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J barrera : I n g e n l e r b Bioquíslica indiistrral.
*,'rimestre l e c t i vo : W1-P
Lugar donde se l l e v a d a cabo: Laboratorio 274, e d i f . *Y"'. ing. de Proceeoe d i d d u l i c a de C.B.I. de la- universidad Metrupolitana-lztapalapa.
Depto de d e ' l a d i v . Autonoma
' racha ae i n i c i o : 15 de j u l i o de 1987.
J F e c L x de terminación: 15 de eaaro de 1 9 3
/%tor: Dr. Sergio nevah Moissev -_ _ _ e o f. ti t u l a r ".i It . Deepto. de Ing. de Procesos niarául ica.
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Jr&yecto : Producción de Proteasas en r'ermentacibn &ida mediante niger por e l mbtodo K o j i .
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EVOLUCIOX EN LA PRODUCCION
DE PROTEASAS ACIDAC POR A 5
PERGILLUS NIGER SOBRE SUS-
TRATOS AYILASEOS POR EL bIE
TODO KOJI
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Introducción
Ob j et i vo
Metas
Sistema de - fermentacidn
Parámetros
Ya t er ial
Método
Esquema de - trabajo
cá 1 culos
Resultados
Discución de Resultados
Conclusi6n
Referencias
I N D I C E
.. < -
INTRODUCCION -
Tradicionalmente las fuentes de enzimas proteolíticas han sido - de origen animal Ó vegetal, entre las primeras pueden citarse algunas
plantas tropicales como la papaya, el higo v la piña, que producen - - resDectivamente la paoaina, l a ficina y la bromelina. Las de origen-
animal provienen de organos como el estomago 6 el páncreas, de donde-
pueden extraerse .respectivamente pepsina y renina, así como tripsina,,
quimotripsina y carboxipeptidasas.
Actualmente el campo de las fermentaciones ha abierto horizontes
muy importantes en la producción de enzimas de origen microbiano, las
cuales nresentan muchas ventajas para ciertos fines, dado que en gene
ral, son muy inespecificas; no requieren cofactores, muy rara vez se-
encuentran como zimógenos, etc. (Hagihara, 1960)
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c f C c c c f c c c c c c f- L
e.- industria textil, con frecuencia se usan amilasas y proteasas - dependiendo de la fabricación y l o s tipos de engomado; p o r ejem
p l o durante el proceso de desengomado del rayón se emplean enzL
mas proteolíticas porque por l o general esta tela s e engoma - - con gelatina o caseína (Gale, 1 9 4 1 ) .
~
f.- Otros uso5 incluyen el curtido de pieles (Jorgensen, 1959) ; y - el empleo de éste tipo de enzimas en la producción de detergen-
tes biológicos (Keay y Col., 1 9 7 3 ) .
La investigación de estas enzimas ha sido enfocada para tratar-
de encontrar nuevas aplicaciones y nuevas cepas de microorganismos-
que tengan la capacidad de producir grandes cantidades de enzimas - proteolíticas, ya que la demanda de éstas aumenta año con año.
Las enzimas proteolíticas se pueden dividir en tres grupos de -
acuerdo al rango de pH en el que s u actividad es óntima v son: pro
teasas Scidas, proteasas neutras y proteasas alcalinas, -
Las proteasas ácidas son producidas por hongos, teniendo un má-
ximo de actividad y estabilidad a un I" 2 a 5, tienen un peso mole-
cular a rededor de 35000 y contienen una baja cantidad de amino' í1C7 ' -
dos b5s cos . Entre los microorganismos que l a s producen est5n: :.-,
Aspergillus oryzae, Mucor pusillus y Aspergiilus nicer, y s u u s o se
limita a las industrias 15cteas y de alimentos.
.. -, .
Las proteasas neutras son producidas nor dos tipos de microorga
nismos: bacterias y hongos, s u pH de actividad est5 entre 7 y 8 , y
presentan un peso moiecualr.aproximado de 40 O00 a 45 000, algunas-
de éstas enzimas requieren Zn y Mg, para incrementar su actividad - (~riffin,1973).
Se sabe que son muchas las clases de mlcroorganismos que poseen
la capacidad de producir enzimas, entre ellas se encuentran las enzi
mas que hidrolizan proteínas y que reciben el nombre de enzimas oro-
teolíticas o proteasas, siendo uno de l o s primeros reportes, la iden - tificaci6r de proteasas alcalinas producidas por Asperqillus orvzas-
(Oshima, 1922).
Ikeda, (1947) demostr6 que cuando Bacillus suhtilis se hace crecer - en un medio conteniendo como fuente de carbono 5cido acético produce
grandes cantidades de proteasas alcalinas.
