Alkali oder Hitze proportional. Aueh das krystalline Pepsin hatte also die Eigensehaften eines Proteins.

Als drittes Ferment 1 endlieh ist das Trypsin in krystalliner Form erhalten worden, and zwar ebenfalls yon NorThrop, gemeinsam mit KuNITz (94--96). 150 kg Pankreas warden gefroren, zerkleinert, naeh dem Auftauen abgepresst und der Salt mit Salzs~ture und dann mit Ammonsulfat fraktioniert ge~_~tllt. Der letzte Niedersehlag wurde gelSst und kurz auf 900 erwarmt, wobei ein inaktiver Proteinteil ausfiel. Die LSsung wurde raseh wieder abgekfihlt und mehrmals mit Ammonsulfat umgefiillt. Bei der letzten Fraktionierang wurde die L6sung mit Trypsinkrystallen angeimpft und sehr langsam mit Ammon- sulfat gef~tllt. Ausbeute 20 g Krystalle.

1 0 b e r krystallisierte Pankreasamylase: CALDWELL, ]~OCHER und S ~ I A ~ (11). Vgl. dazu WAnDSCmml)T-LEITZ und t~EIC~EL (127).

Untersuchungen fiber die Konstitutlon einzelner Fermente. 493

INO~aTIr und K~NITZ haben auf ~hnliehe Weise wie beim Pepsin gezeigt, dass jede Ver~inderung, die das krystalline Protein erleidet, aueh die tryptische Wirksamkeit verringert. Eine besonders merkw~rdige Eigenschaft des Ferments ist seine Temperaturbest~ndigkei~. Es l~isst sich kurze Zeit kochen, ohne dass nach dem Abkfihlen die Aktivit~it sich vermindert hat. Bet n~therer Untersuchung zeigte sieh, class das Protein beim Erhitzen reversibel denaturiert wird. Entspreehend wird Casein durch eine Trypsinl6sung bet 800 nich~ abgebaut, w~ihrend nach dem AbkOhlen die Aktivit~it wieder er- scheint. Naeh l~ingerem Erhitzen in verd~innter S~iure verschwindet die Akti- vitiit endgiiltig, und entspreehend erleidet das Protein eine irreversible Denatu- rierung.

Merkwiirdigerweise wird NOaT~ROPs krystallines Trypsin yon Entero- kinase nicht aktiviert.

Es ist nun zu diskutieren, ob die drei krystallinen Fermente wirklich als einheitliche Sioffe zu betrachten sind oder nicht, ferner, ob alas Protein der katalytisch wirksame Bestandteil der Fermente ist oder sie nur als kolloidaler Tr~iger stabilisiert.

WALDSe~ID~-LEITZ und STEIGERWAL9 (129) haben gezeigt, dass man SU~NERs krystalline Urease mit versehiedenartigen proteolytisehen Fermenten abbauen kann, ohne class die Ureasewirkung gesehwiicht wird. Danach w~ire das Globulin nut als Tr~iger der Urease zu betrachten.

BR~2C~E (10) und SU~DBE~G (120) haben sehon vor vielen Jahren Pepsin- pr~iparate hergestellt, die nut wenig oder kein Eiweiss enthielten. Wahrschein- lich sind sowohl die Pr~tparate yon BReeZE und SU~DBERG, als auch das yon 1YOaTERO~ keine einheitlichen Substanzen. NORT~OPs Pepsin w~ire nach dieser Annahme mit viel Protein verunreinigt, B~i~c~Es und SU~DBE~Gs Fer- mente mit viel anderen kolloiden FremdstoffenL Eine ~ihnliehe Erkl~irung ver- iangt die Tatsaehe, dass Pr~parate yon I ~ E ~ A ~ (97) und yon R~NO~a (101) frei yon Phosphor waren, w~thrend N o ~ O l ~ s Pepsin Phosphor enthielt.

Aus den Messungen yon NORT~O~ am Pepsin bereehnet ~ieh, dass ein Pepsinmolekiil in der Minute 1000 Proteinbindungen spaltet. Nimmt man mit KuH~, tt~ND und F ~ o ~ N (53, 54) an, dass H~imin die aktive Gruppe der Peroxydase ist, go geht aus dem H~imingehalt gereinigter Peroxydase hervor, dass ein Peroxydasemotekfil in der Minute 6 Millionen Molekiile Wasserstoff- peroxyd ~msetzt. Danach miisste Peroxydase 6000real so wirl~sam sein wie Pepsin. Aueh diese Zahlen sprechen gegen die Annahme, dass No~T~oPs Pepsin ein einheitlieher Stoff isi.

