Utilizarea introgresiunilor genetice in biotehnologii

Introgresiune -  formare de hibrizi interspecifici fertili, ca urmare a pătrunderii unei gene străine în genofondul unei populații. (< engl. introgression) 

Biotehnologie - Orice aplicaţie tehnologică care utilizează sisteme biologice, organisme vii sau derivate ale acestora, pentru a crea sau modifica produse sau procese în scopuri bine determinate. Biotehnologia vegetală creează culturi cu caracteristici îmbunătăţite, ca de exemplu plante care produc cantităţi mai mari de alimente sănătoase cu mai puţină apă şi mai puţine erbicide/pesticide.

Iniţial, agricultorii şi cultivatorii au creat noi plante prin încrucişare, adică prin amestecarea genelor, care are ca şi rezultat variaţia, un rezultat care însă nu poate fi controlat. Pe de altă parte, biotehnologia ne permite să definim caracteristica dorită şi să introducem gena care o exprimă, pentru a obţine o ameliorare a plantei respective.

Sunt relativ puţine lucrări care abordează, în mod critic, problema metodelor utilizate pentru transformarea genetică a plantelor (Potrykus, 1991), respectiv a mecanismelor  biologice care permit transferul şi integrarea unui fragment de ADN străin într-o celulă vegetală ţintă. In numeroase laboratoare s-a reuşit transformarea genetică a diferitelor specii de plante, fie ele plante model cum ar fi tutunul ( Nicotiana tabacum) sau petunia ( Petuniahybrida), sau dimpotrivă plante considerate recalcitrante dar de un mare interes economic,cum ar fi soia sau unele cereale. Pentru o anumită specie de plante poate fi aplicată eficient o metodă de transformare genetică, sau mai multe.

Pentru o specie cum ar fi Arabidopsis thaliana, specie model pentru cercetările degenetică moleculară, al cărui genom a fost deja cartat în întregime, se pot aplica cu succes, în funcţie de scopul urmărit,   mai multe metode de transformare genetică: transformare a seminţelor, a explantelor radiculare  sau chiar a inflorescenţelor in planta, cu ajutorul vectorului Agrobacterium tumefaciens, transformarea directă a protoplastelor, metoda biolistică sau microinjectarea. Din păcate, însă, nu se pot aplica cu aceeaşi eficienţă diferite metode la specii considerate recalcitrante, iar celulele ţintă pentru transformare nu sunt întotdeauna cele care posedă totipotenţialitate şi deci pot regenera plante întregi. Mai mult,eficienţa transformării este dependentă nu numai de specie, dar chiar şi de genotip. De aceea, găsirea unei metode general aplicabile care să permită transformarea eficientă şi de rutină a tuturor genotipurilor şi speciilor de plante dorite de experimentatori, rămâne un obiectiv al cercetării din acest domeniu. Metodele de transformare pot fi clasificate în metode indirecte, bazate pe utilizarea unor vectori de ADN, şi metode directe .

Metode indirecte de transformare a plantelor Transformarea mediată de AgrobacteriumBacteriile din sol,  Agrobacterium tumefaciens şi Agrobacterium rhizogenes realizeză ceea ce adeseori s-a numit “inginerie genetică naturală”. Aceaste bacterii sunt capabile să transfere în ţesutul vegetal lezat, un fragment de ADN propriu, ADN-T, de pe plasmida Ti(“tumor inducing”) – în cazul speciei  A. tumefaciens– sau Ri (“root inducing”) – în cazul speciei  A. Rhizogenes,   c a r e   s e   i n t e g r e a z ă   î n  g e n o m u l   p l a n t e i .  C a   u r m a r e   b a c t e r i a  A.tumefaciens induce formarea de tumori la nivelul coletului (“crown gall disease”) iar  A.rhizogenes formarea de rădăcini firoase (“hairy roots”).