En l o s últimos años ha tenido gran auga el estudio de enzimas - proteolíticas producidas por microorganismos, va que son de gran uti -- lidad en l o s procesos industriales, tales como:
a.- Industria farmacéutica, sirven para l a elaboraci6n de preparacio - nes a base de enzimas proteolíticas para combatir algunas infla-
maciones (Reed, 1 9 6 6 ) .
b.- Industria cervecera, se utilizan para ayudar a clarificar y madu - rar la cerveza, durante el perícdo de almacenamiento (R.eed,1966).
c.- Industria cinematografica y fotogrnfica, se u?:ili.zan para recu--
perar la plata empleada tanto en l a s cintas de pelfculas como en
cintas de fotografia, solubilizando la gelatina que engoma a di-
chas cintas (Boidin'~Cd Effront, 1930 ) . ~ C!
d.- Industria. alimenticia, sirven ?ara l a elaboraci4n de hidroliza--
dos de proteínas de pescado, de cereales, y de leche; también se
utilizan para fabricar ablandadores de carnes.
7 --
Las p r o t e a s a s a l c a l i n a s , también l a s producen b a c t e r i a s y hon - g o s , s u máxima a c t i v i d a d e s t á e n t r e DH 10 y 1 1 , t i e n e n un peso mo -
.( l e c u l a r de 2 0 O00 a 30 0 0 0 , su uso s e ha extendido enormemente en-
l a i n d u s t r i a de l o s d e t e r g e n t e s , a l c u r t i d o de p i e l e s y en l a i n - -
d u s t r i a a l i m e n t i c i a . Las enzimas mlis es tudiadas son: S u h t i l i s i n a
C a r l b e r g y S u b t i l i s i n a Novo, producidas Dor B a c i l l u s s u b t i l i e (Ke-
ay y Col . , 1 9 7 2 ) .
También s e han d iv id ido l a s enzimas p r o t e o l í t i c a s en: n r o t e í - nasas y p e p t i d a s a s .
Las p r o t e í n a s a s c a t a l i z a n l a degradación de p r o t e í n a s , dando-
o r i g e n a l a formación de peptonas y p o l i p é t i d o s a combinaciones - - m5s s i m p l e s , como l o s aminoácidos.
A l grupo de l a s p r o t e r n a s a s , per tenece l a pensina que se encu - e n t r a en e l jugo g á s t r i c o , con un pH óutimo de 1 , 2 aZ, l a t r i p s i n a
que s e h a l l a en e l i n t e s t i n o y t i e n e un pH Óptimo de 8 a 9 , y l a - papaina , que s e encuentra en e l jog0 l á c t e o de C a r i c a paDaya, que-
t i e n e un DH Óptimo de 4 a 5.
E l pH Sptimo de l a s pept idJsas s e encuentra por l o genera l - -
c e r c a de 7 , é s t a s enzimas son s i n t e t i z a d a s ?or v e g e t a l e s , animales
y por v a r i o s microorganismos ( j o r g e n s e n , 1959) .
La producción mundial de enzimac p r o t e o l i t i c a s se l l e v a a c a -
bo pr inc ipa lmente por algunas compañías Europeas, de Estados U n i - -
dos de Norteamerica y Japón (Keay y C o l . , 1 9 7 2 ) .
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Los procesos de producción de enzimas involucran fermentacio
nes líquidas ó fermentaciones sólidas, de ésta úitima podemos enten - derla como el crecimiento de microorganismos y la formaciiín de pro-
ductos que ocurre en la superficie de sustratos sólidos, es decir -
con bajo contenido de humedad, (Mudgett, 1 9 8 6 ) . La fermentaci6n s6-
iida se ha venido utilizari'do desde hace muchos siglos en l o s países
orientales para la producción de alimentos fermentados a base de - cereales como el arroz y la soya, en estos procesos intervienen ai-
gunas enzimas extracelulares (Carrizales, 1982).
Una gran cantidad de enzimas extracelulares son producidas - comercialmente a travez de una fermentación sólida de origen j apo -
nes llamado w, que es la preparaciOn de hongos filanentosos cre- cidos en salvado u otro sustrato como arroz, trigo, etc., (Blain, - -
1975) .
La fermentation n o j i se ha realizado en diversos sistemas de
bandejas, tambores rotatorios, lechos fijos, etc. Generalmente el =
sustrato es colocado en condiciones asénticas en las bandejas e incu - bad0 a una temperatura adecuada.
Para la elaboration de productos fermentados en l o s países ori-
entales se utiliza la bande a; de igual forma a nivel industrial se-.
utilizan estas con el fondo agujerado en donde la temperatura y l a - humedad son controladas (Canpel y Moo-íoung, 1980 ) .