In jfingster Zeit haben W~DSC~n)T-LE~TZ und K O F a ~ (125) durch interessante Versuehe diese Ansicht best~tigt. Sie schiittelten L6sungen yon 8,5 mg krystaltisiertem Pepsin mit einem schwer l~sliehen, ebenfa~ls krystallinen Globulin aus Cantaloupesamen (Cucumis melo). Dabei zeigte sich, dass je

Vgl. W I ~ S ~ T ~ (152).

494: W. LANGEN~EeK: Untersuchungen fiber die chemische Natur der Fermente.

naeh der Zahl der durchgeftihrten Adsorptionen, 40--94% des Pepsins yon dem pflanzlichen Globulin adsorbiert wurde. Dabei war aber das Pepsin- protein nieht mitadsorbiert worden, denn das Trockengewieht der ResilOsung war gleieh der Summe aus dem Gewieht des angewandten Pepsins und des- jenigen Teiles vom Canatlonpeglobulin, der in LOsung gegangen war. Die LOsliehkeit des pflanzlichen Globulins in Wasser war dutch Kontrollversuche bestimmt worden. Von den 8,5 mg Pepsin kommt also nut ein unwi~gbarer Anteil auf das eigentliche katalytiseh wirksame Enzym. Dieses ist bet den Versuehen yon dem nattirliehen Trigger auf ein pflanzliehes Globulin iiber- tragen worden.

Soweit man aus der vorli~ufigen Mitteilung yon WAnDSOJ.I~IIDT-LEITZ uad KOFRANYI ersehen kann, ist damit wohl der endgiiltige Beweis erbraeht, dass das krystalline Pepsin yon No~TaRoP zum gr6ssten Teil aus katalytiseh unwirksamen Tri~gersubstanzen besteh~. Man kann vermuten, dass es sieh mit den anderen krystallinen Fermenten der amerikanisehen Forseher ~hnlich verhi~lt. Das seheinbar einheitliehe Verhalten der Krystalle wiirde dann als loekere Bindung des Ferments an das Protein zu erklgren sein. Die M6gliehkeit, dass das Protein nieht der katalytiseh wirksame Bestandteil des Ferments, sondern nur der Trgger ist, haben tibrigens sowohl SuM~E~ (114) wie NOrTHrOP (93) zugegeben.

3. D i pe p t i da se .

Aus Versuehen yon v. EuL~R und JosnP~sos (27, 42) einerseits und WALDSeg~IDT-LEITZ und Mitarbeitern (128,128, 124) andererseits geht hervor, dass nut solehe Dipeptidderivate yon Darmerepsin gespalten werden, deren Aminogrnppe fret ist. Die Antoren haben daraus den Sehluss gezogen, dass die Aminogruppe an der Bindung des Ferments beteiligt ist, und haben diese Annahme dutch weitere Experimente zu stiitzen gesueht. Carboxylgruppen reagieren bekanntlieh besonders glatt mit Aminogruppen, man konnte also daran denken, dass die Dipeptidase eine Aldehydgruppe enthglt und dass die Bildung einer ,,SCHIFFsehen Base" mit dem Dipeptid den primi~ren Vorgang der Enzymreaktion darstellt.

In der Tat wird Dipeptidase dutch Carbonylreagentien wie Phenyl- hydrazin, Natriumbisulfit und Blausi~ure gehemmt [JosEPHSON und v. EuLEa (42)]. Auffallend ist allerdings, dass die Itemmung dureh Phenylhydrazin keineswegs vollsti~ndig ist, wie man nach dem quantitativen Verlauf aller Hydrazonbildungen erwarten sollte, sondem nur die ttiilfte der Enzymwirkung zum Versehwinden bringt. Diese Hemmung ist deshalb yon LANGEZqB~eg (66) anders gedeutet worden, wortiber oben beriehtet wurde (vgh S. 489).

v. EuLEa und K. JosnPitSO~ (26, 41), WALnSegMIDT-LmTz und RAVetI- ALLES (126) haben lerner gezeigt, dass bet der Kondensation yon Aminos~turen oder Dipeptiden mit Aldehydzuekern die Anfangsgeschwindigkeit ein deut-