In decursul coevoluţiei plantă – microorganism aceste bacterii au devenit capabile să transforme plantele pentru a le exploatamai bine ca şi surse de energie. ADN –T se transmite prin seminţe după legile Mendeliene, ca genă dominantă. Există date care confirmă faptul că o astfel de

transformare genetică are loc în natură fără intervenţia omului. Astfel, s-a demonstrat că plasmida Ri poate purta una sau două copii de ADN-T, iar o parte din una dintre aceste secvenţe a fost regăsită în genomul unor plante nemodificate genetic (Potrykus şi Spangenberg, 1995). Celulele vegetale care poartă ADN-T devin celule tumorale, deoarece acest fragment de ADN conţine gene cu efect oncogen. Deleţia acestor gene din ADN-T nu interferă, din fericire, cu transferul şi integrareaADN-T în genomul celulei vegetale receptoare. Doar capetele ADN-T, aşa numitele laturăd reap t ă ş i s t ângă cons t ănd d in o s ecven ţ ă a l c ă tu i t ă d in 24 de nuc l eo t i de ca r e s e r epe t ă , reprezintă situri de recunoaştere pentru sistemul de transfer. Prin înlocuirea oncogenelor dinADN-T cu gene de interes este posibil transferul acestora în celule vegetale ţintă, celule carenu mai dobândesc caracter tumoral şi deci pot regenera plante transformate genetic. Genele de interes – fie ele gene marker sau raportoare  sau gene cu importanţă economică – pot fi introduse în plante fie prin lincaj cu regiunea ADN-T dezarmată prin recombinare, obţinându-se un aşa numit vector de integrare, fie prin clonarea lor între secvenţele repetate lateraleîntr-un replicon independent, ceea ce se numeşte vector binar. Existenţa mai multor regiuniT î n c e lu l a de  Agrobacterium conduce la cotransferul acestora în celula vegetală ţintă cueficienţă crescută. Pe de altă parte pentru integrarea ADN-T în celula vegetală se pot utilizasecvenţe omoloage ADN vegetal ţintă care induc, cu frecvenţă relativ scăzută, recombinarea omolagă între ADN-T şi ADN vegetal. Agrobacterium tumefaciens poate transfera ADN-T diferitelor specii de plante chiar dacă unele dintre acestea nu formeză tumori (de la Riva şi colab., 1998). Deşi spectrul de gazde pentru această bacteriei este limitat la plantele dicotiledonate s-au obţinut tulpini supervirulente, capabile să infecteze eficient şi celulele plantelor monocotiledonate (Potrykusşi Spangenberg, 1995). S-a deschis, astfel, calea transformării cerealelor şi prin intermediul acestui vector bacterian. Eficienţa transformării celulei vegetale de către  A. tumefaciens, variază destul de mult în funcţie de specie, genotip sau chiar de ţesutul ţintă. Este foarte important, totodată, ca ţesutul supus transformării să fie totipotent şi deci să regenereze plante transformate genetic. De cele mai multe ori, însă, dintr-un ţesut doar un număr limitat de celule sunt totipotente şi nu întodeauna acestea sunt şi cele transformate de agrobacterium. Pentru diferite specii de plante s-au identificat metode potrivite pentru transformarea eficientă mediată de  A. tumefaciens. Ca ţesuturi ţintă pot fi utilizate: discuri sau fragmente foliare,fragmente de rădăcini, hipocotile, peţiol, cotiledoane sau seminţe întregi. Primele plante transformate  prin intermediul luiA. tumefaciens a u   f o s t   r e g e n e r a t e   î n   1 9 8 3   ( F r a l e y   ş i colab.,1983), succesele

iniţiale limitându-se la solanacee, în particular la sistemul model tutunul ( Nicotiana tabacum L.). In anii optzeci şi nouăzeci ai secolului douăzeci, tot mai multe specii de plante au putut fi transformate prin intermediul vectorului  A. Tumefaciens, multe dintre ele, specii cu o mare importanţă economică, cum ar fi: soia, bumbacul, orezul,ovăzu l ,   so rgu l ,   t r e s t i a   de   z ahă r , g r âu l   ş i  mu l t e   a l t e l e  (Po t rykus   ş i  Spangenbe rg ,   1995 ; Songstad şi colab., 1995; de la Riva şi colab., 1998). Eficienţa transformării variază foarte mult de la o specie la alta în funcţie de:

- identificarea metodei optime de cultură a ţesutului ţintă, condiţiile de cultură a materiallului sursă, sau suşa bacteriană utilizată. Aceşti factori afectează şi numărul de copii de ADN-T care se integrează în genomul vegetal receptor. Predominant s-a constatat, la diferite specii de plante, integrarea unei singure copii de ADN-T.  