I > L
E l presente trabajo está enfocado a la evoluci6n en la produ---
cción de uroteSsas ácidas PO'. ,el método Koji sohre diversos ~, sustra-.-
t o s amiláceos; la técnica de Koji se ha imnlementado en columnas de-
vidrio, empacadas con el sustrato inoculado. Cada una de las coium-
nas se encuentran conectadas a un humidificador, a travez del cual -
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se hace circular aire para mantener un contenido de humedad en el - sustrato y remover el calor generado durante la fermentación. Todo
este sistema se encuentra sumergido en un baño de agua a temueratu-
ra controlada (Raimbault et al., 1985).
Se dispone para este trabajo de U P > cepa de Asuergillus Niger-
Hiperproductora de proteasa ácida. Dicha cepa fué obtenida en.10~-
laboratorios de Biotecnología de la Universite de Technologie de - -
Compiegne, desarrollada p o r el Doctor Chow y Droduce una uroteasa - cuyos Óvtimos son: pH de 2.5 y temperatura de 37°grados centígra--
dos.
‘
7
OBJETIVO: E l o b j e t i v o de e s t e proyec to e s e l estudio de l a Evolución en l a producción de p r o t e a s a s á c i d a s por A s p e r g i l l u s Niger sobre d i s t i n t o s s u s t r a t o s ami láceos .
c.
METAS :
I . imp,kernentacidn de l a t é c n i c a K o j i para l a producción de- P r o t e a s a Acida en e l l a b o r a t o r i o .
11. Produccibn de P r o t e a s a á c i d a en fermentadores t u b u l a r e s - sobre d i f e r e n t e s s u s t r a t o s a m i l a c e o s ,
1 1 1 , Evaluación de l a Producción de P r o t e a s a de l o s s u s t r a t o s ami laceos .
I . El f
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PARAMETROS,
CONSTANTES:
Temperatura ................................................ j3'C pH ............................... .......................... 5.5 Flujo de aire ............................................... llmin. Tamaño de partícula del sustrato. .......................... malla 10/20
Cántidad empacada por columna .............................. 10 gr. Inoculo .................................................... 1X 1~ -E'. Húmedad .................................................... 5~~
8
VARIABLES:
¿i
Tiempo de fermentación ..................................... 24,36 y 48Hr. Sustratos ................................................. arroz, soya .
trigo, maíz - quebrado, sor go y salvado- de trigo.
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10
- SISTEMA DE FERMENTACION
Columnas de vidrio (long. 20 cm., diam. int. 2 cm.) humidificadores de vidrio (long. I O cm., c;iam. int. L cm) pese:a (bOX35X45 cm.) control de temperatura Haake e52 termometro válvulas de bronce ro tame tro Co I e - Palmer regulador Ce flujo Coilhose Pzeumatics filtro para aire Coilhose Pneumatics tapones de hule no. 4
ACUNDlCIUNAMIENTO üE CUSTKATU Y CEPA -
tamices malla 10 y 20 I icuado ra balanza granataria esnátulas pinetas de 5 ml. microscopio c5mara de Neubauer incubador2 aut oc I ave
i. ’ ANALlSIs -
matraces trlenmeyer de 1000, 500 v 250 ml. I, aforadq.de 100 mla
probetas de 25U, 1UO y 25 ml. cristalizadores pipetas de 2 5 , l O y 1 ml. tubos de ensaye incubadora
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p a r r i l l a con a g i t a c l 6 n magnética
espec t rofotómetro S p e c t r o n i c mini 20 potenciómentro Corning termo b a lanza ba lanza a n a l í t i c a macera do r U 1 t r a t ur r ax
I . balanza g r a n a t a r i a
SUSTANCIAS.
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11
HCL
CH3COONa N a , C O ,
N aOH S C i d O t r i c l o r o a c é t i c o
c\ r e a c t i v o de F o l i n C i o c a l t e a u
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c a s e i n a t i r o s i n a azua d e s t i l a d a
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METOW. 12
-Preparaciin del sustrato
I.-Ueterminar el % de humedad (H1) a una muestra de 10 gr. de cada
2.-A otra fraccijn de 1 0 gr agregar un volumen i le solución 0 . 0 1 N-
3.-Esterilizar a 1 5 lb. por 1 5 min. 4.-Agregar un volumen de suspensión de esporas [El), tal que l a su -
ma A l + A1 + El aé un 5 u % de humedad final. 5.-Homogeinizar la mezcla y dejar reposar 2u min. 6.-Empacar la columna.
sustrato.
de HCL [ALJ , para obtener h i pH de 5.5 .