Untersuchungen fiber die Konstitution einzelner Fermenfe. 495

liehes p~-0ptirnurn besitzt. Wendet man Dipeptide an, so stirnmg das pe- 0ptimurn fiir die Anfangsgesehwindigkeit der Kondensation iiberein mit dern pE-0ptirnum der enzymatisehen Dipeptidspaltung (126). Die Kondensate aus Glucose und Dipeptid werden yon Dipeptidase niehi gespalten. Aus diesen Versuehen wird gesehlossen, dass Dipeptidase eine Aldehydgruppe besitzt, mit der sic sieh an die Aminogruppe des Dipeptids anlagert. Glucose wird also gewissermassen als Modell der Dipeptidase betraehtet. Es ist aber hervor- zuheben, dass es sieh hier nicht um ein katalytisch wirksames Modell handelt. Die Beweiskraft dieser Versuehe wird dadureh wohl etwas eingesehr~nkt.

4. Carboxylase und Carboligase.

Auf S. 479 und 487 haben wir Katalysatoren kennengelernt, die ebenso wio Carboxylase a-Ketos~iuren in Aldehyd und 14ohlendioxyd spalten und aueh in ihrer Kinetik rnit der Carboxylase tibereinstirnmen. Alle diese Katalysatoren enihalten eine freie Aminogruppe, die in der katalytischen Reaktion zur Aldehyd-irninogruppe wird. Der Sehluss, dass aueh die Carboxylase eine Arninogruppe enth~ilt, wird sieh offenbar mit urn so grSsserer Wahrseheinlieh- keit ziehen lessen, je aktivere Katalysatoren synthetisch dargestellt werden. Des Ziel ist, sich der Aktivit~t der Ferrnente irnrner rnehr zu n~hern.

Noeh auf einern anderen Wege l~isst es sieh wahrseheinlieh maehen, class die Carboxylase ein prirn~ires Arnin ist. Wenn es gelingt zu zeigen, dass die Modelle ausser in der Kinetik in mehreren Eigentiirnliehkeiten rnit dern Ferment tibereinstirnmen, wird der Einwand, dass vielleieht aueh andere aktive Gruppen Carboxylasewirkung hervorrufen kSnnen, nieht rnehr stieh- haltig sein. Es ist unwahrseheinlieh, dass zwei verschiedene aktive Gruppen bis in alle Einzelhoiten dieselba Wirkung hervorbringen. In der Tat ist gerade die Carboxylase zu solchen Vergleiehen besonders geeignet, well sic zwei ganz verschiedene Reaktion~n ]~ervorruft, die Spaltang der Brenztraubens~ure und die Bildung yon Acyloinen.

Bekanntlieh entsteht Aeetoin, wenn man Brenztraubens~ure bet Gegen- wart vet,. Aeetaldehyd verg~ren l~isst (37, 86a). Aeetaldehyd allein aber liefert mit Here kein Aeetoin. Das eine Molekfil Aeetaldehyd muss also mittels Carboxylase aus Brenztraubens~iure gebildet werden und lagert sieh in statu naseendi an ein anderes fertiges Molekiil Aldehyd an. Aeetoinbildung und Spaltung der Brenztraubensgure sind eng miteinander ~-erkntipft.

Ftir nnsere Problemstellung ist es vorlgufig nieht n0tig, zu entseheiden, ob man rnit NEUBE~G und HIRSCH (85) die Aeetoinbildung einern besonderen Ferment, der Carboligase, zusehreiben will, oder ob man es mit I)I~SC~ER~ (13) und LANGENBEC~: (70) als wahrseheinlieher ansieht, dass die Carboxylase allein die Aeetoinbildung bewirkt. Auf jeden Fall wird derjenige Katalysator eher rnit der Carboxylase zu vergleiehen sein, bei dessen Wirkung zugleieh Aeetoinbildung beobaehtet wird.

496 W. LANGENBI~CK: U n t e r s u e h u n g e n f iber die e h e m i s e h e N a t u r de r Ferment , e.

E. und J. MtdLLER (83) haben gezeigt, dass man mit kolloidalem Osmium Brenztraubens~ture in Kohlendioxyd und Aeetaldehyd spalten kann. Dabei entsteht aber kein Aeetoin [ D I R S C H E R L (14)]. Dagegen hat DIRSCHERI~ (]5) bei der Einwirkung yon Aminosiinren auf Brenztraubensiiure beobaehtet, dass einige Prozent des entstandenen Aldehyds sieh zu Aeetoin zusammenlagern. Offenbar stehen also die yon LANGE~ECK entdeekten Katalysatoren dem Ferment viel naher als das kolloidale Osmium.