- Ma i   r e cen t ,   c e r ce t ă r i l e   au  v i za t   de sc i f r a r ea  mecan i sme lo r   imp l i c a t e  î n   co lon i za r ea ţesuturilor vegetale de către bacterii, relevându-se noi detalii privind controlul genetic al virulenţei bacteriene (de la Riva şi colab., 1998). 

 

Agrobacterium rhizogenes a fost utilizat pentru prima oară pentru transformarea plantelor de tutun în anul 1977 (Ackermann, 1977). Această bacterie transferând ADN-T de pe plamida Ri determină formarea rădăcinilor firoase pe diferite organe ale plantelor, rădăcini care pot purta gene de i n t e r e s , dacă ace s t ea au fo s t i n t eg ra t e î n ADN-T , r e spec t i v po t r egene ra p l an t e t r ans fo rma te  gene t i c .  

O   e t apă   i n t e rmed i a r ă ,   î n   p roce su l   de   t r ans fo rmare  med i a t ă   de  A. rhizogenes, este cultura rădăcinilor firoase care au capacitatea de a se alungi şi ramifica.Astfel,  prin cultura rădăcinilor firoase se pot obţine metaboliţi  secundari sau pot fi realizate studii fundamentale privind creşterea şi dezvoltarea rădăcinilor. Acest sistem experimental este foarte potrivit şi pentru analize biochimice, rădăcinile prezentând căi biochimice mai simple şi, deci, mai uşor de analizat. Rădăcinile firoase pot fi cultivate uşor, folosind un echipament simplu şi ieftin iar, comparativ cu suspensiile celulare, celulele radiculare sunt stabile din punct de  vedere genetic. Asemănător sistemului A. tumefaciens, bacteria A.rhizogenes poate co-tranfera ADN-T de pe plasmida Ri şi un vector “binar”, de obicei o plasmidă mai mică. Aceasta din urmă poate purta în ADN-T o genă marker, de exemplu o genă care conferă rezistenţă la un antibiotic, o genă raportoare - sau marker pentru vizualizare fenotipică şi o genă cu importanţă economică. Avantajul acestui sistem este acela că cele două tipuri de ADN-T, cel care determină dezvoltarea rădăcinilor firoase, şi ADN-T de pe vectorul binar, se integrează de obicei pe cromozomi diferiţi în plantele transformate şi deci,vor segrega independent în descendenţă. Un avantaj aparte al sistemului de transformare Ri este faptul că toate celulele vegetale care integrează ADN-T de pe plasmida Ri pot fi uşor  identificate şi selectate prin prezenţa fenotipului de rădăcină firoasă.Sistemul de transformare mediată de A. Rhizogenes a fost aplicat unui mare număr de specii de plante (în jur de 200 încă în 1989 – Tepfer 1989), dar asemănător sistemului  A.tumefaciens r ă spunsu l   op t im  va r i a ză   î n   func ţ i e   de   spec i e ,  geno t i p   s au   su şa  bac t e r i ană . Organele vegetale potrivite pentru transformarea cuA. rhizogenes sunt: fragmente de tulpină de   l a   p l an t e   t i ne r e ,   f r agmen te  de  pe ţ i o l ,f r agmen te   fo l i a r e ,   s egmen te  de  h ipoco t i l e   s au cotiledoane, sau fragmente ale unor organe de rezervă cum ar fi rădăcinile de morcov sau tuberculii de cartof. Uneori astfel de explante prezintă un răspuns polar,  formând rădăcini fi r o a s e   n u m a i   l au n a   d i n   e x t r e m e l e   e x p l a n t u l u i ,   r ă d ă c i n i   c a p a b i l e   s ă   i g n o r e  f o r ţ a g rav i t a ţ i ona l ă .  Ma i  mu l t ,   ex i s t ă   da t e   expe r imen t a l e   c a r e   suge rează   e f ec tu l   de  p i t i c i r e   a   p l an t e lo r   i ndus de una d in t r e   gene l e de v i ru l en ţ ă ,   r o lA , de   l a  A. rhizogenes, e fec t cu importanţă practică mai ales pentru unele plante horticole (Curtis şi colab., 1996).