-Preparación de la columna
1.- Colocar un algodón y un circulo de papel filtro en el fondo de
2.- Tapar la colcmna con algodón. 3. - Marcarla 4 . - ksterilizar a I 5 l b . p o r 1 5 min.
la columna.
-Tratamiento de las muestras
1.- Sacar el producto y pesar 3 g r . 2.- diluir 1/10 ron agua destilada 3 . - Homogeinizar en uitraturrax vor 2 min. 4.- Guardar en refrigeraci0n.
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13 ANALISIS DE ACTIVIDAD PROTEASICA:
1.- Tomar 3 g r . de c u s t r a t o y hace r una d í i u c i ó n 1 : l O en agua 2.- Colocar en un tubo de ensaye y Hornogenizar en u l t r a t u r r a x 3 . - Dejar p r e c i p i t a r 1 0 minutos 4.- Tomar 1 m l . de sobrenadante . 5 . - Adicioxar 1 m i . de c a s e í n a a l 2 3 6 . - Incubar 10 minutos a 3OoC 7 . - Adicionar 2 m l . de TCA 8 . - F i l t r a r con Fape l Whartman No. 2
9 . - Tomar 1 m l . de f i l t r a d o
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1 0 . - Adicionar 5 m i . de Na2 CU3 0.4M. t i D i 0
1 1 . - Adic ionar 1 vi. de so luc ión F o l l i n , d e j a r a 40°C
1 2 . - Leer en Spec t ron ic 20 a b60 nm.
MODIFICACION AL METODO:
1 . - Tomar 1 mi. de so luc ión de c a s e i n a y a d i c i o n a r 2 m l . de TCA ( t r i c l c i r o á c e t i c o )
2 . - P e r m i t i r i a coagulación 3 . - Adicionar 1 m l . de sobrenadante 4 . - D e j a r r eacc iona r I O minutos 5 . - F i l t r a r con papel Wnartman No. 2 b.- Tomar I m : . de I i l t r a a o .
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14
7 . - Adic ionar S i n i . de Na2C03 (Carbonato de sodlo)ü,4M 8 . - Adic ionar l m l . de s o l u c i ó n de f o l l i n .
9 . - Leer a 66U n m.
Tratamiento de l a curva std. de t i r o s i n a L
Tubo s o l . S t a . T i r o s i n a (ml. 1
O
2
4
6
S
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1 . - Tomar 1 mi. de Cada tubo L. - Adic ionar 1 ml. de agua 3 . - Adic ionar 2 m i . de TCA
4 . - Tomar I m l .
5 . - Adicionar 5 m l . de SOL. de Na2C03
7 . - Leer a b60 nm.
6 . - Adic ionar 1 ml. de COI. F o l l i n (1 : 2 J
H2° ( m i 1
1 0
8
6
6
2 O 18 .1
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E S Q U E M A D E T R A B A J C
FERMENTACION
1 2 3
FERMEN'IACION
1
2
3
SUS T RATO
ARROZ TRIGO SOYA
CUSTR4TO
SALVADO DE
TRIGO
MA1 z
bORtiO QUEBKADU
COLLTMNAS
COLUMNAS
4
4
4
MUESTRE0 PARA CADA FERMENTACION
7 iEhlY0 ( n R C . 1 NU. t. COLUMNA
O 1 . 2 3
O
24
36
4 8
PARAMET KOS
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I -ANALISIS.
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r - C R O N O G R W - r : i
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ACT 11'1 DAD
ACTIVIDAD PROTEACICA
A) INOCUL4CION
B) ?NESTRE0
C) ANALICIC
DIA
1
293
4
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CALCULOS
LOS cálculos realizados de las diferentes cantidades se basar6i en las siguientes ecuaciones.
-SUSTRATO SECO:
A=B ( 0 . 5 )
DONDE B=Sustrato que se desea tener un 50% de humedad, un pH de 5.5 y
1x1 O * ESPORAS GR.MAT. SECA
/_i
-SUSTRATO FRESCO A EMPLEAR:
C=B ( l+D)
DONDE D= % de húmedad del sustrato
-CANTIDAD CE AGUA ADICIONAL TOTAL PARA @BTENER UN 50% DE HLIMEDAD:
E=B-C
-C!NTIDAD DE HCL 0.01N NECESARIA PARA A C I D I F I C A R E L SUSTRATO CON UNA 11-
MEDAD DEL 50%
F = ( 6 ) B/10
DONDE :
G= Cántidad de HCL 0.01N necesario para llevar a un pH de 5.5 a 10 gr. de sustrato.