Den Mechanismus der Aeyloinbildung durch primate Amine haben L~E~BECK, H~:TSC~E~: rER und J t ~ T E ~ N (73, 70) am Beispiel der Ein- wirkung yon Anilin auf Phenylglyoxyls~nre aufgeklart. Bei dieser Reaktion entsteht ausser Benzaldehyd, Benzalanilin und Kohlendioxyd ein stiekstoff- haltiges Nebenprodukt, dessen Konstitution sieh dureh Synthese beweisen liess. Man erh~It ihn n~mlieh, wenn man Benzoin-anil-anilid mit Benzaldehyd

(I)

(II)

erhitzt (I): C6II+I ?+1~5 C = N - C+I-15 C--N~C+I~+

C - N/--C~5

C6Yf~

? +:I::I:+ % ~ s I

C = N--C+H~ CO I + 2 C.II+--CO--COOll --> + § 2 C~H~--C-COOI~

I I N-C+~+ C+II+ C+I-I+

Daraus kann man sehliessen, dass bei der katalyfischen SpaRung yon Phenyl- glyoxyls~iure mit Anilin prim~tr Benzoin-anil-anilid entsteht. Dieses wird nun yon fiberschfissiger Phenylglyoxyls~ure in Benzoin verwandelt (II), w~h- rend mR Aldehyd der Ringsehluss znm Imidazo]derivat eintritt (I).

Ubertr~tgt man diese Ergebnisse anf die SpaRung der Brenztrauben- s~ture mR Carboxylase, so erh~lt man die Reaktionen (III--V), die si~mtlieh durch Modellversuehe verwirklicht sind: cooE (III) cos I +

12 = N--X - - ~ e - CH = N--X - Cl~3 Cla[~ , 1 ~ _ . , ( V ) '

cm cm (IV) ~ c = ~ x co ] + 2 CII3--CO--COOII - - - - > ]

~ CII--NIIX C]IOII Cl{ = N - X J I [

I CH~ CH~ C1~+

Dieses Schema deutet die Acetoinbildung ohne Annahme eines besonderen Ferments Carboligase. Es steht u. a. mit der Tatsache in Ubereinstimmung, dass Aeyloine, die dutch Here gebildet werden, optisch-aktiv sein kSnnen. Das Aeyloin wird n~mlich aus einer Verbindung mit Carboxylase in Freiheit gesetzt; ist diese optiseh aktiv, so kann sie ihre Asymmetrie auf das Aeyloin tibertragen.

Bemerkenswert ist ferner die Ubereinstimmung der Carboxylasemodelle mit dem Ferment in ihrer Spezifitgt. N~UBERG und WmNMANN (87) haben die interessante Beobaehtung gemaeht, dass Trimethyl-brenztraubens~ure (VI)

Untersuchungen fiber die Konsti~ution einzelner Fermente. 497

yon Carboxylase nicht merklieh angegriffen wird. Aueh Benzo-amino-oxindol reagiert nieht merklich mit dieser Si~ure. Die ausgepri~gte strukturehemische Spezifit~t zeigt sieh also sehon bei den einfaehen Modellen. Die Tr~gheit der Trimethyl-brenztraubensi~ure wird man am besten als sterische Hinderung deuten k~nnen. Dutch die Naehbarschaft des quatern~tren Kohlenstoffatoms wird die Carbonylgruppe behindert eine Iminos~ure zu bilden, ganz ~hnlich, wie das Pinakolin (VII) viel langsamer mit Phenylhydrazin reagiert als Aceton.

(VI) ( c ~ 0 ) ~ c - c o - c o o ~

(VII) (c~,),o-co-c.~

Methyl-~thyl-brenztraubens~ure (VIII) wird sowoh] yon Carboxylase (86) wie yon den synthetisehen Katalysatoren 1 angegriffen.

Die nntersuehten prim~ren Amine stimmen also mit der Carboxylase in ~ier verschiedenen Eigenschaften ttberein: ]. Im Reaktionsverlauf (Brenz- traubens~ure wird in Aeetaldehyd und Kohlendioxyd gespalten), 2. in der Kinetik, 3. in der Acy]oinbildung, 4. in der Spezifit~t. Deswegen kann man mit grosser Wahrseheinlichkeit sehliessen, dass die aktive Gruppe der Carbozylase eine Aminogruppe ist.

1 W. LAI~GENBECK, bisher unver6ffent l ich<

Asher-Spiro, ~Ergebnlsse der Physiologle und exper. Pharmakologle. 35. 32