Transformarea mediată de virusuri

Utilizarea vectorilor virali pentru transformarea plantelor, în ciuda numeroaselor eforturi experimentale, nu a adus rezultate spectaculoase. Deşi, în 1984 a fost posibil transferul unei gene de rezistenţa la antibiotic cu ajutorul unui virus ADN (Brisson şi colab.,1984), cercetările ulterioare au demonstrat că genomul viral nu poate accepta şi transfera fragmente mai lungi de ADN străin. Descoperirea faptului că virusurile ARN pot genera ADNc prin transcripţie inversă a generat sperenţa că, mult mai numeroasele virusuri ARN ar  putea fi utilizate ca vectori de gene pentru celula vegetală. Din păcate, însă, s-au întâmpinatalte dificultăţi. ADNc viral nu se integrează în genomul vegetal iar meristemele, principalasursă de celule totipotente, nu sunt infectate de virusuri. De aceea, vectorii virali sunt mai rar utilizaţi în experimentele de transformare genetică a plantelor.

 Metode directe de transformare a plantelor 

Utilizarea protoplastelor pentru transferul direct de ADN 

Protoplastele - celulele vegetale lipsite de perete celular, reprezintă limita de expresie atotipotenţialităţii. De la primele plante de tutun regenerate din protoplaste izolate (Takebe şi colab., 1971) până astăzi numărul plantelor pentru care regenerarea din protoplaste a devenit posibilă a crescut permanent, ajungând actualmente la aproximativ 400 de specii de plante. Dacă până în anul 1985 tehnologia protoplastelor se putea aplica cu succes mai ales Solanaceaelor şi Brassicaceaelor, o dată cu descoperirea totipotenţialităţii protoplastelor izolate din suspensii celulare embriogene de cereale s-au deschis noi oportunităţi de modificare genetică a acestui important grup de plante.Protoplastele sunt sistemele celulare ideale pentru transferul de ADN şi selecţia transformanţilor. Indepărtarea peretelui celular elimină principala barieră în calea pătrunderii ADN străin în celula vegetală. Izolarea enzimatică a protoplastelor acţionează ca un factor de stress care induce reacţii de răspuns la rănire – reacţii presupuse a declanşa starea de competenţă atât de importantă pentru transformarea eficientă. Mai mult, suspensia de protoplaste se aseamănă cu o suspensie bacteriană avănd avantaje similare prin posibilitateade a cultiva populaţii mari de celule individuale în medii de cultură bine definite. Tesuturile derivate din protoplaste au în general origine clonală provenind din celule individuale.Eficienţa selecţiei transformanţilor este, prin urmare, maximă în cazul protoplastelor deoarece se evită formarea de himere, destul de frecvente la nivelul sistemelor multicelulare. Pentru transferul ADN, de obicei plasmidial, în protoplastele izolate se pot utiliza diferite metode, şi anume:

Tratamente chimice cu agenţi permeabilizanţi

(mai ales polietilenglicol – PEG): PEG şi alţi agenţi chimici pot permeabiliza membrana plasmatică permiţând intrarea unor macromolecule, ADN, în citoplasmă. Mecanismul intim al acestui proces nu este pedeplin înţeles. Primele date raportate în literatură se referă la transferul ADN-T, provenind de la Agrobacterium tumefaciens, în protoplaste de petunia în prezenţa PEG (Draper şi colab., 1982). Primele plante transgenice au fost obţinute la tutun prin această metodă decătre Paszkowski şi colab. (1984). Transformarea protoplastelor prin permeabilizare cu PEG a fost realizată cu succes pentru multe specii de plante, atât dicotiledonate cât şi monocotiledonate, cheia succesului reprentând-o existenţa unui protocol  eficient de regenerare a plantelor din protoplaste.