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TkhL4NO DEL INOCULO :
H = I ( I X l ü8) /J(30X1 0 4 ) K
DONDE :
K = D i iuc ión
J=Esporas cor,tadas en cada cuadro
AJUSTE DE LA HUMEDAD AL 5 0 %
E=F+H+L
DONDE :
L=Cántidad de agua n e c e s a r i a para a j u s t a r a l 5 0 %
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R E S ' U L T A D O S
FERMENTACION NO. 1 ii
CONDICIONES DE FERblENTACION:
ESPORAS : 4 8
1 5 0 ( 2 S X l O ) ( 1 @ ) = 3 . 7 5 X l O
L o s siguientes cálculos estan básados en 40gr. de sustrato (arroz, soya - trigo) e indicar la cántidad de sustrato seco, sustrato fresco, H20 total HCL en diferentes concentraciones, inóculo parn sustrato y H 2 O a adicio-- nar para ajuste.
ARROZ SUSTRATO SECO X=40(@.5)=20gr. CIFTRATO FRESCO Y=20 [1+0.09) =21 . 7 g . NOTA 0.09 ES L A HUMEDAD DEL ARROZ DEL 9 % VOLUMEN DE H,O; H2ü=40-21.7=18.3nl. VOLUMEN DE HCL; HCL= ( 2 . O) (40) / 1 O=Sml. TA.lARU DEL ISUCULO ; T I = 2 0 ( 1 X i O J / 1 5 0 (25x10 ) ( 10 ]=5 .33ml
H20 PARA AJUSTAR HUMEDAD
8 4
H , O T = 1 8 . 3 - l 0 - 5 . 3 3 = 2 . 9 7 nl. i
/ . . 20
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FEI(bIENTACI0N NO, 2
CONDICIONES TIE L A FERMENTACION:
ESPORAS : 2 50 ( 2 5x1 0 4 ) ( 1 O ) =6.2 5x1 ü 8 ESPOR\S/ml
SUSTRATO SECO SUSTRATO FRESCO VOLL!FlEN UE H,O VULUMEN DE HCL 'IAMARO uEL lNOCULO
-
HZO PARA AJUST.\R HUNEDAD
SUS'I'RAI'O SEC@
SUSTRATO FRESCO VOLUMEN DE H70
VULUMEN UE HCL TAMAÑU DEL INUCULO H20 PARA AJUSTAR HUMEDAD
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SUSTRAIO SECO SUSTRATO FRESCO VGLUMEN Dk H,O VOLUMEN DE HCL TAMAÑO TlEL INOCULO H20 PARA AJUSTAR JITlYEilAD -
ARROZ
~ = 4 u ( 0 . 5 ) = 2 0 g r c . ~ = Z u ( 1 + 0 . ~ 9 ) = 2 1 , 7 g r , H20=4.C-21 . 7 g r . = 18.31111. HCL=Z.0 (40 ) /10=8ml . T2=20[1X10 ) /2500 (25X lO ) = 3 . 2 0 m l . H O T = l 8 . 3 - 3 . 2 0 - 8 m l . =7 . l m l .
8 4
2
TRIGO
x=4u ( O , 5) = 2Ogr.
Y = L 9 ( i + O . ~ 9 j = 2 I , 7 g r . H l l =40-21 . 7 = 1 8 . 3 m l . H L L = I . i ( 4 0 j / l u = l u m i . T I = L O ( i X l U ) / 2 S U O X i O ) = 5 . 3 3 m l
2
8 4
H Z @ T = 1 8 . 3 - 1 0 - 5 . 3 3 = 2 . 9 7 m l .
SOYA
X=40 ( O . 5)=2Cit;rs.
Y = Z ü ( i + o . U 7 5 1 = 2 1 . 5 g r s . H ~ U = ~ L I - ~ ~ . 5 = i g . j l+CL=3[40)/1u=1 Z m l .
T I = 2 0 ( 1 X 1 0 ) / Z S O O [ Z S X l O ) = 5 . 3 3 m l . H2UT=18.3-12-5.33=0.97ml.
8 4
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I 21
FERMENTACION NO. 3
CONDICIONES DE LA FERMENTACION:
ESPORAS :
* - i6O(25X1O4)
SUSTRATO SECO SUST?-%lO FRESCO VOLUMEN DE H,O VOLUMEN DE HCL TAMARO DEL IhOCULO H20 PARA AJUSTAR HUMEDAD
L.