 Electroporarea

Implică permeabilizarea reversibilă a membranei plasmatice în prezenţa unor pulsuri de curent continuu având amplitudine crescută şi durată foarte scurtă, porii formaţi în membrană permiţând intrarea ADN străin în citoplasmă (vezi Rakosy-Tican si colab., 2000).  Electroporarea a devenit o metodă de rutină pentru transformarea protoplastelor vegetale, dar şi pentru celulele de mamifere sau bacteriene. La plante electroporarea protoplastelor se foloseşte eficient atât pentru analiza expresiei transiente a transgenelor cât şi pentru transformarea permenetă, pentru numeroase specii de plante incluzând cerealele. Mai mult, prin electroporarea protoplastelor se elimină necesitatea utilizării unor gene marker, ceea ce reprezintă un avantaj deosebit în condiţiile oponenţei acerbe a opiniei publice fată de eliberarea în câmp a unor plante purtând gene marker.Avantajele 

electroporării constau în eficienţa crescută a incorporării ADN străin,reproductibilitatea şi simplitatea acestei metode. Singura limitare a aplicării electroporării o reprezintă capacitatea de regenerare a protoplastelor, dar şi acest dezavantaj a fost depăşit prin extinderea aplicării electroporării celulelor sau chiar ţesuturilor întregi.

Sonicarea

–  permeabilizarea membranei protoplastelor în prezenţa ultrasunetelor s-a dovedit, de asemenea o metodă eficientă pentru transferul ADN în protoplaste vegetale. Ulterior metoda a fost aplicată şi celulelor sau ţesuturilor întregi, dar este utilizată pe scară mai redusă comparativ cu electroporarea (Zhang şi colab., 1991).

Microinjectarea

– constă în introducerea cu ajutorul unei micropipete a ADN direct în protoplaste, acestea fiind fixate cu o altă micropipetă. Microinjectarea celulei vegetale întregi sau a ţesuturilor este, de asemenea posibilă, dar se realizează mai greu din punct devedere tehnic. Un sistem eficient a fost utilizat mai recent (Kost şi colab., 1995) şi constăîn imobilizarea protoplastelor recipiente de tutun într-un strat foarte subţire de mediu solidificat cu agaroză sau alginat. Protoplastele au fost imobilizate deasupra unei grile care a permis localizarea şi monitorizarea prin fotografiere a protoplastelor microinjectate, respectiv a celulelor sau calusurilor derivate din acestea.

 Fuziunea cu lipozomi

– fuziunea lipozomilor încărcaţi cu ADN cu membrana plasmatică a protoplastelor şi eliberarea ADN străin în citoplasmă a fost demonstrată în 1990(Cacboche, 1990). Metoda nu prezintă avantaje deosebite comparativ cu alte metode de transfer direct, de aceea este mai puţin utilizată. S-a încercat, de asemenea, utilizarea lipozomilor pentru a transporta ADN în celule sau ţesuturi întregi, în ideea trecerii lipozomilor prin plasmodesme. S-a demonstrat însă că peretele celular este o barieră de netrecut pentru lipozomi iar plasmodesmele se închid ca răspuns la rănire. O idee interesantă a fost aceea a injectării lipozomilor în vacuola unor celule vacuolate. In acest caz s-a constatat fuziunea lipozomilor cu tonoplastul şi eliberarea ADN în citoplasmă. Deşi elegantă această metodă are aplicaţii restrânse deoarece celulele vacuolate nu sunt totipotente (Potrykus, 1991).

Metoda “biolistics” – împuşcarea directă a ADN în celule

Metoda biolistică (“biolostics”) sau “particle gun”, de împuşcare directă a ADN în ţesuturi ţintă (Klein şi colab., 1987), este cea mai spectaculoasă metodă de transformare genetică a plantelor care a declanşat un val de entuziasm în rândul specialiştilor din acest domeniu. In dezvoltarea acestei tehnici s-a investit foarte mult efort şi bani dar şi rezultatele obţinute au fost pe măsura aşteptărilor. Metoda constă în accelerarea unor particule foarte mici (1μm diametru) din tungsten sau aur coloidal, pe care a fost precipitat ADN, în ţesuturi vegetale ţintă. Această tehnică are numeroase avantaje care o recomandă pentru aplicabilitate generală: este o metodă uşor de aplicat, printr-o împuşcătură pot fi ţintite mai multe celule, celulele supravieţuiesc după împuşcare, genele purtate de particule îşi păstrează activitatea biologică, particulele pot fi împuşcate în straturile superficiale sau în profunzimea unui organvegetal, celulele ţintă pot fi foarte diferite: polen, celule în suspensie,

embrioni imaturi, celule din ţesuturi diferenţiate sau chiar meristeme. Datorită avantajelor sale biolisticul a devenit metoda favorită în numeroase laboratoare, permiţând transformarea cu succes a unor plante pentru care alte metode nu au dat rezultate cum ar fi: soia, porumbul, ovăzul, orezul, sorgul,trestia de zahăr, grâul, plante forestiere etc. O aplicaţie aparte a fost utilizarea împuşcării de microproiectile pentru rănirea apexurilor la floarea soarelui, eficientizând astfel transformarea mediată de Agrobacterium tumefaciens(Bidney şi colab., 1992). Mai mult, s-a reuşit împuşcarea directă în ţesuturi vegetale a celulelor bacteriene întregi.

 Electroforeza

Migrarea ADN printr-un ţesut vegetal ţintă a fost o altă idee interesantă pentru transferul de gene şi a fost aplicată pentru prima oară embrionilor intacţi de orz (Ahokas,1989). In aceste experimente s-a demonstrat expresia tranzientă a alogenelor. Ulterior s-a imaginat un sistem simplu pentru realizarea electroforezei folosind embrioni zigotici(Songstad şi colab., 1995)Condiţiile optime pentru electroforeza embrionilor sunt considerate: un curent de 0,5mA la 25V/embrion, timp de 15 min. In aceste condiţii în jur de 50% din embrioni rămân viabili. S-a reuşit, de asemenea, transformarea permanentă, folosind genele marker de rezistenţă la kanamicină şi GUS (β-glucuronidază), a embrionilor unei specii de orhidee(Griesbach şi Hammond, 1993). Aplicarea acestei tehnici prezintă interes deosebit pentru acele specii care nu au dat rezultate prin aplicarea unor metode ca biolisticul sau electroporarea.

Utilizarea fibrelor de carbură de siliciu („silicon carbide technology“)

Fibrele de carbură de siliciu se utilizează în industrie. Transformarea genetică prin această tehnologie este relativ simplă, constând în vortexarea (agitarea) ţesuturilor împreună cu ADN şi fibre de carbură de siliciu. Astfel, fibrele penetrează pereţii celulari permiţândADN să pătrundă în citoplasmă. Metoda a fost aplicată iniţial transformării embrionilor de insecte, iar ulterior s-a dovedit eficientă şi în transformarea celulelor vegetale (Kaeppler şi colab., 1990). Cercetările de microscopie electronică au relevat penetrarea peretelui celular de către astfel de fibre, sugerând că ADN aderă de suprafaţa fibrelor şi este introdus odată cu acestea în celulă. Având proprietăţi fizice asemănătoare azbestului fibrele de carbură de siliciu sunt probabil carcinogene. Transformarea genetică tranzientă a fost raportată folosind această tehnologie pentru suspensii celulare de porumb, ovăz, tutun şi  Agrostis alba. Transformarea stabilă a fost, de asemenea posibilă folosind suspensii celulare de porumb şi tutun. Datele obţinute au indicat transformarea preponderentă a aglomeratelor celulare neembriogene la porumb, de aceea se impun cercetări ulterioare pentru optimizarea acestei metode. Metoda prezintă avantajul de a fi foarte simplă şi ieftină, dar datorită riscurilor potenţiale pentru sănătatea umană se caută materiale alternative, eventual biodegradabile (Songstad şi colab.,1995).

 Alte metode de transfer direct al ADN în celulele vegetale:

există o serie de alte metode cu aplicabilitate restrânsă de transformare a celulei vegetale cum ar fi: îmbibarea ADN în ţesuturi utilizând seminţe uscate sau embrioni, transformarea polenului sau a tubului polinic, macroinjectarea ADN în ţesuturi sau utilizarea microlaserului pentru a perfora peretele celular şi plasmalema. Astfel de metode se află, actualmente, în diferite faze de experimentare. De un interes deosebit, se vor bucura metodele alternative care nu necesităfaze de cultură in vitro.

 O astfel de metodă, cu potenţial deosebit este transformarea grăuncioarelor de polen, dar deocamdată rezultatele în acest domeniu sunt relativ modeste(Potrykus, 1991).