SUSTRATO SECO SUS TRATO E RES CO VOLUMtN DE H20 VULUMEN UE HCL TMIAÑO DEL INOCULO UZO PARA AJUSTAK HUMEDAD
SUSTRATCI SECO SUSTRATO FRkSCO VULUMEN DE H2U
TAMARO DEL INOCULO lizo PARA AJUSTAK HUMEUAD
VULUMEN DE HCL
8 (1 O) =4.0X1 O
ARROZ X=40(0.5)=20grs. Y = 2 0 [l+O. 09)=21.7grc. H20=40-21 .7=18.3 ml. HCL=2.0 (40) / 10=8 ml. TI : 20(1X108) /1600 (25x1 04) = 5
H20T=18,3-8-5.0=5.3 mi. O ml.
TRIGO
X=4U(0.5)=20grs. Y=%c(1+0.09)=21.7 grc. H20=40-21.7=i8.3 ml. HCL=25 (40 j /lU=l U ml.
8 4 TI=20(1X'l0 ) 1600(25X10 ) = 5 . 0 ml
I! OT-i8.3-i0-5.0=3,3 ml. 2
SOYA
X=40(U.5J=2Ugrs.
H2u=40-21.5=18.5 ml. HC~=3.0(40)/10=12 mi.
8 4 TI=20(1XiO j/2500(75X10 )=5.33 ml. HZOT=18.3=12-5.33=0.970 ml.
Y=20(1+0.U75J=21 .5 q r S .
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-- CONDICIONES DE LA FERVENTACION r"
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CONTEO : 4 8 2¡0(25XlO )10=5.25X10
I 2
ARRU Z
SüSTRATO SECO X=40(@. 5)=20gr.
SUSTKATO FRkSCO Y=20(1+U.Q9)=21,7yrs.
v0~Wk.N Dk H2U H 2 ~=40-21.7=18.3 HCL=2. U(4U) / I O = o m l . VOLUMEN DE HCL (0.Ul) 8 4
TAMARU DEL INOCULO TI=20 (1 X1 u ) 21 u0 (L5X I X1 U ) =3,80ml. H20 PAFA AJUSTAR HLIMEuAD H20T=i8.3-8-3.80=6.5~l.
TRIGO o
SUSTF'ATO SECU SUSTKATO FRLSCO VOLUMEN m 1-1~0
VOLUMEN DE HCI. TAMARO DkL lXOCUL0 H2@ PARA AJUSTAR HUMEUAD
Y=4O(U .5J=?UgrS. Y=20 (l+u. 09~=21 .7 H20=40-71, 7= 1 8 . 3
TI=20 (1x10 j /2 I O 0 (25x1 O )=3.8095 HCL=2.5 (41)) ~10=1or.il"
8 4
H 2 OT=18.3-10-3.8=4,5ml.
SOYA
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[ SUSTRATO FRESCO Y=ZU(l+O. U75)=21 ,5
[ VOLUMEN DE HCL
SUSTRATO SECO X=40(0.s)=20grs.
H @=40-21.5=I8.5 VULUb1E.N UE H20 2 tic~:3(.1-0) 1 n=12ml.
'I'AMARO UEL INOCULO TI = 20 (1x10 J / Z I O 0 (25x1 O )=3,8ml. H20 PARA AJUSTAR HUMEDAD H2UT=i8.3-12-3.8=2.4ml.
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SUSTRATO SECO: SUS'I'RA'IO FKESCO: VOLUMEN DE HZO:
VULUMEN UE HCL:
TAMARO DEL INOCULO: HzO PARA AJUSTAR HUUEUAD
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SUSTRATO SECO : SUSTRATO FRESCO : VCLlTMtN Db H p : VULUMEN UE HCL: T A ~ ~ A R O DEL INOCULO : H2U P A M AJUSTAR HU?itBAIJ :
SORGO
23
x=Ju(0.5)=20gr. Y=Zu(1+0.08)=21 .6gr. HzO=40-21.6=i8.4ml. tiCL=Z. 3(40) 10=9,2mi. TI=ZO(l~108) / Z ü O O (25x1 04)=4. Oml. ki20T= 18.4-9.2-4.0=5.2ml.
MAIZ QUEBRADO
X=.40 (O, 5) = ZOgr , k = 20[1+u. 09j=2 I. 5gr. H20=50-Z1.7=lS.3ml, HCT =2.4 (40)/10=9.6ml.
8 4 TI=ZO(iXlü ) / Z ü 0 0 ~ 2 5 . ~ 1 0 )=4.0mi. M7OT=i8.3-9.6-4.0=4.7ml. -
SUSTUTU SECO:
SUSTRATO FRESCO:
VOLUMEN DE HZO:
VOLUMEN UE HCL:
TAMARO DkL INOCULO:
H 2 0 PARA AJUSTAR HLiMEuAD:
1
SALVADO DE TRIGO
X=40(0.5)=20gr.
Y=20(1+0.075J=2i.Sgr
H20=40-21 .5=18.5ml.
HCL=2.5(40)/10=lC~il.
TI=20 (1x1 O8~/200O(2SX1 0’) =4.Oml
HZOT=i8.5-10-4=4.5~l,
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FERMENTACION NO, 6
CONDICIONES DE FERMENTACION
180 ( 25x1 04) (1 0)=4.5X~l O8
SORGO
SUSTRATO SECO: SUSTRATO FRESCO : VULUMEN UE H20: VOLUMtN DE HCL: TAMANO D t L INOCULO: H20 PARA AJUSTAR HUMEDAD:
SUS'I'RAI'O CbCO. SUSTRATO FRESCO : VOLUMEN DE kiZO:
VULIJe4EN DE i1CL: TAMANO DEL INOCULO: Ii20 PARA AJUSTAR HUMEDAD:
X=40 ( O . 5) =20gr, Y = 2 U ( 1 + 0 . ~ 8 ) = 2 1 , h g r , H20=40-21 -6=18 .4ml .
H C L = ~ . 3 ~ 4 0 ) / 1 ~ = 9 , 2 m l . 8 4 TI=ZO(IXiO ) /1Oo (L5X io ) (i0)=4.4?nL.
H 2 0 T = 1 8 . 4 - 9 . 2 - 4 . 4 = 4 . ? 5
MA12 QUEBRADO
X=40 (U . 5 j = 2 U g r .
Y=LO(i+O.OSj=Zi,;jir. H Z ü = 4 ü - 2 i . 7 = 1 8 . 3 m l . ~ C L = 2 . 4 ( 4 u ) / i 0 = ~ , 6 m l . I I = L O ( 1x1 U ) / 18u (Z5X lO ) 110 1=4.44ml. t i , O T = i 8 . 3 - 9 . 6 - 4 . 4 4 = 4 . : b m l .
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SALVADO DE TRIGO
SUSTRATO SECO: x=40(u. 51 =2ugr.
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SUSTRATC! FRESCO:
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VULUMEN UE HZO: H20=40-Z1.5=18.5 mi.
VULUMEN LIE HCL: HC~=2.5(40) /10=10 ml.
a 4 T A U R O DEL INOCULO: TI=20 (1x10 ) /i8O[,ZSXiO ) ( 1 0 J = 4 . 4 n i l . -
H ~ O P.ARA AJUSTAR HuMEUAD: H7uT=i8.5-i0-4.4=4.1 mi. I
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27
FERMENTACEON NO, 7
CONDICIONES DE FERYENTACION
ESPORAS :
4 8 2i0(25XlU ) (10)=5.25XlO
SUSTRATO SECO :
SUSTRATO FRESCO:
VULUMEN UE HsO:
VOLUMEN DE HCL:
ThiAEJO uEL iNOLULu:
H2U P A M AJUS' Ir-... 'R HWJZDAU:
SUsTRATO SECU:
sUS'i W'I O FHESLO :
VULUMEN UE H20:
VOLUW~N Dk HCL:
TAMAFJO DEL INOCULO:
€Izo PARA AJUSTAR HUMEDAI):
SORGO
X=40(0,5)=20gr.
Y=20(1+0.08)=21 .6 gr.
H20=40-21.6=18.4 ml.
HC~=2.3(40)/10=9.2 mi.
Ti=20[1XiO )/210(25Xlu ) (10)=3.8 ml
H2uT=18. 4-9.2 - 3.8=5.3 ml ,
8 4
MAiZ QuEBKADu
X=40[C,5)=20gr.
Y - Z U (1 +O. 09) =21 . 7 g r ,
H20=40 - 21 .7= I 8.3 mi.
Hl.L=L. 4[40~/1u=9.5 ml.
TI=20(ixlu8)~(ZiO) ( 2 5 ~ 1 0 ~ ) (10)=3.r; ml
H2UT=i8.3-9.6-3.8=5.4 ml.
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SUSTRATO SECO: X=4O(O. 5 ) = 2 O g r .
SUSTRATO FRESCO: Y=2u( 1 + O . u75)=2~i, 5gr .
[ VULUMEN UE HCL: HCL=2.5 (40)/10=10 m l .
[ 'IAMARO UEL INCICULU: 4 TI=20 (1X1 u8) /2tO(25X1 O ) [ 1 0 ~ = 3 . 8 m l ,
H OT= l8 .5 -10 -3 -8=4 .7 ml. 2 - ti20 PARA AJUSTAR HUMEDAD: c c c c c c
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FEñMENlACION NO. 8
CONDICIONES UE FERMENTACIUN
ESPORAS : i70(25.X104) [I 0)=4.25XiO 8
SUSTRATO SECO: SUSTRATO FRESCO:
VOLUMEN DE t i 2 C i :
VOLUMEN nE H C L :
TAMARCi DEL INUCULO: H20 PARA AJUSTAN HIJMEDAD:
SUSTRATO SECO: SUS I RA'I'O FKESCO : VOLUMEN DE H2ü: VOLüMkN Dk HCL: TAMANO D t L T'IOCULO:
~~0 PARA AJUSIAR iiiJMkDAu:
SORGO , .
X=$O [O. 5) =20gr. Y=IO(l+u.O~)=Zl .6 pr. H20=40-21.6=18.4 ml. HC~=2.3(40)/10=9.2 ml. TI=20(1XiO )/170(25XiO ) (1U)=4.7 ml. H20T=i8.4-9.2-4.7=4.5 ml.
8 4
YAIZ QUEBRADO
X= l O [ O . S ) = Z O gr. Y = 2 ~ ( 1 + 0 .r i9)=21.7gr.
ti G=40-?l.i=i8.3 m J . H L L = ~ . 4 ( 4 0 ) /10=9.6ml. 2
S 4 TI=20(1XiO J/(I70) ( 2 5 X 1 0 )(10)=4.7 ml.
H2@T= 1 8.5 - Y . 6 - 4 . ?=4 . O nil.
SALVADO DE TR
X = 4 0 1 0 SUSTRATO SECU:
sUS'I'RA'I'O FRESCO :
V O L U M ~ N Dk H20:
VULUMEN UE HcL:
TAMARO DkL INOCULO:
H20 PARA AJUSTAR HUMEDAD:
GO
5)=20 gr.
Y=2U(l+O.U75)=21 . 5 gr.
H 2 0 = 4 0 - 2 1 . 5 = 1 8 . 5 mi.
HCL=2.5 (40) I 1 0=1 O ml.
8 4 TI=20(1XtO J / 1 ~ o ( ~ ~ x ' l o J (lU)=4.7 mi.
H,0=18.5-i0-4.7=3.8 ml. L
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DISCUSION üE RESULTADOS
La implementación d e l método K o j i sobre columnas empacadoras en
e l i a b o i s t o r i o kue s a t i s f a c t o r i o , debido a l f á c i l manejo d e l sisctema
en e l que a p e s a r de t r a t a r s e de un c u l t i v o s S i i d o , l o s microorganis - mos tuvieron un buen d e s a r r o l l o .
La evoluc i6n en l a Froducción de p r o t e a s a s á c i d a s a n i v e l ? e l a - b o r a t o r i o sobre d i v e r s o s s u s t r a t o s amilaceos r e p o r t a e s c a s a informa-
c i ó n s i n embargo l a producción a c t u a l de p r o t e a s a s s e l l e v a a cabo -
sobre soya y salvado de t r i g o , e s d e c i r s u s t r a t o s con un a l t o c o n t e -
nido p r o t e i c o ; l o que j u s t i r i c a l a mayor p r o d u c c i j n de p r o t e a s a s , no
a s í en s u s t r a t o s C O G una mayor cant idad de Elmidones como e l a r r c z , -
y e l sorgo , que los hace adecuados en l a produccinn de a m i l a s a s .
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E l t r i g o posee un mayor contenido p r o t é i c o que C J arroz y e l so r - g o , pero no a s í con e l Salvado de t r i g o y l a s o y a , dando por r e s u l t a -
do ura producci6n de p r o t e á s a c 5c idas intermedia .
I I $! En estudios que deban realizarse posteriormente sera posible
determinar el tiempo Óptimo de producción en sustratos tales como q ?$ E ' PI ! :
el salvado de trigo y la soya y seleccionar e1 sustrato adecuado- U ' 11 y su tiempo optimo de producción de proteasas ácidas.
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CONCLUSIONES:
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1.- Es pos ib l e l a r ea l i z ac i ón .de1 m%todo K o j i s o b r e columnas empacadas
2 F i v e1 de l abo ra to r i o . a <
2 . - E l salvado de t r i g o es e l sustrato con e l que se obt iene una mayor
producción de proteásas ácidas, d i f i e r e en 0.43 unidades con res- -
pecto a l t r i g o en promedio a l a s 4 8 Hrs. , aicnos resultados sug ie -
ren tomar en cuenta d i ve rsos f a c t o r e s , dentro de l o s cuales e l f a c - tor costo en condiciones d i f e r en t es sera determinante en su s e l e c -
c ión.
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3 . - Los sustratos sorgo, y arroz por su mayor conteniCo de almidones - resu l tar ían a d i f e r enc ia de l o s demás mejores en l a producción de-
r.lmilásas, que en l a producción de proteásas ácidas.
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